CN106636442B - 一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液。本发明提供的联合检测试剂盒能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和BRAF中一个或多个基因突变位点，使实验结果灵敏度高，可以检测出1％的突变率，大大提高了检测灵敏度，克服了现有技术中的难题，同时整个实验过程满足大批量、快速检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及基因变异检测领域，尤其涉及一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒。
背景技术
肺癌是世界上常见的癌症，发病率和死亡率居各癌症之首。2002年全世界肺癌的新发病率为138万，近一半发生在发展中国家。据2008年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万。肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤，肺癌的死亡例数远大于乳腺癌和前列腺癌死亡例数的总和。
肺癌从组织病理学上可以分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数85％，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。发达国家的肺癌患者的5年生存率为15％～20％，而我国肺癌患者5年生存率仅为10％。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及相匹配的科学治疗方案，从而失去了治疗的最佳时机。因此，肺癌的基因突变检测和诊断技术，对于与之匹配的科学有效的化疗方案，提高肺癌患者的生存率，延长生存期有着重大的现实意义。
肺癌的发生主要由于致癌环境下，驱动基因的突变，导致突变细胞过度增殖而形成。肺癌的驱动性基因突变是一种恶性的基因突变，是导致肺癌发生、增殖、转移和耐药的最根本原因。美国国立癌症研究所的肺癌突变联盟组织14家研究单位，对1000例的肺腺癌的驱动突变进行检测。结果显示约60％的患者含有驱动性基因突变。进一步表明了检测肺癌驱动性突变对于肺癌的早期诊断和化疗靶向用药的预后提供重要的中间信息。同时，肺癌的驱动性突变的检测是肺癌靶向药物的开发和用药的前提和基础。
目前常见的检测这些基因突变的方法主要有sanger测序法和荧光定量法。Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子的突变位点就需要分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20％，假阳性率较高。荧光定量PCR法虽然灵敏度高，但对每对引物只能检测一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR体系，同时检测多个突变位点的操作繁琐。这两种方法对样本的需要量都较大，不适合同时检测多个基因突变位点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，可同时检测多个基因的不同的突变位点，同时具有检测灵敏度高，重复性好的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；
所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如Seq ID No 1～Seq ID No 8所示；
所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如Seq ID No 9～Seq ID No 10所示；
所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No11～Seq ID No 14所示；
所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No15～Seq ID No 16所示；
所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如Seq IDNo 17～Seq ID No 20所示。
优选的，荧光探针的核苷酸序列如Seq ID No 21所示。
优选的，QPCR引物的核苷酸序列如Seq ID No 22～Seq ID No 23所示。
优选的，连接接头的核苷酸序列如Seq ID No 24～Seq ID No 33所示。
优选的，所述消化酶为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力为5U/μL。
优选的，所述连接酶为T4连接酶；所述T4连接酶的酶活力为1U/μL。
优选的，所述PCR反应液包含下列含量的组分：10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含以下含量组分：
| 成分 | 浓度 |
| Tris-HCl(pH9.2) | 250mmol/L |
| KCl | 249mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 8mmol/L |
| 甘油 | 50％ |
优选的，所述QPCR反应液包含下列含量的组分：包含10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含以下含量组分：
| 成分 | 浓度 |
| Tris-HCl(pH8.2) | 250mmol/L |
| KCl | 249mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 8mmol/L |
| 甘油 | 50％ |
优选的，所述HiFi酶的酶活力为5U/μL。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一个和多个基因突变中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如Seq IDNo 1～Seq ID No 8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo 9～SeqIDNo 10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 11～Seq ID No 14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 15～Seq ID No 16所示；所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如Seq ID No 17～Seq ID No 20所示。本发明提供的联合检测试剂盒能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和/或BRAF基因的多个突变位点，使实验结果灵敏度高，可以检测出1％的突变率，大大提高了检测灵敏度，克服了现有技术中的难题。
同时，本发明提供的试剂盒通过连接接头的应用，使得一次检测可以同时检测几十个甚至几百个样本，使整个实验过程简单，快速，成本低；另外所述试剂盒对每个样本的需求量低，每个样本只需要10～100ng DNA即可。本发明提供的试剂盒对驱动性突变基因的检测提供了有效手段。
附图说明
图1为实施例1中文库构建流程图；
图2为实施例1中Ion Torrent Proton测序结果。
具体实施方式
本发明提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；
所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如Seq ID No 1～Seq ID No 8所示；
