CN106701936A - 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 - Google Patents
乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106701936A CN106701936A CN201611184603.7A CN201611184603A CN106701936A CN 106701936 A CN106701936 A CN 106701936A CN 201611184603 A CN201611184603 A CN 201611184603A CN 106701936 A CN106701936 A CN 106701936A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- artificial sequence
- round pcr
- pcr amplification
- wheel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
本发明公开一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法；试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；第一轮PCR引物包括46对引物SEQ1‑SEQ92和67对引物SEQ93‑SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；本发明公开了的检测试剂盒及方法，引物组合共包含113对引物，覆盖了乳腺癌易感基因的全部编码序列及邻近至少±5bp内含子区域。本发明采用NGS技术对乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2基因全编码序列和剪切位点的突变进行检测，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法。
背景技术
乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。BRCA1和BRCA2是目前研究较为普遍与乳腺癌和卵巢癌发生有密切关联的两个易感基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。研究表明，约2％-6％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1和BRCA2基因突变。BRCA1和BRCA2这两个基因的突变状态与家族性乳腺癌、卵巢癌的发病关系十分密切。与无突变者/普通人群相比，携带BRCA1和BRCA2基因突变的个体发展成为乳腺癌和卵巢癌的患病风险和复发风险均显著增加。携带有BRCA1和BRCA2基因突变的女性在其一生中最高有87％的可能性发生乳腺癌，有87％的可能性发生乳腺癌。BRCA1和BRCA2有害突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤和前列腺癌等其它风险。因此，对乳腺癌/卵巢癌高风险人群进行BRCA1和BRCA2基因检测很有必要。据乳腺癌信息中心(Breast Cancer Information Core,BIC)报道：BRCA1、BRCA2的基因突变已达3000多种，这些突变分布于整个编码区。最常见的致病突变为移码突变、无义突变等，没有明显的突变热点。大多数突变导致截短蛋白的生成，使得BRCA1、BRCA2蛋白质正常功能的丧失，从而导致肿瘤发生。
随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测，主要包括Sanger测序、高分辨熔点曲线分析等。而随着新一代测序(NGS)技术的发展，其在BRCA1和BRCA2基因突变检测领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变筛查中，NGS技术凭借着高通量、灵敏、全覆盖等优点显示出其临床检测的优越性。
传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1和BRCA2基因突变的主要检测手段。从检测灵敏度上讲，Sanger测序一般只能检测20％以上突变率的变异，对BRCA1和BRCA2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样品检测费用也较高。另外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis,HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。
发明内容
本发明的发明目的在于提供乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法，以提高对腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测的准确度。
本发明实施例第一方面示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物；
所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；
所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226；每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228；
所述SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；
所述SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
进一步，所述第二轮PCR引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条Index1-Index12。
本发明实施例第二方面一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法，包括：
配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
取样本加入到所述第一轮PCR试剂中，进行第一轮PCR扩增，设置第一轮PCR扩增程序参数，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；
将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物进行第二轮多重PCR扩增，设置第二轮多重PCR扩增程序参数，进行第二轮多重PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物；
将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。
进一步，所述第一轮PCR扩增程序参数为：
预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；
变性，变性的温度为95℃，时间为30s；
退火，退火的温度为60℃，时间为30s；
第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为60s；
第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。
进一步，所述第二轮多重PCR扩增程序参数为：
预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；
变性，变性的温度为95℃，时间为20s；
退火，退火的温度为60℃，时间为30s；
第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为40s；
第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。
进一步，将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物的步骤包括：
采用AMPure beads XP纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与第一轮PCR扩增产物1:1混合，得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；
所述磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。
进一步，所述将第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物；
采用AMPure beads XP纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与纯化后的第一轮PCR扩增产物1:1混合；得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；
将磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物20μl。
进一步，所述加乙醇清洗，所述乙醇的体积180μl，所述清洗的次数为两次。
进一步，所述乙醇的浓度为70％。
进一步,所述乙醇的浓度为75％。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法；检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA1引物SEQ93-SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。本发明公开了一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法，所述引物组合共包含113对引物，覆盖了乳腺癌易感基因的全部编码序列及邻近至少±5bp内含子区域。本发明采用NGS技术对乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2基因全编码序列和剪切位点的突变进行检测，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效、成本较低；有利于遗传性乳腺癌的风险评估，对于乳腺癌的筛查、早期发现或预测有重要意义；同时，可为针对BRCA1和BRCA2突变的靶向用药提供基因检测支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1根据一优选实施例示出的一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的基因检测方法；
图2为一批样品的BRCA1基因外显子序列进行多重PCR扩增建库后测序得到的46个扩增子深度分布示意图；
图3为一批样品的BRCA2基因外显子序列进行多重PCR扩增建库后测序得到的67个扩增子深度分布示意图；
图4为BRCA1和BRCA2基因第一轮PCR后pooling中113个扩增子产物均一性示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；
所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；
所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；
SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；
SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
所述第二轮引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条。
一种检测乳腺癌易感基因是否产生突变的多重PCR试剂盒，包括：113对PCR捕获扩增引物、引物对之间的组合情况。
