CN105112499A - 一种基于多探针富集168基因靶区域的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,通过将选择来自TCGA数据库以及目前肺癌获批靶向药物靶点、其他肿瘤靶向药物靶点、临床试验中的靶向药物靶点的168个基因组合在一起,并通过探针捕获技术一次性富集168个基因多靶点序列,从而实验多基因多靶点并行深度高通量测序,且同时检查基因的多种变异类型,如突变,缺失,插入,融合,拷贝数扩增,在检测的深度和广度上均优于现有的技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉一种基于多探针富集168基因靶区域的方法。
背景技术
癌细胞在破裂和死亡时,会释放出循环肿瘤DNA(ctDNA)等内容物,这种ctDNA是飘浮在血液中的基因组片段。细胞残骸一般由清道夫细胞(如巨噬细胞)清除,然而肿瘤细胞体积大且增殖快,导致清道夫细胞应付不过来。对血液中的肿瘤DNA进行检测和测序,可以帮助人们通过取血得到更全面的癌症信息。
2012年,英国癌症研究所的CharlesSwanton在对肾脏肿瘤进行DNA测序时发现,单个肿瘤中存在着惊人的遗传学多样性,只有三分之一的突变是整体共有的。此外,癌转移形成的二级肿瘤也与原发瘤大相径庭。
这些结果说明,标准程序(tissuebiopsy)根本不足以判断癌症的预后情况。而且活检得到的是静态信息,无法准确反映癌症的演化。在这种情况下,ctDNA就成为了科学家们的新希望,它能为人们揭示更多的癌症信息,甚至跟踪癌症的发展。
ctDNA的最大优势在于,能对肿瘤的演化和适应性改变进行监控。可以解释科学问题,比如,为何那么多靶向性治疗都以失败告终,癌症是怎样发展出抗性的等等。要监控患者的癌症发展,医生们目前得进行多次活检,以决定下一步的治疗策略,然而癌症晚期患者通常有多处需要检测的肿瘤,单个肿瘤中也可能存在不同的抵抗机制。更重要的是,活检有一定的风险性,难以用于肺部等脆弱的器官。相比之下,血检就容易多了。2012年,Diaz研究团队对接受EGFR抑制剂治疗的患者进行ctDNA分析。他们发现了42种与癌症抗性有关的KRAS突变,利用这些突变可以比传统方法早五个月发现肿瘤的变化。如果医生们能够及时发现癌症的抗性,就可以早点停用已经不起作用的昂贵药物。研究癌症抗性背后的突变,还有助于开发更有效的癌症疗法或者药物组合。如果能够得到充分利用,血液循环中的肿瘤DNA将为癌症治疗带来一场变革。
但目前ctDNA还无法成为临床上的主要诊疗手段。这是因为,最灵敏的ctDNA检测(例如BEAMing)需要事先知道想要检测的突变,但获得这样的信息又相当麻烦。外显子组测序不需要预先知道任何信息,但检测罕见突变的需求深度测序,这样做的成本非常高。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明旨在提供一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,通过将选择来自TCGA数据库以及目前肺癌获批靶向药物靶点、其他肿瘤靶向药物靶点、临床试验中的靶向药物靶点的168个基因组合在一起,并通过探针捕获技术一次性富集168个基因多靶点序列,从而实验多基因多靶点并行深度高通量测序,且同时检查基因的多种变异类型,如突变,缺失,插入,融合,拷贝数扩增
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,包括如下步骤:
S1gDNA片段化和加接头(adaptor)
1.1)准备所需试剂如下:
SureSelectQXT终止反应液、SureSelectQXT缓冲液、SureSelectQXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPureXP磁珠、乙醇;
1.2)定量待建库样本,调整浓度至25ng/μL,体积2μL;
1.3)PCR仪设置DNA加adaptor程序,设好程序后,点击开启,再立即点击暂停;
1.4)SureSelectQXT缓冲液和SureSelectQXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用;
1.5)将SureSelectQXT缓冲液、步骤1.2)中定量好的50ng待建库样本和SureSelectQXT转座酶溶液依次添加到PCR管中,于冰上操作配制片段化反应体系,每种试剂单独添加;配制完成后,短暂离心,再高速涡旋充分混匀20s,并再次短暂离心,完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上,重新启动反应程序;
1.6)PCR完成后,立即将其转移至冰上;然后往其中加32μL1XSureSelectQXT终止反应液,高速涡旋5s,短暂离心,室温孵育1min;
S2AMPureXP磁珠纯化
2.1)将AMPureXP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温;
2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mLEP管中;
2.3)加入52μL充分混匀的AMPureXP磁珠,涡旋5s,短暂离心,保证磁珠没有沉底;
2.4)置于混匀仪上室温孵育5min;
2.5)孵育好的样本短暂离心,放磁力架上吸附磁珠,时间为3-5min,弃上清;
