CN107858426B

CN107858426B - 一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN107858426B
Application number: CN201710726323.2A
Authority: CN
Inventors: 颜婷婷; 朱月艳; 孙子奎
Original assignee: Shanghai Personal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Personal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: CN107858426A

Abstract

本发明公开的一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1‑SEQ NO.396探针混合物，且每条探针之间的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl。本发明的试剂盒是基于二代测序技术的基因检测，可一次性检测3种变异类型(突变、插入缺失、融合)，同时应用高测序深度覆盖微量基因变异，从而在样本有限的前提下精准检测患者的突变情况，可准确检测1％的突变频率。一方面，多基因高敏感性的平行检测提升了可用药基因变异的检出率，不错失用药的机会；另一方面，可在一次检测中同时检出热点、罕见甚至是未知的基因变异，在发现药物敏感性突变的同时检测相关的耐药突变(如KRAS和ALK点突变)，准确地反映患者用药后的敏感及耐药信息。

Description

一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及为一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其检测方法。

背景技术

随着肿瘤驱动基因的发现和相应靶向药物的研究和应用，肿瘤治疗已经走上了以基因为导向的个体化治疗之路。靶向治疗作用效率高，毒副作用低，可以更大程度提高肺癌患者的生存质量。然而，靶向治疗药物仅作用于带有特定基因突变的肿瘤细胞，对于不含特定基因突变的肿瘤细胞，靶向药物的疗效甚至不如化疗药物。因此，患者在接受靶向治疗前，必须进行相应的基因检测。

肿瘤组织来源的DNA携带有肿瘤细胞独有的基因特征，包括与肿瘤形成和发展有关的基因点突变、插入/缺失、基因融合、拷贝数变异和DNA甲基化异常等，以及肿瘤细胞用药相关的变异。本检测以新鲜血液或唾液等来源的正常细胞为参照样本，以肿瘤新鲜组织或石蜡包埋切片组织等为检测样本，利用靶向捕获技术通过高通量测序同步检测受检者肿瘤组织中16个基因的变异信息。根据检出的点突变、小片段插入/缺失和基因融合变异信息，结合国际相关用药指南分析受检者对相关靶向药物的用药敏感性、耐受性的个体化信息，供受检者参考。

本检测方法涉及16个肿瘤靶向药物用药相关的基因，包括ALK、APC、BRAF、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RB1、RET、ROS1和TP53。检测该16个基因的点突变或单核苷酸多态性、小片段基因插入或缺失以及基因重排信息，详见下表：

本检测产品覆盖的靶向药物，详见下表：

人类基因组包含30亿碱基对，数据量庞大。即使是采用高通量测序技术，直接对全基因组进行测序也面临着成本高、数据分析复杂、周期长等问题。因此，综合考虑临床目的和经济效益，需要在测序之前先对感兴趣的基因序列进行富集。基因捕获技术作为检测环节中必备的关键技术，是精准医学的基础之一。基因捕获测序的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，更精确地发现特定区域遗传变异信息。目前常用的基因捕获方法包括杂交捕获和多重PCR扩增。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，覆盖度高，均一性高，测序深度高及灵敏度高，同时可匹配极短长度的模板片段或特殊结构的DNA，但操作流程相对多重PCR捕获技术较复杂，有时还需要依赖较多专门的仪器设备；多重PCR则操作简单灵活，模板要求量相对较低，对仪器要求最小化，能在数小时内完成目标序列富集和文库构建，一般仅适用于相对较小50Kb以下的目标序列进行捕获，且对于基因重排如基因融合或倒位、大片段缺失无法检测。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于高通量、高灵敏度、高稳定性、低成本，主要针对非小细胞肺癌的肿瘤个体化用药基因突变检测的试剂盒。本发明主要是利用液相探针杂交捕获技术对靶向用药基因、原癌基因、抑癌基因及细胞信号转导通路上的16个基因热点进行捕获富集，然后通过高通量测序技术对富集后的目标区域进行测序，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现突变情况及其突变频率。

本发明另一目的是提供一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交富集的方法。

本发明第一方面的一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包含SEQ NO.1-SEQ NO.396探针混合物，且每条探针的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl，探针序列如下表：

在本发明的一个优选实施例中，所述用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括：

PCR扩增试剂包括如下SEQ NO.397和SEQ NO.398构成的引物对：

SEQ NO.397	AATGATACGGCGACCACCGA
		SEQ NO.398	CAAGCAGAAGACGGCATACGA

富集度检测试剂包括如下SEQ NO.399-SEQ NO.404构成的引物对：

SEQ NO.399	tcaattcattcgatcctcaggtaacc
		SEQ NO.400	gatgttctggaaggcaaactccatg
SEQ NO.401	GGCTCGCCAATTAACCCTGATTAC
		SEQ NO.402	TACCACTGGGCCTCACCTCTATG
SEQ NO.403	GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCT
		SEQ NO.404	TCATAGGGCACCACCACACTATGT

