CN115109789B - 检测样本中lpl基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用，LPL基因突变为LPL c.986A>C。本发明还公开了一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用、检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查急性胰腺炎患者的试剂盒中的应用、检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高甘油三酯血症患者的试剂盒中的应用以及检测样本中LPL基因突变的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用。根据本发明，能够提供新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症的诊断、治疗与预防。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，日常膳食结构有了很大变化，导致越来越多的人出现血液中营养成分含量失衡，例如血脂水平过高导致的高脂血症(hyperlipidemia；HLP)，而高脂血症患者患上动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)和急性胰腺炎(AP)方面的风险都会显著提升。脂类具体涵盖了类脂以及脂肪，脂肪指的是三脂肪酸甘油酯，也就是甘油三酯(TG)，如果存在引起甘油三酯分解减少或者是合成增加的因素，那么就可能出现高甘油三酯血症(HTG)，从而导致高脂血症。
出现高脂血症的因素有很多，主要包含了遗传因素、不健康的生活方式、2型糖尿病等。当前众多的研究发现，发生突变后可导致严重高甘油三酯血症的基因包括：载脂蛋白C-II(APOC2)、脂蛋白脂酶(LPL)、脂酶成熟因子1(LMF1)、载脂蛋白V(APOA5)、糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1(GPIHBP1)等。其中，脂蛋白脂酶(LPL)的缺陷是出现高甘油三酯血症的重要的原因。人脂蛋白酯酶(LPL)基因主要是位于染色体8p22上，是一种酯化酶，具有甘油三酯水解酶的活性，在脂质代谢中发挥极其重要的作用。有研究表明LPL基因突变导致脂蛋白脂酶活性降低，可影响甘油三酯的分解代谢，导致乳糜微粒代谢受阻，体内堆积的乳糜微粒越来越多，从而致使高脂血症的出现。
目前有较多研究对高脂血症的致病机理进行了阐述，但是仍存在未知致病基因位点。进一步研究高脂血症的致病机理，分离出家族性高脂血症的新致病基因突变，对于高脂血症的诊断、治疗与预防具有重要的意义。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症的诊断、治疗与预防。
为此，本公开第一方面提供了一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.986A>C突变，并通过功能研究证实LPL c.986A>C突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.986A>C突变，能够辅助筛查高脂血症患者。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂盒包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测LPL c.986A>C的探针。由此，能够通过引物对和/或探针对LPL c.986A>C进行捕获和/或检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述用于检测LPL c.986A>C的探针根据人基因组中LPL基因编码区第986位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此，探针能够与LPL基因编码区第986位上下游区域的序列结合以对该区域进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此，能够便于对LPL c.986A>C进行检测。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述试剂盒包括实时荧光定量检测试剂，所述实时荧光定量检测试剂包含用于实时荧光定量检测所述LPL基因突变的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列包括5’-GCCGCTACCACCAAGAATATC-3’，所述下游引物的序列包括5’-TCAGTACATGTGATGCAGTGAGC-3’。由此，能够对LPL基因突变进行定量。
在本公开所涉及的应用中，可选地，所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种，且所述LPL基因突变是指LPL基因的胚系突变。由此，能够通过检测被检测者的外周血、唾液和/或组织样本，对受检者的LPL基因的胚系突变进行检测。
