CN117070617B - 检测样本中lpl基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品的应用，所述LPL基因变异为LPL c.1015A>C，所述LPL蛋白变异为LPL p.K339Q。本发明还公开了一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估高脂血症易感性的产品的应用。根据本公开，能够提供新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症的诊断、治疗与预防。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品的应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，日常膳食结构有了很大变化，导致越来越多的人出现血液中营养成分含量失衡，例如血脂水平过高导致的高脂血症(hyperlipidemia；HLP)，而高脂血症患者患上动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)和急性胰腺炎(AP)方面的风险都会显著提升。脂类具体涵盖了类脂以及脂肪，脂肪指的是三脂肪酸甘油酯，也就是甘油三酯(TG)，如果存在引起甘油三酯分解减少或者是合成增加的因素，那么就可能出现高甘油三酯血症(HTG)，从而导致高脂血症。
出现高脂血症的因素有很多，主要包含了遗传因素、不健康的生活方式、2型糖尿病等。当前众多的研究发现，发生突变后可导致严重高甘油三酯血症的基因包括：载脂蛋白C-II(APOC2)、脂蛋白脂酶(LPL)、脂酶成熟因子1(LMF1)、载脂蛋白V(APOA5)、糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1(GPIHBP1)等。其中，脂蛋白脂酶(LPL)的缺陷是出现高甘油三酯血症的重要的原因。人脂蛋白酯酶(LPL)基因主要是位于染色体8p22上，是一种酯化酶，具有甘油三酯水解酶的活性，在脂质代谢中发挥极其重要的作用。有研究表明LPL基因变异导致脂蛋白脂酶活性降低，可影响甘油三酯的分解代谢，导致乳糜微粒代谢受阻，体内堆积的乳糜微粒越来越多，从而致使高脂血症的出现。
目前有较多研究对高脂血症的致病机理进行了阐述，但是仍存在未知致病基因位点。进一步研究高脂血症的致病机理，分离出家族性高脂血症的新致病基因变异，对于高脂血症的诊断、治疗与预防具有重要的意义。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种高脂血症的致病突变位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症的诊断、治疗与预防。
为此，本公开第一方面提供了一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品的应用，其特征在于，所述LPL基因变异为LPL c.1015A>C，所述LPL蛋白变异为。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.1015A>C突变(LPL基因的DNA序列第1015位A碱基被C碱基取代，导致LPL蛋白第339位氨基酸由赖氨酸(K)变异为谷氨酰胺(Q)，即LPL p.K339Q)，并通过功能研究证实LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，通过检测样本中是否携带LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变，能够辅助筛查高脂血症患者。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测所述LPL基因变异的探针。由此，能够通过引物对和/或探针对LPL基因变异c.1015A>C进行捕获和/或检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述引物对根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到，所述探针根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此，引物能够与LPL基因编码区第1015位上下游区域的序列结合、探针能够与LPL基因编码区第1015位及上下游区域的序列结合，以对该区域进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此，能够提供反应底物、催化酶和缓冲液，以便于对LPL c.1015A>C进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述LPL蛋白变异的试剂：蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此，能够提供试剂来对LPL蛋白变异(也称为氨基酸变异)LPL p.K339Q进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂包括可识别具有LPL p.K339Q突变的LPL蛋白的抗体。