CN109097443A - 一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法。本发明所提供的方法可依次包括如下步骤：(1)制备基因组DNA文库；(2)与捕获探针文库进行杂交；所述捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。所述捕获探针文库由如下440个探针组成：LNA探针‑1至LNA探针‑440；所述LNA探针‑1至所述LNA探针‑440的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列表的序列440所示。实验证明，捕获探针文库可以捕获BRCA1基因和BRCA2基因中相应的靶序列。因此，本发明所提供的方法具有重要的应用价值。

Description

一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法。
背景技术
自人类基因组图谱绘制完成后，各国政府都加大了对人类基因组研究的扶持力度，在这样的大背景下，基因测序技术得到了迅猛发展，基因测序市场也快速扩大，并已经从实验室走入临床。通过基因检测预知自己的未来健康状况，有针对性地进行保健和治疗，从被动预防治疗走向主动预知健康。在英美发达国家，基因检测就像体检一样普及，美国国家卫生署登记的基因检测项目达到6000多种，每年基因检测人数达到上千万人次，市场达到200亿，通过基因检测，乳腺癌和直肠癌等发病率也大幅下降。
在我国，基因检测虽然起步较晚，检测的项目也远没有发达国家多，但在北京、上海、广州、深圳、杭州等发达地区的医疗机构和体检中心，早已悄然兴起，据统计，2011年，中国的测序市场规模已达10亿美元；《福布斯》杂志甚至预测测序市场规模将高达千亿美元。然而，从目前市场情况看，基因测序主要应用于高端体检市场，主要集中在经济较发达的大中城市，服务的对象主要为企业家、高级白领等高端人才，绝大多数的普通百姓还不能从该项技术直接受益。究其原因，除了健康观念、认知等原因外，测序成本的高居不下是重要因素之一。
基因测序成本一部分来自测序设备的购置，大部分消耗在测序试剂上。目前国内基因测序试剂主要依赖进口，测序试剂市场被欧美企业垄断，导致测序试剂价格高昂。这很大程度上压缩了国内基因测序服务企业的利润空间，阻碍了测序技术在国内的推广和应用，更不利于基因检测服务的大规模产业化。
基于液相捕获高通量测序技术，市场主要有安捷伦公司的全外显子捕获试剂盒，罗氏公司的固相杂交法和液相杂交法两种技术，这些产品捕获的DNA序列虽然只是全基因组的部分区域，相对于全基因组测序来说成本和时间花费上具有很大的优势，但每个样本的价格仍在万元以上，超出了普通民众的承受范围，不适合大范围内筛查单基因遗传疾病的检测。而且这些技术的缺点是需要合成长片段(150－200bp)的DNA，经过PCR扩增，转录成加生物素修饰的RNA，探针合成效率低，成本高，纯RNA探针稳定性差，有效期短，质量难以保证。
基于测序试剂国产化发展趋势和基因检测更加个性化的用户需求，针对靶基因，开发基于LNA修饰探针的液相靶基因捕获试剂盒和配套的文库构建试剂盒，特别适用于有家族遗传史的特定人群的筛查和大众体检市场；更有意义的是，本项技术还可用于开发其他单基因、多基因遗传疾病的检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何捕获靶序列。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了从生物DNA中捕获靶序列的方法。
本发明所提供的从生物DNA中捕获靶序列的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：采用由n个特异探针组成的捕获探针文库从生物DNA中捕获n种靶序列；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
上述方法一中，所述生物DNA可为生物的基因组DNA或生物的cDNA。
上述方法一中，所述特异探针的5’末端或3’末端或任一位置可具有生物素标记。
上述方法一中，所述锁核酸修饰可为对特异探针中的任意一个或多个核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法一中，所述锁核酸修饰可为对特异探针中的任意一个或多个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法一中，所述锁核酸修饰具体可为对特异探针中的特定几个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法一中，所述捕获探针文库具体可由如下440个探针组成：LNA探针-1至LNA探针-440；所述LNA探针-1至所述LNA探针-440的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列表的序列440所示。所述LNA探针-1至所述LNA探针-440是根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。由上述440个探针组成的捕获探针文库可用于捕获BRCA1基因和BRCA2基因中的靶序列，如BRCA1基因自5’末端起第79823至79670位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第30812至30641位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第33706至33956位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第54294至54548位所示的DNA片段或BRCA1基因自5’末端起第79893至79719位所示的DNA片段。
上述方法一中，所述锁核酸修饰具体可为对所述LNA探针-1至所述LNA探针-440中的特定几个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(见表1中的第二列的下划线标注)进行的锁核酸修饰。
本发明所提供的从生物DNA中捕获靶序列的方法，具体可为方法二，依次可包括如下步骤：
(1)制备基因组DNA文库；
(2)与捕获探针文库进行杂交；
所述步骤(2)中，捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
上述方法二中，所述特异探针的5’末端或3’末端或任一位置可具有生物素标记。
上述方法二中，所述锁核酸修饰可为对特异探针中的任意一个或多个核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法二中，所述锁核酸修饰可为对特异探针中的任意一个或多个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法二中，所述锁核酸修饰具体可为对特异探针中的特定几个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸进行的锁核酸修饰。
上述方法二中，所述捕获探针文库可由如下440个探针组成：LNA探针-1至LNA探针-440；所述LNA探针-1至所述LNA探针-440的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列表的序列440所示。所述LNA探针-1至所述LNA探针-440是根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。由上述440个探针组成的捕获探针文库可用于捕获BRCA1基因和BRCA2基因中的靶序列，如BRCA1基因自5’末端起第79823至79670位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第30812至30641位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第33706至33956位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第54294至54548位所示的DNA片段或BRCA1基因自5’末端起第79893至79719位所示的DNA片段。
上述方法二中，所述锁核酸修饰具体可为对所述LNA探针-1至所述LNA探针-440中的特定几个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(见表1中的第二列的下划线标注)进行的锁核酸修饰。
上述方法二中，所述步骤(1)依次可包括如下步骤：
(1-1)将基因组DNA进行片段化，得到片段化的基因组DNA；
(1-2)将所述片段化的基因组DNA进行平末端化、5’末端磷酸化和3’末端加腺苷尾，得到末端修复产物；
(1-3)将所述末端修复产物连接接头，得到连接有接头的末端修复产物；
(1-4)以所述连接有接头的末端修复产物为模板，进行PCR扩增反应。
所述步骤(1-1)具体可如下：
(1-1a)提取目的细胞的基因组DNA；
(1-1b)配置反应体系；反应体系由目的细胞的基因组DNA和水组成；
(1-1c)将所述反应体系置于冰上进行超声破碎，得到破碎液；
(1-1d)将所述破碎液进行浓缩干燥，得到浓缩液；然后加入超纯水，得到片段化的基因组DNA的溶液。
所述目的细胞可为293T细胞。
所述步骤(1-2)中，“所述片段化的基因组DNA进行平末端化、5’末端磷酸化和3’末端加腺苷尾”的实现方法为：将所述片段化的基因组DNA和反应混合液混合后，孵育；所述反应混合液含有10×末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I、T4多聚核苷酸激酶和BstDNA聚合酶。
所述步骤(1-2)具体可如下：
(1-2a)配置末端修复体系；末端修复体系由10×末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I、T4多聚核苷酸激酶、Bst DNA聚合酶、所述片段化的基因组DNA的溶液和ddH2O组成；
(1-2b)取离心管，加入所述末端修复体系，孵育，得到末端修复产物。
所述步骤(1-2b)中，孵育具体可为先20℃孵育30min，再65℃孵育30min。
所述10×末端修复缓冲液的溶质及其浓度可为800-1000mM MgCl2、20-40mM DTT、8-12mMATP、0.8-1.2μg/μL BSA和3-5mM dNTPs；溶剂可为pH8.1-8.5、400-600mM的Tris-HCl缓冲液。
所述10×末端修复缓冲液的溶质及其浓度具体可为900mM MgCl2、30mM DTT、10mMATP、1μg/μL BSA和4mM dNTPs；溶剂具体可为pH8.3、500mM的Tris-HCl缓冲液。
所述步骤(1-3)中，所述接头可由DNA分子甲和DNA分子乙进行退火反应形成。所述DNA分子甲可为序列表中的序列441所示的单链DNA分子。所述DNA分子乙可为序列表中的序列442所示的单链DNA分子。
所述步骤(1-3)具体可如下：
(1-3a)配置接头连接体系；接头连接体系可由快速连接缓冲液、所述末端修复产物、T4DNA Ligase(Rapid)、所述接头和不含核酸酶的水组成；
(1-3b)取所述接头连接体系，孵育，得到连接有接头的DNA片段；
(1-3c)从连接有接头的DNA片段中，回收DNA片段大小为300－500bp的DNA片段，然后纯化，得到纯化的连接有接头的末端修复产物。
所述(1-3a)中，所述快速连接缓冲液的溶质及其浓度具体可为10mM MgCl2、30mMDTT、10mM ATP和25％(质量浓度为25g/100mL)PEG8000；溶剂具体可为pH7.5、150mM的Tris-HCl缓冲液。
所述步骤(1-3b)中，孵育具体可为22℃孵育30min。
所述步骤(1-3c)中，所述纯化具体可采用QIA quick Gel Extraction Kit进行。
所述步骤(1-4)中，所述进行PCR扩增反应的引物可为所述DNA分子甲和DNA分子丙。所述DNA分子丙可为序列表中的序列443所示的单链DNA分子。
所述DNA分子甲的3’末端的1个碱基可进行硫代修饰或锁核酸修饰。
所述DNA分子乙的5’末端的1个碱基可进行磷酸修饰。
所述DNA分子丙的3’末端的1个碱基可进行硫代修饰或锁核酸修饰。
所述步骤(1-4)具体可如下：
(1-4a)配制富集体系；富集体系可由纯化的连接有接头的末端修复产物、2×PCR扩增缓冲液、所述DNA分子甲、所述DNA分子丙、PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase和不含核酸酶的水组成；
(1-4b)取所述富集体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(1-4c)取所述PCR扩增产物，纯化，得到基因组DNA文库。
所述步骤(1-4a)中，所述2×PCR扩增缓冲液的溶质及其浓度具体可为20mmol/LTris、100mmol/L KCl、4mmol/L MgCl2、0.18％(质量浓度为0.18g/100mL)Triton-100、0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)Tween20、2μg/μL BSA和0.4mmol/L dNTPs；溶剂具体可为水；pH值自然。
所述步骤(1-4c)中，所述纯化可采用1.8×Agencourt AMPure XP磁珠进行。
上述方法二中，所述步骤(2)具体可如下：
(2-1)根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列设计表1所示的440个LNA探针且各个LNA探针的5’末端均进行了生物素修饰；
(2-2)将表1所示的各个LNA探针用不含核酸酶的水溶解，得到相应的LNA探针溶液；然后将各个LNA探针溶液混合，得到捕获探针文库；捕获探针文库中，总DNA浓度为100ng/μL，且各个LNA探针在捕获探针文库中的DNA浓度均相同；
(2-3)配制杂交体系；杂交体系由所述预杂交产物、捕获探针文库和杂交缓冲液组成；
(2-4)取所述杂交体系，孵育，得到杂交产物。
所述步骤(2-3)中，所述杂交缓冲液的溶质及其浓度具体可为10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1.5mol/L氯化钠、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)十二烷基硫酸钠、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)聚蔗糖400、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)聚乙烯吡咯烷酮K40和0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)牛血清白蛋白；溶剂具体可为100mM的磷酸二氢钠水溶液；pH值自然。聚乙烯吡咯烷酮K40具体可为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，订货号为A610436-0250。
所述步骤(2-4)中，所述孵育具体可为65℃孵育24h。
上述方法二中，还可包括如下步骤(a)：完成步骤(1)后、进行步骤(2)前，进行预杂交。所述预杂交中采用的预杂交液中可含有所述DNA分子甲和所述DNA分子丙。
所述步骤(a)具体可如下：
(a-1)配制预杂溶液；预杂溶液可由所述基因组DNA文库和预杂交液组成；
(a-2)取所述预杂溶液，孵育，得到预杂交产物。
所述步骤(a-1)中，所述预杂交液的溶质及其浓度具体可为0.3μg/μL Human Cot-1DNA、3μg/μL鲑鱼精DNA、37.5μM所述DNA分子甲和37.5μM所述DNA分子丙；溶剂具体可为超纯水；pH值自然。Human Cot-1DNA具体可为invitrogen公司的产品，产品目录号为15279-011。
所述步骤(a-2)中，所述孵育具体可为先95℃孵育5min，再65℃孵育5min。
上述方法二中，还可包括如下步骤(b)：完成步骤(2)后，变性后收集靶序列。
所述步骤(b)具体可如下：
(b-1)制备链霉亲和素包被磁珠的溶液；
(b-2)取离心管，加入所述链霉亲和素包被磁珠的溶液和所述杂交产物，孵育；然后离心，弃上清；
(b-3)完成步骤(b-2)后，取所述离心管，加入低严谨性洗涤液，洗涤；
(b-4)完成步骤(b-3)后，取所述离心管，加入高严谨性洗涤液，洗涤；
(b-5)完成步骤(b-4)后，取所述离心管，加入变性液，变性；
(b-6)完成步骤(b-5)后，取所述离心管，加入1.8×Agencourt AMPure XP磁珠，纯化，得到纯化液；
(b-7)配制PCR扩增体系；PCR扩增体系由所述纯化液、所述2×PCR扩增缓冲液、所述DNA分子甲、所述DNA分子丙、PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase和不含核酸酶的水组成；
(b-8)取所述PCR扩增体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(b-9)取所述PCR扩增产物，纯化，得到文库扩增纯化产物。
所述步骤(b-2)中，孵育具体可为室温孵育30min。
所述步骤(b-3)中，所述低严谨性洗涤液的溶质及其浓度具体可为15mmol/L柠檬酸钠、0.15mol/L氯化钠和0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)十二烷基硫酸钠；溶剂具体可为不含核酸酶的水；pH值自然。
所述步骤(b-4)中，所述高严谨性洗涤液的溶质及其浓度具体可为1.5mmol/L柠檬酸钠、15mol/L氯化钠和0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)十二烷基硫酸钠；溶剂具体可为不含核酸酶的水；pH值自然。
所述步骤(b-5)中，所述变性液的溶质及其浓度具体可为0.1mol/L氢氧化钠；溶剂具体可为不含核酸酶的水；pH值自然。
所述步骤(b-9)中，所述纯化可采用1.8×Agencourt AMPure XP磁珠进行。
上述方法二中，还可包括如下步骤(c)：完成步骤(b)后，将所述靶序列连接到克隆载体进行测序。
所述步骤(c)具体如下：将所述文库扩增纯化产物和克隆载体连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序。所述克隆载体具体可为载体pTG19-T。
上文中，所述T4DNA聚合酶的商业名称为T4DNA Polymerase，具体可为NEB公司的产品，产品目录号为M0203S。DNA聚合酶I的商业名称为DNA Polymerase I，Large(Klenow)Fragment，具体可为NEB公司的产品，产品目录号为M0210S。T4多聚核苷酸激酶的商业名称为T4Polynucleotide Kinase，具体可为NEB公司的产品，产品目录号为M0201。T4DNALigase(Rapid)可为苏州吉玛基因股份有限公司的产品，产品目录号为J03002。Bst DNA聚合酶的商业名称为Bst DNAPolymerase，Large Fragment，具体可为NEB公司的产品，产品目录号为M0275。PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase可为NEB公司的产品，产品目录号为M0530S。QIA quick Gel Extraction Kit可为Qiagen公司的产品，产品目录号为28704。所述1.8×Agencourt AMPure XP磁珠可为贝克曼库尔特有限公司生产的Agencourt AMPureXP Kit(产品目录号为A63880)中的组件。M-280链霉亲和素磁珠可为invitrogen公司的产品，产品目录号为11205D。载体pTG19-T具体可为上海捷瑞生物工程有限公司的产品，产品目录号为GV0101。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种反应混合液。
本发明所提供的反应混合液，含有所述10×末端修复缓冲液、所述T4DNA聚合酶、所述DNA聚合酶I、所述T4多聚核苷酸激酶和所述Bst DNA聚合酶。所述反应混合液可对片段化的DNA进行平末端化和/或5’末端磷酸化和/或3’末端加腺苷尾。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种靶序列文库。
本发明所提供的靶序列文库，可由上述任一所述从生物DNA中捕获靶序列的方法得到的靶序列组成。
上述任一所述从生物DNA中捕获靶序列的方法在测序中的应用。
上述应用中，所述测序可为高通量测序。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种测序方法。
本发明所提供的测序方法，可包括如下步骤：按照上述任一所述从生物DNA中捕获靶序列的方法获得靶序列。
上述测序方法还可包括如下步骤：回收所述靶序列并连接到克隆载体进行测序。所述克隆载体具体可为所述载体pTG19-T。
捕获探针文库的应用也属于本发明的保护范围；所述捕获探针文库的应用可为如下(Z1)或(Z2)或(Z3)或(Z4)：
(Z1)从生物DNA中捕获靶序列；
(Z2)从生物DNA中分离靶序列；
(Z3)从生物DNA中富集靶序列；
(Z4)测序；
所述捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
