CN107385059A - 一种与肉鸡生长性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与肉鸡生长性状相关的分子标记及其应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中在SEQ ID NO:1的第二个内含子第1834bp处有一个T/C单核苷酸突变。所述分子标记可应用于中速型肉鸡的选育，包括以下步骤：待测鸡DNA的提取及扩增，将扩增产物进行测序和序列比对分型，育种时选择保留判定为杂合子基因型的个体。通过本发明提供的分子标记筛选得到的杂合子基因型个体70、77和84日龄体重显著高于纯合子个体，77日龄胫长和70日龄胫围也显著大于纯合子个体。本发明提供的分子标记有利于选育优势杂合子肉鸡，提高肉鸡的生产性能。

Description

一种与肉鸡生长性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及家禽遗传育种技术领域，具体地，涉及一种与肉鸡生长性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

我国地方品种肉鸡资源非常丰富，但与国外快大型肉鸡相比生产性能较低。而生长是畜禽生产中非常重要的经济性状，因此肉鸡的生长性状一直是家禽育种的重点研究对象，解析生长性状对肉鸡的生长和育种具有重要意义。

随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，能够从分子水平上快速准确地分析畜禽的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，利用分子标记辅助选择育种。肉鸡的生长性状为数量性状，受微效多基因控制，采用传统育种方法遗传进展缓慢，利用分子标记辅助选择结合传统育种可有效提高肉鸡生长性状的遗传进展，缩短育种时间。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）具有双等位基因、易于统计、广泛分布于整个基因组等特性，是分子标记辅助选择的有力标记。寻找与肉鸡生长性状相关的SNPs，可应用于分子标记辅助选择育种，提高鸡生长性状遗传进展。

Myc基因家族属于编码核蛋白的原癌基因，其产物可促进细胞增殖、永生化、去分化和转化等。c-Myc基因是Myc家族成员，该家族包含c-Myc、N-Myc、L-Myc、S-Myc和Myc-nick 5个基因，其中的c-Myc是研究最多，也是功能最广的基因。研究表明鸡c-Myc作为重要的转录因子，可结合于众多microRNAs（miRNA）和长链非编码RNAs基因的启动子区调控它们的转录，包括miR-203、miR-20a-5p和miR-140-3p在内的多个肌肉发育相关miRNAs的转录，从而促进鸡成肌细胞增殖并抑制鸡成肌细胞分化，而胚胎期成肌细胞的增殖和分化影响着肌纤维的形成，决定着出生后肌肉的生长潜力。然而，目前现有技术中尚未有关于鸡c-Myc基因作为鸡生长性状的分子标记的报道。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种与肉鸡生长性状相关的分子标记，该分子标记可应用于中速型肉鸡的选育，提高肉鸡的生产性能。

本发明的另一个目的是提供一种与肉鸡生长性状相关的分子标记在中速型肉鸡选育中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种与肉鸡生长性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中在SEQID NO:1的第二个内含子第1834bp处有一个T/C单核苷酸突变。

所述分子标记位于鸡c-Myc基因（SEQ ID NO:1）第二内含子区域的1834bp处，通过与鸡生长性状关联分析，发现该分子标记与鸡的多个生长性状显著相关，包括体重、胫长和胫围。其中杂合子TC型为优势基因型，等位基因T为优势等位基因，TC型个体的70、77和84日龄的体重显著大于野生型个体。

本发明还请求保护所述分子标记在选育中速型肉鸡中的应用。

一种应用与肉鸡生长性状相关的分子标记选育中速型肉鸡的方法，包括如下步骤：

S1.提取待检测鸡的DNA；

S2.目的片段的获得及测序：利用正反向引物对通过PCR扩增待测鸡的DNA，将获得的产物进行测序和序列比对分型；

S3.根据序列比对分型的结果，育种时选择保留判定为杂合子基因型的个体。

优选地，步骤S2中所述正反向引物对的序列如下所示：

正向引物（SEQ ID NO:2）：5’-CAGCGCCAGCCTCCCCAGCAAGAAC-3’；

反向引物（SEQ ID NO:3）：5’-CCTCGCTAACGTGGCATTTAACAG-3’。

优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min，38次循环（98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸20s），72℃延伸8min。

