CN106191268A - 专用型brca1基因多重pcr建库试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及专用型BRCA1基因多重PCR建库试剂盒。具体而言,本发明提供一种引物产品,所述产品中的引物包括SEQ ID NO:1-70所示的引物序列。本发明还提供一种多核苷酸序列产品,该产品中的每一种多核苷酸序列分别含有悬挂接头序列和SEQ ID NO:1-70任一所示的引物序列。还提供了相应的试剂盒及BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查方法。
Description
技术领域
本发明属于BRCA1基因突变体检测领域,具体涉及专用型BRCA1基因多重PCR建库试剂盒。
背景技术
乳腺癌是世界女性最常见的恶性肿瘤之一,占女性癌症发病总数的23%,占女性癌症死亡人数的14%。乳腺癌转移复发是患者重要的致死原因,转移后中位生存时间不足2年。在我国,近年来乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。从90年代以来,中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多,城市地区尤为显著。以北京和上海为例,乳腺癌已经连续20年位于女性恶性肿瘤第一位,现在年发病率已达到40/10万以上,并且每年仍以2-3%的速度上升,有逐步接近欧美发达国家水平的趋势。另外,与欧美发达国家女性相比,中国乳腺癌患者绝经前患者占一半以上(欧美不足30%),并且发病年龄高峰较西方女性早5到10年。由于这个年龄段的女性是家庭和社会的中坚力量,进一步突显了乳腺癌对我国社会和家庭带来的巨大危害。同时,上海是中国人口最多的城市,也是乳腺癌发病率最高的城市之一,海市乳腺癌发病趋势代表了未来20年中国城市化进程中的疾病趋势。
乳腺癌的致病原因至今没有完全了解。乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史、较晚的月经初潮年龄、较高的精神压力、较高的身体质量指数(Body Mass Index,BMI)及肿瘤家族史等被认为是罹患乳腺癌的重要诱因。乳腺癌的病因从遗传角度而言也有了较多的突破,BRCA1,BRCA2,TP53,PTEN,STK11/LKB1,CDH1,CHEK2,ATM,MLH1,MSH2等一系列乳腺癌易感基因的突变也被证明与乳腺癌相关。现有研究已经明确证实BRCA1和BRCA2基因的胚系突变与遗传性乳腺癌的发生与密切相关。遗传性乳腺癌约占所有乳腺癌5%-10%左右,其发病年龄相对年轻;30岁以下的年轻乳腺癌患者中约25-35%有乳腺癌易感基因的突变。更重要的是,携带BRCA1/2基因突变的妇女,其一生中患乳腺癌、卵巢癌累计危险随年龄增长而增高,BRCA1/2突变携带者到80岁时发生乳腺癌的预测累积风险均超过80%;而普通人群一生患乳腺癌危险度为14%左右,亦即BRCA1/2基因的突变让妇女罹患乳腺癌的风险升高了5倍以上。
BRCA1/2的功能研究提示其属于抑癌基因,在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。在外界因素的干扰下,抑癌基因发生突变后,细胞的生长失去正常调控从而导致肿瘤的发生。BRCA1/2基因的任何有害突变都可导致较高的乳腺癌和卵巢癌终身风险,同时还会增加一系列其他肿瘤发生的风险。BRCA1/2突变基因携带者终身罹患乳腺癌的累积风险为80%。由此可见,对乳腺癌高危人群进行BRCA1/2基因突变检测,对于早期发现遗传性乳腺癌,尤其是对于恶性程度高、预后相对差的三阴性乳腺癌具有重要意义。通过了解合适患者的BRCA1/2状态有助于评估其癌症的终身风险,并采取可成功降低患病风险的伴随措施,比如建议大多数携带者接受乳腺癌和卵巢癌预防性手术和增加乳腺定期检查次数。
BRCA1/2基因突变检测另一个重要的应用在于为乳腺癌患者使用新一代PARP抑制剂类抗肿瘤新药提供疗效预测。BRCA1/2基因突变显著增加了妇女罹患乳腺癌和卵巢癌的风险,原因是这些突变会致使某些蛋白无效,无法修复造成额外致癌突变的DNA损坏。但是两种基因的瑕疵使肿瘤细胞容易遭受PARP抑制剂的攻击,因为PARP抑制剂能够进一步破坏肿瘤细胞DNA的修复机制。这种组合效果使肿瘤细胞不能修复对DNA的破坏,然后肿瘤细胞就会死掉,这种观念被称为“合成致死”。研究发现新型PARP抑制剂——奥拉帕尼对于携带有BRCA1/2突变的乳腺癌和卵巢癌的肿瘤患者有效。因此,了解BRCA的突变状态对于乳腺癌治疗方面的作用也日趋重要,因为它能够指导PARP抑制剂类药物的应用,利用BRCA1/2基因检测来确定哪些乳腺癌患者会受益于奥拉帕尼,进一步加速乳腺癌诊治方式的革新,所以对于BRCA1/2基因突变的检测具有广泛及深远临床应用和市场开发前景。