由此，能够利用可识别具有LPL p.K339Q突变的LPL蛋白的抗体，来对具有LPL p.K339Q突变的LPL蛋白进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此，能够便于对LPL c.1015A>C或LPL p.K339Q进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种，且所述LPL基因变异是指LPL基因的胚系变异，所述LPL蛋白变异是指LPL蛋白的胚系变异。由此，能够通过检测被检测者的外周血、唾液和/或组织样本，对受检者的LPL基因的胚系突变(胚系突变是指在人的胚胎发育期已经携带的变异，身体内每个细胞都携带)进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述LPL基因变异为杂合突变或纯合突变，所述LPL蛋白变异为杂合突变或纯合突变。
本公开第二方面提供了一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估高脂血症易感性的产品的应用，其特征在于，所述LPL基因变异为LPL c.1015A>C，所述LPL蛋白变异为LPL p.K339Q。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.1015A>C突变(LPL基因的DNA序列第1015位A碱基被C碱基取代，导致LPL蛋白第339位氨基酸由赖氨酸(K)变异为谷氨酰胺(Q)，即LPL p.K339Q)，并通过功能研究证实LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，通过检测样本中是否携带LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变，能够辅助评估高脂血症的易感性。
根据本公开，能够提供一种高脂血症的致病突变位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症的诊断、治疗与预防。
附图说明
图1为本发明实施例所涉及的先证者的甘油三酯水平变化图。
图2为本发明实施例所涉及的先证者的家系图。
图3为本发明实施例所涉及的先证者的测序结果图。
图4为本发明实施例所涉及的LPL的蛋白结构图以及在不同物种间的氨基酸序列图。
图5为本发明实施例所涉及的LPL蛋白的三维结构预测图。
图6为LPL WT和LPL p.K339Q的表达水平结果示意图。
图7为LPL WT和LPL p.K339Q的表达水平直方图。
图8为LPL WT和LPL p.K339Q在细胞内的LPL活性结果图。
图9为LPL WT和LPL p.K339Q在细胞培养上清液中的LPL活性结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组。
为便于理解本发明，下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明，且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。本领域技术人员应该理解，附图只是实施例的示意图，附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
在本实施方式中，涉及下述任一种应用：
一种检测样本中LPL基因变异的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的产品中的应用；
一种检测样本中LPL基因变异的试剂在制备筛查高脂血症伴急性胰腺炎患者的产品中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的产品中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症伴急性胰腺炎患者的产品中的应用；
一种检测样本中LPL基因变异的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。
在本实施方式所涉及的上述应用中，LPL基因变异或LPL氨基酸突变与高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症三种疾病的风险均是相关的，因此，检测LPL基因变异或LPL氨基酸突变的试剂可以用于筛查高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的患者，检测LPL基因变异或LPL氨基酸突变的试剂可以用于评估高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的易感性。
本发明提供的新的突变位点补充了家族性高脂血症的遗传突变谱，能够有利于对高脂血症患者进行诊断以便于进行治疗，以及对家系中的携带者进行基因诊断以便于进行健康管理，同时能够根据父母双方基因型指导生育，以便于规避致病基因的遗传，指导优生优育。