优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系包括DNA模板、2×T5 Super PCR Mix、5×Enhancer Buffer、正反向引物对。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）通过本发明提供的分子标记筛选得到的杂合子基因型个体70、77和84日龄体重显著高于纯合子个体，77日龄胫长和70日龄胫围也显著大于纯合子个体。

（2）本发明提供的分子标记有利于选育优势杂合子肉鸡，提高肉鸡的生产性能。

附图说明

图1为扩增目的序列和引物在c-Myc基因上的位置指示图。

图2为c-Myc基因g.1834T>C位点基因分型结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种应用与肉鸡生长性状相关的分子标记选育中速型肉鸡的方法，包括如下步骤：

1.鸡血样的采集和DNA的提取：

被检测鸡群的系谱情况及生长性状测定完成后，翅下静脉采血约1mL，注入经高压灭菌并装有150μL 2%无菌EDTA（Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。

基因组DNA的抽提采用苯酚—氯仿抽提法（奥斯泊F等，1998）：

（1）取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20% SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；

（2）向消化好的血液中加入500μL的Tris-饱和酚，轻摇20min，使溶液的两相充分混匀，6～8℃下转速10,000rpm离心10min；

（3）取上清至另一干净的离心管中，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，转速10,000rpm离心10min；

（4）取上清至另一干净的离心管中，再次加入500μL氯仿：异戊醇（23:1），轻摇20min，使溶液的两相充分混匀，6～8℃下转速10,000rpm离心10min；

（5）转移上清至另一干净的离心管中，加入1mL无水乙醇（-20℃）来回摇摆以沉淀DNA，转速10,000rpm离心10min后倒出乙醇；

（6）用1mL 75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；

（7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的TE溶液，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；

（8）-20℃保存备用。

2.鸡c-Myc基因目的片段的获得：

根据UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)上鸡(Gallus_gallus-5.0/galGal5)c-Myc基因组DNA序列，该位点位于基因组2号染色体139847558处，利用生物学引物设计软件primer premier 5设计包含该位点的正反向引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成。利用PCR技术对待测样品进行扩增，扩增目的序列和引物在c-Myc基因上的位置如图1所示。PCR反应混合体系如表1所示。

表1 PCR反应混合体系

PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸20s，38个循环；72℃延伸8min；16℃保存。

3.待测样品PCR产物测序及基因型判定：

取3μL的PCR产物（可直接点样），用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并以DNA marker 2000作为参照。电泳检测合格的PCR产物获得的产物，委托北京擎科新业生物技术有限公司进行sanger DNA测序。

获得的序列进行分析比对，判定个体的基因型。根据测序的结果判定该位点在检测群体中的基因型。结果如图2所示，如果该样本是纯合子的话，就只有一个产物峰：T峰或C峰，判定为TT型或者CC型；如果是杂合，那么就会出现2个峰：T峰和C峰，判定为TC型。

4.根据被测个体的基因型，结合生产需要进行留种。

实施例2

本发明对c-Myc基因SNP位点与鸡生长性状关联性进行了检测和分析。

通过检测c-Myc基因g.1834T>C位点在华南农业大学杏花×隐性白鸡F2资源家系群体的基因型，并根据记录的生长性状进行关联分析。

利用SAS 9.2 软件(SAS Institute, 1996)中的GLM程序进行关联分析，其数学模型如下：

Y _ijkl = μ + G _i + D _j + H _k + e _ijkl

Y _ijkl 为生长性状观察值，μ为生长性状群体均数，G _i 为基因型效应，D _j 为家系效应，H _k 为批次效应，e _ijkl 为随机误差效应。

c-Myc基因g.1834T>C位点与鸡生长性状关联分析结果如表2所示，由表中可以得出g.1834T>C位点与鸡70、77和84日龄体重，77日龄胫长和70日龄胫围呈显著相关(P<0.05)或极显著相关(P< 0.01)。其中杂合子基因型CT在各日龄阶段的体重明显比纯合子基因型CC和TT重，胫长和胫围也比纯合子基因型要长，所以CT基因型为优势基因型。

表2 g.1834T>C位点与屠体性状的关联分析结果

注：（）里数字表示基因型和个体数；同行数据，不同大写字母表示差异极显著（P <0.01）；不同小写字母表示差异显著（P< 0.05），相同大写或者小写字母表示差异不显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种与肉鸡生长性状相关的分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3882

