CN104561272B - 一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物,所述组合引物分为组合正向引物和组合反向引物,所述组合正向引物由2部分组成,由接头部分P1序列和正向引物序列组成,所述组合反向引物依次由接头部分P2序列、标签序列和反向引物序列组成。本发明还公开了一种人类耳聋基因突变筛查的试剂盒。本发明还公开了组合引物、试剂盒在制备用于人类耳聋多基因突变筛查试剂方面的应用。本发明使用含有标签(Barcode)序列的引物用以区分不同的样品,进行一次本发明的方法,至少可以检测32份样品,从而使其可以被广泛地用于耳聋易感基因的普查工作。本发明价格要远远低于进口仪器和试剂,使得测序成本大大降低,从而其检测成本也大大降低。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物及其应用。
背景技术
耳聋是最常见的感觉障碍性疾病之一,先天性耳聋可引发言语障碍。据第二次全国残疾人抽样调查显示,我国听力残疾人数约2004万人,占残疾人数总数的24.16%;耳聋导致的言语残疾约127万人,占残疾人总数的1.53%,而世界卫生组织2010年估计全世界听力障碍人数达2.78亿。
耳聋的影响因素主要分为环境因素及遗传因素。随着环境因素导致的耳聋的发病率的降低和对疾病诊疗水平的提高,遗传因素逐渐成为导致耳聋的首要因素,60%的耳聋是由遗传缺陷引起的。在所有被认为与遗传因素相关的先天性耳聋病例中,有约70%属于非综合征性耳聋,及耳聋为临床仅有的症状而不伴有其他器官异常症状,30%伴随有其他器官病变而耳聋属于综合征型听力缺(SNL)。
耳聋遗传学研究表明,人类23对染色体中的22对都分步有耳聋遗传位点,线粒体基因也与耳聋相关,约有半数的先天性耳聋与遗传因素有关。遗传性耳聋根据是否伴有其他器官功能性障碍分为两种,其中约70%为非综合征型耳聋(nonsyndromic hearingloss,NSHL),约30%为综合征型耳聋(syndrome hearing loss,SHL)。非综合征型耳聋具有高度的遗传异质性,可呈多种方式遗传给下一代,包括:常染色体显性遗传(相关染色体位点命名为DFNA),占20%-25%;常染色体隐性遗传(相关染色体位点命名为DFNB),占75%-80%;X连锁遗传(相关染色体位点命名为DFN),占1%;线粒体突变母系遗传,约为1%;Y连锁遗传(相关染色体位点命名为DFNY),目前只报道过一个中国耳聋相关家系[3];其中,常染色体隐性遗传性耳聋,多表现为学语前耳聋;常染色体显性遗传性耳聋则多表现为学语后的进行性发展的耳聋。
遗传性耳聋可由多种基因导致。至2010年7月为止共定位NSHL基因位点136个,包括DFNA位点52个,DFNB位点79个,DFN位点5个,DFNY位点1个;克隆致病基因58个,其中DFNA相关基因24个,DFNB相关基因40个,DFN相关基因2个,线粒体相关基因2个。其中,GJB2基因为最常见的耳聋相关基因,该基因的突变在高加索人群中与50%左右的先天性耳聋相关;其次为SLC26A4,占5%—10%;与线粒体基因突变相关的占1%左右。其余各型NSHL相对来讲占较小比例。
GJB2基因编码的Cx26属于缝隙连接蛋白基因家族。免疫组化证实,内耳非感觉上皮细胞和组织连接细胞表达GJB2基因编码的Cx26蛋白,在声音传导过程中,Cx26蛋白对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用,GJB2基因突变后,K+进入内淋巴液的循环受影响,导致感音神经性聋。由于蛋白质的编码序列仅存在于一个外显子,因此该基因很容易通过PCR反应结合测序进行分析。1997年有学者发现GJB2基因突变与遗传性非综合征型耳聋密切相关。研究表明,在常染色体隐性遗传NSHI患者中,约有50%为GJB2基因突变引起。GJB2的突变位点多样,且有明显的种族特异性,即便在同一国家的不同地区,其突变的频率也相差较大。结合国内外发表的有关GJB2基因突变在中国人群中分布的文献进行分析,在中国人群中现已报道的GJB2变异位点有79G>A、109G>A、341A>G、442G>A、506G>A、608T>A、299-300delAT、235delC、161A>T、240G>A、571T>C、176-191dell6、251delT、35delG、232G>A、504insGCAA、455A>G共17种,其中最常见的突变是235delC,其次是299-300delAT和176del 16bp基因突变。
