CN105925562A - 一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒,包括以下步骤:DNA打碎得到DNA片段,末端修复,加A,加接头,进行Pre‑Capture LM‑PCR;将4000人类致病靶基因的Pre‑capture LM‑PCR产物混合得到混合文库样本,使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交,磁珠捕获DNA并洗脱;进行Post‑capture LM‑PCR。所述试剂盒包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM‑PCR试剂和捕获试剂。本发明选择4000个人类致病基因作为的靶点并组合在一起,通过生物素探针捕获技术一次性富集这些个基因序列,并行高通量测序,可同时检查基因的多种变异类型,检测敏感度高,可使4000致病基因成为临床上的主要诊断检测手段,有利于降低成本,减少漏诊,提高检测阳性率,利于其临床推广。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,尤其涉及一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒。
背景技术
人类基因组是由23对染色体组成,含有约30亿个DNA碱基对。人类基因组计划中调查人类基因组中的真染色质基因序列含有大约20000到25000个蛋白质编码基因。蛋白质编码序列(也就是外显子)在人类基因组中少于1.5%。在基因与调控序列之外,仍然有许多功能未知的广大区域,包括许多重复序列、转位子或伪基因等。当一个或多个基因发生不正常表现时,便可能会使某个相对应的表型产生一些临床症状。遗传异常的原因包括了基因突变和染色体数目异常。如果受损的基因会从亲代遗传到子代,那就会成为一种遗传性疾病。目前已知有大约7000种遗传疾病,但只有近4000个基因是有明确人类致病机制的,并且能够在家族中进行传递。
基因检测是从血液、其他体液或细胞中检测一个人的DNA序列,对受检者基因编码的序列进行测定和定位比对分析。但如何有效、低成本对人类致病基因中识别导致特殊疾病的几个突变是有非常大的挑战性。这是因为,当对20000个人类基因进行检测,有16000个基因的功能不明,对测序数据的大量使用造成对外显区域的低覆盖,从而造成很大程度的漏诊。如果对全部20000个基因的外显子的使用高通量测序方法进行测序检测,成本非常高,不利于其临床推广。
高通量测序技术也称二代测序、下一代测序技术、深度测序或大规模平行测序,它是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。其核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。目前,主要有三种主流的测序平台:illumina公司Hiseq平台、life technologies公司的PGM平台以及Roche公司的454平台。
高通量测序技术由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。然而,虽然二代测序大大降低了DNA分析的成本,其样本制备过程依然繁琐,成为其今后广泛应用中的一种障碍。因此,人们对其DNA文库构建方法进行了大量研究,以期简化样本的制备步骤,获得高质量的检测样本。
发明内容
有鉴于此,有必要针对上述的问题,本发明提供一种富集4000人类靶基因的方法及试剂盒。本发明从OMIM、HGMD、UniProt、HUGO、NCBI和Refseq数据库以及目前已知的人类致病基因中选择4000个作为的靶点并组合在一起。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种富集4000人类致病靶基因的方法,包括以下步骤:
S1、提取总DNA并将其打碎,得到DNA片段;
S2、对DNA片段进行末端修复,得到平末端DNA片段;
S3、在平末端DNA片段3’端加A,得到加A的DNA片段;
S4、在加A的DNA片段的3’端加接头,得到加接头的DNA片段;
S5、对加接头的DNA片段进行Pre-capture LM-PCR;
S6、将4000人类致病靶基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本,使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交,磁珠捕获DNA并洗脱;
S7、磁珠捕获的DNA样本进行Post-capture LM-PCR。
优选地,Pre-captureLM-PCR的反应体系如下:
优选地,Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下:98℃45sec;98℃ 15sec,60℃30sec,72℃ 30sec,9cycles;72℃ 1min;4℃。
优选地,Post-captureLM-PCR反应的体系如下:
优选地,Post-Capture LM-PCR反应的条件如下:98℃45sec;98℃ 15sec,60℃30sec,72℃ 30sec,14cycles;72℃ 1min;4℃。
优选地,本发明中4000人类致病靶基因特异性探针与混合文库样本杂交步骤如下:向离心管中加入COT DNA和sample library,得到混合物1;混合物1中分别加入SeqCapHE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligos,得到混合物2;混合物2在DNA真空浓缩仪浓缩至液体蒸干,加入2×Hybridization Buffer和Hybridization Component A,得到混合物3;将混合物3混匀离心后置于95℃加热10min,加入4000人类致病靶基因特异性探针文库中,得到混合物4,混合物4在47℃孵育24小时。
优选地,磁珠与DNA的结合方法为:将杂交的样本加入到预处理好的磁珠中,混匀后置于热循环仪中47℃结合45分钟。