本公开第二方面提供了一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用，所述LPL氨基酸突变为LPL p.Y329S。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL p.Y329S突变，并通过功能研究证实LPL p.Y329S突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL p.Y329S突变，能够辅助筛查高脂血症患者。
本公开第三方面提供了一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查急性胰腺炎患者的试剂盒中的应用，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.986A>C突变，并通过功能研究证实LPL c.986A>C突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的急性胰腺炎的致病基因位点或急性胰腺炎高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.986A>C突变，能够辅助筛查急性胰腺炎患者。
本公开第四方面提供了一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高甘油三酯血症患者的试剂盒中的应用，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.986A>C突变，并通过功能研究证实LPL c.986A>C突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高甘油三酯血症的致病基因位点或高甘油三酯血症高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.986A>C突变，能够辅助筛查高甘油三酯血症患者。
本公开第五方面提供了一种检测样本中LPL基因突变的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL c.986A>C突变，并通过功能研究证实LPL c.986A>C突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症的致病基因位点、或高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.986A>C突变，能够辅助评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性。
根据本公开，能够提供一种高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的致病基因位点或高脂血症高风险的突变位点，有助于高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的诊断、治疗与预防。
附图说明
图1为本发明实施例所涉及的先证者及其父母基因测序峰图。
图2为本发明实施例所涉及的先证者的家系图。
图3为本发明实施例所涉及的LPL在不同物种间的氨基酸序列对比图。
图4为本发明实施例所涉及的LPL蛋白三维结构的预测图。
图5为本发明实施例所涉及的先证者及其父亲、姐姐与对照组的脂蛋白酯酶(LPL)活性。
图6为本发明实施例所涉及的LPL在高表达LPL野生型(LPL-WT)和LPL突变型(LPL-MUT)细胞及培养上清中的体外活性示意图。
图7为本发明实施例所涉及的先证者对治疗的反应结果示意图。
图8为本发明实施例所涉及的非诺贝特与LPL结合位点的预测示意图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组。
为便于理解本发明，下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明，且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。本领域技术人员应该理解，附图只是实施例的示意图，附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
在本实施方式中，涉及下述任一种应用：
一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的试剂盒中的应用；
一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症伴急性胰腺炎患者的试剂盒中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症患者的试剂盒中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症伴急性胰腺炎患者的试剂盒中的应用；
