CN105907748B

CN105907748B - 一种基于高通量测序的线粒体基因组文库及其构建方法

Info

Publication number: CN105907748B
Application number: CN201610308792.8A
Authority: CN
Inventors: 张巍
Original assignee: Amcare Genomics Laboratory
Current assignee: Amcare Genomics Laboratory
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2016-05-10
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2036-05-10
Also published as: CN105907748A; WO2017193832A1

Abstract

本发明涉及一种基于高通量测序的线粒体基因组文库及其构建方法。所述构建方法包括以下步骤：S1、自总DNA中一步PCR扩增线粒体全长DNA；S2、将线粒体全长DNA打碎，得到DNA片段；S3、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；S4、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；S5、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；S6、对加接头的DNA片段进行前LM‑PCR；S7、对LM‑PCR产物进行后PCR。本发明线粒体基因组文库构建方法通过自总DNA中一步PCR扩增得到线粒体全长DNA，可以保障人类线粒体基因组的精确扩增，不被在人类基因组的同源序列污染混合使突变检测更灵敏和准确。

Description

一种基于高通量测序的线粒体基因组文库及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种基于高通量测序的线粒体基因组文库及其构建方法。

背景技术

线粒体是细胞内产生能量的细胞器。线粒体DNA是线粒体中的遗传物质，呈双链环状。一个线粒体中可有一个或数个线粒体DNA分子。人类线粒体DNA(mtDNA)，共包含37个基因，其中，22个基因编码转移核糖核酸(tRNA)，2个基因编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)，13个基因编码多肽。这些线粒体基因组上的基因是线粒体产生功能蛋白所必不可少，而且线粒体核糖体是存在于线粒体基质内的一种核糖体，负责完成线粒体内进行的翻译工作。

线粒体疾病是由于线粒体的功能不正常而导致的一些疾病。线粒体疾病往往是由于线粒体DNA的突变造成的。这些基因突变可能在mtDNA上，也可能发生在核基因上。对于线粒体疾病患者进行线粒体基因组的分析而发现相关基因突变是一种理想的遗传学诊断方法。由于线粒体病涉及基因众多，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。

高通量测序技术也称二代测序、下一代测序技术、深度测序或大规模平行测序，它是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。其核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。目前，主要有三种主流的测序平台：illumina公司Hiseq平台、life technologies公司的PGM平台以及Roche公司的454平台。

高通量测序技术由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。然而，虽然二代测序大大降低了DNA分析的成本，其样本制备过程依然繁琐，成为其今后广泛应用中的一种障碍。因此，人们对其DNA文库构建方法进行了大量研究，以期简化样本的制备步骤。

如公开号为CN 104894651 A的中国发明专利申请公开了一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库。该构建方法包括：步骤S1、对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA；步骤S2、对片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；步骤S3、利用连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；步骤S4、对带接头片段进行扩增，得到高通量测序文库；连接增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。在所述步骤S3之后以及所述步骤S4之前，所述构建方法还包括对所述带接头片段进行磁珠纯化的步骤。对所述连接片段进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠纯化的步骤。所述步骤S4包括：对所述带接头片段扩增4～7个循环，得到第一扩增片段；对所述第一扩增片段进行0.95～1.20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对所述第一扩增纯化片段扩增6～9个循环，得到第二扩增片段；对所述第二扩增片段进行0.95～1.20倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以及利用0.7～0.85倍体积的磁珠对所述第二扩增纯化片段进行分选，得到所述高通量测序文库。该发明中磁珠纯化分开进行且磁珠用量不同，纯化操作复杂。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，本发明提供一种基于高通量测序的线粒体基因组文库及其构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于高通量测序的线粒体基因组文库构建方法，包括以下步骤：

S1、自总DNA中用一步PCR扩增线粒体全长DNA；

S2、将线粒体全长DNA打碎，得到DNA片段；

S3、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；

S4、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；

S5、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；

S6、对加接头的DNA片段进行前LM-PCR；

S7、对LM-PCR产物进行后PCR。

优选地，所述步骤S1具体为：提取全血DNA，并以其为模板PCR扩增线粒体全长DNA。

更优选地，步骤S1中所用引物对的具体序列为Primer F:ccgcacaagagtgctactctcctc，Primer R:gatattgatttcacggaggatggtg。

优选地，所述步骤S1中PCR反应体系如下：

优选地，所述步骤S1中PCR反应的程序如下：

Lid：105℃，Wait，Auto；Block：95℃，2min；

95℃，20sec；68℃，18min；30cycles；

72℃，20min；4℃，hold。

优选地，前LM-PCR的反应体系如下：

优选地，前LM-PCR的反应条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，9cycles；72℃1min；4℃。

优选地，后PCR反应的体系如下：

优选地，后PCR反应的条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，14cycles；72℃1min；4℃。

优选地，所述步骤S3-S7包含纯化步骤。

优选地，纯化步骤为：向样本中加入相应的反应液混匀，室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合；将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，弃掉上清，将管继续留在磁力架上，加入80％酒精，室温孵育30秒以上，吸走酒精，将管继续留在磁力架上，加入80％酒精，室温孵育30秒以上，吸走酒精；室温下充分干燥。