GJB2基因作为后天高频感音神经性耳蒼患者的常见突变基因之一,其突变造成缝隙连接蛋白Cx31第二细胞外区的结构发生改变。细胞外区是连接子对接的关键部位,是控制蛋白质分子内部稳定的关键因素,因而此突变可能会使缝隙连接蛋白功能受到重大影响,甚至丧失通道功能,引起钾离子再循环障碍,影响内耳毛细胞的功能,导致听力下降,GJB3基因突变临床多表现为局频听力受损的进行性语后聲。1998年,我国夏家辉教授等最早报道了两个引起显性遗传高频听力下降的GJB3突变,他们应用同源EST搜索和巢式PCR的方法克隆出GJB3基因,并将GJB3基因定位在lp33-p35,对42个遗传性疾病的家系中进行筛查,在一个浙江的耳聋家系中发现了一个错义突变,在GJB3基因编码区的第547个碱基由G突变成A(547G>A),使得连接蛋白Cx-31的第183号氨基酸由谷氨酸变成赖氨酸。同时他们还在一个湖南家系中发现了一个无义突变,GJB3的第538个碱基由C变成T(538C>T),导致在第180号碱基位置编码终止。GJB3基因与国人NSHI的相关性,也已成为研究热点。
SLC26A4基因是仅次于GJB2的常染色体隐性遗传耳聋相关基因,其突变导致5-10%的语前聋。大前庭水管综合征(large vestibular aqueductsyndrome,LVAS)是一种逐渐被广泛认识的临床常见的隐性遗传性非综合征型听力障碍性疾病,在儿童和青少年感音神经性聋占1%-12%。LVAS的基因即SLC26A4。SLC26A4基因定位于7q31,全长4930bp,含有21个外显子,开放阅读框2343bp,编码跨膜蛋白Pendrin,该蛋白分子量为86KD,含有780个氨基酸,主要由疏水氨基酸组成,属于离子转运体家族。Pendrin是SLC26A(solute carrierfamily 26A,可溶性转运家族26A)家族成员之一,Pendrin蛋白作为阴离子泵在这些细胞内发挥作用,保持内耳液体的离子平衡,从而维持正常听力,Pendrin蛋白在内耳具有氯/甲酸的转运功能,在保持内耳液体的离子平衡、维持正常听力中起重要作用。与GJB2基因类似,SLC26A4存在一个广泛的基因突变谱,不同种族其突变热点各异。最近研究发现中国人群的SLC26A4基因突变以IVS7-2A>G为最常见,占所有SLC26A4基因致病突变的69.1%。此外,中国人群中SLC26A4基因热点突变还包括281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G。LVAS患者发病较晚,发病和病情加重多与头部外伤、屏气、感冒等有关,目前,LVAS尚无确切有效的治疗方法。通过突变位点检测可以帮助对LVAS的诊断,从而早期发现此类耳聋患者通过正确的指导和严格的活动限制来保存患者较好的残余听力,使得患者可以通过听力康复和语言训练或佩带助听器来获得良好的交流能力,所以在不明原因SNHL患者及相关可疑人群中进行此突变的筛查很有意义而且十分必要。
小于1%的儿童语前聋由线粒体突变所致。已发现的可能与耳毒性药物相关性聋相关的线粒体DNA(mtDNA)突变有1095T>C、1494C>T、1555A>G、827A>G、1005T>C、1116A>G、7444G>A。其中1494C>T、1555A>G突变与耳毒性药性聋的相关性比较明确。在我国大规模的耳聋基因筛查中,证实1555A>G突变为一基因热点突变,是最常见的引起药物性耳聋的突变。研究证实携带mtDNA 12S rRNA 1555A>G点突变的个体对氨基糖甙类抗生素(Aminogylcoside antibiotics,AmAn)耳毒性具有高度的敏感性。应用单次剂量即可导致携带此突变个体的重度听力损失,且不可逆转。鉴于1555A>G突变的发生率高,因而该突变的检出为临床医生预测个体有AmAn遗传易感性提供了可能性,指导该突变阳性个体及母系家属避免使用AmAn可以减少易感致聋的发生。对于已经发生的AmAn致聋患儿,应及早对聋幼儿进行听力补偿(验配助听器),早期进行听力语言训练是避免因聋致哑出现双重残疾的唯一方法。
对GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、线粒体12S rRNA基因突变进行筛查可以明确或提示部分非综合征型聋的病因,因此GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体12S rRNA基因应作为最常见的常染色体隐性遗传耳聋相关基因,并且可以应用到耳聋产前诊断及新生儿常规基因筛查,通过筛查,可以提供准确的遗传咨询,并进行干预进而达到防聋、指导康复、评估耳聋预后及减少耳聋发生率。利用聋病的分子诊断技术来发现导致耳聋的病因及引起耳聋的高危因素,然后进行针对性的干预,将成为提高人口素质的重要举措。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的不足,本发明的第一个目的是提供了一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物。本发明的第二个目的是提供了一种人类耳聋基因突变筛查的试剂盒。本发明的第三个目的是提供了一种人类耳聋突变基因测序方法。本发明的第四个目的是提供了上述组合引物和试剂盒的应用。
