CN113234822A - 一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体公开了一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，其采用的捕获探针的序列如SEQ ID NO:1～2641所示，所述捕获探针覆盖基因组80～300Kb的区域，优选为80～100Kb区域。捕获探针的Tm值为62～76℃。本发明所设计合成的探针能够高效、完整地捕获人基因组目标区域的编码外显子区域及外显子内含子交接区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度均一，将大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间，满足个性化的用户需求，特别适用于遗传性结直肠癌高风险人群的筛查和大众体检市场。

Description

一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法。

背景技术

结直肠癌是在世界范围内发病率第三的恶性肿瘤，死亡率高居第二位，大约每年新增一百二十万患者。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率均呈逐年上升趋势，约1/3的患者有家族性遗传背景，5％～6％的患者可确诊为遗传性结直肠癌，由于对遗传性结直肠癌认识不足，目前我国除了几家肿瘤专科医院和少数综合医院开展了相关工作外，尚缺乏系统的遗传性结直肠癌的登记筛查工作。因此，国内遗传性结直肠癌的实际诊断率仍较低。遗传性结直肠癌根据有无息肉大致可分为2类：第1类是以息肉病为特征，包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遗传性色素沉着消化道息肉病综合征(PJS)、幼年性息肉综合征(JPS)和锯齿状息肉病综合征(SPS)等；第2类为非息肉病性结直肠癌，Lynch综合征是其中的重要代表。

遗传性结直肠癌的发生、发展是一个受多基因、多步骤调控的复杂过程，均已发现相关的致病基因，如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、APC和MUTYH等，其中FAP和Lynch综合征具有常染色体显性遗传的特征，通过对家系先证者的基因诊断，继而找到突变携带者，并对这些高危人群进行风险管理，从而实现预防、早诊和早治。

早期分子诊断采用多种技术平台，如定量PCR、FISH、免疫组化等，一次检测一种或几种基因变异，对同一患者采用顺位检测的方法。传统方法的局限性在于，由于每次检测仅限于一个基因突变或一段基因的突变，所需的活检组织量随检测基因数的增长而增加，检测通量低，耗时长，甚至出现某些基因变异事件的漏检，难以满足快速、准确检测所有靶标基因的需求。因此，亟需研发一种高灵敏度和高特异性的用于一次性检测遗传性结直肠癌多种突变基因的方法。

随着精准医学的发展，高通量测序技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，高通量测序技术结合探针捕获技术可以在较短时间内测定人类基因组目标区域序列，使快速获取个目标区域序列信息成为现实。伴随高通量测序技术与捕获技术的发展，突变负荷作为一种新型肿瘤标记物已经在临床中应用。

当前建立的两项非常重要的高通量技术：基因芯片和第二代测序技术。这两种技术进一步结合，就产生了一种新的解决方案：目标序列捕获测序技术。目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定区域。一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理设计与目的区域互补的探针序列，而根据杂交时状态不同，目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。液相杂交是通过在溶液中，目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。相较于固相杂交，液相杂交具有操作简便、易于自动化等优点。

申请号CN201710473569.3的专利公开了一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法。本发明所提供的方法可依次包括如下步骤：(1)制备基因组DNA文库；(2)与捕获探针文库进行杂交；所述捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子，所述捕获探针文库由440个探针组成。实验证明，捕获探针文库可以捕获BRCA1基因和BRCA2基因中相应的靶序列。但是，对于一些特定疾病，比如遗传性结直肠癌，其不能针对性地筛选基因突变负荷的多个关键区域，针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，导致其测序数据量大，单样本分析时间长，不能很好满足个性化的用户需求，特别是遗传性癌症高风险人群的筛查和大众体检市场。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，以解决背景技术提出的现有高通量测序的捕获基因组靶序列的方法不能针对性地筛选基因突变负荷的多个关键区域，针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，导致其测序数据量大，单样本分析时间长，不能很好满足个性化的用户需求问题。

(二)技术方案

为实现上述捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，解决背景技术提出的现有高通量测序的捕获基因组靶序列的方法不能针对性地筛选基因突变负荷的多个关键区域，针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，导致其测序数据量大，单样本分析时间长，不能很好满足个性化的用户需求问题，本发明提供如下技术方案：

本发明第一方面，提供一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:1～2641所示，所述捕获探针覆盖基因组80～300Kb的区域，优选为80～100Kb区域。

优选的，所述捕获探针包含2641条探针。

优选的，所述捕获探针的Tm值为62～76℃。

优选的，所述捕获探针的浓度为10ng/μL～90ng/μL，优选为25ng/μL。

本发明第二方面还提供上述的捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，在遗传性结直肠癌基因突变高通量测序中的应用。

本发明第三方面还提供一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的试剂盒，所述试剂盒包含上述的捕获探针，以及选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。