一种检测样本中LPL基因突变的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用；
一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用。
在本实施方式所涉及的上述应用中，LPL基因或LPL蛋白的突变与高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症三种疾病的风险均是相关的，因此，检测LPL基因突变或LPL氨基酸突变的试剂可以用于筛查高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的患者，检测LPL基因突变或LPL氨基酸突变的试剂可以用于评估高脂血症、急性胰腺炎和高甘油三酯血症中的任一种或任意多种疾病的易感性。
在一些示例中，在本实施方式所涉及的上述应用中，LPL基因突变为LPL c.986A>C。LPL c.986A>C是指野生型的LPL基因的编码区的第986位碱基由A(腺嘌呤)突变为C(胞嘧啶)。本实施方式中中，通过家系研究鉴定出LPL c.986A>C突变，并通过功能研究证实LPLc.986A>C突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)的致病基因位点或高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL c.986A>C突变，能够辅助筛查高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)患者。并能够辅助评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性。易感性是指由遗传基础所决定一个个体患病的风险，也可以理解为在相同环境下，不同个体患病的风险。
在一些示例中，在本实施方式所涉及的上述应用中，LPL氨基酸突变为LPLp.Y329S。LPL p.Y329S是指野生型的LPL蛋白的氨基酸序列中的第329位由Y(酪氨酸)突变为S(丝氨酸)。本公开中，通过家系研究鉴定出LPL p.Y329S突变，并通过功能研究证实LPLp.Y329S突变会影响脂蛋白酯酶(LPL)活性，由此，提供了新的高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)的致病基因位点或高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)高风险的突变位点，通过检测样本中的LPL p.Y329S突变，能够辅助筛查高脂血症(和/或急性胰腺炎、和/或高甘油三酯血症)患者。并能够辅助评估高脂血症、急性胰腺炎和/或高甘油三酯血症的易感性。
在一些示例中，在本实施方式所涉及的上述应用中，可以通过检测被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种样本对LPL基因或LPL蛋白进行检测。换言之，所检测的样本可以来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种。
在一些示例中，被检测者可以为普通人群、疑似患有家族性/遗传性高脂血症的个体或高脂血症的高风险人群。
在一些示例中，可以对样本中的LPL基因的胚系突变进行检测。胚系突变又叫生殖细胞突变，是来源于精子或卵子等生殖细胞所携带的突变。在一些示例中，可以通过提取被检测者的gDNA(基因组DNA)并对基因组DNA进行检测，来获得LPL基因的胚系突变结果。
在一些示例中，可以对LPL基因的编码区的第986位碱基进行检测。进一步地，可以对LPL c.986A>C突变进行检测。换言之，可以检测被检测者是否携带LPL c.986A>C突变。
在一些示例中，被检测者的LPL基因中只要存在一个LPL c.986A>C突变，就可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。换言之，检测到被检测者的LPL c.986A>C为杂合突变时，可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。当然，检测到被检测者的LPL c.986A>C为纯合突变时，也可以辅助诊断该被检测者为高脂血症患者。
在本实施方式中，通过LPL c.986A>C这一基因突变作为标志物，能够对高脂血症患者进行筛查，进而提供一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用。同样地，还能提供一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查急性胰腺炎、高甘油三酯血症的试剂盒中、在制备评估高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用。同样的，还能提供一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的试剂盒中、在制备评估高脂血症、急性胰腺炎或高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用。