更优选地，当需要将DNA与磁珠分离时，纯化后将管从磁力架上取出，加入pH 8.0的10mM Tris-HCl，室温孵育2分钟即可。

一种基于高通量测序的线粒体基因组文库，通过上述线粒体基因组文库构建方法构建。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明线粒体基因组文库构建方法通过自总DNA中一步PCR扩增得到线粒体全长DNA，可以保障人类线粒体基因组的精确扩增，不被在人类基因组的同源序列污染混合使突变检测更灵敏和准确，且节省了时间；通过进行前LM-PCR可以引入不同序列以备高通量测序使用；通过进行后PCR可以获得足够数量的DNA，以便进行后续高通量测序。

本发明线粒体基因组文库构建方法在末端修复、加A、加接头、前LM-PCR和后PCR后进行纯化，且末端修复、加A后纯化DNA不与磁珠分离，简化了操作步骤，节省了时间。

对本发明构建的线粒体DNA文库进行高通量测序，进行生物信息分析得到检测样本线粒体基因组DNA序列，便可检测出不同突变类型和对之进行定量。由于高通量测序具有对常见和罕见变异高灵敏度，能发现线粒体的编码区外显子区绝大部分疾病相关变异。可以通过增加测序深度，提高突变检测的敏感度。在5000x的覆盖深度，获得更多的序列信息进行统计分析，可以达到的敏感度为0.1-1％。

附图说明

图1为步骤S1中PCR产物电泳图。

图2为步骤S2中片段打碎电泳图。

图3为步骤S6中前LM-PCR产物纯化后电泳图。

图4为步骤S7中后PCR产物纯化后电泳图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。除有特殊说明外，本发明中所用的试剂、设备或方法等都是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。

本发明中使用的以下试剂的配方如下：

末端修复反应混合物(End Repair Master Mix，20μl)：

水 8μl

10×KAPA End Repair Buffer 7μl

KAPA End Repair Enzyme Mix 5μl。

加A反应混合物(A-Tailing Master Mix，50μl)：

水 42μl

10×KAPA A-Tailing Buffer 5μl

KAPA A-Tailing Enzyme 3μl。

连接混合物(Ligation Master Mix，55μl)：

水 30μl

5×KAPA Ligation Buffer 10μl

KAPA T4DNA Ligase 5μl。

实施例1

一种基于高通量测序的线粒体基因组检测和分析方法，包括以下步骤：

S1、PCR扩增线粒体全长DNA

按照常规方法从300μl全血中提取DNA，取2μl DNA样本在NanoDrop上进行浓度测定。测得DNA浓度要求OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，OD260/OD230比值在1.8～2.2之间，以上两个比值可以判断所提取的DNA纯度如何。若超出上述范围，则可认为提取DNA纯度不符合要求，需重新提取或再纯化。根据测定的浓度，用DNA溶解缓冲液进一步稀释到浓度为50ng/μl。

以稀释后的全血DNA为模板进行一步PCR扩增线粒体全长DNA，PCR反应体系如表1所示。

表1、PCR反应体系

本实施例中所用的引物对是发明人根据已公开的线粒体序列设计的，可以扩增线粒体全长DNA，具体序列如下：

Primer F(SEQ ID NO：1):ccgcacaagagtgctactctcctc，

Primer R(SEQ ID NO：2):gatattgatttcacggaggatggtg。

上述PCR反应的程序如下：

Lid：105℃，Wait，Auto；Block：95℃，2min。

95℃，20sec；68℃，18min；30cycles。

72℃，20min；4℃，hold。

取2μl所得PCR产物和3μl染料混匀，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳条件为100v，60min。结果如图1所示。第1泳道是分子大小标记，第2、3泳道是对不同样本进行线粒体扩增，大小约为16kb，第4泳道是阴性对照。

S2、片段打碎

将扩增后的基因组DNA用Q800R超声波破碎仪打断。具体步骤如下：

往杯式探头杯中加入纯水，且没过钛合金探头。在0.5ml的离心管中转入40μl扩增产物，将其固定在样本固定器上，并轻轻弹走底部的气泡。将样本固定器放入到杯式探头中，并再次往杯式探头中加入纯水，直至纯水液面与管中DNA液面平齐。

提前开启Q800R的循环冷凝水系统，设置温度在3℃。在主机上设置好打断程序：Pulse on 20sec；Pulse off 30sec；Time 20min；Amplitude 40％。待温度降到设定温度3℃时，即可开启打断程序。程序运行完成后，将微管中的样本冷冻保存。所有样本完成打断后，关掉循环冷凝水系统，关闭发动机。

每例样本取1μl，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，最终每例样本的片段长度应在500bp以下，峰值在350bp为合格。结果如图2所示。第1泳道是分子大小标记，第2、3泳道是为对不同样本进行DNA打断，片段大小在500bp以下，峰值约350bp左右。

S3、末端修复

每例样本取50μl DNA片段，加入20μl末端修复反应液，总体积70μl。在热循环仪(扩增仪)上20℃孵育30min，结束后立即进行纯化。

纯化的具体方法如下：向每例样本中加入120μl的Agencourt^RAMPure^RXP reagent，总体积190μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。