上述应用中，所述生物DNA可为生物的基因组DNA或生物的cDNA。
上述应用中，所述生物DNA可为基因组DNA文库。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种捕获探针文库。
本发明所提供的捕获探针文库，由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
所述捕获探针文库具体可由如下440个探针组成：LNA探针-1至LNA探针-440；所述LNA探针-1至所述LNA探针-440的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列表的序列440所示。所述LNA探针-1至所述LNA探针-440是根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。由上述440个探针组成的捕获探针文库可用于捕获BRCA1基因和BRCA2基因中的靶序列，如BRCA1基因自5’末端起第79823至79670位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第30812至30641位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第33706至33956位所示的DNA片段、BRCA1基因自5’末端起第54294至54548位所示的DNA片段或BRCA1基因自5’末端起第79893至79719位所示的DNA片段。
实验证明，采用本发明所提供的从生物DNA中捕获靶序列的方法可以捕获靶序列：制备捕获探针文库，捕获探针文库由如下440个探针组成：表1所示LNA探针-1至LNA探针-440，所述LNA探针-1至所述LNA探针-440为根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列设计合成；采用捕获探针文库捕获靶序列。结果表明，捕获探针文库可以捕获BRCA1基因和BRCA2基因中相应靶序列。因此，本发明所提供的方法在基因检测、有家族遗传史的特定人群的筛查、大众体检市场、开发单基因和/或多基因遗传疾病的检测试剂盒等方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为构建靶序列液相捕获高通量测序文库的技术路线。
图2为实施例1步骤二的实验结果。
图3为实施例1步骤四中3的实验结果。
图4为实施例1步骤五的实验结果。
图5为实施例1步骤十中3的实验结果。
图6为实施例1步骤十中4的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
人工合成单链DNA分子甲、单链DNA分子乙和单链DNA分子丙。单链DNA分子甲的核苷酸序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(序列表中序列441)，其中3’末端的1个碱基进行硫代修饰。单链DNA分子乙的核苷酸序列为：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(序列表中序列442)，其中5’末端的1个碱基进行磷酸修饰。单链DNA分子丙的核苷酸序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(序列表中序列443)其中3’末端的1个碱基进行硫代修饰。
10×末端修复缓冲液：溶质及其浓度为900mM MgCl2、30mM DTT、10mM ATP、1μg/μLBSA和4mM dNTPs；溶剂为pH8.3、500mM的Tris-HCl缓冲液。
快速连接缓冲液：溶质及其浓度为10mM MgCl2、30mM DTT、10mM ATP和25％(质量浓度为25g/100mL)PEG8000；溶剂为pH7.5、150mM的Tris-HCl缓冲液。
预杂交液：溶质及其浓度为0.3μg/μL Human Cot-1DNA、3μg/μL鲑鱼精DNA、37.5μM单链DNA分子甲和37.5μM单链DNA分子丙；溶剂为超纯水；pH值自然。Human Cot-1DNA为invitrogen公司的产品，产品目录号为15279-011。
杂交缓冲液：溶质及其浓度为10mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1.5mol/L氯化钠、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)十二烷基硫酸钠、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)聚蔗糖400、0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)聚乙烯吡咯烷酮K40和0.2％(质量浓度为0.2g/100mL)牛血清白蛋白；溶剂为100mM的磷酸二氢钠水溶液；pH值自然。聚乙烯吡咯烷酮K40为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，订货号为A610436-0250。
结合液：溶质及其浓度为0.5mol/L氯化钠、2.5mmol/L Tris碱和0.25mmol/L乙二胺四乙酸二钠；溶剂为不含核酸酶的水；pH值为7.5。
低严谨性洗涤液：溶质及其浓度为15mmol/L柠檬酸钠、0.15mol/L氯化钠和0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)十二烷基硫酸钠；溶剂为不含核酸酶的水；pH值自然。
高严谨性洗涤液：溶质及其浓度为1.5mmol/L柠檬酸钠、15mol/L氯化钠和0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)十二烷基硫酸钠；溶剂为不含核酸酶的水；pH值自然。
变性液：溶质及其浓度为0.1mol/L氢氧化钠；溶剂为不含核酸酶的水；pH值自然。
中和液：溶质及其浓度为1mol/L Tris碱；溶剂为不含核酸酶的水；pH值为7.5。
洗脱液：溶质及其浓度为10mmol/L Tris碱；溶剂为不含核酸酶的水；pH值为8.0。
2×PCR扩增缓冲液：溶质及其浓度为20mmol/L Tris、100mmol/L KCl、4mmol/LMgCl2、0.18％(质量浓度为0.18g/100mL)Triton-100、0.1％(质量浓度为0.1g/100mL)Tween20、2μg/μL BSA和0.4mmol/L dNTPs；溶剂为水；pH值自然。
T4DNA Polymerase为NEB公司的产品，产品目录号为M0203S。在下文中，T4DNAPolymerase称为T4DNA聚合酶。
DNA Polymerase I，Large(Klenow)Fragment为NEB公司的产品，产品目录号为M0210S。在下文中，DNA Polymerase I，Large(Klenow)Fragment称为DNA聚合酶I。
T4Polynucleotide Kinase为NEB公司的产品，产品目录号为M0201。在下文中，T4Polynucleotide Kinase称为T4多聚核苷酸激酶。
T4DNA Ligase(Rapid)为苏州吉玛基因股份有限公司的产品，产品目录号为J03002。
Bst DNAPolymerase，Large Fragment为NEB公司的产品，产品目录号为M0275。在下文中，Bst DNAPolymerase，Large Fragment称为Bst DNA聚合酶。
PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase为NEB公司的产品，产品目录号为M0530S。在下文中，PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase称为高保真DNA聚合酶。
QIA quick Gel Extraction Kit为Qiagen公司的产品，产品目录号为28704。
293T细胞为中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的产品，产品目录号为SCSP-q04。
1.8×Agencourt AMPure XP磁珠为贝克曼库尔特有限公司生产的AgencourtAMPure XPKit(产品目录号为A63880)中的组件。
M-280链霉亲和素磁珠为invitrogen公司的产品，产品目录号为11205D。
载体pTG19-T为上海捷瑞生物工程有限公司的产品，产品目录号为GV0101。
超声波细胞粉碎机scientz-IID为宁波新芝生物科技股份有限公司的产品。
实施例1、
构建用于高通量测序的靶序列捕获文库的技术路线如图1所示。
一、基因组DNA提取
提取293T细胞的基因组DNA，进行2％琼脂糖凝胶电泳，实验结果见图2中2(M为DNAMarker)。将该基因组DNA命名为293T基因组DNA。
二、基因组DNA片段化
1、配置反应体系。500μL反应体系由4μL浓度为500ng/μL的293T基因组DNA和496μL水组成。
2、完成步骤1后，取反应体系，冰浴5min，然后置于冰上采用超声波细胞粉碎机scientz-IID超声破碎(功率为05％，作用2s，间隔2s，共10min)，得到破碎液。
3、完成步骤2后，取破碎液，用离心浓缩干燥仪进行浓缩干燥，得到浓缩液；然后加入20μL超纯水，得到片段化的基因组DNA溶液。
将片段化的基因组DNA溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图2中1(M为DNAMarker)。结果表明，片段化的基因组DNA溶液中293T基因组DNA进行了片段化。
三、末端修复及加A尾
1、配置末端修复体系。末端修复体系为30μL，由3μL 10×末端修复缓冲液、12UT4DNA聚合酶、5U DNA聚合酶I、40U T4多聚核苷酸激酶、5U Bst DNA聚合酶、步骤二中3获得的全部的片段化的基因组DNA溶液和ddH2O组成。
2、完成步骤1后，取低吸附性离心管，加入末端修复体系，先置于20℃孵育30min，再65℃孵育30min，最后4℃保存，得到DNA片段末端修复产物。
进行步骤三的目的为将片段化的基因组DNA溶液中的DNA的粘性末端修复成平末端，并在5’末端进行磷酸化修饰，在3’末端加上一个腺苷尾。
四、连接接头及纯化
1、用去离子水将单链DNA分子甲稀释，得到单链DNA分子甲稀释液。用去离子水将单链DNA分子乙稀释，得到单链DNA分子乙稀释液。取单链DNA分子甲稀释液和单链DNA分子乙稀释液，进行退火反应，形成接头。
2、配置接头连接体系。接头连接体系为60μL，由18μL快速连接缓冲液、步骤三中2获得的全部的DNA片段末端修复产物、10U T4DNA Ligase(Rapid)、接头和不含核酸酶的水组成。接头在接头连接体系中的浓度为3.5μM。
3、完成步骤2后，将接头连接体系置于22℃孵育30min，得到连接有接头的DNA片段。
取连接有接头的DNA片段，进行2％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图3(M为DNAMarker，泳道1和泳道2均为连接有接头的DNA片段)。
4、完成步骤3后，回收DNA片段大小为300－500bp的连接有接头的DNA片段，然后用QIA quick Gel Extraction Kit纯化，获得目的产物。
5、完成步骤4后，取所述目的产物，用40μL EB Buffer洗脱，得到纯化的连接有接头的DNA片段。
五、基因组DNA文库的获得
1、配制富集体系。富集体系为100μL，由40μL纯化的连接有接头的DNA片段、50μL2×PCR扩增缓冲液、单链DNA分子甲、单链DNA分子丙、2U PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase和不含核酸酶的水组成。单链DNA分子甲在富集体系中的浓度为250nmol/L。单链DNA分子丙在富集体系中的浓度为250nmol/L。
2、完成步骤2后，将所述富集体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃30s，15个循环；72℃10min；4℃保存。
3、完成步骤2后，取所述PCR扩增产物，先采用1.8×Agencourt AMPure XP磁珠纯化，然后用30μL洗脱液洗脱，得到基因组DNA文库。
取基因组DNA文库，进行2％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图4(M为DNA Marker，泳道1为基因组DNA文库)。
六、预杂交
1、配制预杂溶液。预杂溶液由5μL DNA浓度为100ng/μL的基因组DNA文库和8μL预杂交液组成。
2、完成步骤2后，取所述预杂溶液，先置于95℃孵育5min，再置于65℃孵育5min，得到预杂交产物。
七、捕获探针文库的制备
1、LNA探针的制备
根据BRCA1基因(GI:262359905)和BRCA2基因(GI:568815585)的核苷酸序列，设计捕获探针，然后由上海吉玛制药技术有限公司合成表1所示的440个LNA探针(各个LNA探针中，对部分T或全部T进行锁核酸修饰，具体如表1所示，下划线为锁核酸修饰的T)，且各个LNA探针的5’末端均进行了生物素修饰。
LNA探针组合由表1所示的440个LNA探针组成，各个LNA探针均为单链DNA分子，它们的核苷酸序列依次如序列表中的序列1至序列表中的序列440所示。
表1
注：下划线为锁核酸修饰的T。
2、捕获探针文库的获得
分别将表1所示的各个LNA探针用不含核酸酶的水溶解，得到相应的LNA探针溶液；然后将各个LNA探针溶液混合，得到捕获探针文库。捕获探针文库中，总DNA浓度为100ng/μL，且各个LNA探针在捕获探针文库中的DNA浓度均相同。
八、杂交
1、配制杂交体系。杂交体系为30μL，由步骤六中2获得的全部的预杂交产物、4μL捕获探针文库和13μL杂交缓冲液组成。
2、完成步骤2后，取所述杂交体系，置于65℃孵育24h，得到杂交产物。
九、靶序列捕获
1、准备链霉亲和素包被磁珠的溶液
(1)取低吸附离心管，加入50μLM-280链霉亲和素磁珠和200μL结合液，然后涡旋振荡混匀。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力分离器2min，弃上清，然后加入165μL结合液，重悬磁珠。
(3)重复步骤(2)两次。
(4)完成步骤(3)后，取所述低吸附离心管，加入165μL结合液，重悬磁珠，得到链霉亲和素包被磁珠的溶液。
2、共孵育捕获
(1)取所述低吸附离心管，加入步骤八中2获得的全部的杂交产物和步骤九1中(4)获得的全部的链霉亲和素包被磁珠的溶液，混匀，室温孵育30min。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力分离器2min，弃上清。
3、洗涤
(1)完成步骤2后，取所述低吸附离心管，加入165μL低严谨性洗涤液，混匀，室温静置15min。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述低吸附离心管，加入165μL高严谨性洗涤液(已65℃预热)，65℃孵育10min。
(4)完成步骤(3)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。
(5)重复步骤(4)两次。
进行步骤3的目的为将没有与M-280链霉亲和素磁珠结合的LNA探针洗掉。
4、变性
(1)完成步骤3后，取所述低吸附离心管，加入50μL变性液，重悬，室温静置10min。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min。
(3)完成步骤(2)后，将上清转移至离心管，然后加入50μL中和液，得到中和溶液。
5、纯化
(1)完成步骤4后，加入已室温平衡的1.8×Agencourt AMPure XP磁珠，涡旋10s，室温静置5min。
(2)完成步骤(1)后，取所述离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述离心管，加入500μL 70％(体积百分比)乙醇水溶液，室温静置2min，弃上清。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)完成步骤(4)后，取所述离心管，室温干燥5min。
(6)完成步骤(5)后，取所述离心管，用40μL洗脱液重悬。
(7)完成步骤(6)后，取所述离心管，置于磁力分离器2min，将上清转移至离心管，得到纯化液。
十、扩增回收
1、配制PCR扩增体系。PCR扩增体系为100μL，由40μL步骤九5中(7)获得的纯化液、50μL 2×PCR扩增缓冲液、单链DNA分子甲、单链DNA分子丙、2U PhusionHigh-FidelityDNAPolymerase和不含核酸酶的水组成。单链DNA分子甲在PCR扩增体系中的浓度为250nmol/L。单链DNA分子丙在PCR扩增体系中的浓度为250nmol/L。
2、完成步骤1后，将所述PCR扩增体系进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃30s，15个循环；72℃10min；4℃保存。
3、完成步骤2后，取所述PCR扩增产物，先采用1.8×Agencourt AMPure XP磁珠纯化，然后用30μL不含核酸酶的水洗脱，得到文库扩增纯化产物，该文库扩增纯化产物即为靶序列捕获文库S1。
将文库扩增纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。实验结果见图5(M为DNA Marker)。
4、完成步骤2后，将所述文库扩增纯化产物加腺苷尾后和载体pTG19-T连接，得到重组质粒。将所述重组质粒转化DH5α大肠杆菌，得到重组大肠杆菌。
随机选取20个重组大肠杆菌(依次命名为Ca09-S4-001至Ca09-S4-0020)，提取质粒并进行测序。部分测序结果见图6：A为Ca09-S4-002，捕获的DNA片段具体如BRCA1基因自5’末端起第79823至79670位所示；B为Ca09-S4-004，捕获的DNA片段具体如BRCA1基因自5’末端起第30812至30641位所示；C为Ca09-S4-007，捕获的DNA片段具体如BRCA1基因自5’末端起第33706至33956位所示；D为Ca09-S4-0012，捕获的DNA片段具体如BRCA1基因自5’末端起第54294至54548位所示；E为Ca09-S4-0018，捕获的DNA片段具体如BRCA1基因自5’末端起第79893至79719位所示。
取步骤4获得的其它的重组大肠杆菌，提取质粒并进行测序。测序结果表明，捕获探针文库可以捕获BRCA1基因和BRCA2基因中相应的靶序列。可见，采用步骤七制备的捕获探针文库可以捕获靶序列。
按照步骤一至步骤十中3的步骤，重复两次，分别得到靶序列捕获文库S2和靶序列捕获文库S3。
十一、高通量测序及数据分析
1、将靶序列捕获文库S1、靶序列捕获文库S2或靶序列捕获文库S3用Hiseq 3000平台进行测序，测序数据用FASTX Toolkit 0.0.13软件(网址为：http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)中的fastq_quality_trimmer模块去除去除低质量读段，用fastx_clipper模块去除读段中的接头序列，用nsplit.pl脚本(可由发明人编写)分隔含N的读段，用FastqPECombine.pl脚本(可由发明人编写)提取分隔后的配对读段。测序数据预处理后的结果见表2。
表2
2、使用bwa-0.7.15软件(网址为：https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/)对有效数据与基因组DNA进行比对，用Samtools 0.1.19软件(网址为：https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.19/)把比对的sam格式转换成bam格式，Samtools 0.1.19 flagstat模块统计读段数的比对率。
与参考基因组比对后的统计结果见表3。结果表明，各样本比对到参考基因组上的总比对率均在98％以上，其中成对比对率约70％。
表3
3、用bedtools-2.17.0软件(网址为：https://github.com/arq5x/bedtools/releases/tag/v2.17.0)中的coverage模块计算靶区域的覆盖率。靶区域的覆盖率见表4。
表4
靶序列捕获文库 覆盖率(％)
S1 94.60
S2 96.98
S3 96.44
根据富集效率的计算公式用TEQC3.16.0软件(网址为：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TEQC.btm)计算靶区域的富集效率，靶区域的富集效率见表5。
表5
靶序列捕获文库 富集效率(倍)
S1 154821.9
S2 159792.6
S3 139448.7
上述结果表明，本发明所提供的LNA探针组合可用于构建捕获探针文库，进一步利用该文库捕获基因组靶序列。因此，本发明所提供的方法，可制备靶序列的捕获文库。
<110> 苏州吉赛基因测序科技有限公司
<120> 一种用于高通量测序的捕获基因组靶序列的方法
<160> 443
<170> PatentIn version 3.5
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<212>DNA