在一些示例中，在上述所涉及的试剂盒中，可以包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测LPL c.986A>C的探针。由此，能够通过引物对和/或探针对LPL c.986A>C进行捕获和/或检测。
在一些示例中，在上述所涉及的试剂盒中，检测LPL c.986A>C的探针可以根据人基因组中LPL基因编码区第986位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此，探针能够与LPL基因编码区第986位上下游区域的序列结合以对该区域进行检测，从而对LPLc.986A>C这一突变进行检测。
在一些示例中，在上述所涉及的试剂盒中，还包括dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此，能够便于对LPL c.986A>C进行检测。
在一些示例中，在上述所涉及的试剂盒中，包括实时荧光定量检测试剂。在一些示例中，实时荧光定量检测试剂包含用于实时荧光定量检测LPL基因突变的上游引物和下游引物。在一些示例中，上游引物的序列包括5’-GCCGCTACCACCAAGAATATC-3’，下游引物的序列包括5’-TCAGTACATGTGATGCAGTGAGC-3’。由此，能够对LPL基因突变进行实时荧光定量。
在一些示例中，在上述所涉及的试剂盒中，还可以包括对除LPL c.986A>C突变外的其他突变进行检测的试剂(包括引物和/或探针)。在一些示例中，其他突变可以包括高脂血症目前已知的全部致病突变和疑似致病突变。由此，能够对高脂血症的相关位点均进行检测，有利于对高脂血症进行一次性的、更加全面的筛查。
在一些示例中，试剂盒的形式可以为试剂或试剂套装的形式。在一些示例中，试剂盒还可以包括仪器所组成的系统。例如，试剂盒可以是由引物和DNA测序仪组成的系统；或者是由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统；或者是由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统；或者是由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统；或者是由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或SequenomMassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。
在一些示例中，试剂盒可以应用于以下技术的至少一种：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、微流控芯片技术、TaqMan探针技术和Sequenom MassArray技术。换言之，可以使用以下技术的至少一种对样本中的LPL基因突变进行检测：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、微流控芯片技术、TaqMan探针技术和Sequenom MassArray技术。由此，能够应用这些技术对LPL基因的突变进行检测。
在一些示例中，上述所涉及的试剂盒可以应用于以下方法中的至少一种：蛋白质和肽段的序列分析技术，例如N末端序列测定的化学方法、Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等；与质谱相关的蛋白质检测技术，例如基质辅助激光解吸电离、飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)和电子喷雾电离质谱测量法(electro sprayion-ization massspectrometry，ESI-MS)；基于抗体的检测方法，例如制备可识别不同突变体的抗体，应用免疫印迹(如western blot)和/或酶联免疫吸附(ELISA)检测蛋白变异。由此，能够对LPL氨基酸突变进行检测。优选地，LPL氨基酸突变包括LPL p.Y329S突变。
下面，结合实施例进一步对本发明所涉及的上述应用进行详细的解释，但是不应把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[实施例]
本实施例中，对涉及到的专业术语的英文简称或符号进行说明，如表1所示。
表1专业术语说明
临床案例：
高甘油三酯血症家族共5名成员，包括先证者、先证者父亲、先证者母亲、先证者姐姐、先证者外甥女(先证者姐姐的女儿)。具体地：
先证者为一30岁女性，因“持续性腹痛3天”以急性胰腺炎收入医院治疗。先证者两年前体检时发现血糖升高，化验空腹血糖12.3mmol/l，甘油三酯9.8mmol/l，服用阿卡波糖以及二甲双胍，控制空腹血糖在7mmol/l左右，未监测餐后血糖，未服用降脂药物。近2年来曾因“急性胰腺炎”3次住院治疗。否认冠心病和高血压病史，否认饮酒病史。化验结果显示TG19.97mmol/L，TC6.0mmol/L，LDLl.36mmol/l，血糖17.2mmol/l，血脂肪酶2157IU/L，血淀粉酶379IU/L，IAA、ICA、GADA均为阴性。胰腺CT示急性胰腺炎表现。