一种用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2全外显子编码序列及邻近±5bp内含子序列的PCR引物，包括113对扩增引物。每对所述扩增引物对的正向引物与反向引物中的所述特异性扩增序列分别为SEQ ID NO.2n-1与SEQ ID NO.2n，其中n为1、2、3...113，参见下表。
每对扩增引物对的正向引物与反向引物序列均包括特异性扩增序列及与特异性序列5’端连接的接头序列。正向引物包含的接头序列为SEQ227：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，反向引物包含的接头序列为SEQ228：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
第二轮引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条，参见下表。
本发明第二方面示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法，如图1所示，所述方法包括：
S101配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
S102取样本加入到所述第一轮PCR试剂中，进行第一轮PCR扩增，设置第一轮PCR扩增程序参数，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
S103将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；
S104将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物加入到所述第二轮PCR试剂中，进行第二轮多重PCR扩增，设置第二轮多重PCR扩增程序参数，进行第二轮多重PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物；
S105将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。
具体的，1.1按下表进行第一轮PCR试剂配置：
1.2按下表进行第二轮PCR试剂配置：
1.3将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2样本处理(在样本处理区进行)：
2.1使用商业化核酸提取试剂盒(可使用天根石蜡基因组DNA提取试剂盒，天根全血基因组DNA提取试剂盒等)提取DNA。
2.2取样本2ul(50-100ng)加入到第一轮PCR试剂中，盖好管盖。
3.第一轮PCR扩增(在扩增1区进行)(请参照各仪器使用说明书进行设置)第一轮PCR扩增程序参数：
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
4.pooing和纯化
4.1将第一轮PCR扩增产物，按照不同的样本类型，以1/1比例混合,第7组按4倍体积，进行第二轮多重PCR扩增4.2pooling后纯化。
将磁珠溶液从4℃冰箱取出，室温平衡约30min；
使用AMPure beads XP磁珠纯化，磁珠/样本比例1/1，目的是去除小片段核酸(200bp以下片段)如引物二聚体等；
按照1/1的比例把混库后的第一轮PCR扩增产物和磁珠混匀；
静置10min，瞬时离心，上磁架；
约3min后，吸走液体；
加180μl 70％(或75％)乙醇洗两遍，可不重悬，吸走废液；
用20μl水洗脱，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物220μl，用作下一步测序接头扩增的模板。
5.第二轮多重PCR扩增(在扩增1区进行)(请参照各仪器使用说明书进行设置)取上一步纯化后的第一轮PCR扩增产物2ul,加入到第二轮多重PCR试剂中,盖好盖子后混匀.按照下表进行循环参数设定：
6.第二轮多重PCR扩增后纯化；
将磁珠溶液从4℃冰箱取出，室温平衡约30min；
使用AMPure beads XP磁珠纯化，磁珠/纯化后的第一轮PCR扩增产物比例1/1，目的是去除小片段核酸(200bp以下片段)如引物二聚体等；
按照1/1的比例把混库后的磁珠和纯化后的第一轮PCR扩增产物混匀；
静置10min，瞬时离心，上磁架；
约3min后，吸走液体；
加180μl 70％或75％乙醇洗两遍，可不重悬，吸走废液；
用20水洗脱，得到磁珠/纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl；
7.文库质检：
7.1使用QUBIT或QPCR检测文库的浓度，文库浓度大于10ng/ul；
7.2使用caliper或Agilent 2100进行片段分布检测，片段大小在300-600bp之间。
结果分析：
实施例一：
本发明的方法和试剂盒已用于检测313例乳腺癌患者组织、128例乳腺癌患者外周血样本和46例卵巢癌患者外周血BRCA基因突变情况实验结果。实验结果表明441例乳腺癌样品检测出23例BRCA有害突变，46例卵巢癌样品检出16例BRCA有害突变，突变结果经过Sanger验证准确率100％。
实施例二：
MiSeq测序软件根据提供的Index标签序列信息，将测序数据拆分到对应的样品。然后，使用测序领域常用的比对程序BWA软件，将每个样品的测序序列比对到人类参考基因组，并根据比对上基因组的测序序列进行目标区域(即BRCA1和BRCA2全部编码序列)覆盖率及多重PCR引物均一性评估，结果如图2和3所示。(1-平均值，2-最小值，3-最大值，4-1/5平均测序深度)96个样本平均reads量在4.5-6.1万条之间，扩增子平均深度为430X，目标区域覆盖率为100％，扩增子测序深度不低于1/5平均测序深度(86X)的覆盖率为100％。另外，也可在试验阶段第一轮多重PCR混pool后对个扩增子片段进行RT-PCR定量分析，评估扩增子的均一性，参见图4这些扩增子深度分布数据统计表明本实例所设计并优化的多重引物组合是非常高效合理的，实现了扩增子间扩增效率差异小，有效节省单个样品所需总数据量，大大提高单次测序所能检测的样品数。另外，对于比对到人基因组中BRCA1和BRCA2编码序列的测序数据进行突变分析，所使用突变分析注释软件为samtools、GATK、ANNOVAR进行分析，表明本发明方法及试剂盒可以用于乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1和BRCA2全编码序列的突变检测。
由以上技术方案可知，本发明实施例示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法；检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。本发明公开了一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法，所述引物组合共包含113对引物，覆盖了乳腺癌易感基因的全部编码序列及邻近至少±5bp内含子区域。本发明采用NGS技术对乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2基因全编码序列和剪切位点的突变进行检测，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效、成本较低；有利于遗传性乳腺癌的风险评估，对于乳腺癌的筛查、早期发现或预测有重要意义；同时，可为针对BRCA1和BRCA2突变的靶向用药提供基因检测支持。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南圣维基因科技有限公司
<120> 乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法
<130> HP163638CS
<160> 241
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggtcaattc tgttcattt 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaagttgtc attttataaa cct 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttctcagttc ctgacacag 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggagccaca taacacattc a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcttaaggg cagttgtgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcctactgtg gttgcttcca 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaggttgat aatcacttgc tga 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctgagttt tcatggacag 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaagaagaa gaagaagaag aaaa 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggtttctct tggtttcttt g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaggaaaag cacagaact 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcacttccca aagctgccta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acctgccaca gtagatgctc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
accagcttca tagacaaagg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
attggtcagc tttctgtaat c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cccactctct tttcagtgcc 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatagccagt tggttgattt cca 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtgagtaata aactgctgtt ct 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaacaccact gagaagcgtg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acacagggga tcagcattc 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acatcagcta ctttggcatt t 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cggactccca gcacagaaaa 20
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgatgaactg ttaggttctg atga 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcttaagttg gggaggcttg 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
actgttaggt tctgatgact cac 23
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gggacgctct tgtattatct gtggctc 27