技术方案:为实现上述发明的目的,本发明采用的技术方案是:一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物,所述组合引物分为组合正向引物和组合反向引物,所述组合正向引物由2部分组成,由接头部分P1序列和正向引物序列组成,所述组合反向引物依次由接头部分P2序列、标签序列和反向引物序列组成,所述标签序列为SEQ ID NO:1-32中的任意一个,所述接头部分P1序列为SEQ ID NO:33,所述接头部分P2序列为SEQ ID NO:34,所述正向序列为SEQ ID NO:35-64中奇数序号序列中的任意一个,反向引物序列为SEQ ID NO:35-64中偶数序号序列中的任意一个,所述组合引物序列如SEQ ID NO:65-94所示。
一种人类耳聋基因突变筛查的试剂盒,包括所述的组合引物、测序引物、一组四色荧光标记的核酸探针,所述测序引物的序列如SEQ ID NO:95-111所示,所述核酸探针的序列如SEQ ID NO:112-116所示。
一种人类耳聋突变基因测序方法,包括以下步骤:
1)样品采集、DNA提取和PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为权利要求1所述的组合引物;采集受检者口腔上皮细胞,使用天根口腔拭子基因组提取试剂盒DP322进行样品的DNA提取。
2)多重PCR扩增制备文库:将步骤1)中不同的引物按照等比例混合,混合后作为一个标签的引物池,用此引物按照多重PCR的方法进行扩增,扩增出的DNA片段即为此标签的扩增文库;其中每套组合引物包含15对组合引物,即进行15重PCR,以Barcode 11为例,具体“组合引物”序列分别为SEQ ID NO:65-94,如表3。不同的样品使用含有不同标签(Barcode)的组合引物进行扩增;
3)乳液PCR:将这些预扩增好的DNA片段与其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠固定在微流控芯片上;
4)测序检测:
A)将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
B)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,测序引物序列分别为SEQ ID NO:95-111,如表4;
C)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针进行连接反应(见表5),通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息,五组荧光标记的核酸探针序列分别为SEQ ID NO:112-116,如表4;
D)循环步骤A)-C)17次,直到获得18个待测基因位点(除GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)的碱基信息;
E)将磁珠上的模板链变性成单链;
F)将变性好的模板链与能和待测基因位点(GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;连接桥Seq Bridge(见表5),其中桥的第三个碱基序列可被核酸内切酶剪切,去磷酸化封闭未连接上桥的模板序列,剪切;
G)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针进行连接反应(见表5),通过荧光信号的种类来判断待测基因位点(GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)的碱基信息;
H)循环步骤E)-G)1次,直到获得待测基因位点GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T的碱基信息;
I)将磁珠上的模板链变性成单链;
J)将变性好的模板链与标签引物Seq Barcode,表4中SEQ ID 118杂交,杂交引物Seq Barcode作为模板DNA的测序引物;
K)加入一组四色荧光标记的核酸探针Probe Mix 1进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列第1位的碱基信息;
L)循环步骤I)-K)4次,分别加入核酸探针Probe Mix2、3、4、5进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列的第2、3、4、5位的碱基信息。
M)通过解码标签序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
本发明提出了一种人类耳聋多基因突变筛查的方法,其基于高通量测序和多重PCR技术,可同时筛查常见的4个耳聋相关基因的20个突变位点,包括GJB2基因的35delG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT,GJB3基因的538C>T、547G>A,SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、IVS15+5G>A,和16S rRNA基因的1494C>T、1555A>G共20个常见突变位点,具有高通量、低成本的特点。
上述的组合引物、试剂盒、测序方法中,所述组合引物为15对组合引物,所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度在3度内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的ΔG的绝对值小于5。
上述的组合引物、试剂盒在制备用于人类耳聋多基因突变筛查试剂方面的应用。
为了更好的理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的术语“多重PCR技术”,是指在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同,在本发明中,使用多对PCR引物,但只有特定的引物才能扩增出特定的产物。
如本文中所说的术语“连接法测序”,其主要是通过:1)测序引物杂交:将5’端固定的模板与能和5’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物,由3’→5’方向进行连接测序;2)采用边连接边测序的策略,在测序引物A与待测片段杂交后,可选用特定的核酸探针对待测片段第1位碱基进行测序,完成后将双链变性,使模板恢复单链状态,随后用特定的核酸探针对待测片段第1位碱基进行测序,循环使用特定的核酸探针进行连接测序与变性过程,完成对待测片段1-5位任一碱基的测序。
基于PDX平台连接法测序的使用,可以满足基因分型,基因突变筛查,等应用。本发明的方法将应用于人类耳聋基因突变筛查,既能快速简便的鉴定突变位点,又能节省成本,节省通量,为耳聋基因突变筛查的一个新方法。
如本文中所说的“连接测序引物”如本文中所说的“组合引物”,是指带有barcode和接头的引物序列,其包含3部分内容,标签(Barcode)部分,接头(Adapter)部分和引物(Primer)部分。标签(Barcode)部分是指经设计的一小段碱基序列,barcode的个数决定了一次上机待测样本的数量,本发明中仅使用32个barcode进行验证,所述标签序列分别为SEQ ID NO:1-32,如表1;接头部分分别为P1,P2,所述接头序列分别为SEQ ID NO:33-34,如表2。引物部分是根据每种型别设计的,所述引物序列分别为SEQ ID NO:35-64,如表2;组合正向引物为Adapter P1+Primer A相连的序列,组合反向引物为Adapter P2+Barcode+Primer B相连的序列,以Barcode 11为例,具体“组合引物”序列分别为SEQ ID NO:65-94,如表3。
设计主要遵循:用软件进行比对,保证引物对之间的退火温度相差不大,最好在3度内。引物对与引物对之间形成的引物二聚体的ΔG的绝对值小于5。组合引物的长度在50-60bp,所以在合成引物时,要选用较高纯化标准。
该正反向引物通过PCR扩增,直接扩增出带有测序接头和标签(Barcode)序列的产物,直接作为乳液PCR的文库,免去了文库构建的步骤,更加省时省力,节省成本。
当对多个样本进行测序时,只需要改变barcode序列,其他接头序列和PCR引物序列不变,即可以扩展出多个样本的文库。PCR反应后,可以将来自各个样本的带有不同Barcode的PCR产物等量混合组成一个文库,然后采用连接法测序对其进行测序。通过独特的延伸引物,根据其突变位点的碱基,推断其是否发生了突变。
为了增加测序的样本数,Barcode序列的设计我们采用8碱基设计,“组合引物”应当注意以下几个方面:
1)应当避免3个或3个以上的单碱基重复序列;
2)同一位点中碱基A和碱基C的总含量应在所有碱基含量的30%-70%之间;
3)本身的GC含量应在40%-60%之间;
4)引物组之间的序列差异应大于4个碱基;
5)引物组序列中应避免出现与用于测序的引物其相似度高的序列;
6)当因无阻序列添加到PCR扩增产物上后,应避免PCR扩增引物形成发卡结构和二聚体等二级结构。
一个优选实施方案中,本发明的“组合引物”可用于制备试剂盒,所述试剂盒可用于耳聋多基因突变筛查。
本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样本进行耳聋多基因突变筛查的方法。所述方法包括使用上文描述的“组合引物”对多个样本的DNA进行扩增,然后进行测序以获得样本的序列的步骤。
有益效果:1)高通量。通过一代测序获得的结果只是单个碱基的结果,而本方法使用含有标签(Barcode)序列的引物用以区分不同的样品,进行一次本发明的方法,至少可以检测32份样品,从而使其可以被广泛地用于耳聋易感基因的普查工作。
2)低成本。采用自主研发的测序仪以及自主研发的试剂,其价格要远远低于进口仪器和试剂,使得测序成本大大降低,从而其检测成本也大大降低。
附图说明
图1引物设计示意图;
图2 1-5号样本文库四重PCR(组合引物11-1至11-4)扩增产物。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,进一步阐明本发明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供了基于高通量测序和多重PCR技术,可同时检测常见的4个耳聋相关基因的20个突变位点的方法。
实施例1样品采集与DNA提取
注意:为了保证样本不被食物或者饮料污染,取样前30min内请勿进食和饮水。
1)采集前请用清水漱口。
2)打开包装的口腔拭子包装,先做吞咽动作,然后将一根干净的口腔拭子伸进受检者口腔,紧靠其右侧脸颊内侧反复刮拭10次。
3)取出拭子,将其朝上放入海绵卡槽,自然晾干30min。
4)用封带将海绵卡槽封好,常温可保存1-2周。
5)使用天根口腔拭子基因组提取试剂盒DP322进行样品的DNA提取。
10个受检者空腔拭子的提取结果为53.4、48.5、49.6、42.6、56.7、58.5、46.3、50.4、41.2和44.4ng/μl。
实施例2PCR扩增
将每条引物混合至终浓度为2μM,按照如下反应体系和扩增程序进行扩增反应。
多重PCR体系如下:
多重PCR反应条件如下:
表1:一种人类耳聋基因突变筛查的标签(Barcode)序列:
标签编号 | 序列 | SEQ ID NO: |
BC001 | TGAACGTG | 1 |
BC002 | TCATGTCC | 2 |
BC003 | TGTGAGGT | 3 |
BC004 | GAGTGAAC | 4 |
BC005 | TGGATCAG | 5 |
BC006 | CTCTCCTA | 6 |
BC007 | TAAGGAGC | 7 |
BC008 | CGTAAGTG | 8 |
BC009 | CCATCTTC | 9 |
BC010 | TACAAGGC | 10 |
BC011 | GTCTTGAC | 11 |
BC012 | TCTGGATC | 12 |
BC013 | GCAGTAGA | 13 |
BC014 | TAAGGTCG | 14 |
BC015 | TTCCAAGC | 15 |
BC016 | CAACAGGA | 16 |
BC017 | GATCTGGT | 17 |
BC018 | GAGAACCT | 18 |
BC019 | TTCGGAAG | 19 |
BC020 | TCCTTGGT | 20 |
BC021 | GAACCAGT | 21 |
BC022 | CTGAGGAT | 22 |
BC023 | TTCGAGTG | 23 |
BC024 | TTGTCCAG | 24 |
BC025 | GTTACTGG | 25 |
BC026 | GCCATTCA | 26 |
BC027 | CTATGGAC | 27 |
BC028 | CCTAGTTG | 28 |
BC029 | TCCAACGT | 29 |
BC030 | TTACGGCT | 30 |
BC031 | CGATTCGT | 31 |
BC032 | CTTAGACC | 32 |
表2:一种人类耳聋基因突变筛查的接头(Adapter)与引物(Primer)序列:
表3:一种人类耳聋基因突变筛查的一套“组合引物”序列(BC011):
实施例3:PCR产物纯化与测序文库的构建
使用Beckman公司的Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化,对已经扩增好的文库进行质控,质控方法如下:先用Nanodrop 2000进行文库初步定量,按摩尔量等比例混合后;使用Qubit 2.0对混合后的文库进行最终定量,作为最终乳液PCR的稀释标准。
得到的10个文库的最终浓度分别为5.5、4.2、5.0、5.2、4.8、4.6、4.2、5.8、5.3和4.8ng/μl。
实施例4:乳液扩增
基于PDX2000平台的乳液操作;