在本实施方式所涉及的上述试剂中，可以包括对LPL基因变异或LPL氨基酸突变进行检测的试剂。在一些示例中，LPL基因变异为LPL c.1015A>C，LPL c.1015A>C是指野生型的LPL基因的编码区的第1015位碱基由A(腺嘌呤)突变为C(胞嘧啶)；LPL氨基酸突变(也即LPL蛋白变异)为LPL p.K339Q，LPL p.K339Q是指LPL蛋白第339位氨基酸由赖氨酸(K)变异为谷氨酰胺(Q)。本实施方式中，通过家系研究鉴定出LPL c.1015A>C突变(LPL基因的DNA序列第1015位A碱基被C碱基取代，导致LPL蛋白第339位氨基酸由赖氨酸变异为谷氨酰胺，即LPL p.K339Q)。本实施方式还通过功能研究证实LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性。在一些示例中，LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变导致LPL活性下降。由此，提供了新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，通过检测样本中是否携带LPL c.1015A>C(LPL p.K339Q)突变，能够辅助筛查高脂血症患者。
在一些示例中，可以使用焦磷酸测序技术、Sanger测序法、NGS测序法、聚合酶链式反应－单链构象多态性分析、TaqMan探针法中的至少一种对LPL基因变异进行检测。在一些示例中，LPL基因变异可以为LPL c.1015A>C。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂可以包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测LPL基因变异的探针。由此，能够通过引物对和/或探针对LPL基因变异进行捕获和/或检测。在一些示例中，试剂还可以包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此，能够便于对LPL基因变异进行检测。
在一些示例中，引物对可以根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到，探针可以根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此，引物能够与LPL基因编码区第1015位上下游区域的序列结合、探针能够与LPL基因编码区第1015位及上下游区域的序列结合，以对LPLc.1015A>C进行检测。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂，也可以包括对LPL c.1015A>C(LPLp.K339Q)以外的其他LPL突变进行检测的试剂。在一些示例中，其他LPL突变可以包括高脂血症目前已知的LPL基因的全部致病突变和疑似致病突变。在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂，也可以包括对LPL基因以外的其他与高脂血症相关的基因进行检测的试剂。在一些示例中，与高脂血症相关的基因可以包括APOC2、LMF1、APOA5、GPIHBP1。由此，能够对高脂血症的相关位点均进行检测，有利于对高脂血症进行一次性的、更加全面的筛查。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂，也可以包括对其他疾病相关的基因或蛋白进行检测的试剂。例如，也可以包括对遗传性代谢疾病相关的基因或蛋白进行检测的试剂。由此，能够同时对被检测者进行多种疾病的筛查。
所在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂，可以包括使用以下方法中的至少一种来检测LPL蛋白变异的试剂：蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此，能够对LPL蛋白变异进行检测。在一些示例中，LPL蛋白变异是指LPL p.K339Q。在一些示例中，本实施方式所涉及的上述试剂也可以包括检测LPL p.K339Q变异的蛋白之外的LPL蛋白的试剂。例如也可以包括检测携带其他已知的致病/疑似致病位点的LPL蛋白变异体的试剂。
在一些示例中，蛋白质和肽段的序列分析技术可以包括N末端序列测定的化学方法、Edman法、C末端酶解方法和C末端化学降解法。
在一些示例中，质谱相关的蛋白质检测技术可以包括基质辅助激光解吸电离、飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)和电子喷雾电离质谱测量法(electro sprayion-ization mass spectrometry，ESI-MS)。
在一些示例中，抗体检测技术可以包括制备可识别不同突变体的抗体法，免疫印迹(如western blot)法和酶联免疫吸附(ELISA)法。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述产品的形式，可以为试剂、试剂套装或试剂盒的形式。在一些示例中，产品还可以包括仪器所组成的系统。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述产品也可以包括对LPL基因变异或LPL氨基酸突变进行检测的仪器所组成的系统。例如，产品可以是由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统，或者是由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统，或者是由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统，或者是由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。由此，能够便于对LPL基因或LPL蛋白进行检测。