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gcaagcctcc ccaacttaag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cacttgacca ttctgctccg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aagcctcccc aacttaagcc 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttcgagtgat tctattgggt tag 23
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gcagaatggt caagtgatga 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tgctagaaca actatcaatt t 21
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgctttcaaa acgaaagc 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tttctgctgt gcctgactgg 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gcaaattgat agttgttcta gca 23
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aagttcactg gtatttgaac actta 25
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cctgcaactg gagccaag 18
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
agtgccataa tcagtacca 19
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tactaagtgt tcaaatacca gtgaactt 28
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggggttttca aatgctgcac 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acctggtact gattatggca c 21
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
caagttcact ttcttccatt tctatg 26
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gtgcagcatt tgaaaacccc 20
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ttcctcttct gcatttcctg gatt 24
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aagcatagaa atggaagaaa gt 22
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
accaaccaca ggaaagcc 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
atccaggaaa tgcagaag 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gatagacaaa acctagag 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atcactgcag gctttcct 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
attgtgctca ctgtactt 18
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gaggctctag gttttgtcta tcat 24
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
tcattagtac tggaacctac ttcatt 26
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
attccaagta cagtgagca 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tagacctcag gttgcaaaac 20
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tcaagcaata ttaatgaagt aggttc 26
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tacttcccat aggctgtt 18
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gttttgcaac ctgaggtcta taa 23
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
aggactcctg ctaagctctc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
taaggaaagt tctgctgttt 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
cctggttact gcagtcattt 20
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tctcagtcta ctaggcata 19
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ccaactccct ggctttcaga 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cttaaatgac tgcagtaacc ag 22
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
tggggcaaac acaaaaacct 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
atccagtcct gccaatgaga 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
atgcaaagga caccacacac 20
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
agctaggtcc ttactcttca g 21
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tcatttaatg gaaagcttct ca 22
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
tcagaacaaa gcagtaaagt agattt 26
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
gatgtcagat accacagcat ct 22
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
attggtggcg atggttttct 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
agtgtttgtt ccaatacagc 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
ttcaacattc atcgttgtgt a 21
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
tctggcttct ccctgctcac 20
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
acctacataa aactctttcc agaatg 26
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
cctctgcatt gaaagttccc ca 22
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
tcactttaaa tagttccagg acac 24
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
cctcgcctca tgtggtttta 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ctgattctgt caccaggggt 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gtgttaaagg gaggagggga 20
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
aaagagcacg ttcttctgc 19
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
agtggtgcat tgatggaagg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tgacgtgtct gctccacttc 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tgtcaacttg agggagggag 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gcagcagaaa tcatcaggtg 20
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
cactatgtaa gacaaaggct g 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
ggcctgggtt aagtatgcag 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
ccagtcttgc tcacaggaga 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gctctttcct tcctggggat 20
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
aaatgtgcca agaactgt 18
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gaactcatac aaccaggacc 20
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tgtggctctg tacctgtgg 19
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
cctgtgtaag tgcattttg 19
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
aggaacagtt tatggttcta a 21
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
ttccttatga tctttaactg ttc 23
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
agtcagccct tgctctttga 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