2.6)加300μL现配的70%乙醇,计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈,令干扰的磁珠下沉,弃上清;
2.7)重复步骤2.6)一次;
2.8)短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇;
2.9)37℃烘干磁珠,时间为1-3min,或置于通风厨1-3min使磁珠干燥;干燥完成后,加36μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心;
2.10)室温孵育2min,放置磁力架上,取一定量上清至新的PCR管中,即得到纯化样本并放置冰上;
S3捕获前PCR
3.1)所需试剂如下:
HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5×HerculaseII反应缓冲液、每个三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)25mM的100mMdNTP混合液、SureSelectQXT引物混合物、DMSO、AMPureXP磁珠和乙醇;
3.2)在冰上操作,将5×HerculaseII反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液、DMSO、SureSelectQXT引物混合物、HerculaseIIFusionDNA聚合酶配制捕获前PCR反应混合液,一次反应中各试剂的剂量依次为10μL、0.5μL、2.5μL、1μL、1μL和15μL;
3.3)将步骤3.2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35μL步骤S2中得到的纯化样本中,涡旋5s混匀;然后放置于PCR仪上,设置PCR反应程序并启动;反应完毕后得到捕获前PCR样本并放置冰上;
S4AMPureXP磁珠纯化
4.1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温;
4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1.5mLEP管中;
4.3)按照步骤2.3)-2.10)进行操作;完成后即得到预文库;
S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测,包括预文库DNA的片段大小是否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足≥500ng;
S6预文库DNA的准备
6.1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中;
6.2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干;
6.3)加入12μL不含核酸酶的水进行溶解,得到12μL预文库DNA;
S7杂交
7.1)准备所需试剂如下:
SureSelectQXT快速杂交缓冲液、SureSelectQXT快速封闭液、SureSelectRNase封闭剂、捕获探针库;
需要说明的是,所述捕获探针库中的探针主要选取自TCGA数据库以及目前肺癌获批的靶向药物靶点、其他肿瘤靶向药物靶点和目前临床试验中的靶向药物靶点。
7.2)分两管配制混合液,记为A管和B管,A管中,用12μL步骤S6得到的预文库DNA和5μL的SureSelectQXT快速封闭液配制混合液,用移液器上下吹打8-10次,涡旋5s混匀,短暂离心;B管中配制捕获库杂交混合液,涡旋5s混匀,放置室温备用;
7.3)PCR仪上设置反应程序,体积设置为30μL;
7.4)将A管转移至PCR仪上,启动运行,在运行一段时间暂停运行;
7.5)在PCR仪上,将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中,用移液器上下吹打8-10次,然后密封好,涡旋5s,快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序,反应完毕后得到杂交样本;
S8T1磁珠捕获
8.1)准备所需试剂如下:
SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液1、DynabeadsMyOne链霉素T1磁珠;
8.2)将DynabeadsMyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后,取50μL至新的1.5mLEP管中,置于磁力架上静置几分钟,待澄清后弃上清;
8.3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200μLSureSelect结合缓冲液,移液器上下吹打10次,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;
8.4)重复步骤8.3)两次;
8.5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200μLSureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用;