本发明第四方面还提供一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，包括以下步骤：

(1)提取血液样本中的基因组DNA双链核酸；

(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；

(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行上机测序，得到血液样本中的核酸序列；

(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，去除干扰信息及背景信号，比对公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19数据，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。

优选的，在步骤(1)中，在提取基因组DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp；更优选的，片段长度为100-500bp，更进一步优选的，片段长度为200-300bp。

优选的，所述样本的测定区域为80～300Kb；更优选为80～100Kb，更进一步优选为84Kb。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，具备以下有益效果：

1、本发明针对性地设计高效液相靶基因捕获探针和配套的文库构建试剂盒，捕获探针高效、完整地捕获遗传性结直肠癌基因组关键区域，显著提高了测序深度，大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间，满足个性化的用户需求，特别适用于遗传性结直肠癌高风险人群的筛查和大众体检市场；

2、本发明所设计的捕获探针，捕获遗传性结直肠癌基因组的基因组目标区域的编码外显子区域及外显子内含子交接区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度均一。

附图说明

图1是本发明一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法流程图。

图2是本发明一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法性能测试结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图2是本发明一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法性能测试结果。从图中可以看出，序列比对率可达99.16％以上，序列捕获率达58％以上，目标区域大小为84Kb，实际覆盖大小约为83.7Kb，覆盖率达到99.3％以上。说明采用本发明捕获探针进行捕获遗传性结直肠癌基因突变的目标区域，可对目标区域进行有效、完整地捕获，从而确保后续高通量测序可完整地检出样本所含的相关突变。

如上所述，本发明提供了一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，捕获探针的序列如SEQ ID NO:1～2641所示。

在本发明中，捕获探针是多条探针的混合物，优选2641条探针，多条探针分别捕获人基因组不同的目标区域，优选为捕获人基因组目标区域的编码外显子区域及外显子内含子交接区域。捕获探针覆盖基因组80～300Kb的区域，优选为80～100Kb区域。

在本发明中，捕获探针的多条探针是按相同比例混合在一起，优选2641条探针，捕获探针的Tm值为62～76℃，且每条探针上具有标记，优选为生物素标记，捕获探针的浓度为10ng/μL～90ng/μL，优选为25ng/μL。

本发明根据遗传性结直肠癌基因组突变的多个关键区域，针对性的设计合成捕获探针，捕获探针完整捕获遗传性结直肠癌患者基因组目标区域，减少非特异性捕获，显著提高了测序深度，大幅降低检测成本和测序数据量，缩短了单样本分析时间。

另外，本发明还提供一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的试剂盒，其中，试剂盒包含上述捕获探针以及选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。

本发明提供了一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，其包含下述步骤：

(1)提取血液样本中的基因组DNA双链核酸；

(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用权利要求1-5任一项所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；

(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行上机测序，得到血液样本中的核酸序列；

(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，去除干扰信息及背景信号，比对公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19(Human Genome 19)，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。

本发明中，在步骤(1)中，在提取基因组DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp，优选的，片段长度为100-500bp，更优选的，片段长度为200-300bp。

本发明中，在步骤(3)中，样本的测定区域为80～300Kb，优选为80～100Kb，更优选为84Kb。

下面对本发明所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例所用到的实验设备的信息如表1所示。

表1本发明所用的实验设备的信息

设备	型号	厂家
			NextSeq CN500测序仪	NextSeq CN500	北京贝瑞基因公司
离心机	5418R	德国Eppendorf公司
			PCR扩增仪	T100	美国伯乐公司
离心管	AxyGen	美国康宁公司

实施例一

用于遗传性结直肠癌基因突变高通量捕获测序的检测质控品的制备。

(1)从ATCC购买获得两株常用的可稳定传代人结直肠癌细胞系HCT-116和HCT-15；

(2)采用胎牛血清培养基(由Thermo Fisher公司提供)培养这两株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％；培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，分别抽提每个细胞系的基因组DNA，并过柱纯化、洗脱；

(3)将纯化后的每个细胞系的基因组DNA分别用Tris-EDTA buffer solution缓冲液稀释至100±5ng/μL，外观为透明液体，无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞OD260/280＞1.7，得到质控品原料DNA；

(4)用WES测序法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，确认杂合和纯合变异位点；

(5)将两种细胞系HCT-116、HCT-15的质控品原料DNA按照1:1的体积比进行均匀混合分装作为质控品，模拟全血样本DNA，-20℃保存；

实施例二

捕获探针设计

选取遗传性结直肠癌基因组突变关键区域，根据关键区域设计并合成多条捕获探针，所述关键区域部分示例如表2所示；所述捕获探针设计序列示例如SEQ ID NO:1～2641所示；所述捕获探针长度为100bp，所述捕获探针首尾相接，覆盖各个目标区域外显子区及外显子内含子交接区域；所有探针均具有生物素标记，所述捕获探针为2641条探针混合物，所述捕获探针的设计方法为：