优选地,磁珠-DNA结合物依次使用Wash Buffer I、Stringent Wash Buffer、WashBuffer I、Wash Buffer II和Wash Buffer III洗脱。
优选地,所述步骤S2-S5和步骤S7包含纯化步骤。
优选地,纯化步骤为:向样本中加入相应的反应液混匀,室温孵育10分钟,使DNA与磁珠充分结合;将管放置于磁力架上,直至溶液变清澈,弃掉上清,将管继续留在磁力架上,加入80%酒精,室温孵育30秒以上,吸走酒精,将管继续留在磁力架上,加入80%酒精,室温孵育30秒以上,吸走酒精;室温下充分干燥。
更优选地,当需要将DNA与磁珠分离时,纯化后将管从磁力架上取出,加入ddH2O或pH 8.0的10mM Tris-HCl,室温孵育2分钟即可。
一种富集4000人类靶基因的试剂盒,包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM-PCR试剂和捕获试剂。
优选地,所述捕获试剂包含4000人类致病靶基因特异性探针文库、捕获磁珠和标记序列。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明从OMIM、HGMD、UniProt、HUGO、NCBI和Refseq数据库以及目前已知的人类致病基因中选择4000个作为的靶点并组合在一起,通过生物素探针捕获技术一次性富集这些个基因序列,并行高通量测序,可同时检查基因的多种变异类型,检测敏感度高,可使4000致病基因成为临床上的主要诊断检测手段,有利于降低成本,减少漏诊,提高检测阳性率,利于其临床推广。本发明试剂盒便于致病基因的富集,简化了检测操作,节省时间。
附图说明
图1为本发明流程图。
图2为步骤S1中片段打碎电泳图。
图3为步骤S5中前LM-PCR产物纯化后电泳图。
图4为步骤S7中后PCR产物纯化后电泳图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明,下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。除有特殊说明外,本发明中所用的试剂、设备或方法等都是本领域技术人员所熟知的,在此不再赘述。
本发明中使用的以下试剂的配方如下:
末端修复反应混合物(End Repair Master Mix,20μl):
水 8μl
10×KAPA End Repair Buffer 7μl
KAPA End Repair Enzyme Mix 5μl。
加A反应混合物(A-Tailing Master Mix,50μl):
水 42μl
10×KAPA A-Tailing Buffer 5μl
KAPA A-Tailing Enzyme 3μl。
连接混合物(Ligation Master Mix,55μl):
水 30μl
5×KAPA Ligation Buffer 10μl
KAPA T4DNA Ligase 5μl。
实施例1
为了简便说明,本实施例仅以6个样本为例来说明本发明富集人类致病靶基因的方法,如图1所示,包括以下步骤:
S1、提取总DNA并将其打碎,得到DNA片段
按照常规方法从每个样本的300μl全血中提取DNA,取2μl DNA样本在NanoDrop上进行浓度测定。测得DNA浓度要求OD260/OD280比值在1.8~2.0之间,OD260/OD230比值在1.8~2.2之间,以上两个比值可以判断所提取的DNA纯度如何。若超出上述范围,则可认为提取DNA纯度不符合要求,需重新提取或再纯化。根据测定的浓度,用DNA溶解缓冲液进一步稀释到浓度为25ng/μl。
总DNA用Q800R超声波破碎仪打断。具体步骤如下:
往杯式探头杯中加入纯水,且没过钛合金探头。在0.5ml的离心管中转入40μl25ng/μl的DNA,将其固定在样本固定器上,并轻轻弹走底部的气泡。将样本固定器放入到杯式探头中,并再次往杯式探头中加入纯水,直至纯水液面与管中DNA液面平齐。
提前开启Q800R的循环冷凝水系统,设置温度在3℃。在主机上设置好打断程序:Pulse on20sec;Pulse off30sec;Time20min;Amplitude 40%。待温度降到设定温度3℃时,即可开启打断程序。程序运行完成后,将微管中的样本置于-20℃保存。所有样本完成打断后,关掉循环冷凝水系统,关闭发动机。
每例样本取2μl打碎后的DNA片段,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,最终每例样本的片段长度应在500bp以下,峰值在350bp为合格。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。第1泳道是分子大小标记,第2~7泳道是为对不同样本进行DNA打断,片段大小约在500bp以下,后续步骤纯化收集峰值约350bp左右片段。
S2、末端修复
每例样本取50μl DNA片段,加入20μl末端修复反应混合物,总体积70μl。在热循环仪(扩增仪)上20℃孵育30min,结束后立即进行纯化。
纯化的具体方法如下:向每例样本中加入120μl的AgencourtRAMPureRXP reagent,总体积190μl。用移液枪上下反复吸打,充分混匀溶液。室温孵育10分钟,使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上,直至溶液变清澈,小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上,加入200μl80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精,此步应尽可能将酒精吸干净,但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。
S3、加A
向每个含有修复DNA-磁珠的管中加入50μl的加A反应混合物反应液,总体积50μl。移液枪上下反复吸打,充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上30℃孵育30min,结束后立即进行纯化。