在一些示例中，本实施方式所涉及的上述产品也可以包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此，能够便于进行基因检测或蛋白检测。
在一些示例中，高脂血症患者的临床表现还包括急性胰腺炎和高甘油三酯血症。在一些示例中，高脂血症患者通常伴有急性胰腺炎。因此，本公开提供了新的高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)的致病基因位点或高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.1015A>C突变，能够辅助筛查高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)患者，并能够辅助评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性。易感性是指由遗传基础所决定一个个体患病的风险，也可以理解为在相同环境下，不同个体患病的风险。
在一些示例中，在本实施方式所涉及的上述应用中，可以通过检测被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种样本对LPL基因或LPL蛋白进行检测。换言之，所检测的样本可以来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种。
在一些示例中，被检测者可以为普通人群、疑似患有高脂血症的个体或高脂血症高风险人群。在一些示例中，疑似患有高脂血症的个体可以为急性胰腺炎患者、反复性胰腺炎患者、高脂血症患者、高三油甘脂血症患者。在一些示例中，高脂血症高风险人群可以为具有高脂血症家族史的人群，例如至少一名直系家属被确诊为高脂血症的个体。
在一些示例中，可以对样本中的LPL基因的胚系突变进行检测。胚系突变又叫生殖细胞突变，是来源于精子或卵子等生殖细胞所携带的突变。在一些示例中，可以通过提取被检测者的gDNA(基因组DNA)并对基因组DNA进行检测，来获得LPL基因的胚系突变结果。
在一些示例中，可以对LPL基因的编码区的第1015位碱基进行检测。进一步地，可以对LPL c.1015A>C突变进行检测。换言之，可以检测被检测者是否携带LPL c.1015A>C突变。
在一些示例中，被检测者的LPL基因中只要存在一个LPL c.1015A>C突变，就可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。换言之，检测到被检测者的LPL c.1015A>C为杂合突变时，可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。当然，检测到被检测者的LPL c.1015A>C为纯合突变时，也可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。
在本实施方式中，通过LPL c.1015A>C这一基因变异作为标志物，能够对高脂血症患者进行筛查，进而提供一种检测样本中LPL基因变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品中的应用。同样地，还能提供一种检测样本中LPL基因变异的试剂在制备筛查急性胰腺炎、高甘油三酯血症的产品中、在制备评估高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。同样的，还能提供一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的产品中、在制备评估高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的产品中的应用。
下面，结合实施例进一步对本发明所涉及的上述应用进行详细的解释，但是不应把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[实施例]
本实施例中，对可能涉及到的专业术语的英文简称或符号进行说明，如表1所示。
表1专业术语说明
临床案例：
(1)案例信息
先证者为一32岁女性，已育有一子一女，孕26周主诉腹痛伴呕吐一周，化验示甘油三酯(TG)15.21mmol/L，总胆固醇11.08mmol/L，腹部MR显示急性胰腺炎表现，脾脏稍大，以急性胰腺炎收入院；治疗一周后，甘油三酯水平下降至9.28mmol/L，出院。孕29周，甘油三酯水平升高至33.98mmol/L；孕33周，甘油三酯水平继续升高至46.39mmol/L，收入内分泌科、营养科会诊，给予低分子肝素治疗，进行控制饮食，辅以短肽型肠内制剂；一周后复查，甘油三酯12.01mmol/L，出院待产。孕35周，查甘油三酯58.23mmol/L，胎盘早剥收入产科。孕35周+3天查甘油三酯32.45mmol/L，经阴分娩一女婴，2420g，新生儿的甘油三酯检测结果为0.33mmol/L。产后甘油三酯水平下降，产后一天为28.94mmol/L；产后三天甘油三酯18.68mmol/L；产后五天甘油三酯22.72mmol/L；产后十二天甘油三酯8.3mmol/L，恢复哺乳；产后三周甘油三酯20.25mmol/L，停止哺乳，服用力平之(非诺贝特胶囊)。具体可参考图1，图1为本发明实施例所涉及的先证者的甘油三酯水平变化图。