(1)根据公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19确定各个目标区域的外显子区域及外显子内含子交接区域；

(2)以各个区域内的外显子区域及外显子内含子交接区域首个外显子为起始，根据标准序列HG19设计捕获探针，探针长度为100bp(如有外显子或至其末端不足100bp情况，则延伸至外显子内含子交接区，保证探针长度为100bp)，则区域确定则探针设计具有唯一性；

(3)将设计探针进行合成，同时以生物素进行标记；

表2部分探针关键区域示例

实施例三

遗传性结直肠癌基因组突变捕获测序检测试剂盒的制备

(1)设计并合成实施例二所示目标区域的捕获探针；

(2)将设计捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度25ng/μL，-20℃保存；

(3)将捕获探针混合物和实施例一中获得的质控品分别分装。

(4)准备说明书、外包装，组装封口。

(5)其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为30ng～50ng/反应。

实施例四

遗传性结直肠癌基因组突变捕获测序检测试剂盒的制备

(1)设计并合成实施例二所示目标区域的捕获探针；

(2)将设计捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度25ng/μL，-20℃保存；

(3)将捕获探针混合物、实施例一中获得的质控品、末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠分别分装。

(4)准备说明书、外包装，组装封口。

(5)其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为30ng～50ng/反应。

实施例五

遗传性结直肠癌基因组突变捕获测序检测

本实施例中测序所使用的仪器为NextSeq CN500。

采用以下方法分别以本发明实施例二捕获探针对样本进行基因突变检测。质控品的制备方法同实施例一。

1.样本的提取及片段化：从2例人血液样本中使用核酸提取或纯化试剂(德国QIAGEN公司)提取基因组DNA，质控品直接使用，无需提取，分别取600ng的每个人基因组样品和质控品，不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL，进行离心，然后将溶液全部转移到微管中，在Covaris S2仪器(购自美国Covaris公司)上进行片段化，得到200-300bp的DNA双链核酸片段的混合物，并取5μL片段化的样品进行琼脂糖凝胶电泳；质控品按照与样品相同的方法进行操作。

2.基因文库构建

(1)末端修复和接头连接：在0.2ml PCR反应管中，加入纯化后400ng双链核酸片段样本，用无核酸酶水补齐至50μL，然后分别加入3μL末端修复酶混合物(含5～40U/μL末端修复酶的溶液)和7μL末端修复反应缓冲液，离心后在20℃下保温30min，随后在65℃下保温30min，进行末端修复；离心后分别加入2μL接头(含index标签)、10μL DNA连接酶、30μL连接反应缓冲液及8μL无核酸酶水进行接头连接。

(2)纯化：将接头连接的产物进行离心后，转移到1.5ml的离心管中，加入52μL核酸纯化磁珠，进行离心，吸弃上清，保持离心管在磁力架上，随后加入300μL 75％乙醇，静置1min后吸弃上清，重复洗涤一次，37℃干燥磁珠，时间约为1～3min，加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用；

3.基因文库扩增与纯化：向装有20μL上清的0.2ml的PCR反应管中分别加入25uL 2×PCR预混液(含有1～50U/μL Taq DNA聚合酶扩增反应液)和5μL扩增引物；

在PCR仪中按下述程序进行扩增：68℃，2min；98℃，2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增10个循环；最终72℃延伸5min，在4℃下保存备用；

将扩增的产物全部转移到1.5ml离心管中，然后加入45μL核酸纯化磁珠，离心吸弃上清，加入300μL 75％乙醇，静置30s后吸弃上清，重复洗涤一次，37℃干燥磁珠，时间约为1～3min，加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用；将纯化后的预文库使用

dsDNA HS Assay Kit(Life公司生产)进行浓度测定。

4.基因文库捕获

(1)杂交：每8个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，最后不足8个的混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mL LoBind离心管中成为一个样品池，血液样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μLDNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)(含有0.1M～20M的NaCl、NaH2PO4成分的溶液)、2.7μL杂交增强剂(含有0.1M～20M的NaCl、聚蔗糖成分的溶液)和3.8μL无核酸酶水，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶，将重溶后的液体全部转移到0.2ml的PCR反应管中，95℃下保温10分钟取出PCR反应管，短暂离心后加入实施例二中获得的捕获探针混合物，震荡混匀3～5s，短暂离心后在65℃保温4h，热盖温度为75℃。