<213>人工序列
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gacagagaac acaagcagag attagtgtca attcattctc ctgga 45
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ggtcaccaca ggtgcctcac acatctgccc aattgctgga gacag 45
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tctggggtat caggtaggtg tccagctcct ggcactggta gagtg 45
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cctgtggctc tgtacctgtg gctggctgca gtcagtagtg gctgt 45
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tccccaggaa ggaaagagca ttcaaagtgt caaagtagga ctact 45
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aggcacctta ccatggaagc cattgtcctc tgtccaggca tctgg 45
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catatagcac aggtacatgc aggcacctta ccatggaagc cattg 45
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agctgtacca tccattccag ttgatctaaa atggacattt agatgta 47
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tcaccacaga agcaccacac agctgtacca tccattccag ttgatct 47
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ggtgaatgat gaaagctcct tcaccacaga agcaccacac agctgta 47
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ggggttctcc caggctctta cctgtgggca tgttggtgaa gggcc 45
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agaaaccaaa cacaacccat caggataaga gaaagagaag cttcc 45
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ccattgacca catctcctct gacttcaaaa tcatgctgaa agaaa 45
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cctttctgtc ctgggattct cttgctcgct ttggaccttg gtggt 45
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acttgaggga gggagcttta cctttctgtc ctgggattct cttgc 45
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gtggggtgag atttttgtca acttgaggga gggagcttta ccttt 45
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<223>
<400>21
gagatcatag aaaagacagg ttacatacag cagaagaacg tgctc 45
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
tagactgggt cacccctaaa gagatcatag aaaagacagg ttaca 45
<210>23
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
tcagcatttt tctttcttta atagactggg tcacccctaa agagat 46
<210>24
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
agcatctgca gaatgaaaaa cactcaaagg attagaagtt gaaaaca 47
<210>25
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
gtccgttcac acacaaactc agcatctgca gaatgaaaaa cactcaa 47
<210>26
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
ttcctagaaa atatttcagt gtccgttcac acacaaactc agcatct 47
<210>27
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
tacccatttt cctcccgcaa ttcctagaaa atatttcagt gtccgtt 47
<210>28
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
tacttacaga aatagctaac tacccatttt cctcccgcaa ttcctag 47
<210>29
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
tgaggtgtta aagggaggag gggagaaata gtattatact tacagaa 47
<210>30
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>30
tctggcaaac ttgtacacga gcatctgaaa ttaaatcaaa tattcca 47
<210>31
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>31
gttaaagtga tgtggtgttt tctggcaaac ttgtacacga gcatctg 47
<210>32
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>32
gcagatgcaa ggtattctgt aaaggttctt ggtatacctg ttttcat 47
<210>33
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>33
cctctgaaag gaatgggaga agtttaattt acacaacgat gaatgtt 47
<210>34
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>34
ggtcatcaga gaagaggctg attccagatt ccaggtaagg ggttccc 47
<210>35
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>35
ttcagaagga tcagattcag ggtcatcaga gaagaggctg attccag 47
<210>36
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>36
gctgactctg gggctctgtc ttcagaagga tcagattcag ggtcatc 47
<210>37
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>37
atggtatgtt gccaacacga gctgactctg gggctctgtc ttcagaa 47
<210>38
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38
tttcaatgca gaggttgaag atggtatgtt gccaacacga gctgact 47
<210>39
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>39
gcaactttca attggggaac tttcaatgca gaggttgaag atggtat 47
<210>40
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>40
ctggactctg ggcagattct gcaactttca attggggaac tttcaat 47
<210>41
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>41
tcttccattg cattataccc agcagtatca gtagtatgag cagcagc 47
<210>42
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>42
gcttctccct gctcacactt tcttccattg cattataccc agcagta 47
<210>43
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>43
tgttgaagct gtcaattctg gcttctccct gctcacactt tcttcca 47
<210>44
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>44
attcttttgt tgaccctttc tgttgaagct gtcaattctg gcttctc 47
<210>45
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>45
tacatatgga tacactcaca aattcttctg gggtcaggcc agacacc 47
<210>46
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>46
aagataaatg gaaggagaaa accatcgcca ccaattgtga aagga 45
<210>47
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>47
ttagaagggg atgacctaga aagataaatg gaaggagaaa accat 45
<210>48
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>48
cctatcatct aatgatgggc atttagaagg ggatgaccta gaaagat 47
<210>49
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>49
gactcccaga gcaactgtgc atgtaccacc tatcatctaa tgatggg 47
<210>50
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>50
tgggtagttt ctattctgaa gactcccaga gcaactgtgc atgtacc 47
<210>51
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>51
ttaatgagct cctcttgaga tgggtagttt ctattctgaa gactccc 47
<210>52
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>52
gctcctccac atcaacaacc ttaatgagct cctcttgaga tgggtag 47
<210>53
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>53
aagatgtttc cgtcaaatcg tgtggcccag actcttccag ctgttgc 47
<210>54
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>54
tttgttccaa tacagcagat gaaatattac ctagatcttg ccttggc 47
<210>55
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>55
cttctggatt ctggcttata gggtattcac tacttttctg tgaagtt 47
<210>56
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>56
aaacttgtca gcagaaaggc cttctggatt ctggcttata gggtatt 47
<210>57
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>57
tatttttact ggtagaacta tctgcagaca cctcaaactt gtcagca 47
<210>58
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>58
cctttccact cctggttctt tatttttact ggtagaacta tctgcag 47
<210>59
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>59
agcatcttta cattgatgtt tcttaccttt ccactcctgg ttcttta 47
<210>60
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>60
ccctctgctt caaaaacgat aaatggcacc aagaaaatga aatactt 47
<210>61
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>61
caggttatgt tgcatggtat ccctctgctt caaaaacgat aaatggc 47
<210>62
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>62
gaagggtagc tgttagaagg ctggctccca tgctgttcta acacagc 47
<210>63
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>63
cagaagagtc acttatgatg gaagggtagc tgttagaagg ctggctc 47
<210>64
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>64
atttcgcagg tcctcaaggg cagaagagtc acttatgatg gaagggt 47
<210>65
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>65
tctgatgtgc tttgttctgg atttcgcagg tcctcaaggg cagaaga 47
<210>66
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>66
gccaacaata cacacctttt tctgatgtgc tttgttctgg atttcgc 47
<210>67
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>67
gcttaagata tcagtgtttg gccaacaata cacacctttt tctgatg 47
<210>68
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>68
gctgcttcac cttaaataac aaaaacagag gttcagatgt aaaagca 47
<210>69
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>69
tttcactctc acacccagat gctgcttcac cttaaataac aaaaaca 47
<210>70
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>70
gcagtcttca gagacgcttg tttcactctc acacccagat gctgctt 47
<210>71
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>71
ctctgagagg atagccctga gcagtcttca gagacgcttg tttcact 47
<210>72
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>72
cctgagtggt taaaatgtca ctctgagagg atagccctga gcagtct 47
<210>73
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>73
cagtatttgt tacatccgtc tcagaaaatt cacaagcagc tgaaaat 47
<210>74
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>74
attactgggt tgatgatgtt cagtatttgt tacatccgtc tcagaaa 47
<210>75
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>75
tctcagtggt gttcaaatca ttattactgg gttgatgatg ttcagta 47
<210>76
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>76
aacagaacta ccctgatact tttctggatg cctctcagct gcacgct 47
<210>77
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>77
ggctccacat gcaagtttga aacagaacta ccctgatact tttctgg 47
<210>78
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>78
catgagtatt tgtgccacat ggctccacat gcaagtttga aacagaa 47
<210>79
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>79
ggctccttgc taagccaggc tgtttgcttt tattacagaa ttcagcc 47
<210>80
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>80
ctatcattac atgtttcctt acttccagcc catctgttat gttggct 47
<210>81
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>81
tattccattc ttttctctca cacaggggat cagcattcag atctacc 47
<210>82
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>82
tgagcatggc agtttctgct tattccattc ttttctctca cacaggg 47
<210>83
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>83
tcagtatctc taggattctc tgagcatggc agtttctgct tattcca 47
<210>84
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>84
gtgttatcca aggaacatct tcagtatctc taggattctc tgagcat 47
<210>85
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>85