在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、Human Cot-1

PerfectHyb^TMPlus hybridization buffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQ NO.405和SEQ NO.406构成的引物：

SEQ NO.405	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
		SEQ NO.406	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

且摩尔数比为SEQ NO.405和SEQ NO.406＝1：1，检测时浓度为300μM each的上述混合液用量为1μl。

在本发明的一个优选实施例中，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：

在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidin beads，以及用于洗去非目标DNA的1×washing buffer、0.1×washingbuffer和将捕获的DNA洗脱下来的FE buffer。

在本发明的一个优选实施例中，所述1×washing buffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS。

在本发明的一个优选实施例中，所述0.1×washing buffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS。

在本发明的一个优选实施例中，所述FE buffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mM EDTA的溶液。

在本发明的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后用于洗涤Streptavidin beads的BW缓冲液。

在本发明的一个优选实施例中，BW缓冲液包括5mM Tris·Cl、0.5mM EDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。

在本发明的一个优选实施例中，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。

在本发明的一个优选实施例中，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×。

在本发明的一个优选实施例中，所述2×预混液包括2×Q5buffer、1×GCenhancer buffer、各组分浓度为0.4mM的dNTP、用量为0.2μl的浓度2000U/ml为Q5高保真DNA聚合酶。

在本发明的一个优选实施例中，所述富集度检测试剂还包括2×SYBR GreenMaster Mix(vazyme)、Primer mix(2uM each)、dH₂O和input/R1/R2。

作为本发明第二方面的用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交富集的方法，具体包括如下步骤：

1)文库构建。

2)杂交捕获：对构建好的文库等比例混合后使用SEQ NO.1-SEQ NO.396探针混合物进行液相探针捕获杂交，富集获得DNA；其中SEQ NO.1-SEQ NO.396探针混合物的摩尔数比均为1：1。检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl；

杂交捕获所采用的杂交体系由以下体积的各组分组成：

杂交程序如下：

将H1、H2混匀离心后分别放入PCR中，变性退火程序如下：

程序运行完毕后将H1用移液枪一次性小心加入到H2中，由于PerfectHyb^TM Plushybridization buffer比较粘稠请勿用枪头吹打混匀；将混合液放在漩涡振荡器上振荡混匀离心后放入PCR仪中，50℃杂交过夜；

用1ml BW重新悬浮Streptavidin beads，洗涤两次；

将杂交完毕的混合液用移液枪小心转移至含SA beads的离心管中，缓慢地一次性将管壁上的SA beads冲到离心管底部，漩涡振荡10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min；

取预热好的500μl 1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；

然后用500μl 0.1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min；

向洗涤后的磁珠加入20μl FE buffer，漩涡振荡混匀短暂离心后95℃1200rpm孵育10min；

最后使用

Nucleotide Removal Kit对上清进行纯化；

3)PCR扩增：对一轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.397和SEQ NO.398)，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。

所述的扩增体系包括：杂交产物20μl、5ul引物(SEQ NO.397和SEQ NO.398)、50μlPCR预混液、去离子水，总体积100μl。

PCR扩增程序如下：

4)二轮杂交富集：对纯化后的一轮PCR产物留取20ng用于富集度检测，其余全部用于二轮杂交。其中，二轮杂交input量为100ng-500ng，杂交时间为4h，其余条件与步骤同一轮杂交；

5)PCR扩增：对二轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对SEQ NO.397和SEQ NO.398，扩增所用循环数为10，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化；

6)富集度检测：对步骤2)所得的multiplex DNA sample library pool、步骤3)和步骤5)经过PCR扩增后的一轮、二轮DNA分别使用StepOne^TM and StepOnePlus^TM RealtimePCR system进行Realtime PCR富集度检测，每个样本做三个重复，以超纯水做阴性对照，以混合前任意一个文库做阳性对照。模板使用量均为1.0ng；计算每个样本Ct的平均值，然后使用富集前DNA样本Ct的平均值减去富集后的DNA样本Ct的平均值得到ΔCt；计算富集度，富集度计算方法为：Fold enrichment＝E^ΔCt，其中E为各检测引物对SEQ NO.399-SEQNO.400、SEQ NO.401-SEQ NO.402、SEQ NO.403-SEQ NO.404的PCR扩增效率。