先证者父亲患有高血压病及高脂血症，无胰腺炎病史。先证者母亲以及先证者姐姐患有糖尿病，并有轻度HTG。先证者外甥女血脂和血糖正常。先证者家族成员均无自身免疫性疾病、胆结石及酗酒、滥用药物史。
样本检测：
1)采集先证者、先证者父亲、先证者母亲、先证者姐姐、先证者外甥女的空腹外周血，进行TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)以及FFA(游离脂肪酸)检测和进行葡萄糖耐量试验。
2)提取先证者、先证者父亲、先证者母亲、先证者姐姐、先证者外甥女外周血基因组DNA(gDNA)进行检测。
具体地，采集先证者及其父母、姐姐、外甥女各自约2mL外周血，用QIAamp全血DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取基因组DNA。然后使用GenCap液相捕获目标基因技术(北京迈基诺公司)，采用该技术捕获与血脂异常相关的95个基因(见表2)的编码侧翼区域以及外显子区域。最后采用二代测序的IlluminaNextseq 500平台对上述区域进行双端测序，读长的数值是150bp。
表2与血脂异常相关的95个基因
| ABCA1 | ABCG5 | ABCG8 | ABO | ACACB | ACE | ACVRIC | ADRB2 |
| AGPAT2 | ALB | ALDH2 | ALMS1 | ANGPTL3 | ANGPTL4 | APOA1 | APOA2 |
| APOA4 | APOA5 | APOB | APOC2 | APOC3 | APOE | ARSB | ASCC3 |
| BSCL2 | C6orf183 | CAV1 | CD163 | CD36 | CETP | CTF1 | CYP27A1 |
| DHCR24 | DYRKIB | EEPD1 | EHBP1 | EIF4B | EPHX2 | EV15 | F13A1 |
| F7 | FAMII4A2 | G6PC | GCKR | GCLC | GCLM | GHR | GHRL |
| GPAM | GPDI | GPIHBPI | HFE | HMGCR | HNFIA | ITGB3 | LCAT |
| LDLR | LDLRAPI | LIPA | LIPC | LIPG | LIPI | LMFI | LPA |
| LPL | MC4R | MCU | MGAT1 | MLXIPL | MMAB | MTTP | MVK |
| PCSK7 | PCSK9 | PDGFC | PHKA2 | PHKG2 | PKDIL3 | PLCE1 | PMFBPI |
| PNPLA3 | PPARA | PPARG | PPPIRI7 | PTRF | SLCI2A4 | SLCI7A8 | SLC29A3 |
| SLC37A4 | SORT1 | TALDOI | TIMD4 | TM6SF2 | TRIBI | USFI |
二代测序完成后，将测序数据中的低质量数据以及接头数据去除。借助BWA软件同相关的参考基因组(hg19)进行比对，针对测序均一性和深度以及探针特异性等相关资料完成统计分析工作。使用基因组分析工具包软件(GATK)检测单核苷酸多态(SNPs)、插入或缺失(Indels)，将数据转换为VCF格式，变异使用ANNOVAR来同众多的数据库(1000Genome(1000正常人群数据库)、ESP6500、dbSNP、EXAC、Inhouse、HGMD)进行关联，并通过SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster等软件对突变位点进行预测。也即通过GATK软件来针对该样本对应的比对数据完成接下来的多态性位点检测工作，针对插入缺失突变以及单核苷酸多态性等数据完成相应的分析和统计工作，使用PolyPhen2和SIFT以及GERP++等数据库来针InDels(插入缺失变异)和SNPs(单核苷酸变异)的致病性完成有效的分析工作，将ESP6500si和1000正常人群数据库以及ExAC_EAS数据库之中的内部频率数值在0.05之内并且预测结果都是致病性位点的数据选取出来，把这些数据当作是同疾病有关的位点。具体地，使用下面五个步骤来筛选潜在的致病突变：(i)突变读数应大于5，突变率≥30％；(ii)将在ESP6500、1000Genome以及Inhouse数据库内部出现的频率在5％之上的突变去除；(iii)如果是在InNormal数据库(MyGenostics)中存在的突变，则删除；(iv)去除同义突变。(v)在步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)之中，如突变是同义的，但是在HGMD数据库中报告的，则将其保留。当上述工作完成后，保留下来的突变应该是致病突变。