actttctgaa tgctgctatt tagtgttatc caaggaacat cttcagt 47
<210>86
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>86
cttctggaaa accactcatt aactttctga atgctgctat ttagtgt 47
<210>87
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>87
cagaacctaa cagttcatca cttctggaaa accactcatt aactttc 47
<210>88
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>88
ctccccatca tgtgagtcat cagaacctaa cagttcatca cttctgg 47
<210>89
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>89
actttggcat ttgattcaga ctccccatca tgtgagtcat cagaacc 47
<210>90
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>90
gaacgtccaa tacatcagct actttggcat ttgattcaga ctcccca 47
<210>91
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>91
cactggccag taagtctatt ttctctgaag aaccagaata ttcatct 47
<210>92
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>92
tattaaagcc tcatgaggat cactggccag taagtctatt ttctctg 47
<210>93
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>93
tgaactcttt cacttttaca tattaaagcc tcatgaggat cactggc 47
<210>94
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>94
gcttgccttc ttccgatagg ttttcccaaa tattttgtct tcaatat 47
<210>95
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>95
ctataattag attttcagtt acatggctta agttggggag gcttgcc 47
<210>96
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>96
gacgctcttg tattatctgt ggctcagtaa caaatgctcc tataatt 47
<210>97
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>97
ctttaattta tttgtgaggg gacgctcttg tattatctgt ggctcag 47
<210>98
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>98
gatgtaggtc tccttttacg ctttaattta tttgtgaggg gacgctc 47
<210>99
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>99
atctgctttc ttgataaaat cctcaggatg aaggcctgat gtaggtc 47
<210>100
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>100
ggagtctttt gaactgccaa atctgctttc ttgataaaat cctcagg 47
<210>101
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>101
ttccctgatt tatcatttca ggagtctttt gaactgccaa atctgct 47
<210>102
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>102
attctgctcc gtttggttag ttccctgatt tatcatttca ggagtct 47
<210>103
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>103
gtaatattca tcacttgacc attctgctcc gtttggttag ttccctg 47
<210>104
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>104
cgttttgaaa gcagattctt tttcgagtga ttctattggg ttaggat 47
<210>105
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>105
ccatattgct tatactgctg cttataggtt cagctttcgt tttgaaa 47
<210>106
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>106
tcctcctcag cctattcttt ttaggtgctt ttgaattgtg gatattt 47
<210>107
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>107
aatatgcctg gtagaagact tcctcctcag cctattcttt ttaggtg 47
<210>108
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>108
actactagtt caagcgcatg aatatgcctg gtagaagact tcctcct 47
<210>109
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>109
gtgggcttag atttctactg actactagtt caagcgcatg aatatgc 47
<210>110
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>110
tttgcaattc agtacaatta ggtgggctta gatttctact gactact 47
<210>111
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>111
actgctagaa caactatcaa tttgcaattc agtacaatta ggtgggc 47
<210>112
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>112
gttctttacc ttccatgagt tgtaggtttc tgctgtgcct gactggc 47
<210>113
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>113
catttggctt gttactcttc ttggctccag ttgcaggttc tttacct 47
<210>114
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>114
atgtctttta cttgtctgtt catttggctt gttactcttc ttggctc 47
<210>115
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>115
tctgggaaag tatcgctgtc atgtctttta cttgtctgtt catttgg 47
<210>116
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>116
gtgcatttgt taacttcagc tctgggaaag tatcgctgtc atgtctt 47
<210>117
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>117
acacttagta aaagaaccag gtgcatttgt taacttcagc tctggga 47
<210>118
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>118
tctcttggaa ggctaggatt gacaaattct ttaagttcac tggtatt 47
<210>119
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>119
tctagtttct cttctttttc ttctcttgga aggctaggat tgacaaa 47
<210>120
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>120
tgagatcttt ggggtcttca gcattattag acactttaac tgtttct 47
<210>121
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>121
aaccctttct ccacttaaca tgagatcttt ggggtcttca gcattat 47
<210>122
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>122
acagatcttt cagtttgcaa aaccctttct ccacttaaca tgagatc 47
<210>123
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>123
atgaaatact gctactctct acagatcttt cagtttgcaa aaccctt 47
<210>124
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>124
ccataatcag taccaggtac caatgaaata ctgctactct ctacaga 47
<210>125
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>125
acgagatact ttcctgagtg ccataatcag taccaggtac caatgaa 47
<210>126
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>126
tagagtgcta acttccagta acgagatact ttcctgagtg ccataat 47
<210>127
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>127
ggttctgttt ttgccttccc tagagtgcta acttccagta acgagat 47
<210>128
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>128
actgactcac acatttattt ggttctgttt ttgccttccc tagagtg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>129
ggggttttca aatgctgcac actgactcac acatttattt ggttctg 47
<210>130
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>130
caaccatgaa ttagtccctt ggggttttca aatgctgcac actgact 47
<210>131
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>131
catttctatt atctttggaa caaccatgaa ttagtccctt ggggttt 47
<210>132
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>132
acttcatgtc ccaatggata cttaaagcct tctgtgtcat ttctatt 47
<210>133
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>133
ttgtttcccg actgtggtta acttcatgtc ccaatggata cttaaag 47
<210>134
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>134
actttcttcc atttctatgc ttgtttcccg actgtggtta acttcat 47
<210>135
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>135
gcaaatactg agcatcaagt tcactttctt ccatttctat gcttgtt 47
<210>136
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>136
tgaaaccttg aatgtattct gcaaatactg agcatcaagt tcacttt 47
<210>137
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>137
ggagcaaatg actggcgctt tgaaaccttg aatgtattct gcaaata 47
<210>138
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>138
catttcctgg atttgaaaac ggagcaaatg actggcgctt tgaaacc 47
<210>139
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>139
tgttgcacat tcctcttctg catttcctgg atttgaaaac ggagcaa 47
<210>140
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>140
attcaaaagt gacttttgga ctttgtttct ttaaggaccc agagtgg 47
<210>141
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>141
gcctgcagtg atattaactg tctgtacagg cttgatatta gactcat 47
<210>142
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>142
tggcattatc aactggctta tctttctgac caaccacagg aaagcct 47
<210>143
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>143
gcctcctttg atactacatt tggcattatc aactggctta tctttct 47
<210>144
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>144
gatgatagac aaaacctaga gcctcctttg atactacatt tggcatt 47
<210>145
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>145
tttcgttgcc tctgaactga gatgatagac aaaacctaga gcctcct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>146
atttggagta atgagtccag tttcgttgcc tctgaactga gatgata 47
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tgggttttgt aaaagtccat gtttatttgg agtaatgagt ccagttt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>148
ggaaaaagtg gtggtatacg atatgggttt tgtaaaagtc catgttt 47
<210>149
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>149
ttttaacaaa tgacttgatg ggaaaaagtg gtggtatacg atatggg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>150
ggtgacattg aatgttcctc aaagttttcc tctagcagat ttttctt 47
<210>151
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>151
catttcccat ttctctttca ggtgacattg aatgttcctc aaagttt 47
<210>152
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>152
cactgtactt ggaatgttct catttcccat ttctctttca ggtgaca 47
<210>153
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>153
ttattacggc taattgtgct cactgtactt ggaatgttct catttcc 47
<210>154
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>154
tggaacctac ttcattaata ttgcttgagc tggcttcttt aaaaaca 47
<210>155
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>155
ggagcccact tcattagtac tggaacctac ttcattaata ttgcttg 47
<210>156
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>156
gaacctattt cattaatact ggagcccact tcattagtac tggaacc 47
<210>157
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>157
cttgaatgtt ttcatcactg gaacctattt cattaatact ggagccc 47
<210>158
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>158
tctgtttcta cctagttctg cttgaatgtt ttcatcactg gaaccta 47
<210>159
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>159
atagcattca attttggccc tctgtttcta cctagttctg cttgaat 47
<210>160
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>160
gcaaaacccc taatctaagc atagcattca attttggccc tctgttt 47
<210>161
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>161
caattacttc caggaagact ttgtttatag acctcaggtt gcaaaac 47
<210>162
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>162
acttcccata ggctgttcta agttatctga aatcagatat ggagaga 47
<210>163
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>163