8.6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温,在室温下将30μL杂交样本转移至步骤8.5)已加入200μLSureSelect结合缓冲液的EP管中,以1800rmp的速度混匀,在混匀仪上室温孵育30min;
8.7)按照600μl/样本的量预热SureSelect洗液2,保证步骤8.10)使用时温度达65℃;
8.8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上,待澄清,弃上清,然后加入200μLSureSelect洗液1,吹打8-10次,确保磁珠悬浮;
8.9)高速涡旋8s,短暂离心,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;
8.10)加200μL步骤8.7)中预热的SureSelect洗液2,移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬;然后高速涡旋5s,短暂离心;离心完成后,在65℃下孵育10min;孵育完成后,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;重复上述操作两次;
8.11)快速离心,放置于磁力架上静置,吸干残留液体;然后加入23μL不含核酸酶的水,混匀,得到23μL带T1磁珠的样本,放置冰上备用;
S9捕获后PCR加标签Index:
9.1)实验前试剂准备,所需试剂如下:
HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5×HerculaseII反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液、SureSelectQXTP7和P5双端标签引物、AMPureXP磁珠、乙醇;
9.2)在冰上配制捕获后PCR反应混合液,一次反应的配制剂量为不含核酸酶的水13.5μL、5×HerculaesII反应缓冲液10μL、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液0.5μL、HerculaseIIFusionDNA聚合酶1μL;涡旋混匀;
9.3)将捕获后PCR反应混合液加入步骤S8最终得到的23μL带有T1磁珠的样本EP管中;
9.4)依次加入1μLP7端接头引物和1μLP5端接头引物,上下吹打混匀,确保磁珠重悬;然后进行PCR仪反应设置;
9.5)将PCR后的样本管放置磁力架上,取50μL上清至新的1.5mLEP管中;
S10AMPureXP磁珠纯化
10.1)使用前充分混匀XP磁珠;
10.2)加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mLEP管中的样本中,涡旋5s,短暂离心,保证磁珠没有沉底;
10.3)置于混匀仪上室温孵育5min;
10.4)放磁力架上吸附磁珠3-5min,弃上清;
10.5)加300μL现配的70%乙醇,计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈,令干扰的磁珠下沉,弃上清;
10.6)重复步骤10.5)一次;
10.7)短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇;
10.8)37℃烘干磁珠,时间为1-3min,或置于通风厨1-3min使磁珠干燥;
10.9)加25μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心;然后室温孵育2min,放置磁力架上,取25μL上清至新的1.5mL管中,即得到文库,放置冰上;
S11对步骤S10得到的文库进行质量检测以及qPCR检测。
需要说明的是,步骤1.1)中,确保SureSelectQXT终止反应液添加25%乙醇:首次使用时,在4.5mL的SureSelectQXT终止反应液中加1.5mL25%乙醇,涡旋混匀、离心并做好标记,放置室温密封保存备用。
需要说明的是,步骤1.3)中,PCR的参数设定如下:
步骤1:温度45℃,运行时间10分钟;
步骤2:温度4℃,运行时间1分钟;
步骤3:温度4摄氏度,锁定;
其中,需要确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
需要说明的是,步骤1.5)中,SureSelectQXT缓冲液、样本和SureSelectQXT转座酶溶液添加到PCR管的具体方法如下:
1.5.1)在PCR管中,加17μLSureSelectQXT缓冲液;
1.5.2)加2μL样本至管底,样本量为50ng;
1.5.3)加2μLSureSelectQXT转座酶溶液至管底。
需要说明的是,步骤3.3),PCR反应参数设置如下:
步骤1:循环次数为1,温度设为68℃,运行2分钟;
步骤2:循环次数为1,温度设为98℃,运行2分钟;
步骤3:循环次数为8,温度设为98℃运行30秒,然后温度设为57℃运行30秒,最后温度设为72℃运行1分钟;
步骤4:循环次数为1,温度设为72℃,运行5分钟;
步骤5:循环次数为1,温度设为4摄氏度,锁定。
需要说明的是,步骤7.2)中,B管中的捕获杂交混合液的配置方法为:按一次反应的剂量为捕获探针库2μL、SureSelectQXT快速杂交缓冲液6μL、SureSelectRNase封闭液0.5μL、ddH2O4.5μL。