目前,针对突变基因检测方法主要分为两大方向:其一是对全基因序列的检测,其二是对已知的突变位点检测。因为BRCA1和BRCA2是两个功能复杂的大基因,需要进行整个基因的扫描才能确定是否存在基因突变,鉴于二代测序技术的发展,有望成为BRCA1/2基因突变的有效检测手段。1994年,美国率先在一些人群中开展基因筛检,经历了10多年的发展,截至2005年底,包括乳腺癌基因突变的筛查,美国已有500多万人接受了基因检测。从总体上看,美国乳腺癌的发病率下降了70%;在美国,已经有超过10万名妇女接受了乳癌易感基因BRCA1和BRCA2的检测。而在加拿大针对乳腺癌的基因检测已成为常规检测手段,而全部费用由国家支付。因为经过卫生经济学家测算发现,在早期对包括乳腺癌在内的一些癌症性疾病进行有效监测和预防,远比发病后以及病情晚期治疗更能减少卫生财政的支出。
然而,在我国BRCA1/2基因突变筛查仍然是盲点。我国目前临床上仍普遍采用体检、钼靶和B超等传统手段来诊断、评价乳腺癌,这些方法存在明显的局限性。首先,多数病人在诊断确立时已经跨越了肿瘤的早期阶段,而对于基因突变的筛查,根据其结果通过遗传咨询可以判断预估患者罹患乳腺癌的危险度,在乳腺癌发生前行预防性的治疗,从而做到“治未病”。其次,乳腺癌病情发生发展复杂多变,现代医学对癌症的诊治必须以每个患者的信息为基础决定治疗方案,从基因组的差异来对每个患者行个体化治疗。安吉丽娜·朱莉和姚贝娜两位明星,由于采取的措施不同,她们的命运各不相同。由此可以看出,开始阶段对乳腺致癌基因BRCA1/2进行的基因检测可以导致完全不同的生存预后。复旦大学附属肿瘤医院的全国多中心研究结果显示,汉族遗传性乳腺癌人群中BRCA1/2突变率为9.5%,这意味着对于中国遗传性乳腺癌患者中,每10个人就至少有1个人携带BRCA1/2基因的突变。为此,2014年NCCN指南提出,发生在45岁以下的乳腺癌患者、60岁以下的三阴性乳腺癌患者,乃至有癌症高危家族史的乳腺癌患者和健康人等,都有进行乳腺癌基因突变筛查的指证。但是,目前国内关于BRCA1/2突变的大规模筛查的方法和评估体系尚未建立,在基因分子检测迅猛发展的今天,亟需建立稳定的检测技术和规范的筛查流程,并客观科学地评估基因的遗传变异的作用,通过个体的遗传易感检测,来评估女性罹患乳腺癌的风险,建立乳腺癌分子预警系统;同时,BRCA1/2突变检测系统还可为PARP抑制剂类抗肿瘤新药在乳腺癌上的应用提供可靠的疗效预测。
发明内容
本发明第一方面提供一种引物产品,该产品含有SEQ ID NO:1-70所示的引物序列。
在一个或多个实施方案中,所述引物分为独立包装的两组,其中,一组引物含SEQID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68;另一组引物含SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70。
本发明第二方面提供一种多核苷酸序列产品,所述产品含70种多核苷酸序列,其中,每一种多核苷酸序列含悬挂接头序列和特异性引物序列,每一种多核苷酸序列所含的所述特异性引物序列各自独立选自SEQ ID NO:1-70。
在一个或多个实施方案中,SEQ ID NO:1-70所示的引物中,奇数编号的引物为正向引物,偶数编号的引物为反向引物,其中,在正向引物的5’端还连接有SEQ ID NO:71所示的悬挂接头序列,在反向引物的5’端还连接有SEQ ID NO:72所示的悬挂接头序列。
本发明第三方面提供一种BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查试剂盒,所述试剂盒含有本文所述的引物产品。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒含有两个独立包装的容器,其中一个容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68的混合物,另一个容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70的混合物。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还含有PCR扩增所需的其它试剂,例如酶试剂。
在一个或多个实施方案中,所述SEQ ID NO:1-70所示的序列中,奇数编号的引物为正向引物,偶数编号的引物为反向引物,其中,在正向引物的5’端还连接有SEQ ID NO:71所示的序列,在反向引物的5’端还连接有SEQ ID NO:72所示的序列。
在一个或多个实施方案中,所述酶是来自Kapa Biosystems的KAPA2G Robusthotstart ready mix。