所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如Seq ID No 9～Seq ID No 10所示；
所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No11～Seq ID No 14所示；
所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No15～Seq ID No 16所示；
所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如Seq IDNo 17～Seq ID No 20所示。
本发明中，所述EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组和PIK3CA基因引物组对应的正反向序列如表1所示：
表1各基因引物组的信息
所述各基因引物组的正向序列和反向序列的来源委托生物工程公司合成。所述引物的摩尔浓度优选为10μmol/L。所述的引物的体积优选为10μL。
本发明中，所述HiFi酶的酶活力优选为5U/μL。所述HiFi酶的体积优选为10μL。本发明对所述HiFi酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的HiFi酶的来源即可。本发明实施例中，所述HiFi酶购自Thermo Fisher。
本发明中，所述PCR反应液优选包含下列含量的组分：10mM的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包括以下含量组分：
| 成分 | 浓度 |
| Tris-HCl(pH9.2) | 250mmol/L |
| KCl | 249mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 8mmol/L |
| 甘油 | 50％ |
所述PCR反应液的体积优选为10～100μL。
本发明中，所述连接接头的核苷酸序列优选如Seq ID No 24～Seq ID No 33所示。每种连接接头对应一个待测样本，从而通过不同的连接接头来区分不同样本的检测结果。所述连接接头的质量浓度优选为100pmol/L。所述连接接头的体积优选为2～20μL。
本发明中，所述连接缓冲液的主要成分为：
| 成分 | 浓度 |
| Tris-HCL(pH7.6) | 250mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 50mmol/L |
| ATP | 5mmol/L |
| DTT | 5mmol/L |
| 聚乙二醇 | 25％(w/v) |
本发明中，所述消化酶优选为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力优选为5U/μL。本发明对所述磷酸二酯酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸二酯酶的来源即可。本发明实施例中，所述磷酸二酯酶购自sigma公司。
本发明中，荧光探针的核苷酸序列优选如Seq ID No 21所示。所述RNA探针组的质量浓度优选为150ng/μl。所述RNA探针组的体积优选为200μl。所述荧光探针的来源委托生物工程公司合成。
本发明中，QPCR正向引物的核苷酸序列优选如Seq ID No 22；QPCR反向引物的核苷酸序列优选如Seq ID No 23所示。所述QPCR正向引物和QPCR反向引物的来源委托生物工程公司合成。所述正向引物或反向引物的摩尔浓度优选为10μmol/L。所述正向引物或反向引物的体积优选为10μL。
本发明中，所述连接酶为T4连接酶；所述T4连接酶的酶活力为1U/μL。本发明对所述连接酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接酶的来源即可。本发明实施例中，所述连接酶购自Thermo Fisher。
本发明中，所述QPCR反应液优选包含下列含量的组分：10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包括以下含量组分：
| 成分 | 浓度 |
| Tris-HCl(pH8.2) | 250mmol/L |
| KCl | 249mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 8mmol/L |
| 甘油 | 50％ |
所述QPCR反应液的体积优选为10～100μL。
本发明中，所述QPCR反应的Taq酶的来源购自Thermo Fisher公司。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一个或多个基因突变中的应用。
本发明中，所述试剂盒的检测方法优选包括以下步骤：
(1)使用上述技术方案所述试剂盒中所述引物组对待测样本的DNA进行扩增，得到PCR扩增产物；
(2)将所述PCR扩增产物与消化酶混合，对目的片段两端的引物进行剪切处理，得到平末端DNA片段；
(3)将所述步骤(2)得到的平末端DNA片段与连接接头、连接酶和连接缓冲液混合，连接，得到连接有接头的DNA片段；
(4)用磁珠纯化试剂盒按照操作说明对所述步骤(3)得到的DNA片段进行纯化，得到检测文库；
(5)用荧光定量PCR法对所述步骤(4)中得到的检测文库进行定量检测；
(6)将不同样本制备的定量后的文库进行混合，连接离子球微粒后，将连接有离子球微粒的文库在OT2仪器上进行乳液PCR，得到的模板进行测序，得到测序结果；
(7)将筛选后的步骤(6)中得到的测序结果与人类基因库hg19数据库进行序列比对，获得突变位点，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，从而确定突变基因。
本发明使用上述技术方案所述试剂盒中所述引物组对待测样本的DNA进行PCR扩增。
本发明中，所述PCR扩增的扩增体系如下：
| 成分 | 体积 |
| Hifi酶 | 1μL |
| 5×扩增酶缓冲液 | 4μL |
| 引物(100pmol/L) | 1μL |
| 模板DNA(10～100ng/μL) | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补至20μL |
本发明中，所述PCR扩增的扩增程序如下：
本发明中，所述PCR产物得到后优选进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增情况。所述琼脂糖凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的琼脂糖凝胶电泳方案即可。
得到PCR产物后，本发明向PCR产物中加入消化酶，对目的片段两端的引物进行剪切处理，得到平末端DNA片段。
本发明中，所述消化酶的加入体积量为PCR产物的体积的0.1倍。
本发明中，所述消化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的消化方法即可。所述消化的程序如下：
| 温度 | 时间 |
| 50℃ | 10min |
| 55℃ | 10min |
| 60℃ | 20min |
得到平末端DNA片段后，本发明将所述平末端DNA片段、连接接头、连接酶和连接缓冲液混合，连接，得到连接有接头的DNA片段。
本发明中，所述平末端DNA片段、连接接头、连接酶和连接缓冲液混合量的比例如下：
| 组分 | 体积 |
| 5×连接缓冲液 | 5μL |
| 连接酶(Ligase) | 1μL |
| 连接接头(100pmol/L) | 2μL |
| 消化产物 | 22μL |
| 总体积 | 30μL |
所述连接的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。本发明中所述连接采用PCR仪中进行反应。所述连接的
程序如下：
| 温度 | 时间 |