需要说明的是,步骤7.3)中,PCR反应程序参数设置如下:
步骤1:循环次数为1,95℃下运行5分钟;
步骤2:循环次数为1,65℃下运行10分钟;
步骤3:循环次数为1,65℃下运行1分钟;
步骤4:循环次数为60,每次在65℃下运行1分钟,37℃下运行3秒;
步骤5:循环次数为1,65℃下锁定;
其中,步骤7.4)中PCR的暂停具体是在步骤3结束后进行的。
需要说明的是,步骤6.1)中,用于杂交的DNA数量为500to750ng,具体取12μL预文库。
本发明的有益效果在于:现有的大部分检测技术只能一次检测单靶点突变,或者多靶点的部分突变类型,本产品通过探针捕获技术一次性富集168个基因多靶点序列,从而实验多基因多靶点并行深度高通量测序,且同时检查基因的多种变异类型,如突变,缺失,插入,融合,拷贝数扩增,在检测的深度和广度上均优于现有的技术。
附图说明
图1为本发明的实施流程图;
图2a-图2e分别为样本一至样本五以本发明方法制备得到的文库的QC检测结果示意图;
图3a-图3e分别为样本一至样本五以本发明方法制备得到的文库的序列测序深度分布情况示意图;
图4a-图4e分别为样本一至样本五插入片段结果示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述,需要说明的是,本实施例以本技术方案为前提,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围并不限于本实施例。
如图1所示,本发明的实施流程具体如下:
预文库(Pre-Library)制备(50ngDNAsamples)
一、gDNA片段化和加接头adaptor
实验前试剂准备
1、所需试剂如表1所示:
表1
2、确保SureSelectQXT终止反应液添加25%乙醇:首次使用时,在4.5mL的SureSelectQXT终止反应液中加1.5mL乙醇,涡旋混匀、离心并做好标记,放置室温密封保存备用。
操作流程:
1)用QubitdsDNAHS分析试剂盒定量待建库样本,调整浓度至25ng/μL,体积2μL。
2)PCR仪设置DNA加接头程序(需热盖),如表2所示:
表2
步骤 | 温度 | 时间 |
步骤1 | 45℃ | 10分钟 |
步骤2 | 4℃ | 1分钟 |
步骤3 | 4℃ | Hold锁定 |
需要注意的是,45℃不能超过10min。
设好程序后,点击开启,再立即点击暂停。确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
3、SureSelectQXT缓冲液和SureSelectQXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用。
4、在冰上操作,配制片段化反应体系。每种试剂单独加,勿配混合Mix。加样顺序依次进行:
1)在PCR管中,加17μLSureSelectQXT缓冲液。
2)加2μL样本至管底(样本量为50ng)。
3)加2μLSureSelectQXT转座酶溶液至管底。
加完后,移液器上下吹打8-10次,确保粘性试剂完全转移至PCR管中。
5、将样本PCR管短暂离心,再高速涡旋充分混匀20s,然后再次短暂离心。
6、立即将其放置于步骤2中暂停的PCR仪上,重新启动反应程序。
7、4℃1min运行完成后,立即将其转移至冰上。
8、加32μL1XSureSelectQXT终止反应液,高速涡旋5s,短暂离心,室温孵育1min后,进行下一步纯化。
二、AMPureXP磁珠纯化
1、使用前充分混匀已平衡至室温的XP磁珠。
2、配制70%乙醇,现配现用,每个样本需要600μL/次。
3、将已片段化和加adaptor的样本转移至新的1.5mLEP管中。
4、加52μL充分混匀的XP磁珠,涡旋5s,短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
5、置于混匀仪上室温孵育5min。
6、孵育好的样本短暂离心,放磁力架上吸附磁珠,时间为3-5min,弃上清。
7、加300μL70%乙醇(现配现用),计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈,一些干扰的磁珠会下沉,弃上清。
8、重复步骤7一次。
9、短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇。
10、37℃烘干磁珠,时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥,其中磁珠不能太干,否则会影响样本溶解效率。
11、加36μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心。
12、室温孵育2min,放置磁力架上,取上清(约35μL)至新的PCR管中,放置冰上。
三、捕获前PCR
实验前试剂准备
所需试剂如表3所示:
表3
操作流程
1、涡旋混匀试剂。
2、本步骤在冰上操作,配制捕获前PCR反应混合液,如表4所示:
表4
3、将捕获前PCR反应混合液加入上述的35μL的纯化样本中。涡旋5s混匀。
4、放置于PCR仪上,程序如下(需热盖),设置参数如表5所示:
表5
5、反应完后放置冰上。
四、AMPureXP磁珠纯化
操作流程
1、使用前充分混匀XP磁珠。