其中，所述探针混合物的浓度为25ng/μL。

其中，实施例二中的探针混合物的序列如SEQ ID NO:1～2641所示。

(2)富集：将链霉亲和素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液(含有0.1M～25M的NaCl、Tris成分的溶液)，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2ml的PCR反应管中；将(1)中的PCR反应管取出，短暂离心后将将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL 65℃预热的1×洗液1(含有0.1M～25M的NaCl、SDS成分的溶液)，将全部悬液转移至1.5mL AxyGen离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。然后加入200μl 65℃预热的1×杂交洗液(含有0.1M～25M的NaCl、SDS、Na2HPO4成分的溶液)震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。并用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL无核酸酶水，震荡后转移至0.2ml的PCR反应管中；

5.捕获文库扩增与纯化

(1)捕获文库扩增：向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，混匀离心后，按下述程序进行PCR扩增：98℃，2min；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增14个循环，最终72℃,5min，在4℃下保存备用，热盖105℃；

(2)纯化：将PCR反应管离心后，将产物全部转移至离心管中，加入75μL核酸纯化磁珠，静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。再加入300μL 75％乙醇，静置30s后吸弃上清，重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加36μL已恢复至室温的无核酸酶水混匀，进行离心，室温静置5min，取上清液20μL至0.2ml的PCR反应管中备用；将纯化后的预文库使用

dsDNA HS Assay Kit(Life公司生产)和Agilent HighSensitivity DNA Kit(安捷伦公司生产)进行浓度和片段长度测定。

6.测序结果与分析

(1)测序：将上述所得到的扩增产物按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序，平均有效覆盖深度：≥500×；

(2)数据处理与分析：

获得原始测序数据后，将测序获得的序列信息数据使用BWA软件运行分析比对，比对后的数据含有样本中包含的所有变异信息及背景信号。

1)数据预处理：使用Illumina Sequencing Analysis Viewer v2.4.5软件分析每批次数据测序质量Q30碱基占比，如批次数据Q30碱基占比≥75％则质控通过；如批次数据Q30碱基占比<75％，则质控不通过。然后使用Illumina公司的bcl2fastq v2.19软件将测序生成的bcl文件转化成样本对应的fastq文件。使用分析系统的数据预处理模块(基于Trimmomatic-0.36软件)去除建库过程中引入的接头序列以及低质量碱基片段(尾部8个碱基平均质量小于20的部分片段以及长度小于50bp的短片段)。

2)数据比对：使用分析系统的序列比对模块(基于bwa v0.7.10和GATK v3.2-2软件)将fastq文件中的碱基序列比对至HG19(GRCh37)人类参考基因组上生成bam文件，并根据基因组坐标对bam文件进行排序，然后对基因组复杂区域进行序列比对优化。

3)数据质控：使用分析系统的数据质控模块计算每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、建库复杂度、目标区域的中位测序深度等参数。如果Q30碱基占比≥80％，序列比对至参考基因组比例≥90％，建库复杂度≥20％，中位测序深度≥500×，则样本数据质控通过；否则样本数据质控不通过。如数据质控不通过，则实验失败，要重新实验。

4)突变分析：使用分析系统的变异鉴定模块(基于varscan v2.3.9软件)分析样本中的点突变和插入缺失突变，使用分析系统的融合分析模块(基于factera v1.4软件)分析样本中的重排(融合)，分析参数设置要求位点覆盖深度≥100×，序列比对质量≥60,碱基质量≥30。

5)突变注释：使用分析系统的注释模块(基于ANNOVAR v20150617软件和snpEffv4.2软件)对鉴定出的点突变、插入缺失和基因重排(融合)进行HGVS格式和COSMIC数据库(v69)注释。

6)阳性判断标准：经过以上1-5步分析流程处理后，符合质量指标要求的突变结果进行阴/阳性判断。如突变的双端支持(即正向和反向序列支持)的独特(即去除PCR重复)DNA片段≥2时，判断为阳性；反之，则判断为阴性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:1～2641所示，所述捕获探针覆盖基因组80～300Kb的区域。

2.根据权利要求1所述的一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针包含2641条探针。

3.根据权利要求1所述的一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针的Tm值为62～76℃。

4.根据权利要求1所述的一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针的浓度为10ng/μL～90ng/μL。

5.权利要求1-4任一项所述的捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的捕获探针，其在遗传性结直肠癌基因突变高通量测序中的应用。

6.一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的捕获探针，以及选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。

7.一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取血液样本中的基因组DNA双链核酸；

(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用所述的捕获探针捕获所述的DNA单链；

(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行上机测序，得到血液样本中的核酸序列；

(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，去除干扰信息及背景信号，比对公共数据网站NCBI提供的人类全基因组标准序列HG19数据，确定组织样本测定区域中的变异位点及数目。

8.根据权利要求7所述的一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，其特征在于：在步骤(1)中，在提取基因组DNA双链核酸后进行片段化处理，得到片段长度为100-1000bp。

9.根据权利要求7所述的一种捕获遗传性结直肠癌基因组靶序列的方法，其特征在于：所述样本的测定区域为80～300Kb。

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