CN116606924A - 一种smn1-smn2融合基因微小突变的检测套组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种SMN1‑SMN2融合基因微小突变的检测套组及其应用。所述检测套组包含用于扩增样本中SMN融合基因的引物与测序引物。利用本发明的检测引物，通过长片段扩增，将SMN1与SMN2融合基因的外显子1到外显子8完全扩增，然后直接进行测序，通过测序可确认检测SMN1‑SMN2融合基因是否发生微小突变，检测技术流程简单，容易实现标准化。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组及其应用，所述SMN1-SMN2融合基因微小突变的突变类型主要包括：点突变、缺失突变、插入突变与缺失插入突变等。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是儿童最常见的神经肌肉病，以脊髓前角α运动神经元退化变性导致肌无力、肌萎缩和瘫痪为主要临床特征，随着疾病进展，可出现呼吸、消化、骨骼等多系统受累。根据发病年龄及临床表现分为Ⅰ型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和Ⅳ型(成人型)。根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断，同时可行相关辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和SMN1基因分析以进行确诊。
SMN基因(Survival motor neuron)位于染色体5q11.2～q13.3上，全长约为28kb，含有9个外显子，分别为外显子1、2a、2b、3、4、5、6、7和8，人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因为SMN1基因(survival motor neuron gene1，运动神经元存活基因1)与SMN2基因(survival motor neuron gene2，运动神经元存活基因2)。SMA遗传变异方式非常多样，约95％患者存在SMN1第7号外显子和/或第8号外显子纯合缺失，即〔0+0〕基因型；另有5％为由SMN1复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异，为〔0+1d〕基因型，均可影响全长mRNA转录导致体内SMN蛋白水平降低而致病。因SMN1和SMN2序列的高度同源性，且均位于5q13.2，该区域存在包括SMN在内的多对同源基因导致基因组不均等的互换和基因转换，而出现SMN1和SMN2拷贝数的多种变化，同时，SMN1和SMN2之间还存在部分转换，出现SMN1-SMN2融合基因，如仅见SMN1外显子7缺失，外显子8不缺失。经研究发现大约有5-12％SMA患者因SMN1和SMN2发生部分转换，使得SMN基因在外显子7和外显子8拷贝数不一致。
SMN1发生双等位基因的致病性变异是SMA诊断的主要依据。由于95％的SMA患者为SMN1纯合缺失，应首先进行SMN1拷贝数定量分析。当受检者为SMN1外显子7或外显子7与8纯合缺失，即可诊断为SMN1纯合缺失型患者。当受检者为SMN1杂合缺失，提示需进行另一个SMN1等位基因的序列分析，如检测到微小致病性变异，该个体诊断为SMN1缺失和微小变异的的复合杂合突变患者。多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependentprobeamplification,MLPA)技术通过直接检测SMN1拷贝数，明显区分患者、携带者及正常人，同时检测患者SMN2拷贝数，是目前国内外SMA管里共识推荐使用诊断SMA的金标准，但该方法无法检测SMN1基因微小变异。SMN1复合杂合突变患者需要确认发生在SMN1基因的微小变异，目前的技术或者文献通常采用SMN1外显子8特异性长片段PCR结合巢式PCR，接着进行Sanger测试的方法可以见测SMN1外显子和邻近内含子区域的微小变异。