2、将步骤三中所得的捕获前PCR样本库转移至新的1.5mLEP管中。
3、加50μL充分混匀的XP磁珠,涡旋5s,短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
4、置于混匀仪上室温孵育5min。
5、孵育好的样本短暂离心,放磁力架上吸附磁珠(时间大约3-5min),弃上清。
6、加300μL70%乙醇(现配现用),计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈,一些干扰的磁珠会下沉,弃上清。
7、重复步骤6一次。
8、短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇。
9、37℃烘干磁珠,时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥(磁珠不能太干,否则会影响样本溶解效率)。
10、加13μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心。
11、室温孵育2min,放置磁力架上,取上清(约12μL)至新的PCR管中,放置冰上(或4℃存储过夜或-20℃长期存储)。
五、预文库质量检测
1、2100检测
检测试剂:Agilent2100DNA1000试剂盒
检测目的:判断预文库DNA的片段大小
结果分析:此建库方法预文库DNA的片段主要分布在245-325bp。
需要注意的是,DNA片段大小若小于245bp表明可能在片段化反应中gDNA的量太少,测序结果可能会增加duplicates;若大于325bp表明可能在片段化反应中gDNA的量太多,测序结果可能会降低靶向区域覆盖度。
2、Qubit测浓度
检测试剂:Qubit双链DNA分析试剂盒
检测目的:测定预文库DNA的浓度
结果分析:杂交预文库DNA的总量应≥500ng。
杂交捕获
六、杂交预文库DNA准备
取500-750ng的预文库DNA至新PCR管中,调整终体积至12μL
七、杂交
实验前试剂准备
所需试剂如表6所示:
表6
操作流程
1、配混合液,分两管,配制体系如下
A管:样本管,混合液的配制如表7所示:
表7
试剂 | 1次反应的体积 |
预文库DNA | 12μL |
SureSelect QXT快速封闭液 | 5μL |
总体积 | 17μL |
用移液器上下吹打8-10次,涡旋5s混匀,短暂离心。
B管:配置捕获库杂交混合液(CaptureLibraryHybridizationMix),配置试剂及剂量如表8所示。
表8
涡旋5s混匀,放置室温备用。
1、PCR上设置反应程序,具体设置参数如表9所示。体积设置为30μL,需要说明的是,该体积为杂交反应的终体积。
表9
2、将A管(17μL)转移至PCR仪上,点击“开始”。
3、运行到第3步(65℃,1min),立即点击“暂停”。
4、(在PCR仪上操作)转移B管中的13μL捕获库杂交混合液至A管中,用移液器上下吹打8-10次。
5、将其密封好,涡旋5s,快速离心,放回PCR仪上继续杂交反应程序。
八、T1磁珠捕获
实验前试剂准备:所需试剂如表10所示:
表10
操作流程
1、将DynabeadsMyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后,取50μLT1磁珠于新的1.5mLEP管中,置于磁力架上静置几分钟,待澄清后弃上清。
2、向磁珠中加入200μLSureSelect结合缓冲液,移液器上下吹打10次,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清。
3、重复2两次,共三次。
4、向磁珠中加入200μLSureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用。
5、待杂交结束,将杂交样本转移至室温,在室温下将杂交样本(约30μL)转移至200μLSureSelect结合缓冲液中。1800rmp混匀,混匀仪上室温孵育30min。
6、按照600μl/样本的量65℃预热SureSelect洗液2,保证第10步使用时温度达65℃。
7、第5步孵育好的样本短暂离心后放磁力架上,待澄清,弃上清。
8、向有样本的磁珠中加入200μLSureSelect洗液1,吹打8-10次,确保磁珠悬浮。
9、高速涡旋8s,短暂离心,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清。
10、加SureSelect洗液2:
1)加200μL步骤6中预热的65℃SureSelect洗液2,移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬。
2)高速涡旋5s,短暂离心。
3)65℃孵育10min(若使用PCR仪孵育,不需热盖)。
4)放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清。
5)重复1)-4)两次
11、第3次弃上清后,快速离心,放置于磁力架上静置,吸干残留液体。
12、加23μL不含核酸酶的水,混匀,放置冰上备用。
文库(Library)制备
九、捕获后PCR加标签
实验前试剂准备,所需试剂如表11所示:
表11
操作流程
1、在冰上配制捕获后PCR反应混合液,配制剂量如表12所示。
表12
上述试剂均需要涡旋混匀。