caaacctgag atgcatgact acttcccata ggctgttcta agttatc 47
<210>164
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>164
atttcaccat catctaacag gtcatcaggt gtctcagaac aaacctg 47
<210>165
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>165
gcttttgcta aaaacagcag aactttcctt aatgtcattt tcagcaa 47
<210>166
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>166
ctaagctctc ctttctggac gcttttgcta aaaacagcag aactttc 47
<210>167
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>167
tgaaagggct aggactcctg ctaagctctc ctttctggac gcttttg 47
<210>168
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>168
ctgagccaaa tgtgtatggg tgaaagggct aggactcctg ctaagct 47
<210>169
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>169
ttggcccctc ttcggtaacc ctgagccaaa tgtgtatggg tgaaagg 47
<210>170
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>170
cttctgagga ctctaatttc ttggcccctc ttcggtaacc ctgagcc 47
<210>171
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>171
gcagggaagc tcttcatcct cactagataa gttctcttct gaggact 47
<210>172
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>172
cggtgctatg cctagtagac tgagaaggta tattgtttac tttacca 47
<210>173
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>173
aaattctcct ctgtgttctt agacagacac tcggtagcaa cggtgct 47
<210>174
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>174
cctttgccaa tattacctgg ttactgcagt catttaagct attcttc 47
<210>175
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>175
aaggtgatgt tcctgagatg cctttgccaa tattacctgg ttactgc 47
<210>176
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>176
gaacattttg tttcctcact aaggtgatgt tcctgagatg cctttgc 47
<210>177
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>177
gtgaagaaaa caagctagca gaacattttg tttcctcact aaggtga 47
<210>178
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>178
gtcttccaat tcactgcact gtgaagaaaa caagctagca gaacatt 47
<210>179
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>179
ggatcctggg tgtttgtatt tgcagtcaag tcttccaatt cactgca 47
<210>180
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>180
tggaagaacc aatcaagaaa ggatcctggg tgtttgtatt tgcagtc 47
<210>181
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>181
agactgatgc ctcatttgtt tggaagaacc aatcaagaaa ggatcct 47
<210>182
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>182
agaccaactc cctggctttc agactgatgc ctcatttgtt tggaaga 47
<210>183
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>183
aaaccaattc cttgtcactc agaccaactc cctggctttc agactga 47
<210>184
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>184
tcctctttct tcatcatctg aaaccaattc cttgtcactc agaccaa 47
<210>185
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>185
ttattttctt ccaagcccgt tcctctttct tcatcatctg aaaccaa 47
<210>186
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>186
ccatgctttg ctcttcttga ttattttctt ccaagcccgt tcctctt 47
<210>187
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>187
ggttccaata cctaagtttg aatccatgct ttgctcttct tgattat 47
<210>188
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>188
tggggcaaac acaaaaacct ggttccaata cctaagtttg aatccat 47
<210>189
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>189
tcccacacta tagggaaaag acagagtcct aataagaaac actagtt 47
<210>190
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>190
atttgtaaca attcttgatc tcccacacta tagggaaaag acagagt 47
<210>191
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>191
ccctggttcc ttgaggggtg atttgtaaca attcttgatc tcccaca 47
<210>192
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>192
tgcaataagt tgccttatta acggtatctt cagaagaatc agatcct 47
<210>193
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>193
aaggttctct ttgactcacc tgcaataagt tgccttatta acggtat 47
<210>194
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>194
cagtatggta aagaacagtc aagcaattgt tggccagttc tgtgc 45
<210>195
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>195
gagactggtt tcctgctaaa cagtatggta aagaacagtc aagca 45
<210>196
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>196
aggttagaga gttggacact gagactggtt tcctgctaaa cagta 45
<210>197
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>197
tcagagttct cacagttcca aggttagaga gttggacact gagac 45
<210>198
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>198
ttgtatccgc tgctttgtcc tcagagttct cacagttcca aggtt 45
<210>199
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>199
tagacagacg tcttttgagg ttgtatccgc tgctttgtcc tcaga 45
<210>200
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>200
gacccttacc caattcaatg tagacagacg tcttttgagg ttgta 45
<210>201
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>201
gctgtttgca tctgtaaaat acaagggaaa acattatgtt tgcagtt 47
<210>202
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>202
agcccatact ttggatgata gaaacttcat cttttagatg ttcagga 47
<210>203
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>203
tcttttggca cggtttctgt agcccatact ttggatgata gaaactt 47
<210>204
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>204
tcgggttcac tctgtagaag tcttttggca cggtttctgt agcccat 47
<210>205
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>205
gttttaccaa ggaaggattt tcgggttcac tctgtagaag tcttttg 47
<210>206
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>206
tgtaggctcc tgaaattaaa ttgtttgaga aacacactca gcaagtg 47
<210>207
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>207
tcaacaagtt gactaaatct cgtactttct tgtaggctcc tgaaatt 47
<210>208
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>208
ttgggatatt caacacttac actccaaacc tgtgtcaagc tgaaaag 47
<210>209
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>209
acagcacttg agtgtcattc ttgggatatt caacacttac actccaa 47
<210>210
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>210
gccctttctt ctggttgaga agtttcagca tgcaaaatct ataaatt 47
<210>211
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>211
acataaagga cactgtgaag gccctttctt ctggttgaga agtttca 47
<210>212
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>212
ccttttggtt atatcattct tacataaagg acactgtgaa ggccctt 47
<210>213
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>213
gaatatcgta ggtaaaaatg cctattggat ccaaagagag gccaaca 47
<210>214
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>214
aagtaatgca atatggtaga ctggggagaa ctacaaacta ggaattt 47
<210>215
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>215
actctgccgc tgtaccaatc tcctgtaaaa gaattagata aattcaa 47
<210>216
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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tataatcagc tggcttcaac tccaataata ttcaaagagc aagggct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ctccacaaag gaaaccatct tataatcagc tggcttcaac tccaata 47
<210>218
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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acaattacga accaaaccta tttaaaactc cacaaaggaa accatct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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cctgcagaag aatctgaaca taaaaacaac aattacgaac caaacct 47
<210>220
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>220
gctccaccct ataattctga acctgcagaa gaatctgaac ataaaaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>221
cctgtccact tctaaattct tgtcttagtg aaaggtatga tgaagct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ggatcaagca gatgatgttt cctgtccact tctaaattct tgtctta 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ggaatgttcc caatagtaga cataaaagtc ttcgcacagt gaaaact 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>224
tctcactgaa ttattgtact gtttcaggaa ggaatgttcc caatagt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>225
ttgttctaca atgtacacat gtaacaccac aaagagataa gtcaggt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ggtatgtggg agtttgtttc atacaccaaa gtttgtgaag gtaaata 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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cccaccctta gttctactgt gctcataggt aataatagca aatgtgt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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caagttcttt agctacacca cccaccctta gttctactgt gctcata 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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ggatcctgat atgtcttggt caagttcttt agctacacca cccaccc 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agacaccaaa acatatttct gaaagtctag gagctgaggt ggatcct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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tctttcctcc cagggtcgtc agacaccaaa acatatttct gaaagtc 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aatgaagaag catctgaaac tgtatttcct catgatacta ctgctgt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>233
gaagctgcaa gtcatggtaa gtcctctgtt tagttgaact acagg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>234
gtgaaaacac aaatcaaaga gaagctgcaa gtcatggtaa gtcct 45
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<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
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tatcgcttct gtgacagaca gtgaaaacac aaatcaaaga gaagc 45
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agtctgaaga aaaatgatag atttatcgct tctgtgacag acagtga 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gaagcaccac ttacatttgc aaatgctgat tcaggtacct ctgtc 45
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<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
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aaatcagaac taattaactg ttcagcccag tttgaagcaa atgct 45