使用Sanger测序法、ABI3730xl测序仪来完成一代测序的工作，比较二代测序以及一代测序的结果。具体地，基于所需测序的DNA片段合成引物，并且使用聚合酶链反应法来将其扩增，本实施例中，所述合成的检测LPL突变基因的引物为：上游引物：5’-GCCGCTACCACCAAGAATATC-3’，下游引物：5’-TCAGTACATGTGATGCAGTGAGC-3’。
本实施例中，所有数据的获取都在符合法律规范、用户同意的基础上上，对数据的合法应用。先证者及家属均同意并且在知情同意书上进行了签字。此外，如未特别指明，本实施例所用试剂或仪器均为市售。
检测结果：
如图1、图2所示，图1为本发明实施例所涉及的先证者及其父母基因测序峰图，提示先证者及其父亲存在LPL杂合突变c.986A>C(p.Y329S)；图2为本发明实施例所涉及的先证者的家系图，提示I-1(先证者父亲)、II-3(先证者)、III-6(先证者姐姐)均携带共同的突变(LPL c.986A>C(p.Y329S))，且为杂合子。先证者母亲及外甥女DNA测序未发现该基因突变。先证者及其家庭成员均没有发现其他的与血脂代谢有关的基因(APOC2、APOA5、LMF1、GPIHBP1等)突变。
本实施例中，发现的杂合突变(LPL c.986A>C)的携带情况与携带者的临床表型相符，因此该突变可能会削弱LPL的活性，这可能是HTG的致病突变。
功能研究：
(1)在发现LPL基因新的突变位点(LPL c.986A>C)后，对LPL c.986A>C进行功能预测，具体地：
根据Mutation Taster软件的建议，这种基因改变可能也会影响蛋白质的性质，而且是致病性的。LPL基因编码475个氨基酸残基的蛋白质，突变位点c.986A>C(p.Y329S)位于保守结构域上，LPL保守结构域由一个脂蛋白酯酶超家族区域组成。这种新的LPL突变被预测通过配体非依赖性激活LPL导致酶活性降低，从而导致脂代谢缺陷。图3为本发明实施例所涉及的LPL在不同物种间的氨基酸序列对比图，如图3所示，多个氨基酸序列比对表明p.Y329在不同物种间是保守的。图4为发明实施例所涉及的LPL蛋白三维结构的预测图，其中，图4(a)是LPL野生型的；图4(b)是LPL突变型的，参考序列NM_000237.2，突变位点为c.986A>C(p.Y329S)。3D结构预测结果显示LPL突变型的局部氢键未发生变化。
(2)使用铜试剂检测生成的游离脂肪酸的量，同时以此为基础计算脂蛋白酯酶活性。进一步构建质粒，进行细胞转染，通过细胞实验检测突变体LPL的体外活性，对新发现的LPL突变体进行功能分析。具体方法为：
采用南京建成生物工程研究所的总酯酶试剂盒测定脂蛋白酯酶(LPL)活性，包括：
1)人肝细胞克隆2.5B1(CAT：CRL-12461)培养过夜，质粒转染；2)分别取2.5ugpcDNA3.1质粒、LPL野生型质粒(Homo-LPL)(NM_000237.3)、LPL突变型质粒(Homo-LPL(c.986A>C))，分别添加100μl opti-MEM，孵育的时间设定成5min；3)选取5μl脂质体2000转染试剂，将减血清培养基添加到其中，孵育的时间设定成5min；4)在Liopfectamine mix内部添加DNA mix，孵育的时间设定成5min；5)在细胞培养液之中添加上述所有混合物，4-6小时以后将培养基进行更换，将温度设定成37℃并且在5％CO2的条件下培养48小时；6)将细胞/上清提取出来并且借助总酯酶测试盒来针对总酯酶活性进行测定。
使用酶标仪(版本：4.00.53；序列号：3001-1792；实际仪器温度：23.1、22.9、22.7℃；波长数值为550nm)测量吸光度，然后借助以下公式来对脂蛋白酯酶(LPL)活性进行计算：
本实施例中，进行脂蛋白酯酶(LPL)活性测定时，使用的Homo-LPL(NM_000237.3)质粒购自Biosune Biotechnology(上海)有限公司，根据生产说明使用Quik Change定点突变试剂盒(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)构建LPL突变型质粒。所有构建质粒均在ABI3730xl测序仪上测序验证。该构建质粒被完全测序，并在其他克隆设计中用作模板。
本实施例中，进行蛋白质免疫印迹，LO2细胞(人正常肝细胞)与编码LPL-WT(LPL野生型)、LPL-MUT(LPL突变型)的质粒进行转染。在6cm2的培养皿内部接种细胞。之后，在第二天添加pCDNA3.1-LPL-WT和pCDNA3.1-LPL-MUT。孵育48h后，搜集细胞开展SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。借助山羊抗兔IgGH&L二抗(ab7064，1:5000)、抗脂蛋白脂酶(ab172953，1：1000)以及抗GAPDH(ab9485，1:1000)抗体等进行Western blotting。使用化学发光试剂盒(美国，MILLPOLE，CA，WBKLS0050)检测信号，并使用化学发光成像系统(上海琴翔科学仪器有限公司)进行成像。