<212> DNA

<213> 鸡c-Myc基因

<400> 1

attgtaccgg acggagcgcg ccgcgccgcc ttggaccgta caatctgccg cacgccggga 60

aggcgagccc tctccgctgt attttttttc tcatcgtggt gggaggaagc gatctacgtt 120

ctcccggcgt tttggctccc ttttttcccc cgtcttctcc ggcggttctt tttatatttt 180

tatctccaat ttcctgattt tgttgttccc cgcaccgccc gcaattattg cctcgctccg 240

tctcgcagcc ggcgcgttgg aggagccggt gagtggcggg gctccgcttt acccatcact 300

cgatccgccg cggtcgggct gacagcgcgg ggccgcggga ccgccggtgc ctcccggggg 360

acgcggcgct gctccgggca cggcgcgccc catccttctc cgtgctctcg gcttggatat 420

ataattctat tttttggagg gggggggggg ggtgggggag ggcaagaagc atttgcttct 480

ccagcgtacg cacggcaggt tatgcttatt gcacatatat acgtatatat atgtgcgtgt 540

gtggatatat atgtatatat gataaatttg gcaaagtttg cccagctccg tgcacggcca 600

ggtgggtggc tggggagcag cccggctctg cgctgggagc taccggccct tctcgcccgg 660

ttcccggtgc cggagctggg caccggctga gcgcggcggc tgcgggagct gtgcccgagc 720

ggagcccctc cggagagtcg cggggagagc gctccgggcg tccccgggcg ctgacccctc 780

gatggacggg gtcgcgactc ccggtcgccc cgctgagctg gggagggggt gaggcggggg 840

gctcacgagg ggtcgtgctt tttattatta ttattatttt attattatta ttagtttata 900

tatatatata tatatataaa tcaatctgac ggcgcggggt gccgggaggg agcgctgcgt 960

gccgagggtc gatctccccc gctatagggg ccggggggag cggagcctcg cggccccgag 1020

cgcggctcac ccggcccccc cgtgtccccc tcccgcccgc aggcagcagc cgccgcgatg 1080

ccgctcagcg ccagcctccc cagcaagaac tacgattacg actacgactc ggtgcagccc 1140

tacttctact tcgaggagga ggaggagaac ttctacctgg cggcgcagca gcggggcagc 1200

gagctgcagc ctcccgcccc gtccgaggac atctggaaga agtttgagct cctgcccacg 1260

ccgcccctct cgcccagccg ccgctccagc ctggccgccg cctcctgctt cccttccacc 1320

gccgaccagc tggagatggt gacggagctg ctcggggggg acatggtcaa ccagagcttc 1380

atctgcgacc cggacgacga atccttcgtc aaatccatca tcatccagga ctgcatgtgg 1440

agcggcttct ccgccgccgc caagctggag aaggtggtgt cggagaagct cgccacctac 1500

caagcctccc gccgggaggg gggccccgcc gccgcctccc gacccggccc gccgccctcg 1560

gggccgccgc ctcctcccgc cggccccgcc gcctcggccg gcctctacct gcacgacctg 1620

ggagccgcgg ccgccgactg catcgacccc tcggtggtct tcccctaccc gctcagcgag 1680

cgcgccccgc gggccgcccc gcccggcgcc aaccccgcgg ctctgctggg ggtcgacacg 1740

ccgcccacga ccagcagcga ctcgggtgag cggcgcccac tcgtgtcggg gacccgagcg 1800

ttcctccttc ccgctgctcg cgggacctca ccctgcttct ccccccttgc gcgcaccgct 1860

ctgttaaatg ccacgttagc gaggcgctct gcgagtttat ttcctggaaa agcagttttc 1920

cctccaccct tttggaggaa aaaaaggagt caaaagggga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaagggagg gagggagaaa ctttcataac ggggtcagag ccagaggtcc ccagcgcggg 2040