ttcttcagaa gctccaccct 20
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
acacaggttt gcctaaat 18
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
tctcattccc agtatagagg 20
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
ctcttagcca aaatattagc ata 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
cctaagggat ttgctttgtt tta 23
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
atctcagggc aaaggtataa c 21
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
acaggcaatt cagtaaacgt 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
acctcatctg ctctttcttg 20
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
tcactgtgtt gattgacctt t 21
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
agcaatttca acagtctaat caat 24
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
aagtgaaacc atggataag 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
gagcaagact ccacctcaaa 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
tctatgagaa aggttgtgag a 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
ttcacattca tcagcgtttg 20
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
tgccaaatgt cctagaagat ga 22
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
aggccaaaga cggtacaact t 21
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
ctcatttgta tctgaagtgg aacc 24
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
gtaggctaga aatacgtggc 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
ttgtaccgtc tttggcctgt 20
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
atgagattca agatgctgct c 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
ctttgccacg tatttctagc 20
<210> 118
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tgacctgaaa aacttgcat 19
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
ggaacttctc cagtggcttc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
acctgcattc ttcaaagcta 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
agctggccag ccaccaccac 20
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
aacacagaag gaatcgtcat c 21
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
tggtacttta attttgtcac tttgtg 26
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
tgctttttgg atcattttca ca 22
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
tctcaggatc ttgattataa agaag 25
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ggagttaaaa taagagtgct g 21
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
aaagaagagg tcttggctgc 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
tggcaacagc tcaacgtttt 20
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
tcccatggaa aagaatcaag atg 23
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
tcctttcatt agctacttgg aagac 25
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
actgtcaatc cagactctga ag 22
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
tgtccgattt taaatcttga cctag 25
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
aaacagactt gacttgtgta aa 22
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
gaagctacct ccaaaactgt g 21
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
tctaggtcaa gatttaaaat cggac 25
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
tttcaacaca agctaaacta gtagg 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
tgaacataac attaagaaga gcaaa 25
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
tcaaactgac ttcctgattc 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
cacctagcca aaaggcagaa 20
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
tgctgctgtc tacctgacc 19
<210> 141
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
agtcagtttg aatttactca gtttag 26
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
catgagcaga ataaaagccc cta 23
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
tgtaacaaaa gtgcttctgg t 21
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
gaaacaacag aatcatgaca ttt 23
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
acttctgcag aggtacatcc 20
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
atcattttta cttgaatcac tgc 23
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
agataacaaa tatactgctg 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
accatgacat gcttcttgag 20
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
ttatctggcc agtttatgaa gga 23
<210> 150
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
caattcttct ggtttctgat caaag 25
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
tgtcatggta atacttcaaa taa 23
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
tgtctgtttc ctcataactt 20
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
accagaagaa ttgcataact ttt 23
<210> 154
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
aaaactggtg atttcactag tacctt 26
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
cagttggtac tggaaatcaa ctag 24
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
ctttggggca gctgtgatc 19
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
atgggcaaag accctaaagt 20
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
aggctgaatt ttcaatgact gaa 23
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
gatcacagct gccccaaag 19
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
ttcaagtaat gaagtctgac tca 23
<210> 161
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
agtcattgaa aattcagcct ta 22
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
catcagaatg gtaggaatag ctg 23
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tcaaccagaa agaataaata ctgc 24