| 22℃ | 30min |
| 72℃ | 10min |
得到连接有接头的DNA片段后，本发明用磁珠纯化试剂盒按照操作说明对所述DNA片段进行纯化，得到检测文库。
本发明中，所述磁珠纯化试剂盒购于贝克曼公司。
得到检测文库后，本发明用荧光定量PCR法对所述检测文库进行定量检测。
本发明中，所述荧光定量PCR的反应体积如下：
| 组分 | 体积 |
| QPCR的Taq酶 | 1μL |
| 5×QPCR缓冲液 | 5μL |
| QPCR引物(100pmol/L) | 2μL |
| 荧光探针(100pmol/L) | 2μL |
| 模板 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补至20μL |
本发明中，所述荧光定量PCR的反应程序如下：
得到定量后的文库后，本发明将不同样本制备的定量后的文库进行混合，连接离子球微粒后，将连接有离子球微粒的文库在OT2仪器上进行乳液PCR，得到的模板进行测序，得到测序结果。
本发明中，根据QPCR结果得到文库的浓度，将制备好的文库稀释成100pM的浓度，将不同样本的文库等体积混合后在配套的仪器Ion OneTouch2和ES仪器上面进行乳液PCR，富集PCR产物。
本发明中，所述乳液PCR优选使用Thermo Fisher公司生产的Ion OneTouch200template Kit v2试剂盒。
得到测序结果后，本发明将筛选后的测序结果与人类基因库hg19数据库进行序列比对，获得突变位点，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，从而确定突变基因。
本发明中，所述筛选的方法为使用Ion torrent Proton仪器自带的默认的质控参数去除多克隆的数据和低质量的数据。
本发明中，所述比对优选采用Ion torrent Proton仪器自带的服务器将筛选后的序列数据与人类基因库hg19数据库进行序列比对，从而得到突变位点。
本发明中，根据测序后获得测序深度数据5000以上和覆盖度数据达到90％以上时，证明测序的质量可信度高，得到的比对后得到的碱基变异情况。
本发明中，所述测序深度每个样本都在3万以上，测序reads的覆盖度都在90％以上。
本发明中，检测的突变位点结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释。所述注释的方法优选为参考比对的数据库进行。所述参考比对的数据库优选为COSMIC数据库以及REFSEQ数据库。
下面结合实施例对本发明提供的一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取15年6月-12月送我公司检测肺癌患者石蜡包埋组织样本7例。对其进行多基因驱动突变的联合检测。
1、按照本发明所述试剂盒和方法对组织样本进行DNA抽提(抽提试剂盒A购于life公司)，得到的DNA溶于试剂盒中配好的Tris-EDTA中，稀释gDNA，用qubit dsDNA HS AssayKit定量试剂盒对稀释后的gDNA进行精确定量，使DNA浓度约3ng/uL。
A、目标DNA扩增；
按下述组分，配制PCR体系，进行目的片段扩增。
| 成分 | 体积 |
| Hifi酶 | 1μL |
| 5×扩增酶缓冲液 | 4μL |
| 引物(100pmol/L) | 1μL |
| 模板DNA(10～100ng/μL) | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补至20μL |
按下述扩增条件，进行PCR扩增：
B、引物序列的部分消化：
在扩增产物中，加入2微升消化酶，按下列条件进行消化反应。可在PCR仪中进行。
| 温度 | 时间 |
| 50℃ | 10min |
| 55℃ | 10min |
| 60℃ | 20min |
C、接头连接：
在消化完成的体系中加入接头序列和连接酶体系。体系如下：
| 组分 | 体积 |
| 5×连接缓冲液 | 5μL |
| 连接酶(Ligase) | 1μL |
| 连接接头(100pmol/L) | 2μL |
| 消化产物 | 22μL |
| 总体积 | 30μL |
反应条件如下，可在PCR仪中进行反应：
| 温度 | 时间 |
| 22℃ | 30min |
| 72℃ | 10min |
D、cDNA纯化：
用本发明的磁珠(购于贝克曼公司)进行DNA的纯化。用磁珠吸附目标DNA片段，在磁力架上，用75％酒精进行洗涤DNA 1次，然后用试剂盒中配好的Tris-EDTA溶液进行洗脱，得到的纯化好的就是我们需要的文库。
E、文库定量：
将上述步骤得到的文库进行荧光定量PCR定量。用参考品做对照，做标准曲线，将每个文库稀释100倍，按照下列的体系配置反应液：
| 组分 | 体积 |
| QPCR的Taq酶 | 1μL |
| 5×QPCR缓冲液 | 5μL |
| QPCR引物(100pmol/L) | 2μL |
| 荧光探针(100pmol/L) | 2μL |
| 模板 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补至20μL |
按照下列反应程序进行QPCR：
按照结果，将文库稀释至100pM浓度，各文库等体积混合，至此，文库制备完成。
2、在Ion OneTouch 2实验平台上，用Ion OneTouch 200template Kit v2试剂盒进行油包水PCR，并富集PCR产物。操作按照仪器使用说明书进行。
3、富集后的PCR产物可根据Ion Proton 200sequencing Kit说明进行样品处理，上样到测序仪配套的P1芯片，Ion torrent Proton进行高通量测序。
4、结果分析。
测序结果经过筛选，仪器自带的程序的默认质控环节将去除多克隆的数据和低质量的数据。Ion torrent平台自带的服务器将得到的数据再与人类基因库hg19数据库进行序列比对(如图2)，符合率达到93％。获得测序深度数据图(如表2所示)和覆盖度数据图(如表2所示)，以及碱基变异情况(如表3所示)，测序深度每个样本都在3万以上，测序reads的覆盖度都在90％以上。检测到的突变，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，注释主要比对的数据库为COSMIC数据库以及REFSEQ数据库。
表2实施例1中待测样本的测序深度数据和覆盖度数据结果
肺癌患者基因突变联合检测结果见表2。
表2本发明中碱基变异情况
由表2可以看出，一次测序实验中，可以同时检测多个样本，同时检测不同的基因突变包括EGFR、PIK3CA、KRAS、NRAS和BRAF五种基因的多个突变位点，操作流程简单，耗时短。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海鼎晶生物医药科技股份有限公司
<120> 一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒
<130> 2017
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<170> PatentIn version 3.3
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 7
cacagcaggg tcttctctgt tt 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccctgcatgt gttaaacaat acagc 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aatgactttc tagtaactca gcagcat 27
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctcttacct aaactcttca taatgcttgc 30
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atccgacaag tgagagacag gat 23
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcacactagg gttttcattt ccattgatta 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaggttaata tccgcaaatg acttgc 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgcttattta accttggcaa tagcattg 28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
taagtactca tgaaaatggt cagagaaacc 30
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
attataaggc ctgctgaaaa tgactga 27
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tagctattcg acagcatgcc aat 23
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccagagtgag ctttcatttt ctcagt 26
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
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<400> 19
attttacaga gtaacagact agctagagac a 31
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cattttagca cttacctgtg actccata 28
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccctgcgtgt ctccgactc 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccatctcatc cctgcgtgtc t 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctctctatgg gcagtcggtg at 22
<210> 24
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggagataat tc 12
<210> 25
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cttaatcaat tc 12
<210> 26
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
caggccaacc ac 12
<210> 27
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cttggacttc tc 12
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tcaacaggaa tc 12
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ttcctagccg ac 12
<210> 30
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
caaggctccg tc 12
<210> 31
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cttggagagg ac 12
<210> 32
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cctgacttat c 11
<210> 33
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctgaagcacc ac 12
Claims (10)
1.一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，其特征在于，由以下部分组成：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；
所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如Seq ID No 1～Seq ID No 8所示；
所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如Seq ID No 9～Seq ID No 10所示；
所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 11～SeqID No 14所示；
所述基因KRAS引物组包括2条引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 15～Seq ID No 16所示；
所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如Seq IDNo 17～Seq IDNo 20所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，荧光探针的核苷酸序列如Seq ID No 21所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，QPCR引物的核苷酸序列如Seq ID No 22～Seq ID No 23所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，连接接头的核苷酸序列如Seq ID No 24～Seq ID No 33所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述消化酶为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力为5U/μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述连接酶为T4连接酶；所述T4连接酶的酶活力为1U/μL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包含下列含量的组分：包含摩尔浓度为10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含摩尔浓度为250mmol/L Tris-HCl、249mol/L KCl、8mmol/L Mg2+和质量浓度为50％的甘油。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述QPCR反应液包含下列含量的组分：包含摩尔浓度为10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含摩尔浓度为250mmol/L Tris-HCl、249mol/L KCl、8mmol/L Mg2+和质量浓度为50％的甘油。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HiFi酶的酶活力为5U/μL。
10.权利要求1～9任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一个或多个基因突变中的应用。
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