纯化的具体方法如下:向每例样本中加入90μl的PEG/NaclSPRIRSolution,总体积140μl。用移液枪上下反复吸打,充分混匀溶液。室温孵育10分钟,使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上,直至溶液变清澈,小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上,加入200μl80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精,此步应尽可能将酒精吸干净,但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将官从磁力架上取出。
S4、加接头
向每个加了A的DNA-磁珠样本管中加入以下反应液:
用移液枪上下反复吸打,充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上20℃孵育15min,结束后立即进行后续纯化步骤。纯化的具体方法如下:
向每例样本中加入50μl的PEG/NaclSPRIRSolution,总体积100μl。用移液枪上下反复吸打,充分混匀溶液。室温孵育10分钟,使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上,直至溶液变清澈,小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精,此步应尽可能将酒精吸干净,但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。加入50μl的10mM Tris-HCl(pH 8.0),室温孵育2分钟,使得DNA从磁珠上分离开来。将上清全部转移至一个新的管中,继续后面的操作。
S5、Pre-capture LM-PCR
按照表1和表2所示的标准建立Pre-capture LM-PCR的反应体系和反应条件。
表1、Pre-capture LM-PCR的反应体系
试剂 | 用量 |
2×KAPA HiFiHotStartReadyMix | 25μl |
Pre-LM-PCR Oligos 1&2,5μM | 5μl |
加接头的文库(Adapter-ligated Sample Library) | 20μl |
总体积 | 50μl |
表2、Pre-capture LM-PCR的反应条件
样本在4℃或-20℃保存72小时,或者直接进行后续的纯化实验。Pre-capture LM-PCR产物纯化的具体方法为:
每例样本中加入50μl的AgencourtRAMPureRXP reagent,总体积100μl。用移液枪上下反复吸打,充分混匀溶液。室温孵育10分钟,使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上,直至溶液变清澈,小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精。室温孵育30秒以上,小心吸走酒精,此步应尽可能将酒精吸干净,但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。加入52μl ddH2O,室温孵育2分钟,使得DNA从磁珠上分离开来。将离心管放回到磁力架上直至溶液变清澈。取50μl上清转移至一个新的管中,继续后面的操作。用1.5%琼脂糖凝胶电泳、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示,第1泳道是分子大小标记,第8~26泳道是为对不同样本进行前LM-PCR,片段大小约在400bp左右。Qubit测定扩增后的DNA浓度结果见表3。
表3、Qubit测定扩增后的DNA浓度
S6、杂交捕获
(1)试剂和仪器准备
①杂交准备
a)打开PCR仪器,设置温度为95℃并保持该稳定温度。
b)取适量4000人类致病靶基因特异性探针文库4.5μl,放置室温解冻。
②以6个样本为例来说明HE Universal Oligo和HE Index Oligo的配制。
表4、HEUniversal Oligo和HE IndexOligo配制表
组成 | 数量 |
SeqCap HE Universal Oligo | 1500pmol(3μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 2 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 4 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 5 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 6 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 7 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
SeqCap HE Index 12 Oligo | 250pmol(0.5μl of 500μM) |
最终浓度 | 3,000pmol(6μl of 500μM) |
③DNA样本混合液的准备
根据Nanodrop测定的样本浓度,每例样本取300ng混合于一个1.5ml管中制成混合文库样本,最终取1.5μg的混合文库样本用于杂交。
④序列捕获与磁珠洗脱液的准备
将NimbleGenSeqCap EZ Hybridization and Wash kit中的10×洗脱液(I,II,III and Stringent)和2.5×Bead洗脱液稀释成1×的工作液,制备1个捕获单位量工作液的洗脱液用量如表5所示。
表5、洗脱液的稀释用量表
试剂用量 | +PCR级水 | 反应体积(1X) |
10×Stringent Wash Buffer(vial 4)–40μl | 360μl | 400μl |
10×Wash Buffer I(vial 1)–30μl | 270μl | 300μl |
10×Wash Buffer II(vial 2)–20μl | 180μl | 200μl |