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
tggatattac tttggaaaaa ctagt 25
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
tgagccagta ttgaagaatg tt 22
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
tgtgaaacac aaacgatttt acc 23
<210> 167
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
tgaggaactt gtgactagc 19
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
acaacctgcc ataattttcg t 21
<210> 169
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
tcagtaaagt aattaaggaa aacaa 25
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
tgtaatgaag catctgatac c 21
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
agtctcatct gcaaatactt gtg 23
<210> 172
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
tacttttaaa caatactttg gaaaagactt g 31
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
tcagatgctt cattacaaaa cgc 23
<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
ggaactttct aaaatggaaa cttgc 25
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
gcaagtcttt tccaaagtat tgtttaaaag 30
<210> 176
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
aggaagtatt tttgatacat tttgtctag 29
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
agggagtgtt agaggaattt gat 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
tcttttccca aaacatgaat gtt 23
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
aacaacagtt ggtattagga 20
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
tggcagttta gaatctgtca 20
<210> 181
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
gcttcaccta aaaacgtaaa aatgg 25
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
ggcaacacga aaggtaaaaa t 21
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
tgagaaataa aactgatatt atttg 25
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
ctttgagagg caggtggatc 20
<210> 185
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
acattcactg aaaattgtaa agcct 25
<210> 186
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
agtgttaact tcttaacgtt agtgt 25
<210> 187
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
agcaaatgag ggtctgcaa 19
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
ggtctgcctg tagtaatcaa gt 22
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
tttaccgcac ctggtcaaga 20
<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
tcagagccat gtccatcaat gtt 23
<210> 191
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
agttgaacag tgtgttagga atatta 26
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
caccaaaggg ggaaaaccat 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 193
gccaggggtt gtgcttttta 20
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
tgtcataaaa gccatcagta ttgt 24
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
gtgtgataca tgtttacttt aaat 24
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 196
gaagaaagag ggatgaggga 20
<210> 197
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
tgtagttgtt gaattcagta tcatc 25
<210> 198
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
gtcacagact acacagaaac ct 22
<210> 199
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
tggaattcta gagtcacact tcct 24
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
atcaggagag cccaccagt 19
<210> 201
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
ccagttagat cctcccctc 19
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
acctcccaaa aactgcacaa 20
<210> 203
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
tcaatatatt tattaatttg tccagatt 28
<210> 204
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
gaaccaagat cacgccatt 19
<210> 205
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
gtgcctggcc tgatacaat 19
<210> 206
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
ctgtcccttg ttgctattct tt 22
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 207
atctcccttc tttgggtgtt 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 208
tcctgtgatg gccagagagt 20
<210> 209
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 209
tgttctgatt gctttttatt ccaata 26
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 210
tggatttata atcattttgt tagtaaggtc 30
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 211
tcacttcttc cattgcatct ttc 23
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 212
tggagattcc ataaactaac aag 23
<210> 213
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 213
aagtgcttgt tagtttatgg aatctc 26
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 214
atttgccaac tggtagctcc 20
<210> 215
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 215
tcctttcttg catcttaaaa ttc 23
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 216
aaataccaaa atgtgtggtg 20
<210> 217
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 217
gtccaaactt ttcatttctg ct 22
<210> 218
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 218
ggcctccata tatacttctt ataatat 27
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 219
aggagttagg ggagggagac 20
<210> 220
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 220
tctctttttg cagttctttt g 21
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 221
cttcaaagtc ttgtaaaggg gag 23
<210> 222
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 222
gaatttttta aatggagtca tctg 24
<210> 223
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 223
catttcagcc accaaggag 19
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 224
ttctgaactg gtgggagca 19
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 225
cccaagctct tttgtctggt 20
<210> 226