(2)样本检测：
a)采集先证者、先证者之父、先证者之母、先证者之弟、先证者之子的外周血，完全抗凝和离心，然后采集血浆。测定血浆CHO(总胆固醇)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、TG(甘油三酯)、Hcy(同型半胱氨酸)、NEFA(非酯化脂肪酸)、脂蛋白a、载脂蛋白A1和载脂蛋白B。
b)提取先证者、先证者之父、先证者之母、先证者之兄、先证者之子、先证者之女的基因组DNA(gDNA)进行全外显子测序(WES)，全外显子组测序和序列分析均由山东大学齐鲁医院合作单位济南爱新佐尔医学检测有限公司进行。
本实施例中，所有数据的获取都在符合法律规范、用户同意的基础上上，对数据的合法应用。先证者及家属均同意并且在知情同意书上进行了签字。此外，如未特别指明，本实施例所用试剂或仪器均为市售。
(3)检测结果：
血浆CHO(总胆固醇)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、TG(甘油三酯)、Hcy(同型半胱氨酸)、NEFA(非酯化脂肪酸)、脂蛋白a、载脂蛋白A1和载脂蛋白B的检测结果见下表2：
表2代谢物检测结果
基因检测结果：如图2、图3所示，图2为本发明实施例所涉及的先证者的家系图，图3为本发明实施例所涉及的先证者的测序结果图。
图2中，圆圈代表女性，方形代表男性，箭头所指为先证者。根据图2和图3可知，I-1(先证者父亲)、II-2(先证者)、III-1(先证者之子)均携带共同的突变(LPL c.1015A>C(p.K339Q)，转录本NM_000237.2)，LPL基因的DNA序列第1015位A碱基被C碱基取代，导致LPL蛋白第339位氨基酸由赖氨酸(K)变异为谷氨酰胺(Q)。且为杂合子。先证者母亲及先证者至女(III-2)经DNA测序未发现携带该基因变异。其中，LPL c.1015A>C突变，根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，该突变在GmomAD数据库正常对照人群中未收录(PM2证据)，生物信息分析软件Mutation_Taster、SIFT、PolyPhen2均预测为有害突变(PP3)，综上该突变暂判定为临床意义不明。
本实施例中，发现的杂合突变(LPL c.1015A>C)的携带情况与携带者的临床表型相符，因此推测该突变可能会削弱LPL的活性，其可能是HTG(高甘油三酯血症)的致病突变。为了进一步研究该突变的致病性，后续进行了功能研究。
功能研究：
(1)保守性分析
为了进一步研究LPL突变对蛋白质功能的功能影响，我们预测了LPL突变对蛋白质结构的影响。图4为本发明实施例所涉及的LPL的蛋白结构图以及在不同物种间的氨基酸序列图，可以看到，LPL基因编码472个氨基酸残基的蛋白质，突变位点c.1015A>C/p.K339Q位于LPL的保守结构域上，LPL保守结构域由一个脂蛋白酯酶超家族区域组成(图4中的A部分)，LPL作为同型二聚体，具有甘油三酯水解酶和配体/桥接因子对受体介导的脂蛋白摄取的双重功能。根据保守分析，突变LPL p.K339Q所在的位置高度保守，多个氨基酸序列比对表明K339在不同物种间是保守的,在四种植物中均为赖氨酸(K)(图4中的B部分)。
(2)蛋白三维结构预测分析
图5为本发明实施例所涉及的LPL蛋白的三维结构预测图。
利用I-TASSER建模和PyMOL绘图分析，对LPL-WT的三维(3D)结构及其变体(LPLp.K339Q)通过线程法进行预测，并通过最终模型的头对头比较进行综合分析。并利用PyMOL的自适应泊松-玻尔兹曼求解器(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver(APBS))分析了LPL-WT及其变体(LPL p.K339Q)的表面电荷。
结果显示，利用pyMol的诱变模块将蛋白残基339赖氨酸突变为谷氨酰胺，观察到残基周围静电势能的变化和周围氢键发生了变化，突变后的静电势能发生了左移。根据I-TASSER建模和PyMOL作图分析，Lys339突变到Gln后，Gln339和Val340之间在距离处形成一对氢键，表明LPL p.K339Q突变可能会影响LPL的主链结构。综上所述，突变体LPLp.K339Q可能会影响LPL的三级结构。
(3)体外活性研究
构建LPL-WT(wide tpye，野生型)质粒和LPL c.1015A>C质粒，转染细胞检测蛋白表达，并收集上清液和细胞微球，以测定LPL的表达和活性。具体而言：
Homo-Lpl(NM_000237.3)质粒购自生物太阳生物技术(上海)有限公司。Lpl突变型质粒LPLc.1015A>C使用QuikChange定点突变试剂盒(安捷伦技术公司，圣克拉拉市，CA)，根据制造商的说明构建。所有构建物均通过ABI 3730xl测序仪进行测序验证，其结构被完全测序，并在其他克隆设计中作为模板使用。