2、将捕获后PCR反应混合液加入23μL带有T1磁珠的样本管中。
3、加1μLP7端接头引物;
4、加1μLP5端接头引物;
5、上下吹打混匀,确保磁珠重悬。PCR仪反应设置如表13所示。
表13
步骤 | 循环次数 | 温度 | 运行时间 |
1 | 1 | 98℃ | 2分钟 |
2 | 10 | 98℃ | 30秒 |
3 | 1 | 72℃ | 5分钟 |
4 | 1 | 4℃ | 锁定 |
6、PCR完成后,PCR后的样本管放置磁力架上,取上清(约50μL)至新的1.5mLEP管中进行下一步纯化。
十、AMPureXP磁珠纯化
操作流程
1、使用前充分混匀XP磁珠。
2、配制70%乙醇((现配现用,每个样本需要600μL)。
3、加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mLEP管中样本中,涡旋5s,短暂离心(保证磁珠没有沉底)。
4、置于混匀仪上室温孵育5min。
5、放磁力架上吸附磁珠(时间大约3-5min),弃上清。
6、加300μL70%乙醇(现配现用),计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转离心管一圈,一些干扰的磁珠会下沉,弃上清。
7、重复6一次。
8、短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇。
9、37℃烘干磁珠,时间为1-3min或置于通风厨1-3min使磁珠干燥(磁珠不能太干,否则会影响样本溶解效率)。
10、加25μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心。
11、室温孵育2min,放置磁力架上,取上清(约25μL)至新的1.5mL管中,放置冰上(或4℃存储过夜或-20℃长期存储)。
十一、文库质量检测,检测通过后,即可上机进行测序以及根据测序结果进行数据分析。
以下将通过对五个不同的样本一至样本五,按照上述方法进行实验,并对实验结果作如下检测,以对本发明的性能进行分析:
如图2a-图2e所示,通过Agilent2100片段分析仪检测使用本发明方法所制备的文库,结果显示成功捕获到了170bp左右的血浆游离DNA,加上文库接头120bp,主峰在290左右,且样本间重复性极高。
如图3a-图3e所示,对于样本一至样本五,本发明序列测序深度的分布基本都在均值15000层左右,没有长拖尾,覆盖均一。
如图4a-图4e所示,通过最后的测序数据的分析,结果显示不同的样本间插入片段均为170左右,说明成功抓取了血浆中的游离DNA。
对于本领域的技术人员来说,可以根据以上的技术方案和构思,作出各种相应的改变和变形,而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1gDNA片段化和加接头(adaptor)
1.1)准备所需试剂如下:
SureSelectQXT终止反应液、SureSelectQXT缓冲液、SureSelectQXT转座酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)、AMPureXP磁珠、乙醇;
1.2)定量待建库样本,调整浓度至25ng/μL,体积2μL;
1.3)PCR仪设置DNA加adaptor程序,设好程序后,点击开启,再立即点击暂停;
1.4)SureSelectQXT缓冲液和SureSelectQXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备用;
1.5)将SureSelectQXT缓冲液、步骤1.2)中定量好的50ng待建库样本和SureSelectQXT转座酶溶液依次添加到PCR管中,于冰上操作配制片段化反应体系,每种试剂单独添加;配制完成后,短暂离心,再高速涡旋充分混匀20s,并再次短暂离心,完成后立即将PCR管放置于步骤1.3)中暂停的PCR仪上,重新启动反应程序;
1.6)PCR完成后,立即将其转移至冰上;然后往其中加32μL1XSureSelectQXT终止反应液,高速涡旋5s,短暂离心,室温孵育1min;
S2AMPureXP磁珠纯化
2.1)将AMPureXP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温;
2.2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1.5mLEP管中;
2.3)加入52μL充分混匀的AMPureXP磁珠,涡旋5s,短暂离心,保证磁珠没有沉底;
2.4)置于混匀仪上室温孵育5min;
2.5)孵育好的样本短暂离心,放磁力架上吸附磁珠,时间为3-5min,弃上清;
2.6)加300μL现配的70%乙醇,计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈,令干扰的磁珠下沉,弃上清;
2.7)重复步骤2.6)一次;
2.8)短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇;
2.9)37℃烘干磁珠,时间为1-3min,或置于通风厨1-3min使磁珠干燥;干燥完成后,加36μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心;