本发明第四方面提供本发明所述引物产品或多核苷酸序列产品在BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查中的应用。
本发明第五方面提供本发明所述引物产品或多核苷酸序列产品在制备BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查试剂盒中的应用。
本发明第六方面提供一种BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使用本发明的多核苷酸序列产品扩增样品中的基因组DNA;
(2)给步骤(1)获得的扩增产物添加标记的测序接头;和
(3)将步骤(2)所得产物测序。
具体实施方式
本发明涉及BRCA1基因突变的筛查。具体而言,本发明涉及使用SEQ ID NO:1-70所示的特异性引物序列筛查BRCA1基因中的突变。
通常,将所示70条序列分成两组,分别与样品混合后进行PCR。分组的原则是组内的引物扩增区域没有交叉重叠即可。在某些实施方案中,将所述70条引物分成以下两组:SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68;和SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70。
本文中,奇数编号的序列为正向引物序列,偶数编号的序列为反向引物序列。通常,可根据后续的添加测序接头所使用的标记的接头引物序列(Index Adapter Primer)中的引物序列,在每一条正向引物和每一条反向引物的5’端各添加一条悬挂接头序列(overhang adapter sequence)。“悬挂接头序列”为本领域周知,通常与标记的接头引物序列中的引物互补,用以经由PCR而将测序接头序列和样品特异性的标记连接到先前使用该特异性引物或者获得的产物上。例如,作为示范性的例子,本发明根据Illumina官方公布的信息,分别在每一条正向引物的5’端连上SEQ ID NO:71所示的序列,在每一条反向引物的5’端连上SEQ ID NO:72所示的序列。
因此,在某些实施方案中,本发明提供一种多核苷酸序列产品。该多核苷酸序列产品含有70种多核苷酸序列,其中每一种多核苷酸序列含有悬挂接头序列和本发明SEQ IDNO:1-70中的任意一条特异性引物,或由悬挂接头序列和本发明SEQ ID NO:1-70中的任意一条特异性引物组成。如前所述,该多核苷酸序列产品中的70种多核苷酸序列可分成两组。分组的原则是组内的引物扩增区域没有交叉重叠即可。例如,在某些实施方案中,基于以下序列将所述70条多核苷酸序列分成两组:SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68;和SEQID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70。
本发明的引物产品或多核苷酸序列产品可以是例如组合物的形式。组合物中还可含有合适的溶剂,例如水。组合物还可以是冻干的形式。本发明的引物产品或多核苷酸序列产品可提供于试剂盒中,用于BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查。在某些实施方案中,本发明的试剂盒可含有两个独立包装的容器,其中一个容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68的混合物,或前文所述的相应的含悬挂接头序列的多核苷酸序列的混合物;另一个容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70的混合物,或前文所述的相应的含悬挂接头序列的多核苷酸序列的混合物。试剂盒还可含有PCR扩增所需的其它试剂,例如酶试剂;以及任选的指导技术人员使用该试剂盒进行PCR及测序的说明书。例如,在某些实施方案中,试剂盒中的酶可以是来自Kapa Biosystems的KAPA2G Robust hotstartready mix。
因此,本发明也提供SEQ ID NO:1-70所示的引物,或前文所述的相应的含悬挂接头序列的多核苷酸序列在BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查中的应用,或在制备BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查试剂盒中的应用。
本发明还提供一种BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使用本发明的多核苷酸序列产品扩增样品中的基因组DNA;
(2)给步骤(1)获得的扩增产物添加标记的测序接头;和
(3)将步骤(2)所得产物测序。
