CN105224824A - 基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法 - Google Patents

基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，包括下列步骤：（1）样品处理；（2）DNA和RNA的提取；（3）RNA样品的反转录等温链位移扩增；（4）核酸文库的制备；（5）Ion？Torrent测序；（6）生物信息学分析；（7）系统进化分析与遗传距离计算。本发明建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序非诊断性检测方法，可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息，是一种有效的新方法。

Description

基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，属于生物病毒检测技术领域。
背景技术
宏基因组学诞生于上世纪90年代，是指不经过微生物培养阶段，采用直接提取环境中总DNA和总RNA的方法，对微生物基因总和进行研究的一门新学科.宏基因组技术的出现，使得人们对占微生物总体99％以上不可培养微生物的研究成为现实，微生物基因的可探测空间显著增大.总的来说，目前宏基因组技术的应用主要分为两个方面：一方面是筛选功能基因，开发具有所需功能的蛋白；另一方面是通过对宏基因组文库进行分析，探讨在各种环境下微生物间相互作用和微生物与周围环境间相互影响的规律，以便我们能更加客观、全面地认识微生物世界.在宏基因组技术的应用范围被不断扩展的同时，围绕着宏基因组文库的构建和筛选、测序和分析等方面的研究已成为宏基因组学发展的主要推动力，宏基因组技术的进步将不断提升其应用价值。
病毒宏基因组学(viralmetagenomics)是宏基因组学的一个分支，它是研究特定环境中病毒群落的一项技术方法。利用病毒宏基因组学方法进行未知病毒的鉴定及研究已经得到了普遍认可。
2010年，科研人员发现一种导致蛋鸭产蛋大幅下降，后期伴有神经症状的新型病毒病。由于该病剖检症状主要呈现卵泡变性、变形，卵泡膜充血、出血，因此命名为鸭出血性卵巢炎(duckhemorrhagicovaritis,DHO)。随着关于该病的病原信息被越来越多的研究所揭示，发现病毒和坦布苏病毒亲缘关系最近。2011年，中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会正式将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”，并确定为一种新型鸭黄病毒-鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)。然而，最初该未知病原的发现，受制于常规检测技术的局限性，基因组序列信息严重缺乏，病原信息并未快速揭晓，因此病因众说纷纭，疫情得不到及时有效的控制，造成了疫情的蔓延和巨大经济损失。及早发现、鉴别未知或新发病原是疾病防控的关键，同时对疾病的临床治疗也具有重要的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：通过建立一套基于病毒宏基因组学的鸭坦布苏病毒的鉴定技术。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，包括下列步骤：
(1)样品处理：
将细胞培养样品冰浴融化，组织样品研磨后离心，12000g离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤，此过程在超净工作台中完成；然后取滤液加入DNaseⅠ、RnaseA各1.5μL、10×DNaseⅠBuffer40μL，于37℃水浴3h，以降解样品中宿主游离核酸，然后置75℃水浴10min，灭活DNaseⅠ；
(2)DNA和RNA的提取：
处理后的样品均分为两份，200μL样品用QIAGenDNA提取试剂盒提取DNA，另外200μL按RneasyMiniKit提取试剂盒操作步骤提取RNA；
(3)RNA样品的反转录等温链位移扩增
每份病毒RNA样品溶解于5μL的RNase水，用OvationRNA-SeqSystemV2基因组扩增试剂盒进行扩增，等温链位移扩增的反应条件为：
(4)核酸文库的制备
上述样本全部扩增完毕后，用PCR纯化试剂盒进行纯化；分别取100ng纯化产物，用IonShearTMPlusReagentKit进行酶切打断5min，酶切产物加入1.8倍体积XPBeads纯化，然后分别加入不同的IonXpressTMBarcode接头，E-Gel胶选择片段构建文库；用PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryqPCRMix鉴定文库质量；
(5)IonTorrent测序
取20μL终浓度为300ng/L的工作文库上机IonChefSystem进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机IontorrentPGM进行高通量测序；
(6)生物信息学分析
上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据；将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列；选取GenBank中批量下载的黄病毒科全基因序列作为参考序列，将测序数据通过Blast比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应的病毒；
(7)系统进化分析与遗传距离计算
将测得序列通过DNAstar、MEGA6.0软件的MegAlign模块，对病毒全基因组与GenBank中已发表的坦布苏病毒以及其他黄病毒科成员进行同源性比对，并针对病毒NS5基因基于邻接法(neighbor-joiningmethod)构建系统进化树，计算遗传距离。
从GenBank下载参考序列的毒株(见表1)，从GenBank下载的NS5基因参考序列(见表2)
表1从GenBank下载的参考序列毒株及其缩写
表2从GenBank下载的NS5基因参考序列毒株及其缩写
本发明的有益效果：
刘胜旺、张玥、刘晓丽等在《东北农业大学学报》上发表过曾对分离自山东鸭场的病毒Du/CH/LSD/1101282株进行全基因组测序的研究，确证了病毒的基因信息属坦布苏病毒与巴格扎病毒亲缘关系较近，但遗传距离介于病毒种的水平上。但全基因扩增引物设计较为繁琐，且需多达10对引物的设计才最终对病毒进行了确证。
在本发明中，采用二代高通量测序，将样品核酸进行短片段文库制备，避免了常规试验中的细菌转化、培养以及单克隆的挑选，短时间即可获得大量数据，可快速注释病原体的全部遗传信息。
本发明针对提取的RNA样本首次采用等温链位移扩增技术，高效扩增了RNA类病毒样本的核酸序列，并成功构建高质量的核酸文库。SPIA是一个强健的等温链位移扩增过程。它用一个DNA/RNA嵌合SPIA引物，DNA引物和RNA酶抑制剂在一个同质的等温实验中可提供效率很高的DNA序列扩增过程。RNA酶抑制剂在DNA/RNA异源双链的第一链5’端习惯于降解RNA。DNA酶启动3’端的引物复制，置换了既有的上游链。新合成的链5’端RNA部分可再次被RNA酶抑制剂去除。遗弃的独特引物位点可提供新一轮的cDNA合成。整个SPIA过程由引物结合，DNA复制，第一链置换和RNA切割地等过程重复，可快速积累SPIAcDNA。
鸭坦布苏病毒基因组为单股正链RNA，含有一个开放阅读框，编码顺序为5’UTR-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR3’，国际上，通常以黄病毒NS5基因3’端长约1kb的区域同源性作为黄病毒属的病毒分类依据，且同源性在84％以上的分离株定义为同一种病毒。在本发明中，将测得的数据与其他黄病毒科成员进行同源性比对，发现全基因组的核苷酸同源性比对与近三年我国发生在鸭群中的坦布苏病毒在98％以上。选取其中的NS5基因进行核苷酸同源性比对，发现与坦布苏病毒在87％以上，证实该株病毒符合鸭坦布苏病毒特征，属黄病毒科、黄病毒属，蚊媒恩塔亚病毒群。
本发明建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序非诊断性检测方法，3小时以内即可完成病毒前处理，5小时内即可完成上级测序步骤，24小时以内即可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息，可针对细胞培养样品、鸭源组织样品、养殖环境样品等，样品覆盖度广，是一种鸭坦布苏病毒监控的有效新方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1：目标文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1：6.8pM标准品扩增曲线；2:0.68pM标准品扩增曲线；3:0.068pM标准品扩增曲线；TB：目标检测文库扩增曲线。
图2：IonTorrent测序仪读取序列数。
图3：序列搜索比对结果。
图4：QD株与其他GenBank已公布序列的核苷酸同源性比较。
图5：NS5基因核苷酸序列比对图。
具体实施方式
实施例1本发明的方法在病毒感染的细胞培养样品中坦布苏病毒的确认和生物分型上的应用实例
1材料和方法
1.1病料
病毒感染的细胞培养样品为青岛某公司送检，病毒分离未能确定病原，用常规PCR诊断方法亦未能确定。鸭胚成纤维细胞、BHK细胞由申请人实验室保存；
1.2分子生物学试剂
DNaseⅠ、RnaseA购自天根生物技术有限公司；XPReagent为Thermo公司产品；DneasyKit,RneasyMiniKit为QIAGen公司产品；OvationRNA-SeqSystemV2基因组扩增盒购自Nugen公司；IonShearTMPlusReagentKit、IonXpressTMBarcodeX、PCRSuperMix、LibraryAmplificationPrimerMix、IonLibraryqPCRMix试剂盒均为LifeTechnologies公司产品。
1.3主要仪器StepOnePLUS荧光PCR仪购自ABI公司。IonChefSystem核酸前处理仪，IonTorrent测序仪购自美国Thermo公司。
1.4.未知样品的处理
1.4.1样品处理：将细胞培养样品冰浴融化，组织样品研磨后离心，12000g离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤，此过程在超净工作台中完成。然后取滤液加入DNaseⅠ、RnaseA各1.5μL、10×DNaseⅠBuffer40μL，于37℃水浴3h，以降解样品中宿主游离核酸，然后置75℃水浴10min，灭活DNaseⅠ。
1.4.2DNA和RNA的提取：处理后的样品均分为两份，200μL样品用QIAGenDNA提取试剂盒提取DNA，另外200μL按RneasyMiniKit提取试剂盒操作步骤提取RNA。
1.4.3RNA样品的反转录等温链位移扩增每份病毒RNA样品溶解于5μL的RNase水，参照Nugen公司OvationRNA-SeqSystemV2基因组扩增试剂盒的使用说明加入试剂，SPIA等温链位移扩增的反应条件为：
SPIA等温链位移扩增反应条件
1.5核酸文库的制备上述样本全部扩增完毕后，用PCR纯化试剂盒进行纯化。分别取100ng纯化产物，用IonShearTMPlusReagentKit进行酶切打断5min，酶切产物加入1.8倍体积XPBeads纯化，然后分别加入不同的IonXpressTMBarcode接头，E-Gel胶选择片段(约400bp)构建文库。用PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryqPCRMix鉴定文库质量。
1.6IonTorrent测序取20μL终浓度为300ng/L的工作文库上机IonChefSystem进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机IontorrentPGM进行高通量测序。
1.7生物信息学分析上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据。将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列。选取GenBank中批量下载的黄病毒科全基因序列作为参考序列，将测序数据通过Blast比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应的病毒。
1.8系统进化分析与遗传距离计算将测得序列(暂定为QD株)，通过DNAstar、MEGA6.0软件的MegAlign模块，对病毒全基因组与GenBank中已发表的坦布苏病毒以及其他黄病毒科成员进行同源性比对，并针对病毒NS5基因基于邻接法(neighbor-joiningmethod)构建系统进化树，计算遗传距离。从GenBank下载参考序列的毒株(见表1)，从GenBank下载的NS5基因参考序列(见表2)
2结果
2.1核酸文库的鉴定分别取5μL100倍稀释后的扩增样本，使用IonLibraryqPCRMix荧光定量法进行浓度测定，标准品梯度稀释成6.8pM～0.068pM的标准品，每个梯度做两个平行，进行实时荧光RT-PCR检测，根据质粒拷贝数与Ct值的相关性，由SDS软件2.1得标准曲线为Y＝-3.305X+17.322相关度R2＝0.995，目标检测文库检测浓度为327pM。结果见图1。
2.2IonTorrent测序测得6.2M数据，3163352reads，匹配reads数为1725436(图2所示)。所测数据经软件自动拼接，同时在NCBI上进行Blast搜索，显示有48段序列涵盖坦布苏病毒全部全基因组序列，与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列，比对结果为100％(GenBank登录号为JF312912)(图3所示)。
2.3生物信息学分析
将本试验测得的坦布苏病毒QD株全基因序列与其他22株黄病毒科病毒进行同源性比对，发现该株病毒与黄病毒科中的黄热病毒(Yellowfevervirus)、登革热病毒(Denguevirus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheusvirus)、西尼罗病毒(WestNilevirus)、巴格扎病毒(Bagazavirus)、坦布苏病毒(Tembusuvirus)具有遗传进化关系，其中与近三年发生在我国的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近，达98％，与黄热病毒亲缘关系最远，结果见图4。
针对黄病毒的分类，在国际上，通常以黄病毒NS5基因3’端长约1kb的区域同源性作为病毒属的分类依据。据此，我们将本试验测得的NS5基因与其他黄病毒病毒进行核苷酸同源性比对，采用MEGA6.0中的Distance模块，VarianceEstimationMethod设置为Bootstrapmethod，1000次，核苷酸替换模型为P-distance，结果见图5。
实施例2、本发明的非诊断性检测方法检测不同类型样品
将建立的非诊断性检测方法检测不同地区，不同类型的禽类组织样品，并与常规病毒分离方法比较，评估该方法的灵敏度及特异性。
一、材料
1.SPIA扩增试剂盒，IonTorrent测序仪(实施例1)
2.送检病料来自河北、山东、北京等不同鸡群临床有发病表现疑似感染DTMUV的病、死鸭的组织样品53份。禽呼肠孤病毒(ARV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性贫血病毒(CAV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭病毒性肝炎病毒(DVH)细胞培养样品7份等均由山东出入境检验检疫局动检科保存。
3.SPF鸭胚：购自山东省农科院家禽研究所。
二、检测鸭坦布苏病毒的特异性试验方法
利用本研究建立的二代测序非诊断性检测方法对不同病料组织样品进行测定，对所有实验室保存的其他病毒细胞培养样品ARV、IBV、ILTV、CAV、IBDV、DEV、DVH进行检测，确定宏基因组学测序方法的特异性。
三、结果
1.病毒分离鉴定结果
病毒分离的鉴定结果见表3。由表1可知，在总计53份样品中，有15份样品在接种鸭胚CEF共计7日后经鉴定为阳性，病毒分离阳性率为28.3％。
表3病毒分离IFA鉴定结果
样品编号 结果 样品编号 结果 样品编号 结果 样品编号 结果