10×Wash Buffer III(vial 3)–20μl | 180μl | 200μl |
2.5×Bead Wash Buffer(vial 7)–200μl | 300μl | 500μl |
工作液在室温下可保存2周。在洗脱前提前2小时将buffers置于47℃水浴中进行平衡。
⑤捕获磁珠(Capture Beads)预处理
使用前提前30分钟将捕获磁珠恢复至室温。将磁珠充分涡旋混匀15秒。以每个捕获单位加100μl磁珠于1.5ml离心管中。每个离心管最多可加6个捕获单位的磁珠量。将管置于磁力架上,当液体变澄清时(此过程不超过5分钟),小心弃掉上清(勿吸走底部的磁珠),残留的液体将在后续洗脱步骤被去除。
加2倍于磁珠体积的1×Bead Wash Buffer于磁力架的管中。将管从磁力架中取出并涡旋10秒。将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。重复本步骤一次。
用等体积的1×Bead Wash Buffer重悬磁珠。取100μl重悬磁珠加入新的0.2ml离心管中。将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。此时,捕获磁珠预处理完成,可以结合捕获的DNA。此步骤结束后应立即进行后续的操作,避免捕获磁珠失水变干。少量的磁珠洗脱液不会干扰捕获磁珠与DNA结合。
(2)杂交
往新的1.5ml离心管中加入5μl的1mg/ml COT DNA和1.5μg混合文库样本,得到混合物1。混合物1中分别加入3μl的500μMSeqCap HE Universal Oligo和3μl的500μMSeqCapHE Index Oligo(以6个样本为例),得到混合物2(sample library/COT DNA/SeqCap HEUniversal Oligo-SeqCap HE Index Oligo混合物),混合物2的组成如表6所示。
表6、混合物2的组成
成分 | 组成 |
COT DNA | 5μg |
混合文库样本 | 1.5μg≤50ul |
500μMSeqCap HE Universal Oligo | 3μl |
500μMSeqCap HE Index Oligos | 3μl |
总体积 | 体积≤57μl |
将混合物2的管盖打开,放入DNA真空浓缩仪中60℃,浓缩15min。随着加入液体的体积增多,需适当延长浓缩时间,直至液体蒸干。
往蒸干的混合物2中加入:7.5μl of 2×Hybridization Buffer(vial 5)和3μlof Hybridization Component A(vial 6),得到混合物3。混合物3的组成如表7所示。
表7、混合物3的组成
成分 | 组成 |
COT DNA | 5μg |
混合文库样本 | 1.5μg≤50ul |
500μMSeqCap HE Universal Oligo | 3μl |
500μMSeqCap HE Index Oligos | 3μl |
2×Hybridization Buffer(vial 5) | 7.5μl |
Hybridization Component A(vial 6) | 3μl |
最终体积 | 10.5μl |
将混合物3混匀10秒,并在浓缩仪的离心模式下以最大转速离心10秒。将混合物置于95℃加热模块上加热10mins以变性DNA。室温下以最大转速离心10秒。将变性的混合物加入4.5μl 4000人类致病靶基因特异性探针文库的0.2ml管子中。涡旋混匀3秒并离心10秒。将以上的混合物全部转移至0.2ml管中,并盖好管盖,得到混合物4。混合物4在热循环仪上热模块47℃(热盖57℃)孵育24小时。混合物4的组成如表8所示。
表8、混合物4的组成
成分 | 组成 |
COT DNA | 5μg |
混合文库样本 | 1.5μg |
500μMHE Universal Oligo and 500μMHE Index Oligos | 1,500pmol each |
2×Hybridization Buffer(vial 5) | 7.5μl |
Hybridization Component A(vial 6) | 3μl |
4000人类致病靶基因特异性探针文库 | 4.5μl |
最终体积 | 15μl |
(3)捕获磁珠与DNA的结合
将杂交的样本加入到预处理好的捕获磁珠中。用移液器上下充分混匀10次,置于热循环仪中47℃(热盖57℃)结合45分钟。每15分钟将样本涡旋混匀3秒,以确保磁珠均匀悬浮。
(4)磁珠-DNA结合物洗脱
往15μl的磁珠-DNA结合物中加入100μl47℃的1×Wash Buffer I。涡旋混匀10秒。瞬时离心,将0.2ml管中内容物全部转移至0.5ml的管中。
将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。将管从磁力架中取出,加入200μl 47℃的1×Stringent Wash Buffer,移液枪上下吸打10次混匀。此过程47℃恒温快速操作以确保温度不下降。47℃孵育5分钟。重复本步骤一次。
将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。加200μl室温1×Wash Buffer I,涡旋混匀2分钟。若管盖上有液体残留,继续下一步骤前轻轻敲打管子收集管盖上液体。将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。加200μl室温1×Wash Buffer II,涡旋混匀1分钟。将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。加200μl室温1×Wash Buffer III,涡旋混匀30秒。将管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清,便可弃掉上清。将管从磁力架上取出,每管beads-DNA结合捕获样本加50μl ddH2O。将磁珠捕获的样本于于-15℃至-25℃保存。DNA不用进行再次分离磁珠,磁珠捕获的样本将作为模板用于接下来的Post-capture LM-PCR。