本文所使用的标记的测序接头可以是本领域常规的标记的测序接头。该标记的测序接头的结构为本领域周知,例如通常包括测序接头和样品特异的标记。通常,在扩增产物的两端分别添加标记的测序接头。因此,在添加测序接头后所得的产物中,其5’端和3’端分别是相应的测序接头序列。上述方法中,步骤(1)到(3)可采用本领域周知的技术手段实施,除了使用本发明的引物或多核苷酸序列进行步骤(1)的扩增。
采用本发明的引物、试剂盒和方法,可利用多重PCR技术实现基因全部外显子区域的捕获。相对于探针捕获方法,极大简化了实验流程,缩短了实验时间,减少了实验的试剂和人工成本。另外,接头序列的添加,可实现多个样本的平行上样。
本发明中,术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。
如无具体说明,本发明的各种原料均可以通过市售得到;或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明,本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明的其他方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准,则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1:引物设计及制备
引物由Ion AmpliSeqTMDesigner软件设计。然后在各正向引物的5’端添加序列TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:71);在各反向引物的5’端添加序列GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:72)。
引物由上海茂槿生物技术有限公司合成。合成后引物分装成2组,分别为组1和组2,各组引物及其描述如下表1和2所示:
表1
表2
实施例2:基因组定量
来自血液、组织和唾液等样本DNA均可用于扩增。本实施例使用来自手术切除的乳腺肿瘤组织DNA,共12份样品,分别命名为BC1A01到BC1A12。每份样品25mg组织,采用Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)处理,抽提DNA,Nanodrop质控。参考Qubit说明书,对样本基因组DNA进行准确定量,将DNA的浓度控制在20-50ng/μl的范围内。定量后DNA浓度若高于50ng/μl,则利用TE缓冲液稀释至50ng/μl。
实施例3:PCR扩增
采用以下PCR反应体系及PCR程序对实施例2获得的每份基因组DNA样品进行扩增,其中,每份基因组DNA样品平行进行两个PCR,一个PCR采用实施例1组1引物,另一个PCR采用实施例组2引物:
(1)PCR反应体系,25μl,其中:
酶为KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
(2)PCR程序如下:
采用上述PCR方法扩增得到两组PCR产物。
实施例4:PCR产物纯化
采用以下步骤纯化实施例3获得的两组PCR产物:
1.将实施例3获得的PCR反应液(25ul)中加入9μl磁珠(AMPure XP Beads),移液器吹打10-15次,转移至纯化板,室温静置5min;
2.纯化板置于磁力架,5min至溶液澄清;
3.取上清至新的纯化版,加入17.5μl磁珠,吹打10-15次,室温静置5min;
4.纯化板置于磁力架,5min至溶液澄清,去除上清;
5.加入100μl 70%乙醇洗涤;
6.纯化板置于磁力架,2min至溶液澄清,去除上清;
7.室温放置,至乙醇挥发干净;
8.加入20μl洗脱缓冲液,充分悬浮磁珠,室温静置2min以洗脱DNA。置磁力架,静置5min,取上清于新的96孔板。
实施例5:添加被标记的测序接头
依照Nextera Index Kit说明,添加被标记的测序接头。具体的PCR反应如下:
1、PCR为20μl反应体系,其中
酶为KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
2、PCR程序:
实施例6:纯化
第一步纯化:
1.将实施例5的PCR反应液(20ul)中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads),吹打10-15次,转移至纯化板,室温静置5min;
2.纯化板置于磁力架,5min至溶液澄清,去除上清;
3.加入100μl 70%乙醇洗涤;
4.纯化板置于磁力架,2min至溶液澄清,去除上清;
5.室温放置,至乙醇挥发干净;
6.加入20μl洗脱缓冲液,充分悬浮磁珠,室温静置2min以洗脱DNA。置磁力架,静置5min,取上清于新的纯化板;
第二步纯化:
1.第一步纯化产物中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads),吹打10-15次,室温静置5min;
2.纯化板置于磁力架,5min至溶液澄清,去除上清;
3.加入100μl 70%乙醇洗涤;
4.纯化板置于磁力架,2min至溶液澄清,去除上清;
5.室温放置,至乙醇挥发干净;
6.加入20μl洗脱缓冲液,充分悬浮磁珠,室温静置2min以洗脱DNA。置磁力架,静置5min,取上清于新的96孔板。
实施例7:
参考Qubit说明书,对实施例6的纯化产物进行准确定量。定量后的PCR文库等摩尔混合后稀释至2nM。文库采用NaOH变性,标化至8-12pM,在Miseq测序试剂盒v3中上样600μl,机器运行。
获得fastq格式的原始测序数据后,使用常规方法进行二代测序的数据分析。简单地说,首先是BWA软件将序列与参考基因组进行比对,确定序列在基因组位置,然后利用Samtools等软件将序列排列,最后GATK寻找样本测序数据与参考基因组差异,获得多态及突变位点,并将这些位点进行功能注释。
结果如下表3、4、5和6所示。
表3:覆盖倍数
表4:覆盖倍数
表5:突变结果(插入缺失型)
Freq:2个等位基因的测序深度;DP:总测序深度;数据库无rs号,则以“.”表示。
表6:突变结果(单碱基多态及突变)
Freq:2个等位基因的测序深度;DP:总测序深度。
样品BC1A07、BC1A08、BC1A09和BC1A10未检测到单碱基多态及突变。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种引物产品,其特征在于,所述产品中的引物包括SEQ ID NO:1-70所示的引物序列。
2.如权利要求1所述的引物产品,其特征在于,所述引物分为独立包装的两组,每一组的引物扩增区域没有交叉重叠;
优选地,一组引物含SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68;另一组引物含SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70。
3.一种多核苷酸序列产品,其特征在于,所述多核苷酸序列产品含70种多核苷酸序列,其中,每一种多核苷酸序列含悬挂接头序列和特异性引物序列,每一种多核苷酸序列所含的所述特异性引物序列各自独立选自SEQ ID NO:1-70。
4.如权利要求3所述的多核苷酸序列产品,其特征在于,
SEQ ID NO:1-70所示的引物中,奇数编号的引物为正向引物,偶数编号的引物为反向引物,其中,在正向引物的5’端连接有SEQ ID NO:71所示的悬挂接头序列,在反向引物的5’端连接有SEQ ID NO:72所示的悬挂接头序列;和/或
所述多核苷酸序列产品包括两组多核苷酸序列,每一组的引物扩增区域没有交叉重叠;优选地,一组多核苷酸序列中的特异性引物序列分别是SEQ IDNO:1、2、5、6、9、10、13、14、19、20、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、63、64、67和68;另一组多核苷酸序列中的特异性引物序列分别是SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、17、18、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、61、62、65、66、69和70。
5.一种BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物产品,或含有权利要求3或4所述的多核苷酸序列产品;和任选的PCR所需的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有两个容器,每个容器分别含有所述组的引物或多核苷酸序列。
7.权利要求1或2所述的引物产品或权利要求3或4所述的多核苷酸序列产品在BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查中的应用。
8.权利要求1或2所述的引物产品或权利要求3或4所述的多核苷酸序列产品在制备BRCA1基因多重PCR建库试剂盒或BRCA1基因突变筛查试剂盒中的应用。
9.一种BRCA1基因多重PCR建库或BRCA1基因突变筛查方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)使用权利要求3或4所述的多核苷酸序列产品扩增样品中的基因组DNA;
(2)给步骤(1)获得的扩增产物添加标记的测序接头;和
(3)将步骤(2)所得产物测序。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述样品来自人的血液、组织或唾液。
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