7)测序：对经步骤6)检测后有一定富集度的步骤2)获得的PCR扩增产物进行测序。

8)分析：对步骤7)获得的测序结果进行分析，完成目标区域的突变检测。

本发明与现有技术相比，优点如下：

(1)更全面的肿瘤个体化用药选择：

全面检测NCCN指南建议的可药物抑制靶点基因、肺癌等Ⅱ/Ⅲ期临床试验在研的可药物抑制靶点以及多癌种已获批的可药物抑制靶点，提供全面的肿瘤个体化用药基因检测。

(2)更精准的基因变异检测：

基于二代测序技术的基因检测，可一次性检测3种变异类型(突变、插入缺失、融合)，同时应用高测序深度覆盖微量基因变异，从而在样本有限的前提下精准检测患者的突变情况，可准确检测1％的突变频率。一方面，多基因高敏感性的平行检测提升了可用药基因变异的检出率，不错失用药的机会；另一方面，可在一次检测中同时检出热点、罕见甚至是未知的基因变异，在发现药物敏感性突变的同时检测相关的耐药突变(如KRAS和ALK点突变)，精准的反映患者用药后的敏感及耐药信息。

(3)更专业的检测报告解读：

拥有本发明的分析报告系统，专业遗传咨询团队，提供报告解读及遗传咨询，确保了每一份检测报告的准确性，为医生设计更合理的个性化治疗方案提供精准且全面的依据。

(4)操作简便、环境宽松、流程简化：

产品杂交环境宽松，仅需普通PCR仪即可，实现一管多重杂交，流程简化。

本发明针对晚期非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肾细胞癌、结直肠癌、髓样甲状腺癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌、胃肠道间质瘤、慢性髓细胞性白血病等患者，一次性检测16个靶向用药基因、原癌基因、抑癌基因及细胞信号转导通路上的相关基因，为临床提供全面、精准的药物敏感、耐药信息，寻找合适靶向药物并辅助临床制定个性化的治疗方案。

附图说明

图1是本发明肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒二轮杂交富集度检测图；

图2是本发明肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒富集文库Agilent Bioanalyzer2100检测图；

图3是本发明肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒数据分析结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法进行详细地描述说明。

肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂。

1)杂交捕获：所述杂交试剂包括探针混合物(SEQ NO.1-SEQ NO.396)，且每条探针的摩尔数比均为1：1。检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl。所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2(SEQ NO.405和SEQ NO.406)、Human Cot-1

PerfectHyb^TM Plus hybridizationbuffer。Block3.1/3.2摩尔数比为SEQ NO.405和SEQ NO.406＝1：1，检测时浓度为300μMeach的上述混合液用量为1μl。另外，Human Cot-1

的规格为1mg/ml，检测时用量为0.1μl。PerfectHyb^TM Plus hybridization buffer的用量为50μl。所述杂交体系中还包括Multiplex DNA sample library pool，该library pool是将各待富集文库使用AgilentBioanalyzer2100高灵敏性DNA芯片进行检测得到文库片段分布范围及主峰的平均片段长度和浓度。然后按照等质量等比例混合，得到520ng的文库，其中500ng用于杂交，剩余20ng用于杂交后富集度检测用。

优选的，杂交体系由以下体积的各组分组成：

杂交程序如下：

将H1、H2混匀离心后分别放入PCR中，变性退火程序如下：

程序运行完毕后将H1用移液枪一次性小心加入到H2中，由于PerfectHyb^TMPlushybridization buffer比较粘稠请勿用枪头吹打混匀。将混合液放在漩涡振荡器上振荡混匀离心后放入PCR仪中，50℃杂交过夜。用1ml BW重新悬浮Streptavidin beads，洗涤两次。将杂交完毕的混合液用移液枪小心转移至含SA beads的离心管中，缓慢地一次性将管壁上的SA beads冲到离心管底部，漩涡振荡10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min。取预热好的500μl 1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min。然后用500μl 0.1×washing buffer/each sample洗涤SA beads两次，每次50℃1200rpm孵育1min。向洗涤后的磁珠加入20μl FE buffer，漩涡振荡混匀短暂离心后95℃1200rpm孵育10min。最后使用

Nucleotide Removal Kit对上清进行纯化。

2)PCR扩增：对一轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.397和SEQ NO.398)，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。

PCR扩增程序：

3)二轮杂交富集：对纯化后的一轮PCR产物留取20ng用于富集度检测，其余全部用于二轮杂交。其中，二轮杂交input量为100ng-500ng，杂交时间为4h，其余条件与步骤同一轮杂交。