S4、加A

向每个含有修复DNA-磁珠的管中加入50μl的加A反应混合物，总体积50μl。移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上30℃孵育30min，结束后立即进行纯化。

纯化的具体方法如下：向每例样本中加入90μl的PEG/NaclSPRI^RSolution，总体积140μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。

S5、加接头

向每个加了A的DNA样本管中加入以下反应液：

用移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。热循环仪(扩增仪)上20℃孵育15min，结束后立即进行后续纯化步骤。纯化的具体方法如下：

向每例样本中加入50μl的PEG/NaclSPRI^RSolution总体积100μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。加入50μl的10mM Tris-HCl(pH 8.0)，室温孵育2分钟，使得DNA从磁珠上分离开来。将上清全部转移至一个新的管中，继续后面的操作。

S6、前LM-PCR

前LM-PCR的反应体系和反应条件如表2和表3所示。

表2、前LM-PCR的反应体系

试剂	用量
		2×KAPA HiFiHotStartReadyMix	25μl
Pre-LM-PCR引物1﹠2，5μM	5μl
		Adapter-ligated Sample Library(加接头的文库)	20μl
总体积	50μl

表3、前LM-PCR的反应条件

样本在4℃或-20℃保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。前LM-PCR产物纯化的具体方法为：

每例样本中加入50μl的Agencourt^RAMPure^RXP reagent，总体积100μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合。将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将管继续留在磁力架上，加入200μl 80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将管从磁力架上取出。加入50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，室温孵育2分钟，使得DNA从磁珠上分离开来。

用1.5％凝胶电泳、Nanodrop及Qubit测定扩增后的DNA浓度及片段大小。如图3所示，第1泳道是分子大小标记，第2、3泳道是为对不同样本进行前LM-PCR，片段大小约在400bp左右。Qubit测定扩增后的第2、3泳道两个样品DNA浓度分别为34.2ng/μl和42.2ng/μl。

S7、后PCR

后PCR反应体系和反应条件如表4和表5所示。

表4、后PCR反应体系

与磁珠结合的DNA(bead-bound captured DNA)	20μl
		KAPA HiFiHotStartReadyMix	25μl
Post-LM-PCR引物1&2(5μM)	5μl
		总体积	50μl

表5、后PCR反应条件

样本在4℃或-20℃保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。PCR后纯化的方法为：

将Agencourt^RAMPure^RXP reagent翻转几次，使得其充分混匀。往每个样本管中加入90μl的Agencourt^RAMPure^RXP reagent，涡旋2秒。室温放置15min。瞬时离心，然后将样本放入磁力架中，静置直至液体变得清澈。小心吸走溶液，注意不要吸走底部的磁珠。不要从磁力板中移走样本管，直接往管中加入200μl 80％酒精，静置1min，然后吸出液体。重复该步骤一次。将管放入到加热器中，37±0.5℃，5min，或者直到管中酒精完全蒸发。用52μl的NF水溶解磁珠。移液器吹打10次，室温2min。将离心管放回到磁力板中直至溶液变清澈。每例样本直接转移50μl至1.5ml离心管中。

用1.5％凝胶电泳、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度及片段大小。经过多重PCR后，此时产物中将增加68bp附加物，应注意仔细观察峰值出现是否一致。凝胶电泳图如图4所示，第1泳道是分子大小标记，第2、3泳道是为对不同样本进行后PCR，峰值约在400bp左右。下表为Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度如表6所示。

表6、Qubit及qPCR测定扩增后的DNA浓度

样本编号	1031	1037
			Qubit测定值(ng/μl)	2.54	2.62
qPCR测定值(nM)	12.2	9.8

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于高通量测序的线粒体基因组文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、自总DNA中一步PCR扩增线粒体全长DNA；

S1中所用引物对的具体序列为Primer F:ccgcacaagagtgctactctcctc，Primer R:gatattgatttcacggaggatggtg；

所述步骤S1中PCR反应体系如下：

所述步骤S1中PCR反应的程序如下：

Lid：105℃，Wait，Auto；Block：95℃，2min；

95℃，20sec；68℃，18min；30cycles；

72℃，20min；4℃，hold；

S2、将线粒体全长DNA打碎，得到DNA片段；

S3、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；

S4、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；

S5、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；

S6、对加接头的DNA片段进行前LM-PCR；

前LM-PCR的反应体系如下：

前LM-PCR的反应条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，9cycles；72℃1min；4℃；

S7、对LM-PCR产物进行后PCR；

后PCR反应的体系如下：

后PCR反应的条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，14cycles；72℃1min；4℃。

2.根据权利要求1所述的线粒体基因组文库构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：提取全血DNA，并以其为模板PCR扩增线粒体全长DNA。

3.根据权利要求1所述的线粒体基因组文库构建方法，其特征在于，所述步骤S3-S7包含纯化步骤。

4.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于通过PCR扩增线粒体全长DNA；所述引物对的具体序列为

Primer F:ccgcacaagagtgctactctcctc，

Primer R:gatattgatttcacggaggatggtg。