agcggaggga gcgcttcccg gtgacacccg agggtcggga aggggttaac tgcagcccga 2100

gaaccgcggg gagaatgcgg gcggggaggt gccagtgaaa gtggctgcga ggagcgagtg 2160

aatgggactg ggaaagtttt agaaatgctt ccttaggtat ttgacagcgt gttccgctcg 2220

ctcataaatt tgggttgaaa gcgagttgct actcaagcat tgcagccttc gggtttctca 2280

gttttttaag gttttttttt tttttttctg cttagatttt ccacaaatta gcagatcaag 2340

agagattgag aaaatgtctc tgaatacaca tgtgtgttaa gtaagctttc ttttgaggcg 2400

tggccaaagc cttctaaatc cttaattaag ggcagcttga gtctgggagc tttattgcgc 2460

tgcgttgctg acagccgagg ttaaactttg ctgctatctc tgtgctcgca gttacgcaag 2520

agctgtgcaa cttttgaaat cagggagcca gagttccgag ggcagtcctt gaaacgctgc 2580

ttccttaagg gaagggctct tgggtaggga atggggagtc ttgcagagtc ggatggtttg 2640

aaagtaggtt tgtcaatggg ttccttgctt cgtggcttgg agtaacccct tgttgggctg 2700

tcctgagagt ttttgcacag atcagctcat gatgctattt ttttcctgtg cagaagaaga 2760

acaagaagaa gatgaggaaa tcgatgtcgt tacattagct gaagcgaacg agtctgaatc 2820

cagcacagag tccagcacag aagcatcaga ggagcactgt aagccccacc acagtccgct 2880

ggtcctcaag cggtgtcacg tcaacatcca ccaacacaac tacgctgctc ctccctccac 2940

caaggtggaa tacccagccg ccaagaggct aaagttggac agtggcaggg tcctcaaaca 3000

gatcagcaac aaccgaaaat gctccagtcc ccgcacgtca gactcagagg agaacgacaa 3060

gaggcgaacg cacaacgtct tggagcgcca gcgaaggaat gagctgaagc tgagtttctt 3120

tgccctgcgt gaccagatac ccgaggtggc caacaacgag aaggcgccca aggttgtcat 3180

cctgaaaaaa gccacggagt acgttctgtc tatccaatcg gacgagcaca gactaatcgc 3240

agagaaagag cagttgaggc ggaggagaga acagttgaaa cacaaacttg agcagctaag 3300

gaactctcgt gcataggaac tcttggacat cacttagaat accccaaact agactgaaac 3360

tatgataaaa tattagtgtt tctaatatca ctcatgaact acatcagtcc attgagtatg 3420

gaactattgc aactgcatgc tgtgcgactt aacttgagac tacacaacct tggccgaatc 3480

tccgaacggt ttggccagaa cctcaaaact gcctcataat tgatactttg ggcataaggg 3540

atgatgggac attcttcatg cttggggatg aactcttcaa ctttttttct tttaaaattt 3600

tgtatttaag gcattttttc ttacgagaat tccaaataga gttgtcccca gattgctgta 3660

tatatttaca catcttcttg ccatgtaaat acctttaata aagtctttat agaaaaatgt 3720

gcaacattaa tacacagcag ttgtgggaac tggatttata cttgtcttga acttgtgtgc 3780

cataacattt cacagttttg ttttttattt aaatacattt ttttctttta aaaatgattt 3840

ttattttgtt tttagataaa taaatatttg cccaaaatat aa 3882

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 2

cagcgccagc ctccccagca agaac 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 3

cctcgctaac gtggcattta acag 24

Claims (6)

1.一种与肉鸡生长性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中在SEQ ID NO:1的第二个内含子第1834bp处有一个T/C单核苷酸突变。

2.与肉鸡生长性状相关的分子标记在选育中速型肉鸡中的应用。

3.一种应用与肉鸡生长性状相关的分子标记选育中速型肉鸡的方法，包括如下步骤：

S1.提取待检测鸡的DNA；

S2.目的片段的获得及测序：利用正反向引物对通过PCR扩增待测鸡的DNA，将获得的产物进行测序和序列比对分型；

S3.根据序列比对分型的结果，育种时选择保留判定为杂合子基因型的个体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述正反向引物对的序列如下所示：正向引物5’到3’为SEQ ID NO:2，反向引物5’到3’为SEQ ID NO:3。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min，38次循环（98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸20s），72℃延伸8min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系包括DNA模板、2×T5 Super PCR Mix、5×Enhancer Buffer、正反向引物对。