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cttatgtcca aatttaattg ataatggaag ctggccagcc accacca 47
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<212>DNA
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aaagtggact ggaaatacat actgtttgct cacagaagga ggactcc 47
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<212>DNA
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agactttcaa tgcaagtttt tcaggtcata tgactgatcc aaacttt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>242
tccagtggct tcttcatttc agggtatcaa aaagtctata ttcagaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>243
gagatgaaga gcagcatctt gaatctcata cagactgcat tcttgca 47
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>244
ggaaacagtg gtaaataaga gagatgaaga gcagcatctt gaatctc 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gcctaccaaa atcagagaag ccattaaatg aggaaacagt ggtaaat 47
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<212>DNA
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ttctttgcca cgtatttcta gcctaccaaa atcagagaag ccattaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>247
cagatggaga aaatacccct attgcatatt tcttcatgtg accaaaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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tttcaggtct aaatggagcc cagatggaga aaatacccct attgcat 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgaatggtct caactaaccc tttcaggtct aaatggagcc cagatgg 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gttgtaccgt ctttggcctg tgaatggtct caactaaccc tttcagg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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gtgacaaaat ctccaaggaa gttgtaccgt ctttggcctg tgaatgg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>252
gaagcccttt gagagtggaa gtgacaaaat ctccaaggaa gttgtac 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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gattcaaatg tagcaaatca gaagcccttt gagagtggaa gtgacaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>254
tgaagcaaac gctgatgaat gtgaaaaatc taaaaaccaa gtgaaag 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ccacattgga aagtcaatgc caaatgtcct agaagatgaa gtatatg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tgggtaagtg ttcattttta cctttcgtgt tgccaatcac tattttt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aggagagccc cttatcttag tgggtaagtg ttcattttta cctttcg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tcaagaattg gaaaaagaag aggagagccc cttatcttag tgggtaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tcccgaaaat gaggaaatgg ttttgtcaaa ttcaagaatt ggaaaaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>260
acacattctc tttttacatg tcccgaaaat gaggaaatgg ttttgtc 47
<210>261
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>261
ctaaactgcc aagtcatgcc acacattctc tttttacatg tcccgaa 47
<210>262
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>262
agatgatgaa ctgacagatt ctaaactgcc aagtcatgcc acacatt 47
<210>263
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>263
cacttgttga gaacattcat gttttgggaa aagaacaggc ttcacct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>264
ggtattagga accaaagtgt cacttgttga gaacattcat gttttgg 47
<210>265
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>265
caacaagaca aacaacagtt ggtattagga accaaagtgt cacttgt 47
<210>266
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>266
gtttctccat atctctctca atttcaacaa gacaaacaac agttggt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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tcgtgttgat aagagaaacc cagagcactg tgtaaactca gaaatgg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>268
aatgtatcaa aaatacttcc tcgtgttgat aagagaaacc cagagca 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agaactgagc atagtcttca ctattcacct acgtctagac aaaatgt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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gcaagtttcc attttagaaa gttccttaca caaagttaag ggagtgt 47
<210>271
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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catctgcttt ctctggattt agtacagcaa gtggaaagca agtttcc 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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cagctcacaa gagaagaaaa tactgctata cgtactccag aacattt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aaagtaacga acattcagac cagctcacaa gagaagaaaa tactgct 47
<210>274
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>274
cgcaagacaa gtgttttctg aaatagaaga tagtaccaag caagtct 47
<210>275
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>275
tcagatgctt cattacaaaa cgcaagacaa gtgttttctg aaataga 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>276
gtggaaaatc tgtccaggta tcagatgctt cattacaaaa cgcaaga 47
<210>277
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>277
tgggattttt agcacagcaa gtggaaaatc tgtccaggta tcagatg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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gtctcatctg caaatacttg tgggattttt agcacagcaa gtggaaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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tagggaagct tcataagtca gtctcatctg caaatacttg tgggatt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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acgcattcac ataaggtttt tgctgacatt cagagtgaag aaatttt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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attatggcag gttgttacga ggcattggat gattcagagg atattct 47
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<213>人工序列
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<400>282
catttaggat agccagtggt aaaatcgttt gtgtttcaca tgaaaca 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>283
ttttgaggta gggccacctg catttaggat agccagtggt aaaatcg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>284
tgtccatatc taatagtaat aattttgagg tagggccacc tgcattt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>285
aatgcatacc cacaaactgt aaatgaagat atttgcgttg aggaact 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>286
acagtagcat gtctaacagc tattcctacc attctgatga ggtatat 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>287
acacaaatca gtccccttat tcagtcattg aaaattcagc cttagct 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>288
aaaaagtcct gcaacttgtt acacaaatca gtccccttat tcagtca 47
<210>289
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>289
tggtgccacc taagctctta agtgataatt tatgtagaca aactgaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ccttgtttct attgagactg tggtgccacc taagctctta agtgata 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>291
gctgccccaa agtgtaaaga aatgcagaat tctctcaata atgataa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>292
gtgagaccat tgagatcaca gctgccccaa agtgtaaaga aatgcag 47
<210>293
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>293
taaagacctt gaattagcat gtgagaccat tgagatcaca gctgccc 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>294
ccatcaatgg gcaaagaccc taaagtacag agaggcctgt aaagacc 47
<210>295
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>295
agtgaaatca ccagttttag ccatcaatgg gcaaagaccc taaagta 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>296
aatctttgga caaagtgaaa aacctttttg atgaaaaaga gcaaggt 47
<210>297
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>297
aaaagatcaa agaacctact ctattgggtt ttcatacagc tagcggg 47
<210>298
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>298
gggacaaccc gaacgtgatg aaaagatcaa agaacctact ctattgg 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>299
aatcaactag tgaccttcca gggacaaccc gaacgtgatg aaaagat 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>300
gactgcaagt gggaaaaata ttagtgtcgc caaagagtca tttaata 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>301
gcgaaagctc aagaagcatg tcatggtaat acttcaaata aagaaca 47
<210>302
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>302
gccagtttat gaaggaggga aacactcaga ttaaagaaga tttgtca 47
<210>303
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>303
acatatgtct taaattatct ggccagttta tgaaggaggg aaacact 47
<210>304
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>304
agatgaaacg gacttgctat ttactgatca gcacaacata tgtctta 47
<210>305
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>305
ctgaagctct gcaaaaagct gtgaaactgt ttagtgatat tgagaat 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>306
cacaaaactg aatgtttcta ctgaagctct gcaaaaagct gtgaaac 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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ggcttttatt ctgctcatgg cacaaaactg aatgtttcta ctgaagc 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
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aaaatgaagt ggggtttagg ggcttttatt ctgctcatgg cacaaaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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ttctggttat ttaacagatg aaaatgaagt ggggtttagg ggctttt 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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ggcctgttga aaaatgactg taacaaaagt gcttctggtt atttaac 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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agacagcagc aagcaatttg aaggtacagt tgaaattaaa cggaagt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gccccatcga ttggtcaggt agacagcagc aagcaatttg aaggtac 47
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<212>DNA