血浆脂蛋白酯酶(LPL)活性分析结果
利用铜试剂法测定并计算出先证者及其父亲、姐姐、母亲、外甥女血浆脂蛋白酯酶(LPL)活性，并对4名健康志愿者也进行了血浆脂蛋白酯酶(LPL)活性的测定作为对照组(controls)，对照组数据以平均值表示。图5为本发明实施例所涉及的先证者及其父亲、姐姐与对照组的脂蛋白酯酶(LPL)活性，如图5所示，结果表明存在杂合突c.986A>C(p.Y329S)的先证者父亲I-1脂蛋白酯酶活性较对照组下降约67.77％，提示这个位点突变可以下调LPL活性，减少甘油三酯的分解，c.986A>C(p.Y329S)突变可能是患者血中甘油三脂分解代谢缺陷导致高甘油三酯血症的原因。但是，先证者II-3的LPL活性没有降低，分析为先证者所接受的贝特类药物治疗可能提高LPL活性。先证者姐姐II-6、先证者外甥女LPL活性(0.83u/mgprot)无降低，先证者母亲LPL活性(0.56u/mgprot)较对照组略有降低，分析LPL活性受多种因素调控。因此，为进一步解释上述现象，进一步构建了质粒，进行细胞转染，通过细胞试验进一步检测LPL活性，对LPL突变体进行功能分析。
突变体LPL体外活性分析结果
图6为本发明实施例所涉及的LPL在高表达LPL野生型(LPL-WT)和LPL突变型(LPL-MUT)细胞及培养上清中的体外活性示意图。选用LO2细胞；在图6中，(a)为LPL野生型和LPL突变型蛋白的表达，使用WB测试生成蛋白质的量；(b)为LPL蛋白表达水平的直方图分析；(c)为LPL-WT和LPL-MUT在体外培养的LO2细胞中的活性；(d)为LPL-WT和LPL-MUT在体外培养的LO2细胞上清液中的活性；n.s.p＞0.05，*p<0.05，*p<0.001与对照组比较；n.s.p＞0.05，#p<0.05LPL-WT与LPL-MUT的活性比较。结果表明LPL c.986A>C(p.Y329S)变异不影响蛋白表达水平；但LPL突变体(LPL-MUT)转染细胞(参见图6中的(c))和培养上清液(参见图6中的(d))中LPL活性均弱于野生型LPL(LPL-WT)，在差异方面具备统计学的意义(P<0.01)。因此，杂合突变LPL c.986A>C(p.Y329S)会降低LPL的活性，影响TG的水解，从而引起HTG，LPL c.986A>C(p.Y329S)为一种致病突变。
临床治疗：
对携带该突变体的先证者采用非诺贝特治疗，甘油三酯水平得到理想的控制和稳定。对非诺贝特与LPL结合位点的预测分析表明，突变位点不影响非诺贝特与LPL酶结合的紧密程度和结合构象的相对浓度，这可能是该突变不影响非诺贝特疗效的原因之一。具体地：
非诺贝特与LPL结合位点的预测分析
采用Sybyl x-2.1的Surflex模块进行分子对接，采用Sybyl x-2.1的“Sketch”模块进行小分子化合物的分子构建，对非诺贝特与脂蛋白酯酶(LPL)的结合位点进行了预测分析实验。具体地：
1.蛋白-小分子之间的分子对接：
(1)采用Sybyl x-2.1的Surflex分子对接模块，采用Sybyl x-2.1的“Sketch”模块进行小分子化合物的分子构建，而参考的2D结构来构建3D结构，并进行加氢原子和Gasteiger-Huckel电荷，最后利用Sybyl x-2.1的“Powell”能量最小化方法进行结构优化，采用的优化最大步长为1000步，能量梯度为
(2)分子对接时，对受体蛋白的处理：加AMBER7 FF99电荷以及加氢原子的方式处理蛋白。选择受体蛋白原配体所在的周围氨基酸作为抑制剂/激动剂分子对接的活性位点。
(3)利用Protomol模块产生分子对接的活性位点的最终文件，即xxxx-A_H-L-0.50-0.sfxc。
(4)参数：采用默认的分子对接参数。
2.对接结果分析与方法
(1)分子对接得到的受体蛋白与小分子间相互作用的分子对接打分值。
(2)分子对接打分值越高，表示化合物与靶标的结合力越大，可能会有较高的活性。一般来说，这个数值大致可以表征为结合常数PKi(即-logKi)，或者是PIC50(即-logIC50)。分子对接打分数值越大意味着化合物的靶点亲和力越高。选择靶点亲和力高的结合位点进行结构预测。
本实施例中，如表3、表4、图7所示，图7为本发明实施例所涉及的先证者对治疗的反应结果示意图，先证者入院在胰腺炎控制后每天服用200毫克非诺贝特，并给予胰岛素控制血糖，治疗期间为低脂饮食。经过14天的治疗，先证者血糖水平稳定，血脂水平明显下降。出院后，继续低脂饮食和200毫克非诺贝特每日1次口服。先证者父母以及姐姐，患有糖尿病，并有轻度HTG，他们都没有接受治疗，其外甥女血脂和血糖正常。
表3先证者治疗前后血脂变化及家系成员血脂水平
表4先证者及其家系成员血糖水平
先证者口服“非诺贝特”后甘油三酯水平得到了理想的控制。