4)PCR扩增：对二轮富集获得DNA进行PCR扩增，扩增使用的引物对(SEQ NO.397和SEQ NO.398)，扩增所用循环数为10，扩增后使用1×AMPur XP beads进行纯化。

5)富集度检测：对步骤1)所得的multiplex DNA sample library pool、步骤2)和步骤4)经过PCR扩增后的一轮、二轮DNA分别使用StepOne^TM and StepOnePlus^TM RealtimePCR system进行Realtime PCR富集度检测，每个样本做三个重复，以超纯水做阴性对照，以混合前任意一文库做阳性对照。模板使用量均为1.0ng。计算每个样本Ct的平均值，然后使用富集前DNA样本Ct的平均值减去富集后的DNA样本Ct的平均值得到ΔCt。计算富集度，富集度计算方法为：Fold enrichment＝E^ΔCt，其中E为各检测引物对SEQ NO.399-SEQ NO.400、SEQ NO.401-SEQ NO.402、SEQ NO.403-SEQ NO.404的PCR扩增效率。

效果说明：图1可以看出，经过二轮杂交后，检测引物SEQ NO.399-SEQ NO.400、SEQNO.401-SEQ NO.402、SEQ NO.403-SEQ NO.404所在的DNA富集度为E¹⁴、E¹⁶、E¹⁶。结果表明，经过两轮杂交后目的片段确实得到了一定程度的富集，且富集效果显著。图2为二轮杂交富集产物质量分析，从图中可以看出文库主峰单一且大小与杂交前文库大小一致，可用于进一步测序分析。图3中对杂交后的3个文库进行了信息分析，结果表明该杂交试剂盒对目标区域实现了有效富集，可有效地用于突变的检测。应当指出的是虽然在某些情况下，本方法检测体细胞突变的灵敏度为1％，低于此频率的突变可能无法检出。由于肿瘤组织本身的异质性、取样的局限性和本检测方法的局限性，当检测结果为阴性时，不能排除受检者组织仍然存在突变的可能性。另外本检测内容仅包含基因点突变、片段插入/缺失和基因重排，未包含基因拷贝数变异、基因表达变化和甲基化异常等其他信息，上述药物的敏感性及耐药性仅根据相关靶标基因在检测范围内的突变情况进行判断，信息仍然有限。因此在临床用药时，需要根据更多具体信息和情况进行综合判断和使用。

Claims

1.一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；

其中所述杂交用试剂包括如下SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.396探针混合物，且每条探针的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM的上述各探针混合物用量为1μl；

所述PCR扩增试剂包括如下SEQ ID NO.397和SEQ ID NO.398构成的引物对：

SEQ ID NO.397 AATGATACGGCGACCACCGA SEQ ID NO.398 CAAGCAGAAGACGGCATACGA

富集度检测试剂包括如下SEQ ID NO.399-SEQ ID NO.404构成的引物对：

SEQ ID NO.399 tcaattcattcgatcctcaggtaacc SEQ ID NO.400 gatgttctggaaggcaaactccatg SEQ ID NO.401 GGCTCGCCAATTAACCCTGATTAC SEQ ID NO.402 TACCACTGGGCCTCACCTCTATG SEQ ID NO.403 GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCT SEQ ID NO.404 TCATAGGGCACCACCACACTATGT

；

所述16个基因为ALK、APC、BRAF、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RB1、RET、ROS1和TP53，所涉及的检测区域和基因变异类型如下：

2.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、Human Cot-1

PerfectHyb^TM Plushybridization buffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQ ID NO.405和SEQ ID NO.406构成的引物：

且摩尔数比为SEQ ID NO.405：SEQ ID NO.406＝1：1，检测时浓度为300μM的上述各混合液用量为1μl。

3.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：

4.如权利要求3所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidin beads，以及用于洗去非目标DNA的1×washing buffer缓冲液、0.1×washing buffer缓冲液和将捕获的DNA洗脱下来的FE buffer缓冲液；

所述1×washing buffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS；

所述0.1×washing buffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS；

所述FE buffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mM EDTA的溶液。

5.如权利要求4所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后用于洗涤Streptavidin beads的BW缓冲液；

BW缓冲液包括5mM Tris·Cl、0.5mM EDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。

6.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。

7.如权利要求6所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×预混液；

所述2×预混液包括2×Q5 buffer、1×GC enhancer buffer、各组分浓度为0.4mM的dNTP、用量为0.2μl的浓度2000U/ml为Q5高保真DNA聚合酶。