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 226
aacataagta ctaatgtgtg gtttgaa 27
<210> 227
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 227
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 228
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 228
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 229
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 229
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 230
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 230
caagcagaag acggcatacg agatgtatcg tcgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 231
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 231
caagcagaag acggcatacg agatgtgtat gcgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 232
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 232
caagcagaag acggcatacg agattgctcg tagtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 233
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 233
caagcagaag acggcatacg agatgtcgtc gtctgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 234
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 234
caagcagaag acggcatacg agatgtgcgt gtgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 235
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 235
caagcagaag acggcatacg agatgcgtcg tgtagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 236
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 236
caagcagaag acggcatacg agatgtcgtg tactgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 237
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 237
caagcagaag acggcatacg agatgatgta gcgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 238
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 238
caagcagaag acggcatacg agatgagtga tcgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 239
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 239
caagcagaag acggcatacg agatcgctat cagtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 240
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 240
caagcagaag acggcatacg agatcgctgt agtcgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 241
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 241
caagcagaag acggcatacg agatgctagt gagtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
Claims (10)
1.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物；
所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；
所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226；每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228；
所述SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；
所述SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二轮PCR引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条Index1-Index12。
3.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法，其特征在于，包括：
配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；
取样本加入到所述第一轮PCR试剂中，进行第一轮PCR扩增，设置第一轮PCR扩增程序参数，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；
将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物加入到所述第二轮PCR试剂中，进行第二轮多重PCR扩增，设置第二轮多重PCR扩增程序参数，进行第二轮多重PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物；
将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增程序参数为：
预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；
变性，变性的温度为95℃，时间为30s；
退火，退火的温度为60℃，时间为30s；
第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为60s；
第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。
5.根据权利要求3所述的法，其特征在于，所述第二轮多重PCR扩增程序参数为：
预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；
变性，变性的温度为95℃，时间为20s；
退火，退火的温度为60℃，时间为30s；
第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为40s；
第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物的步骤包括：
纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与所述第一轮PCR扩增产物1:1混合，得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；
所述磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物；
纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与纯化后的第一轮PCR扩增产物1:1混合；得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；
将磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到磁珠/纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。
8.根据权利要求6或7任一项所述的方法，其特征在于，所述加乙醇清洗，所述乙醇的体积180μl，所述清洗的次数为两次。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乙醇的浓度为70％。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于,所述乙醇的浓度为75％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611184603.7A CN106701936A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611184603.7A CN106701936A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106701936A true CN106701936A (zh) | 2017-05-24 |
Family
ID=58939346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611184603.7A Pending CN106701936A (zh) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106701936A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624686A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-10-09 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒 |
| CN109402257A (zh) * | 2018-11-03 | 2019-03-01 | 杭州链康医学检验实验室有限公司 | 一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 |
| CN109666740A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-04-23 | 四川新开源健坤医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因的快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110241212A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-17 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用 |
| CN111269980A (zh) * | 2020-02-11 | 2020-06-12 | 圣湘生物科技股份有限公司 | Brca1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105200154A (zh) * | 2015-11-02 | 2015-12-30 | 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 | Brca1和brca2基因突变的多重pcr检测方法和试剂盒 |