2.10)室温孵育2min,放置磁力架上,取一定量上清至新的PCR管中,即得到纯化样本并放置冰上;
S3捕获前PCR
3.1)所需试剂如下:
HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5×HerculaseII反应缓冲液、每个三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)25mM的100mMdNTP混合液、SureSelectQXT引物混合物、DMSO、AMPureXP磁珠和乙醇;
3.2)在冰上操作,将5×HerculaseII反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液、DMSO、SureSelectQXT引物混合物、HerculaseIIFusionDNA聚合酶配制捕获前PCR反应混合液,一次反应中各试剂的剂量依次为10μL、0.5μL、2.5μL、1μL、1μL和15μL;
3.3)将步骤3.2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35μL步骤S2中得到的纯化样本中,涡旋5s混匀;然后放置于PCR仪上,设置PCR反应程序并启动;反应完毕后得到捕获前PCR样本并放置冰上;
S4AMPureXP磁珠纯化
4.1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温;
4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1.5mLEP管中;
4.3)按照步骤2.3)-2.10)进行操作;完成后即得到预文库;
S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测,包括预文库DNA的片段大小是否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足≥500ng;
S6预文库DNA的准备
6.1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中;
6.2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干;
6.3)加入12μL不含核酸酶的水进行溶解,得到12μL预文库DNA;
S7杂交
7.1)准备所需试剂如下:
SureSelectQXT快速杂交缓冲液、SureSelectQXT快速封闭液、SureSelectRNase封闭剂、捕获探针库;
7.2)分两管配制混合液,记为A管和B管,A管中,用12μL步骤S6得到的预文库DNA和5μL的SureSelectQXT快速封闭液配制混合液,用移液器上下吹打8-10次,涡旋5s混匀,短暂离心;B管中配制捕获库杂交混合液,涡旋5s混匀,放置室温备用;
7.3)PCR仪上设置反应程序,体积设置为30μL;
7.4)将A管转移至PCR仪上,启动运行,在运行一段时间暂停运行;
7.5)在PCR仪上,将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中,用移液器上下吹打8-10次,然后密封好,涡旋5s,快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序,反应完毕后得到杂交样本;
S8T1磁珠捕获
8.1)准备所需试剂如下:SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液1、DynabeadsMyOne链霉素T1磁珠;
8.2)将DynabeadsMyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后,取50μL至新的1.5mLEP管中,置于磁力架上静置几分钟,待澄清后弃上清;
8.3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200μLSureSelect结合缓冲液,移液器上下吹打10次,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;
8.4)重复步骤8.3)两次;
8.5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200μLSureSelect结合缓冲液重悬磁珠备用;
8.6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温,在室温下将30μL杂交样本转移至步骤8.5)已加入200μLSureSelect结合缓冲液的EP管中,以1800rmp的速度混匀,在混匀仪上室温孵育30min;
8.7)按照600μl/样本的量预热SureSelect洗液2,保证步骤8.10)使用时温度达65℃;
8.8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上,待澄清,弃上清,然后加入200μLSureSelect洗液1,吹打8-10次,确保磁珠悬浮;
8.9)高速涡旋8s,短暂离心,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;