将LO2细胞(人正常肝细胞)和HEK-293细胞(人胚胎肾细胞293)(均购自ATCC)接种在10cm2的培养皿中24h，在第二天，进行转染，向培养皿中添加pCDNA3.1、pCDNA3.1-LPL-WT和pCDNA3.1-LPL-p.K339Q，每种质粒各3μg，并加入500μL的opti-MEM(Gbico，cat：31985-070)，孵育3-5min。将6μL的脂质体TM2000转染试剂(Invitrogen，cat：11668-027)加入opti-MEM，孵育3-5min。将DNA混合物加入脂质体混合物中，孵育15-20min。将上述混合物加入细胞培养基中，4-6h后使用新鲜培养基。对照组不进行转染。用5％二氧化碳在37℃下培养48h。然后，收集细胞并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用抗脂蛋白脂肪酶(ab172953，Abcam，1：1000)、抗GAPDH抗体(ab9485，Abcam，1：1000)和山羊抗兔IgG H&L二抗(ab7064，Abcam 1：5000)进行免疫印迹。使用化学发光试剂盒(密理浦氏公司，CA，USA，WBKLS0050)检测信号，并使用化学发光成像系统(上海秦翔科学仪器有限公司)进行成像。获得细胞上清液，使用总酯酶检测试剂盒(cat：A067-1-2，南京建成生物工程研究所)测定总酯酶活性。计算公式如下图所示。LPL活性(μ/mL)＝(LPL OD值-空白管)/(标准管OD值-空白管)×浓度标准(500μmol/L)×稀释比，样品测试前×60min/20min÷1000(OD：光密度)。
图6为LPL WT和LPL p.K339Q的表达水平结果示意图，图7为LPL WT和LPL p.K339Q的表达水平直方图，图8为LPL WT和LPL p.K339Q在细胞内的LPL活性结果图，图9为LPL WT和LPL p.K339Q在细胞培养上清液中的LPL活性结果图。由图6和图7可知，LPL c.1015A>C/p.K339Q变异不影响LPL的蛋白表达水平。有图8和图9可知，在转染细胞中和培养上清液中，LPL c.1015A>C/p.K339Q变异体的蛋白活性均弱于LPL野生型的蛋白活性，在差异方面具备统计学的意义(P<0.01)。由此，推测LPL c.1015A>C/p.K339Q会降低LPL的活性，影响TG的水解，从而引起家族性联合性高脂血症，推测其为致病突变。
本实施例中，如无特别说明，所使用的试剂或仪器均为普通市售获得。本实施例中，研究数据以平均±标准差(标准差)表示。对两组GraphPad Prism 8之间的数据集采用双尾、配对的学生t检验(Student's t-test)进行统计学比较。每个实验至少独立重复三次。有代表性的实验结果如图所示。p<为0.05被认为是显著性的。
综上，根据实施例的上述研究及研究结果显示，LPL c.1015A>C突变或LPLp.K339Q突变会损害LPL蛋白的功能。LPL c.1015A>C突变或LPL p.K339Q突变是本实施例中的高脂血症家系的致病突变。本实施例发现的LPL c.1015A>C(p.K339Q)突变，是家族性高脂血症新的致病基因，且呈常染色体显性遗传。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (9)
1.一种检测样本中LPL基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查高脂血症患者的产品的应用，其特征在于，所述LPL基因变异为LPL c.1015A>C，所述LPL蛋白变异为LPL p.K339Q，转录本为NM_000237.2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测所述LPL基因变异的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到，所述探针根据人基因组中LPL基因编码区第1015位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述LPL蛋白变异的试剂：N末端序列测定的化学方法、C末端酶解方法、C末端化学降解法、基质辅助激光解吸电离、飞行时间质谱测量法、电子喷雾电离质谱测量法、免疫印迹法和酶联免疫吸附法。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测所述LPL蛋白变异的试剂包括可识别具有LPL p.K339Q突变的LPL蛋白的抗体。
7.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种，且所述LPL基因变异是指LPL基因的胚系变异，所述LPL蛋白变异是指LPL蛋白的胚系变异。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LPL基因变异为杂合突变或纯合突变，所述LPL蛋白变异为杂合突变或纯合突变。
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