| CN105586427A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-05-18 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法 |
| CN105779636A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-20 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用 |
| CN106191269A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 通用型brca1基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191272A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 通用型brca2基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191268A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 专用型brca1基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191271A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 专用型brca2基因多重pcr建库试剂盒 |
-
2016
- 2016-12-20 CN CN201611184603.7A patent/CN106701936A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105200154A (zh) * | 2015-11-02 | 2015-12-30 | 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 | Brca1和brca2基因突变的多重pcr检测方法和试剂盒 |
| CN105586427A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-05-18 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法 |
| CN105779636A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-20 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 用于扩增人乳腺癌易感基因brca1和brca2编码序列的pcr引物及应用 |
| CN106191269A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 通用型brca1基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191272A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 通用型brca2基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191268A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 专用型brca1基因多重pcr建库试剂盒 |
| CN106191271A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 上海产业技术研究院 | 专用型brca2基因多重pcr建库试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YOUNG MIN KWON等: "《High-Throughput Next Generation Sequencing Methods and Applications》", 31 December 2011, HUMANA PRESS * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624686A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-10-09 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒 |
| CN108624686B (zh) * | 2018-03-30 | 2019-06-04 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种检测brca1/2突变的探针库、检测方法和试剂盒 |
| CN109666740A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-04-23 | 四川新开源健坤医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因的快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN109402257A (zh) * | 2018-11-03 | 2019-03-01 | 杭州链康医学检验实验室有限公司 | 一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 |
| CN109402257B (zh) * | 2018-11-03 | 2023-06-23 | 杭州链康医学检验实验室有限公司 | 一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 |
| CN110241212A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-09-17 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用 |
| CN110241212B (zh) * | 2019-06-25 | 2023-08-01 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用 |
| CN111269980A (zh) * | 2020-02-11 | 2020-06-12 | 圣湘生物科技股份有限公司 | Brca1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法 |
| CN111269980B (zh) * | 2020-02-11 | 2023-06-16 | 圣湘生物科技股份有限公司 | Brca1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106701936A (zh) | 乳腺癌易感基因brca1和brca2检测试剂盒及方法 | |
| CN106283199B (zh) | 检测肿瘤相关的50个热点突变基因的捕获文库和试剂盒 | |
| CN109402257B (zh) | 一种用于人类brca1和brca2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒 | |
| CN105368930B (zh) | 测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法 | |
| CN108753954B (zh) | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 | |
| CN105734679B (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
| CN109609635B (zh) | 多基因富集的探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法 | |
| CN106554955B (zh) | 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途 | |
| WO2021139783A1 (zh) | 一次性检测肺癌多重基因突变的试剂盒 | |
| CN110853708B (zh) | 用于hla分型的核酸捕获探针的设计方法 | |
| CN110079592A (zh) | 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 | |
| CN106757379A (zh) | 肺癌多基因变异文库构建方法 | |
| CN111647654A (zh) | 用于检测血色病及肝豆状核变性易感基因突变的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| WO2019076018A1 (zh) | 一种用于检测目的基因低频突变的扩增子文库的构建方法 | |
| CN107312770A (zh) | 一种用于高通量测序检测的肿瘤brca1/2基因变异文库的构建方法及其应用 | |
| CN107557461B (zh) | 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法 | |
| CN108060227A (zh) | 一种检测pah基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 | |
| CN105803054A (zh) | 试剂盒及其在检测唇腭裂相关基因中的用途 | |
| CN110157808A (zh) | 一种与喉鳞癌发生发展相关的非编码rna的应用 | |
| CN102140509B (zh) | 一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法 | |
| CN111748628B (zh) | 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 | |
| AU2019453690B2 (en) | Method for preparing nested multiplex PCR high-throughput sequencing library and kit | |
| CN110714077B (zh) | 同时检测brca1/2外显子序列和化疗用药位点的引物及应用 | |
| CN110452958A (zh) | 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用 | |
| CN113234822A (zh) | 一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 410205 Changsha province high and New Technology Industrial Development Zone, Lu Pine Road, No. 680, Hunan Applicant after: Shengxiang Biotechnology Co., Ltd Address before: 410205 Changsha province high and New Technology Industrial Development Zone, Lu Pine Road, No. 680, Hunan Applicant before: Sansure Biotech Inc. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170524 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |