JP2008307036A

JP2008307036A - 高トリグリセリド血症の成因となる新規リポタンパクリパーゼ（ｌｐｌ）遺伝子欠失変異及びそれを利用した高トリグリセリド血症を診断するためのｌｐｌ変異検出キット

Info

Publication number: JP2008307036A
Application number: JP2007181489A
Authority: JP
Inventors: Atsuko Takagi; 敦子高木; Yasuyuki Ikeda; 康行池田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-12
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2008-12-25

Abstract

【課題】高トリグリセリド血症の成因解明と高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防に有用なＬＰＬ遺伝子解析をより簡便に行うために、日本人におけるＬＰＬ遺伝子変異を集積するとともに、それら変異を標的とした遺伝子診断を行うのに必要な特異的診断キットを提供する。
【解決手段】日本人高トリグリセリド血症被検者ＡのＬＰＬ遺伝子中に新たな突然変異ＬＰＬ遺伝子５′隣接領域からエキソン１を含み、イントロン１の一部にわたる約５４ｋｂの大きな欠失変異（正確にはＮＴ＿０３０７３７．９の配列の７５９４４２０から７６４８３３７までの５３９１８塩基の欠失変異）を確認した。変異ＬＰＬ遺伝子の塩基配列に基づいて、当該変異を検出するためプロープを提供し、また変異部分を含む塩基配列を増幅し変異を検出する簡便な原発性高トリグリセリド血症診断法、診断用キットを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は高トリグリセリド血症の成因の診断に有用なリポタンパクリパーゼ遺伝子変異（ＬＰＬ遺伝子の５′隣接領域とエキソン１と一部のイントロン１の欠失変異、正確にはＮＴ＿０３０７３７．９の配列の７５９４４２０から７６４８３３７までの５３９１８塩基の欠失変異）に関するものである。更にこの変異を検出するための遺伝子診断試薬に関するものである。

リポタンパクリパーゼ（以下、ＬＰＬという）は、約６０キロダルトンの糖タンパク質であり、腸管で生成されるカイロミクロンや、肝臓で生成される超低比重リポタンパク中のトリグリセリドを加水分解して、遊離脂肪酸を産生する酵素である。

ＬＰＬ蛋白をコードしている遺伝子であるＬＰＬ遺伝子の異常のホモ接合体（または複合型ヘテロ接合体）の患者は、高カイロミクロン血症をともなう１，０００ｍｇ／ｄｌ以上の著しい高トリグリセリド血症（Ｉ型高脂血症）を呈し、急性膵炎が引き起こされ死に至る場合がある。よって、高カイロミクロン血症や膵炎を発症した場合の病因を明らかにすることは、その後の治療方針を決定するために重要である。

ＬＰＬ遺伝子欠損ヘテロ接合体の場合には、正常者にくらべＬＰＬ活性は約半分になるが、高インスリン血症にならず、飲酒癖のない健全な生活習慣をもっている場合には、高トリグリセリド血症（ＩＶ型高脂血症）を発症することはない。しかし、ＬＰＬ遺伝子欠損ヘテロ接合体の遺伝背景を持っていて、飲酒癖や運動不足・肥満などの悪い生活習慣を伴うと、肝臓でのトリグリセリド合成が亢進し、ＬＰＬ活性が正常者の半分のレベルでは血中のトリグリセリドを加水分解して正脂血状態を保つには不足であり、高トリグリセリド血症（ＩＶ型高脂血症）を発症する。これが続くと、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の小型・高密度化を引き起こし、これは動脈硬化の危険因子となり、将来的に心疾患等の危険因子となる。高トリグリセリド血症の成因にはＬＰＬ遺伝子異常以外の遺伝因子や環境因子もかかわり、その成因はすべてが解明されているわけでない。高トリグリセリド血症になったときにその病因を明らかにすることは、その後の治療方針の決定や、患者がその治療を受け入れ、生活習慣の改善もふくめて、確実に実行するためには、たいへん重要である。

将来的には、高トリグリセリド血症になる前に、たとえば、飲酒癖等、悪い生活習慣を身に付ける２０歳以前に自分がＬＰＬ遺伝子異常ホモ接合体（または複合型ヘテロ接合体）あるいはヘテロ接合体であるか否かを知ることで、将来起こる可能性のある高トリグリセリド血症発症とそれに部分的に起因する動脈硬化、心疾患を予防できるようになるであろう。これは究極のテーラーメイド医療である。いったん身についた悪しき生活習慣を改善するよりは、最初からそのような生活習慣を身につけない方が容易であると考えられる。特に、女性の場合は、妊娠すればＬＰＬ遺伝子正常者でも高トリグリセリド血症になるのが普通なので、それ以前にあらかじめ自分のＬＰＬ遺伝子の状態を知っておくことは、妊娠中の栄養管理を厳密に行うことができ、それによって、高トリグリセリド血症に起因する膵炎の併発や流産を予防できる。

ヒトのＬＰＬ遺伝子は第８染色体短腕（ｐ２２）に位置し、１０個のエキソンからなり、約３０ｋｂの長さがある。

ＬＰＬ遺伝子の変異は日本人においてこれまでに２５種程度が見いだされている。このうち日本以外でも見いだされているものは少数であり、人種の違いで、見いだされる変異の種類に違いがあることをしめす。日本人の高トリグリセリド血症の成因診断を簡便かつ正確に行うには、日本人でのＬＰＬ遺伝子変異をさらに集積することが重要である。
ヒトゲノムシーケンスＮＴ＿０３０７３７．９

高トリグリセリド血症の成因がＬＰＬ遺伝子異常によるものか否かを診断することは、高トリグリセリド血症の治療方針の決定に重要である。更に、将来的には高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防として、本症を発症する前にＬＰＬ遺伝子診断がなされることが望ましい。しかし、遺伝子配列決定法等の通常の遺伝子解析方法は、一般的な診断に適用するには時間やコストがかかるため実用的とはいえず、より簡便な診断方法の開発が望まれている。

従って、本発明の目的は、高トリグリセリド血症の成因解明と高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防に有用なＬＰＬ遺伝子解析をより簡便に行うために、日本人において集積してきたＬＰＬ遺伝子変異を用いて、それら変異を標的とした遺伝子診断を行うことにより、ＬＰＬ遺伝子診断を簡便化することである。

本発明者らはこれまで、日本人の高トリグリセリド血症者から２０種類のＬＰＬ遺伝子変異を集積してきた。その他、日本の他施設でのみ見いだされている５種類のＬＰＬ遺伝子変異を含め、現在日本人でのＬＰＬ遺伝子変異は２５種類が集積されている。ちなみにこれら変異があるとＬＰＬ酵素活性はゼロあるいはほぼゼロになる。

本発明者らは上記目的を達成するために日本人の高トリグリセリド血症者におけるＬＰＬ遺伝子異常をさらに検索した結果、ＬＰＬ遺伝子５′隣接領域からエキソン１を含み、イントロン１の一部にわたる約５４ｋｂの大きな欠失変異（正確にはＮＴ＿０３０７３７．９の配列の７５９４４２０から７６４８３３７までの５３９１８塩基の欠失変異）を発見し、この事実に基づいて本発明を完成するに至った。このような広い範囲にわたる欠失変異はＬＰＬ遺伝子異常としては日本ではじめてのものである。
すなわち、本発明の第１は、本欠失変異の結果、隣接された配列で、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、または欠失変異によりつながった部分である１００３番目から１０２２番目の塩基を含む部分配列またはその相補配列である。この欠失変異によりＬＰＬ遺伝子５′隣接領域からエキソン１とイントロン１の一部を失う結果となり、ＬＰＬ遺伝子の翻訳開始コドンはエキソン１にあるため、ＬＰＬ蛋白を全く合成できず、ＬＰＬ活性を完全に失う。

本欠失変異によりポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、当該部位の変異による高トリグリセリド血症の診断に有用なプローブやプライマー等を作成することが可能になる。

本発明の第２は、配列番号１で表わされる配列、または欠失変異によりつながった部分である１００３番目から１０２２番目の塩基を含む部分配列を増幅し検出するためのプライマーおよび変異検出試薬を含むことを特徴とする高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キットである。

本発明の高トリグリセリド血症の成因を特定する診断キットの好ましい実施形態の一つは、プライマーとして、配列番号２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものである。

以上説明したように、本発明によれば、ＬＰＬ遺伝子の欠失突然変異による高トリグリセリド血症の診断に有用なポリヌクレオチドを提供できる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列に基いて高トリグリセリド血症の診断に有用なプローブやプライマー等を容易に作成することが可能になり、上記ＬＰＬ遺伝子の変異による高トリグリセリド血症の成因診断を簡単に行なうことができる診断キットを提供できる。

ＬＰＬ遺伝子の上記変異を調べる方法としては、ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＳＳＣＰ法（ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｕｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＥＣＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌａｒｒａｙ）法、ＡｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎａｌｌｅｌｉｃｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＤＮＡｃｈｉｐ）、Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法、ＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＨＰＬＣ法、Ｉｎｖａｄｅｒａｓｓａｙ法等が挙げられるが、これらの方法に限定されるわけではなく、その他多くの方法が存在する。

具体的な上記変異に的をしぼった遺伝子解析法は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＥＣＡ法、ＡｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎａｌｌｅｌｉｃｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＤＮＡｃｈｉｐ）、Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒａｓｓａｙ法、Ｎａｎｏ−Ｉｎｖａｄｅｒａｓｓａｙ法等が挙げられるが、これらの方法に限定されるわけではなく、その他多くの方法が存在する。

本発明の高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キット（以下、単に診断キットという）は、ＬＰＬ遺伝子の本欠失変異の有無を判別するための診断キットであり、配列番号１で表わされる塩基配列あるいは、欠失変異によりつながった部分である配列番号１の１００３番目から１０２２番目の塩基を含む部分配列を増幅し検出するためのプライマーを含む。上記プライマーとしては、配列番号２で表わされるプライマー（センスプライマー）と配列番号３で表わされるプライマー（アンチセンスプライマー）の組み合わせが挙げられる。

配列番号２及び３で表わされるプライマーを用いて、高トリグリセリド血症被検者の血液などから常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法を行なうと、欠失変異がない場合は、センスプライマーとアンチセンスプライマーの間の距離は５４Ｋｂ以上のため、ＰＣＲ産物は得られないが、本欠失変位が存在した場合、３４９４ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応物を電気泳動することによって、３４９４ｂｐのＰＣＲ産物の有無がわかり、本欠失変位の有無が判定できる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ＰＣＲ用試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー）はＴＡＫＡＲＡ社のものを用いた。

高トリグリセリド血症を呈する被検者Ａ（ＴＧ：７７９ｍｇ／ｄｌ、ＴＣ：２８０ｍｇ／ｄｌ）の末梢血（ＥＤＴＡ採血の試料、以下同じ）から、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢＬＯＯＤＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりゲノムＤＮＡを抽出した。

このゲノムを鋳型にＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応液の組成はつぎのとおりである。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＬＡＴａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．１μｌ
ＰＣＲ用バッファー２ｘＧＣＩＢｕｆｆｅｒ５．０μｌ
ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）１．６μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）５０ｎｇ／μｌ１．０μｌ
プライマー（配列番号２）（１ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ
プライマー（配列番号３）（１ｐｍｏｌ／μｌ）１．０μｌ
滅菌蒸留水で最終液量１０μｌにする。

ＰＣＲ反応条件は、９４℃、０．５分６０℃、１．０分６８℃、５．０分このステップを３５回繰り返した。その後、６８℃、１０．０分１回である。

そして、ＰＣＲ反応液を１％アガロース電気泳動すると図１に示されるように、被検者Ａでは約３．５Ｋｂのバンドが検出されたが、正常コントロールではバンドは検出されなかった。

被験者Ａで検出されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯＸＬＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）のベクターに直接ＴＡクローニングし、塩基配列を決定した。

その結果、被験者Ａにおいて、配列番号１で表わされるように、ＬＰＬ遺伝子５′隣接領域からエキソン１を含み、イントロン１の一部にわたる約５４ｋｂの大きな欠損変異（正確にはＮＴ＿０３０７３７．９の配列の７５９４４２０から７６４８３３７までの５３９１８塩基の欠失変異）を確認した。
この変異は日本のみならず、世界でもはじめてのものである。本被験者Ａはこの変異に関してヘテロ接合体であった。

ちなみに本被験者Ａはもう一方のアレルに既知変異である１塩基置換によるナンセンス変異を有しているため、ＬＰＬ遺伝子産物を全く作らず、高トリグリセリド血症（とくに高カイロミクロン血症）を呈したものであった。

本発明の新規ＬＰＬ遺伝子変異は、ＬＰＬ変異を簡便に検出する遺伝子診断チップ等の開発において重要なものである。日本人のＬＰＬ遺伝子変異の早期診断キットの開発においては、日本人から見いだされたすべてのＬＰＬ変異を検出できる遺伝子診断チップが必要である。我々は日本人に見いだされた２５種類の変異の大半についてすでにインベーダー法による遺伝子診断システムを開発している。今回、新たに見いだされた変異を日本人のＬＰＬ遺伝子変異の診断キットの中に加えることで、変異検出力を高めることができる。本発明の変異検出法は、ＬＰＬ遺伝子変異の診断キットの開発を念頭においている企業にとって有用なものであると考えられる。ＬＰＬ遺伝子変異の診断が迅速に行えるようになると、高トリグリセリド血症の成因解明と治療方針の決定のみならず、生活習慣病予防のためのテーラーメイド医療にも貢献すると考えられる。

被験者Ａと対照者のゲノムを鋳型にして、配列番号２と配列番号３で表わされるプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。１：サイズマーカー２：正常コントロール３：被験者Ａ（本欠失変異と別の既知変異の複合型ヘテロ接合体者）

Claims

欠失変異の結果、隣接された配列で、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１で表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドのうち、欠失変異の結果、隣接された配列の接合部分とその周辺の１００３番目から１０２２番目の塩基を含む部分配列またはその相補配列。
欠失変異の結果、隣接された接合部分とその周辺の、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列の１００３番目から１０２２番目の塩基を含むすべての配列またはその相補配列。
ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法であって、検査対象からＤＮＡを採取し、ＤＮＡ標品を作製する工程、ＤＮＡ標品中に請求項１あるいは請求項２に記載の塩基配列の存在の有無を検出する工程を含むことを特徴とする、ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法。
請求項１の変異の有無を調べるために用いるＰＣＲにおいて、プライマーとして使用する配列番号２と配列番号３表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
請求項１あるいは請求項２の変異の有無を調べるために用いるＰＣＲにおいて、プライマーとして使用する配列番号２と配列番号３以外の少なくとも１５塩基以上のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。