乳液PCR就是将这些预扩增好的DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量的片段化DNA片段,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有片段化DNA模板的磁珠固定在微流控芯片上。
乳液扩增主要分为乳液PCR、破乳、模板磁珠富集、3’端修饰与固定几个步骤。
将10个文库稀释成相同的浓度,混合后进行乳液扩增。
实施例5:上机测序
1)用含0.005M NaOH和65%甲酰胺的缓冲液在65℃下处理10分钟,将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
2)将变性好的模板链与20μM能和待测基因位点对应的引物37℃杂交10min,杂交引物作为模板DNA的测序引物;测序引物序列分别为SEQ ID NO:95-111,如表4;
3)加入50μM一组对应的四色荧光标记的核酸探针(见表5),在0.35U/μl T4NAD连接酶的作用下15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤,最后用CCD成像,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息;
4)循环步骤1)-3)17次,直到获得所有待测基因位点(除GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)的碱基信息。
5)用含0.005M NaOH和65%甲酰胺的缓冲液在65℃下处理10分钟,将磁珠上的模板链变性成单链;
6)将变性好的模板链与能和待测基因位点(GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;
7)加入50μM桥Seq Bridge,在0.35U/μl T4DNA连接酶的作用下15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤;
8)在0.2U/μl碱性磷酸酶的作用下37℃反应5min,去磷酸化封闭未连接上桥的模板序列;
9)在核酸内切酶V的作用下37℃反应30min,剪切;
10)加入50μM一组对应的四色荧光标记的核酸探针,在0.35U/μl T4DNA连接酶的作用下15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤,最后用CCD成像,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点(GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T)的信息;
11)循环操作循环步骤5)-10)一次,直到获得GJB2的176-191del16和GJB3的538C>T的碱基信息。
12)用含0.005M NaOH和65%甲酰胺的缓冲液在65℃下处理10分钟,将磁珠上的模板链变性成单链;
13)将变性好的模板链与20μM标签(Barcode)引物37℃杂交10min,杂交引物作为模板DNA的测序引物;
14)加入50μM核酸探针Probe Mix 1,在0.35U/μl T4NAD连接酶的作用下15℃反应30min,然后用含0.01%wt Triton X-100、20%wt甘油的缓冲液洗涤,最后用CCD成像,通过荧光信号的种类来判断标签(Barcode)序列第1位的碱基信息,
15)循环步骤12)-14)4次,分别加入核酸探针Probe Mix 2、3、4、5进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签(Barcode)序列的第2、3、4、5位的碱基信息。
16)通过解码标签(Barcode)序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
表4:一种人类耳聋基因突变筛查的测序引物与核酸探针的序列:
表5:测序所用引物与探针信息
实施例6:结果分析
根据测序结果中的标签(Barcode)序列以及测序引物,将测序结果与每一个样品一一对应。然后进行数据分析。
表6:突变位点的碱基信息
表7:一种人类耳聋基因突变筛查的测序结果:
样本标签 | 突变位点 | 所属基因 |
BC001 | 235delC、538C>T | GJB2、GJB3 |
BC002 | IVS7-2A>G | SLC26A4 |
BC003 | 299-300delAT | GJB2 |
BC004 | 299-300delAT | GJB2 |
BC005 | 1555A>G | 12S rRNA |
BC006 | 176del 16bp | GJB2 |