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atcttcatgt cataatgaat gccccatcga ttggtcaggt agacagc 47
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<212>DNA
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aaaccagatg actatcttaa agaccacttc tgaggaatgc agagatg 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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agtacatttg aagtgcctga aaaccagatg actatcttaa agaccac 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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caagctacat attgcagaag agtacatttg aagtgcctga aaaccag 47
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tcaaaccata atttaacacc tagccaaaag gcagaaatta cagaact 47
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acccctcaga tgttattttc caagcaggat tttaattcaa accataa 47
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gcaagcctca gtcaattaat actgtatctg cacatttaca gagtagt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gtaaatacct tggcattaga taatcaaaag aaactgagca agcctca 47
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<213>人工序列
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gcttcagaac agcttcaaat aaggaaatca agctctctga acataac 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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aaatcacagt tttggaggta gcttcagaac agcttcaaat aaggaaa 47
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ggactcttag gtccaatttc aaatcacagt tttggaggta gcttcag 47
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<211>47
<212>DNA
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attacatgaa caaatgggca ggactcttag gtccaatttc aaatcac 47
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<212>DNA
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ggtttatgtt cttgcagagg agaacaaaaa tagtgtaaag cagcata 47
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ttttatatgg agacacaggt gataaacaag caacccaagt gtcaatt 47
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ccattttcaa gaactctacc atggttttat atggagacac aggtgat 47
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cttgacttgt gtaaacgaac ccattttcaa gaactctacc atggttt 47
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<212>DNA
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gttgccacct gaaaaataca tgagagtagc atcaccttca agaaagg 47
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aattataaaa acgttgagct gttgccacct gaaaaataca tgagagt 47
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<213>人工序列
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aggcaaagaa tcatacaaaa tgtcagacaa gctcaaaggt aacaatt 47
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tgttctgtca aacctagtca tgatttctag aggcaaagaa tcataca 47
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<212>DNA
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ttaactccta cttccaagga tgttctgtca aacctagtca tgatttc 47
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aaaatgccag cactcttatt ttaactccta cttccaagga tgttctg 47
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aatcccagaa aagtctttta tatgatcatg aaaatgccag cactctt 47
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tcaaaagtgg aatacagtga tactgacttt caatcccaga aaagtct 47
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catgtcaccc agtacaacat tcaaaagtgg aatacagtga tactgac 47
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agaagaggtc ttggctgcag catgtcaccc agtacaacat tcaaaag 47
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<212>DNA
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ctctgtcatg cctgcaggaa ggacagtgtg aaaatgatcc aaaaagc 47
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tattacccca gaagctgatt ctctgtcatg cctgcaggaa ggacagt 47
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gctcttttgg gacaattctg aggaaatgtt ctagaaatga aacatgt 47
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accaactttg tccttaacta gctcttttgg gacaattctg aggaaat 47
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atccttaaag gcttcaaaaa gcactccaga tggtaaaatt agctttt 47
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gccgattacc tgtgtaccct ttcggtaaga catgtttaaa tttttct 47
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atgcatcatg tttctttaga gccgattacc tgtgtaccct ttcggta 47
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agacaaaagc aaaacattga tggacatggc tctgatgata gtaaaaa 47
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<212>DNA
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acagtgtgtt aggaatatta acttggagga aaacagacaa aagcaaa 47
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gcagaccaac caaagtcttt gttccacctt ttaaaactaa atcacat 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gagacacttg attactacag gcagaccaac caaagtcttt gttccac 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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agcagtttca ggacatccat tttatcaagt ttctgctaca agaaatg 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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actttggaaa aatcttcaag caatttagca gtttcaggac atccatt 47 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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cgcacctggt caagaatttc tgtctaaatc tcatttgtat gaacatc 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>353
atacagaatc caaattttac cgcacctggt caagaatttc tgtctaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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caactaagga acgtcaagag atacagaatc caaattttac cgcacct 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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attttctccc cattgcagca caactaagga acgtcaagag atacaga 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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caggtatgtg tttgtctaca atactgatgg cttttatgac agagtgt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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cctctgcgtg ttctcataaa caggtatgtg tttgtctaca atactga 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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agcagtagga ggccaagttc cctctgcgtg ttctcataaa caggtat 47
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<212>DNA
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cctcgaatct ctctgaaagc agcagtagga ggccaagttc cctctgc 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttgcaaaaac atccactctg cctcgaatct ctctgaaagc agcagta 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttccacagcc aggcagtctg tatcttgcaa aaacatccac tctgcct 47
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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atatacagga tatgcgaatt aagaagaaac aaaggcaacg cgtcttt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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cctccaatga tggaaaggct ggaaaagaag aattttatag gtactct 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgatggtgga tggctcatac cctccaatga tggaaaggct ggaaaag 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggaaaaggaa tacagttggc tgatggtgga tggctcatac cctccaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gtaaggaaag tttatggact ggaaaaggaa tacagttggc tgatggt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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tggcgtttct aaacattgca taaaaattaa cagcaaaaat gcagagt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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agggtgcttc ttcaactaaa atacaggcaa gtttaaagca ttacatt 47
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<213>人工序列
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gtgcctttcc taaggaattt gctaatagat gcctaagccc agaaagg 47
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<213>人工序列
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gaaactggca gctatggaat gtgcctttcc taaggaattt gctaata 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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cactatagat ggatcatatg gaaactggca gctatggaat gtgcctt 47
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<213>人工序列
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actccaggtg tggatccaaa gcttatttct agaatttggg tttataa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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aatattctac ttttatttgt tcagggctct gtgtgacact ccaggtg 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gccccagaat ctcttatgtt aaaggtaaat taatttgcac tcttggt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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atgcctgtac acctcttgaa gccccagaat ctcttatgtt aaaggta 47
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<212>DNA
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agaactggtg ggctctcctg atgcctgtac acctcttgaa gccccag 47
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aagattattc ttcatggagc agaactggtg ggctctcctg atgcctg 47
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cctcccctct tagctgtctt aaagaatggc agactgacag ttggtca 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ctgttaaggc ccagttagat cctcccctct tagctgtctt aaagaat 47
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<213>人工序列
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acttacagat gggtggtatg ctgttaaggc ccagttagat cctcccc 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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caaaaagtgg ccattattga acttacagat gggtggtatg ctgttaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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aaactagtag tgcagatacc caaaaagtgg ccattattga acttaca 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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acacttgttc tctgtgtttc tgacataatt tcattgagcg caaatat 47