先证者出院后每日服用非诺贝特200mg治疗，降糖方面使用门冬胰岛素30，在早饭前和晚餐前各14U ih，口服阿卡波糖每次50mg，每日3次。出院3个月以后，复查甘油三酯水平小于1.0mmol/l，空腹血糖5-6mmol/L，饭后2h血糖小于7.8mmol/l。先证者口服非诺贝特后甘油三酯水平明显降低，效果显著，从随访结果看，先证者的甘油三酯水平控制在正常范围内，未再发生急性胰腺炎。贝特类药物通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α，改变与脂蛋白和脂肪酸代谢相关的基因的表达。过氧化物酶体增殖物激活受体α下调LPL抑制因子apoCIII(APOCIII)，上调LPL激活因子apoAV，从而提高LPL活性。PPARα被激活之后，形成PPAR-RXR异源二聚体，与PPAR启动子区域的反应元件结合，并对能量代谢的相关基因的转录进行调节，这就是“反式激活”，这种相互作用调节脂蛋白脂酶的表达。这些发现可能是其调节LPL活性改变的原因之一。
为了进一步研究非诺贝特对LPL活性的影响，预测了非诺贝特和LPL的结合位点，对靶点结合力较高的结合位点进行结构分析。结果表明，突变的存在使非诺贝特与LPL突变结合更紧密，结合构象更集中。由此，推测其他贝特类药物也可能在一定程度上提高突变后LPL酶活性。图8为本发明实施例所涉及的非诺贝特与LPL结合位点的预测示意图。其中，图8中(A)和(B)分别是野生型LPL和突变型LPL结合对接的聚类分析，分析了结合位点和结合能。图8中的(C)-(J)：分析上述结合位点的结合位点和结合能，Top1结合位点WT(C)，P.Y329S(D)；Top1结合姿势WT(E)，P.Y329S(F)；TOP2结合位点WT(G)，P.Y329S(H)；TOP2结合姿势WT(I)，P.Y329S(J)。分子对接的聚类分析表明，与LPL野生型和LPL p.Y329S突变型相比，非诺贝特与LPL的结合能力无显著差异。Top1和Top2的结合位点和结合能预测结果表明，突变的存在可以使小分子结合更紧密，结合构象更集中。LPL突变不影响非诺贝特与LPL的结合活性。因此，该突变不影响非诺贝特的疗效。
本实施例中，所研究的数据用平均值±标准差(SD)的形式来表示。采用两组间数据的双尾配对学生t检验(Student's t-test)进行统计比较，也可以在数据大于两组的情况下，采取单因素方差分析，然后使用GraphPad Prism 8进行Dunnett和Bonferroni方法比较。每个实验都采用不少于3次的重复操作。P值<0.05为显著差异。
综上，根据实施例的上述研究及研究结果显示，LPL c.986A>C突变或LPL p.Y329S突变会损害LPL蛋白的功能。LPL c.986A>C突变或LPL p.Y329S突变是本实施例中的高脂血症、急性胰腺炎、高甘油三酯血症家系的致病突变。本实施例发现LPL c.986A>C(p.Y329S)是新的高脂血症、急性胰腺炎、高甘油三酯血症的致病基因，且呈常染色体显性遗传。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (10)
1.一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增LPL基因的引物对和/或用于检测LPL c.986A>C的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于检测LPL c.986A>C的探针根据人基因组中LPL基因编码区第986位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测所述LPL基因突变的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列包括5’-GCCGCTACCACCAAGAATATC-3’，所述下游引物的序列包括5’-TCAGTACATGTGATGCAGTGAGC-3’。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种，且所述LPL基因突变是指LPL基因的胚系突变。
7.一种检测样本中LPL氨基酸突变的试剂在制备筛查高脂血症患者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL氨基酸突变为LPL p.Y329S。
8.一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备筛查高甘油三酯血症患者的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。
9.一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备评估高脂血症的易感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。
10.一种检测样本中LPL基因突变的试剂在制备评估高甘油三酯血症的易感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述LPL基因突变为LPL c.986A>C。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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