BC007 | 235delC | GJB2 |
BC008 | 235delC、IVS7-2A>G | GJB2、SLC26A4 |
BC009 | 1555A>G | 12S rRNA |
BC010 | 235delC | GJB2 |
结果显示,10个受检者中共计检出GJB2基因突变5例,其中4例为235delC突变,其中2例为299-300delAT突变,其中1例为176del 16bp突变;共计检出GJB3基因突变1例,为538C>T突变;共计检出SLC26A4基因突变2例,为IVS7-2A>G突变;共计检出12S rRNA基因突变2例,为1555A>G突变。
为了检测本发明方法的准确性,我们采用Sanger测序法进行验证,发现所有结果完全吻合,无假阴性、假阳性。
Claims (6)
1.一种人类耳聋基因突变筛查的组合引物,其特征在于:所述组合引物分为组合正向引物和组合反向引物,所述组合正向引物由2部分组成,由接头部分P1序列和正向引物序列组成,所述组合反向引物依次由接头部分P2序列、标签序列和反向引物序列组成,所述标签序列为SEQ ID NO:1-32中的任意一个,所述接头部分P1序列为SEQ ID NO:33,所述接头部分P2序列为SEQ ID NO:34,所述正向序列为SEQ ID NO:35-64中奇数序号序列中的任意一个,反向引物序列为SEQ ID NO:35-64中偶数序号序列中的任意一个。
2.根据权利要求1所述的组合引物,其特征在于,所述组合引物序列如SEQ ID NO:65-94所示。
3.一种人类耳聋基因突变筛查的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的组合引物、测序引物、一组四色荧光标记的核酸探针,所述测序引物的序列如SEQ ID NO:95-111所示,所述核酸探针的序列如SEQ ID NO:112-116所示。
4.一种非诊断目的人类耳聋突变基因测序方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)样品采集、DNA提取和PCR扩增引物的设计:所述扩增引物设计为权利要求1所述的组合引物;
2)多重PCR扩增制备文库:将步骤1)中不同的引物按照等比例混合,混合后作为一个标签的引物池,用此引物按照多重PCR的方法进行扩增,扩增出的DNA片段即为此标签的扩增文库;
3)乳液PCR:将这些预扩增好的DNA片段与其中一个连接子互补序列的磁珠进行乳液PCR反应,得到大量有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠,并变性得到基因组测序模板,最后将这些扩增有目的基因组DNA片段的单克隆磁珠固定在微流控芯片上;
4)测序检测:
A)将单克隆磁珠上的模板链变性成单链;
B)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;
C)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的信息;
D)循环步骤A)-C)17次,直到获得18个待测基因位点的碱基信息;
E)将磁珠上的模板链变性成单链;
F)将变性好的模板链与能和待测基因位点对应的引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;连接桥,其中桥的第三个碱基序列可被核酸内切酶剪切,去磷酸化封闭未连接上桥的模板序列,剪切;
G)加入一组对应的四色荧光标记的核酸探针进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断待测基因位点的碱基信息;
H)循环步骤E)-G)1次,直到获得待测基因位点的碱基信息;
I)将磁珠上的模板链变性成单链;
J)将变性好的模板链与标签引物杂交,杂交引物作为模板DNA的测序引物;
K)加入一组四色荧光标记的核酸探针Probe Mix进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列第1位的碱基信息;
L)循环步骤I)-K)4次,分别加入核酸探针Probe Mix进行连接反应,通过荧光信号的种类来判断标签序列的第2、3、4、5位的碱基信息;
M)通过解码标签序列来区分不同的样本,通过所加入的测序引物来区分待测基因的位点。
5.根据权利要求1所述的组合引物,其特征在于,所述组合引物为15对组合引物,所述上游组合引物与下游组合引物之间的退火温度在3度内,且引物对与引物对之间形成的引物二聚体的ΔG的绝对值小于5。
6.权利要求1所述的组合引物、权利要求3所述的试剂盒在制备用于人类耳聋多基因突变筛查试剂方面的应用。
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