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<213>人工序列
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ataatggaaa gggatgacac agctgcaaaa acacttgttc tctgtgt 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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gaggaaatgt tggttgtgtt gatgtaatta ttcaaagagc ataccct 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>386
atcatcgctt ttcagtgatg gaggaaatgt tggttgtgtt gatgtaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>387
agaccttttc ctctgccctt atcatcgctt ttcagtgatg gaggaaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttggattctt tcctgaccct agaccttttc ctctgccctt atcatcg 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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atttctgcta acagtactcg gcctgctcgc tggtatacca aacttgg 47
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atatttatta atttgtccag atttctgcta acagtactcg gcctgct 47
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<213>人工序列
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cccaacaaaa gagactagaa gccttattca ctaaaattca ggaggaa 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggaagcagca aaatatgtgg aggcccaaca aaagagacta gaagcct 47
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<212>DNA
<213>人工序列
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aatgaaagag aggaagaaaa ggaagcagca aaatatgtgg aggccca 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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agtggatgga gaagacatca tctggattat acatatttcg caatgaa 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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ccttgaggtg agagagtaag aggacatata atgaggcttg atgatta 47
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<213>人工序列
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aatgcagcag acccagctta ccttgaggtg agagagtaag aggacat 47
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<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>397
agctttatga agcagtgaag aatgcagcag acccagctta ccttgag 47
<210>398
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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aaccatattt accatcacgt gcactaacaa gacagcaagt tcgtgct 47
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<213>人工序列
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aagggatgtc acaaccgtgt ggaagttgcg tattgtaagc tattc 45
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<212>DNA
<213>人工序列
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caaaaggaac aaggtttatc aagggatgtc acaaccgtgt ggaag 45
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<213>人工序列
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aggccatgga atctgctgaa caaaaggaac aaggtttatc aaggg 45
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<213>人工序列
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gatccagttg gaaattagga aggccatgga atctgctgaa caaaa 45
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>403
aatgataaga aacaagctca gatccagttg gaaattagga aggcc 45
<210>404
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>404
gccttgaata atcacaggca aatgttgaat gataagaaac aagctca 47
<210>405
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>405
tcagtgaaga gcagttaaga gccttgaata atcacaggca aatgttg 47
<210>406
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>406
taaatggtca cagggttatt tcagtgaaga gcagttaaga gccttga 47
<210>407
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>407
ggcgtccatc atcagattta tattctctgt taacagaagg aaagaga 47
<210>408
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>408
tctccaaaca gttatactga gtatttggcg tccatcatca gatttat 47
<210>409
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>409
tcttccattg catctttctc atctttctcc aaacagttat actgagt 47
<210>410
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>410
tcttgttctg aggtggacct aataggattt gtcgtttctg ttgtg 45
<210>411
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>411
gcaaattttt agatccagac tttcagccat cttgttctga ggtgg 45
<210>412
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>412
acgggagccc cttcacttca gcaaattttt agatccagac tttca 45
<210>413
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>413
ttatttcaga tttaccagcc acgggagccc cttcacttca gcaaa 45
<210>414
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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tgtaggtttc agatgaaatt ttatttcaga tttaccagcc acggg 45
<210>415
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>415
gaggtaaggt tacttttcag catcaccaca cattttggta tttttct 47
<210>416
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>416
ggccactttc aagagacatt caacaaaatg aaaaatactg ttgaggt 47
<210>417
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>417
tttctgctag tccaaaagag ggccactttc aagagacatt caacaaa 47
<210>418
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>418
tgctggagat ttttctgtgt tttctgctag tccaaaagag ggccact 47
<210>419
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>419
tcaggccttc ttactttatt tgctggagat ttttctgtgt tttctgc 47
<210>420
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>420
agtggcgacc agaatccaaa tcaggccttc ttactttatt tgctgga 47
<210>421
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>421
tggtacagga aacaagcttc tggtaagtta atgtaaactc aaggaat 47
<210>422
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>422
agactgtact tcagggccgt acactgctca aatcattcct ggtacag 47
<210>423
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>423
aagtggtcca ccccaactaa agactgtact tcagggccgt acactgc 47
<210>424
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>424
tgacatactt tgcaatgaag cagaaaacaa gcttatgcat atactgc 47
<210>425
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>425
ccagtacgga agaatgtgag aaaaataagc aggacacaat tacaact 47
<210>426
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>426
agaacaggag agttcccagg ccagtacgga agaatgtgag aaaaata 47
<210>427
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>427
tgtactacat ctctgatcaa agaacaggag agttcccagg ccagtac 47
<210>428
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>428
atctcagact gaaacgacgt tgtactacat ctctgatcaa agaacag 47
<210>429
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>429
tcccaccagt tcagaagatt atctcagact gaaacgacgt tgtacta 47
<210>430
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>430
agtgaatcca ctaggactgc tcccaccagt tcagaagatt atctcag 47
<210>431
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>431
cccaagctct tttgtctggt tcaacaggag aaaaacaatt tatatct 47
<210>432
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>432
cccatttgta catttgtttc tccggctgca cagaaggcat ttcagcc 47
<210>433
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>433
ctttacctcc acctgttagt cccatttgta catttgtttc tccggct 47
<210>434
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>434
ggatttcttg agtagactgc ctttacctcc acctgttagt cccattt 47
<210>435
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>435
tgcaaaaaga gaagagcctt ggatttcttg agtagactgc ctttacc 47
<210>436
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>436
agattgatga ccaaaagaac tgcaaaaaga gaagagcctt ggatttc 47
<210>437
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>437
gtcttgtaaa ggggagaaag agattgatga ccaaaagaac tgcaaaa 47
<210>438
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>438
tcagcccaga tgacttcaaa gtcttgtaaa ggggagaaag agattga 47
<210>439
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>439
agtctgtttc cacacctgtc tcagcccaga tgacttcaaa gtcttgt 47
<210>440
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>440
actttgtatg gccaaaagga agtctgtttc cacacctgtc tcagccc 47
<210>441
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>441
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210>442
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>442
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
<210>443
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>443
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64

Claims (10)

1.一种从生物DNA中捕获靶序列的方法，包括如下步骤：采用由n个特异探针组成的捕获探针文库从生物DNA中捕获n种靶序列；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
2.一种从生物DNA中捕获靶序列的方法，依次包括如下步骤：
(1)制备基因组DNA文库；
(2)与捕获探针文库进行杂交；
所述步骤(2)中，捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述捕获探针文库由如下440个探针组成：LNA探针-1至LNA探针-440；所述LNA探针-1至所述LNA探针-440的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列表的序列440所示。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)依次包括如下步骤：
(1-1)将基因组DNA进行片段化，得到片段化的基因组DNA；
(1-2)将所述片段化的基因组DNA进行平末端化、5’末端磷酸化和3’末端加腺苷尾，得到末端修复产物；
(1-3)将所述末端修复产物连接接头，得到连接有接头的末端修复产物；
(1-4)以所述连接有接头的末端修复产物为模板，进行PCR扩增反应。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1-2)中，“所述片段化的基因组DNA进行平末端化、5’末端磷酸化和3’末端加腺苷尾”的实现方法为：将所述片段化的基因组DNA和权利要求6所述反应混合液混合后，孵育。
6.反应混合液，含有10×末端修复缓冲液、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I、T4多聚核苷酸激酶和Bst DNA聚合酶；所述10×末端修复缓冲液的溶质及其浓度为800-1000mM MgCl2、20-40mM DTT、8-12mM ATP、0.8-1.2μg/μL BSA和3-5mM dNTPs；溶剂为pH8.1-8.5、400-600mM的Tris-HCl缓冲液；所述反应混合液可对片段化的DNA进行平末端化和/或5’末端磷酸化和/或3’末端加腺苷尾。
7.一种靶序列文库，由权利要求1至5任一所述方法得到的靶序列组成。
8.权利要求1至5任一所述方法在测序中的应用。
9.捕获探针文库的应用，为如下(Z1)或(Z2)或(Z3)或(Z4)：
(Z1)从生物DNA中捕获靶序列；
(Z2)从生物DNA中分离靶序列；
(Z3)从生物DNA中富集靶序列；
(Z4)测序；
所述捕获探针文库由n个特异探针组成；n为自然数；所述特异探针为根据所述靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
10.由n个特异探针组成的捕获探针文库；n为自然数；所述特异探针为根据靶序列的核苷酸序列设计合成并且进行了锁核酸修饰的单链DNA分子。
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