S7、Post-capture LM-PCR
按照表9和表10的要求建立Post-capture LM-PCR反应的体系和反应条件。
表9、Post-capture LM-PCR反应体系
试剂 | 用量 |
bead-bound captured DNA | 20μl |
KAPA HiFiHotStartReadyMix | 25μl |
Post-captureLM-PCR Oligos 1&2(5μM) | 5μl |
总体积 | 50μl |
表10、Post-capture LM-PCR反应条件
样本在4℃或-20℃保存72小时,或者直接进行后续的纯化实验。Post-captureLM-PCR后纯化的方法为:
往每个样本管中加入90μl的AgencourtRAMPureRXP reagent,总体积140μl,用移液枪上下反复吸打,充分混匀溶液。室温孵育15min,使DNA与磁珠充分结合。将管置于磁力架上,静置直至液体变得清澈。小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精,室温孵育30秒以上,小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上,加入200μl 80%酒精,室温孵育30秒以上,小心吸走酒精,室温充分干燥。将管从磁力架上取出,加入52μl的ddH2O,室温孵育2min,使DNA从磁珠上分离开来。将离心管放回到磁力架中直至溶液变清澈。每例样本直接转移50μl至1.5ml离心管中,继续后面的操作。
用1.5%琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示,第1泳道是分子大小标记,第2~4泳道是为对不同样本进行后PCR,峰值约在400bp左右。Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度结果如表11所示。
表11、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度结果
样本编号 | 组1 | 组2 | 组3 |
Qubit测定值(ng/μl) | 2.44 | 2.14 | 2.64 |
qPCR测定值(nM) | 14.36 | 6.7 | 7.84 |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种富集4000人类致病靶基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、提取总DNA并将其打碎,得到DNA片段;
S2、对DNA片段进行末端修复,得到平末端DNA片段;
S3、在平末端DNA片段3’端加A,得到加A的DNA片段;
S4、在加A的DNA片段的3’端加接头,得到加接头的DNA片段;
S5、对加接头的DNA片段进行Pre-Capture LM-PCR;
S6、将4000人类致病靶基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本,使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交,磁珠捕获DNA并洗脱;
S7、磁珠捕获的DNA样本进行Post-capture LM-PCR。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,Pre-Capture LM-PCR的反应体系如下:
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下:98℃45sec;98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,9cycles;72℃1min;4℃。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,Post-capture LM-PCR反应的体系如下:
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,Post-capture LM-PCR反应的条件如下:98℃45sec;98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,14cycles;72℃1min;4℃。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交步骤如下:向离心管中加入COT DNA和sample library,得到混合物1;混合物1中分别加入SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligos,得到混合物2;混合物2在DNA真空浓缩仪浓缩至液体蒸干,加入2×Hybridization Buffer和HybridizationComponent A,得到混合物3;将混合物3混匀离心后置于95℃加热10min,加入4000人类致病靶基因特异性探针文库中,得到混合物4,混合物4在47℃孵育24小时。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,磁珠与DNA的结合方法为:将杂交的样本加入到预处理好的磁珠中,混匀后置于热循环仪中47℃结合45分钟。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S2-S5和步骤S7包含纯化步骤。
9.一种富集4000人类靶基因的试剂盒,其特征在于,包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM-PCR试剂和捕获试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述捕获试剂包含4000人类致病靶基因特异性探针文库、捕获磁珠和标记序列。
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