样品1 - 样品17 + 样品33 - 样品49 +
样品2 + 样品18 + 样品34 - 样品50 -
样品3 - 样品19 - 样品35 + 样品51 -
样品4 - 样品20 - 样品36 - 样品52 +
样品5 - 样品21 - 样品37 - 样品53 +
样品6 + 样品22 + 样品38 -
样品7 - 样品23 - 样品39 -
样品8 + 样品24 - 样品40 -
样品9 - 样品25 + 样品41 -
样品10 - 样品26 - 样品42 +
样品11 + 样品27 - 样品43 -
样品12 - 样品28 - 样品44 -
样品13 - 样品29 + 样品45 +
样品14 - 样品30 - 样品46 -
样品15 - 样品31 - 样品47 -
样品16 - 样品32 - 样品48 -
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
3.2宏基因组学测序鉴定结果由表4可知，在总计53份样品中，有15份样品经SPIA扩增后在测序鉴定中为阳性，阳性率为28.3％，与病毒分离鉴定吻合率为100％。
表4宏基因组测序鉴定结果
样品编号 结果 样品编号 结果 样品编号 结果 样品编号 结果
样品1 - 样品17 + 样品33 - 样品49 +
样品2 + 样品18 + 样品34 - 样品50 -
样品3 - 样品19 - 样品35 + 样品51 -
样品4 - 样品20 - 样品36 - 样品52 +
样品5 - 样品21 - 样品37 - 样品53 +
样品6 + 样品22 + 样品38 -
样品7 - 样品23 - 样品39 -
样品8 + 样品24 - 样品40 -
样品9 - 样品25 + 样品41 -
样品10 - 样品26 - 样品42 +
样品11 + 样品27 - 样品43 -
样品12 - 样品28 - 样品44 -
样品13 - 样品29 + 样品45 +
样品14 - 样品30 - 样品46 -
样品15 - 样品31 - 样品47 -
样品16 - 样品32 - 样品48 -
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2.检测其他常见的不同病毒的细胞培养样品结果，见下表5
表5.基于宏基因组学的二代测序见常见禽类病毒的特异性
从表5中可以看出，建立的二代测序非诊断性检测方法在检测常见禽类病毒时无交叉反应，与NCBI测序数据比对均在90％以上，说明此方法病毒覆盖面广，所设计的实验流程科学有效。

Claims (1)

1.基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）样品处理：
将细胞培养样品冰浴融化，组织样品研磨后离心，12000g离心5min，取上清用0.22μm滤膜过滤，此过程在超净工作台中完成；然后取滤液加入DNaseⅠ、RnaseA各1.5μL、10×DNaseⅠBuffer40μL，于37℃水浴3h，以降解样品中宿主游离核酸，然后置75℃水浴10min，灭活DNaseⅠ；
（2）DNA和RNA的提取：
处理后的样品均分为两份，200μL样品用QIAGenDNA提取试剂盒提取DNA，另外200μL按RneasyMiniKit提取试剂盒操作步骤提取RNA；
（3）RNA样品的反转录等温链位移扩增
每份病毒RNA样品溶解于5μL的RNase水，用OvationRNA-SeqSystemV2基因组扩增试剂盒进行扩增，等温链位移扩增的反应条件为：
（4）核酸文库的制备
上述样本全部扩增完毕后，用PCR纯化试剂盒进行纯化；分别取100ng纯化产物，用IonShearTMPlusReagentKit进行酶切打断5min，酶切产物加入1.8倍体积AMPure?XPBeads纯化，然后分别加入不同的IonXpressTMBarcode接头，E-Gel胶选择片段构建文库；用Platimun?PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryTaqMan?qPCRMix鉴定文库质量；
（5）IonTorrent测序
取20μL终浓度为300ng/L的工作文库上机IonChefSystem进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314芯片中，上机IontorrentPGM进行高通量测序；
（6）生物信息学分析
上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件fastq格式的测序序列数据；将fastq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序列及错误序列；选取GenBank中批量下载的黄病毒科全基因序列作为参考序列，将测序数据通过Blast比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例以及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应的病毒；
（7）系统进化分析与遗传距离计算
将测得序列通过DNAstar、MEGA6.0软件的MegAlign模块，对病毒全基因组与GenBank中已发表的坦布苏病毒以及其他黄病毒科成员进行同源性比对，并针对病毒NS5基因基于邻接法（neighbor-joiningmethod）构建系统进化树，计算遗传距离。
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