8.10)加200μL步骤8.7)中预热的SureSelect洗液2,移液器上下吹打至少10次确保磁珠重悬;然后高速涡旋5s,短暂离心;离心完成后,在65℃下孵育10min;孵育完成后,放置于磁力架上静置,待澄清后弃上清;重复上述操作两次;
8.11)快速离心,放置于磁力架上静置,吸干残留液体;然后加入23μL不含核酸酶的水,混匀,得到23μL带T1磁珠的样本,放置冰上备用;
S9捕获后PCR加标签Index:
9.1)实验前试剂准备,所需试剂如下:
HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5×HerculaseII反应缓冲液、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液、SureSelectQXTP7和P5双端标签引物、AMPureXP磁珠、乙醇;
9.2)在冰上配制捕获后PCR反应混合液,一次反应的配制剂量为不含核酸酶的水13.5μL、5×HerculaesII反应缓冲液10μL、每个dNTP25mM的100mMdNTP混合液0.5μL、HerculaseIIFusionDNA聚合酶1μL;涡旋混匀;
9.3)将捕获后PCR反应混合液加入步骤S8最终得到的23μL带有T1磁珠的样本EP管中;
9.4)依次加入1μLP7端接头引物和1μLP5端接头引物,上下吹打混匀,确保磁珠重悬;然后进行PCR仪反应设置;
9.5)将PCR后的样本管放置磁力架上,取50μL上清至新的1.5mLEP管中;
S10AMPureXP磁珠纯化
10.1)使用前充分混匀XP磁珠;
10.2)加60μL充分混匀的XP磁珠至上述转移至1.5mLEP管中的样本中,涡旋5s,短暂离心,保证磁珠没有沉底;
10.3)置于混匀仪上室温孵育5min;
10.4)放磁力架上吸附磁珠3-5min,弃上清;
10.5)加300μL现配的70%乙醇,计时1min,期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈,令干扰的磁珠下沉,弃上清;
10.6)重复步骤10.5)一次;
10.7)短暂离心,将EP管重新放回磁力架静置30s,使用P10移液器除净残留乙醇;
10.8)37℃烘干磁珠,时间为1-3min,或置于通风厨1-3min使磁珠干燥;
10.9)加25μL不含核酸酶的水,涡旋混匀,短暂离心;然后室温孵育2min,放置磁力架上,取25μL上清至新的1.5mL管中,即得到文库,放置冰上;
S11对步骤S10得到的文库进行质量检测以及qPCR检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤1.1)中,确保SureSelectQXT终止反应液添加25%乙醇:首次使用时,在4.5mL的SureSelectQXT终止反应液中加1.5mL25%乙醇,涡旋混匀、离心并做好标记,放置室温密封保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤1.3)中,PCR的参数设定如下:
步骤1:温度45℃,运行时间10分钟;
步骤2:温度4℃,运行时间1分钟;
步骤3:温度℃,锁定;
其中,需要确保在开始DNA片段化时温度到达45℃。
4.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤1.5)中,SureSelectQXT缓冲液、样本和SureSelectQXT转座酶溶液添加到PCR管的具体方法如下:
1.5.1)在PCR管中,加17μLSureSelectQXT缓冲液;
1.5.2)加2μL样本至管底,样本量为50ng;
1.5.3)加2μLSureSelectQXT转座酶溶液至管底。
5.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤3.3),PCR反应参数设置如下:
步骤1:循环次数为1,温度设为68℃,运行2分钟;
步骤2:循环次数为1,温度设为98℃,运行2分钟;
步骤3:循环次数为8,温度设为98℃运行30秒,然后温度设为57℃运行30秒,最后温度设为72℃运行1分钟;
步骤4:循环次数为1,温度设为72℃,运行5分钟;
步骤5:循环次数为1,温度设为4摄氏度,锁定。
6.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤7.2)中,B管中的捕获杂交混合液的配置方法为:按一次反应的剂量为捕获探针库2μL、SureSelectQXT快速杂交缓冲液6μL、SureSelectRNase封闭液0.5μL、ddH204.5μL。
7.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤7.3)中,PCR反应程序参数设置如下:
步骤1:循环次数为1,95℃下运行5分钟;
步骤2:循环次数为1,65℃下运行10分钟;
步骤3:循环次数为1,65℃下运行1分钟;
步骤4:循环次数为60,每次在65℃下运行1分钟,37℃下运行3秒;
步骤5:循环次数为1,65℃下锁定;
其中,步骤7.4)中PCR的暂停具体是在步骤3结束后进行的。
8.根据权利要求1所述的一种基于多探针富集168基因靶区域的方法,其特征在于,步骤6.1)中,用于杂交的DNA数量为500to750ng,具体取12μL预文库。
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