SMN1与SMN2基因序列上仅有5个碱基的差异，分别一个在内含子6、一个在外显子7、二个在内含子7和一个外显子8，正常情况下SMN1单倍型为g-C-a-a-G和SMN2单倍型为a-T-g-g-A，对于发生部分转换的SMN1-SMN2融合基因的复合杂合突变的样本，如SMN基因在外显子7为SMN1基因序列，外显子8为SMN2基因序列，可能的单倍型为g-C-g-g-A或g-C-a-g-A或g-C-a-a-A等(如图一)，在此情况下若采用SMN1外显子8特异性长片段PCR，将无法无法准确的确定微小突变是否发生在SMN1上。因此寻求一种新的检测SMN1-SMN2融合基因微小突变的方法，增加SMN1扩增专一性，简化操作流程，实现SMN1微小突变检测标准化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组及其应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组，其包括长片段扩增引物与测序引物；
其中，所述长片段扩增引物包括：
第一引物：黏合SMN1和SMN2外显子1上游区域序列，
第二引物：特异性的黏合SMN1在外显子7与SMN2的差异位点区域，
第三引物：特异性的黏合SMN1在内含子6与SMN2的差异位点区域，
第四引物：黏合SMN1和SMN2外显子8下游区域序列；
所述测序引物为根据SMN基因设计的特异性检测引物，包括针对SMN基因外显子1、SMN基因外显子2a、SMN基因外显子2b、SMN基因外显子3、SMN基因外显子4、SMN基因外显子5、SMN基因外显子6、SMN基因外显子7、SMN基因外显子8的测序引物。
进一步的，上述长片段扩增引物序列如下：
第一引物SEQ ID No.1：5'-TGGAGTTCGAGACGAGGCCTAAG-3'；
第二引物SEQ ID No.2：5'-CTTTTTGATTTTGTCTGAAACCCTG-3'；
第三引物SEQ ID No.3：5'-ATCTATATATAGCTATCTGTG-3'；
第四引物SEQ ID No.4：5'-ACAAAATGCTATGGTGGCATCC-3'。
进一步的，上述测序引物序列如下：
SMN基因外显子1测序引物SEQ ID No.5：5'-CCGTACTGTTCCGCTCCCAGAAG-3'；
SMN基因外显子2a测序引物SEQ ID No.6：5'-TGTGTGGATTAAGATGACTCT-3'；
SMN基因外显子2b测序引物SEQ ID No.7：5'-AGGTGCTTTCTGAGGTGACG-3'；
SMN基因外显子3测序引物SEQ ID No.8：5'-TATCCTTCACCTCCCCACTG-3'；
SMN基因外显子4测序引物SEQ ID No.9：5'-ACACAGTTGTCAGTTTGATCC-3'；
SMN基因外显子5测序引物SEQ ID No.10：5'-TCTGTTTGACTTCAGGATTTG-3'；
SMN基因外显子6测序引物SEQ ID No.11：5'-GTTGGTTTTCTCCAAATGCTAG-3'；
SMN基因外显子7测序引物SEQ ID No.12：5'-GTAGGCATGAGCCACTGCA-3'和SEQ IDNo.13：5'-GTCTGCTGGTCTGCCTACTA-3'；
SMN基因外显子8序引物SEQ ID No.14：5'-ACTGGAATTCGTCAAGCCTC-3”。
进一步，上述SMN基因外显子7为SMN1基因外显子7，SMN基因外显子8为SMN2基因外显子8。
上述一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组在制备脊髓性肌萎缩症的SMN1-SMN2融合基因因微小突变检测试剂盒中的应用。
一种脊髓性肌萎缩症的SMN1-SMN2融合基因因微小突变检测试剂盒，包括扩增反应液、SMNex1-7引物混合液、SMNex7-8引物混合液、DNA聚合酶与SMN测序引物；所述SMNex1-7引物混合液由SEQ ID No.1～2所示的引物组合获得；所述SMNex7-8引物混合液由SEQ IDNo.3～4所示的引物组合获得；所述SMN测序引物包含SEQ ID No.5～SEQ ID No.14所示的引物。
一种非疾病诊断治疗目的的检测SMN1-SMN2融合基因微小突变的方法，其是利用上述的试剂盒进行检测，具体包含以下步骤：
(a)长片段扩增：于扩增反应液中混合待测DNA样品及SMNex1-7引物混合液、SMNex7-8引物混合液，进行长片段扩增反应，产生两种扩增产物；
(b)测序检测：将步骤(a)产生的长片段扩增产物，使用SMN测序引物通过Sanger测序进行测序检测，并与SMN基因进行比对，确认是否有微小突变。
本发明的有益效果在于：
(1)因SMN1和SMN2高度同源，容易发生互相转换，若发生部分转换，使得该等位基因在外显子7和外显子8为分别为SMN1基因与SMN2基因，形成SMN1-SMN2融合基因，如外显子7为SMN1、外显子8为SMN2。本发明透过两段的长片扩增产物，可精准的扩增并分析SMN1-SMN2融合基因全外显子与内含子的序列，此设计也能针对SMN1基因进行微小突变分析，因此SMA患者中5-10％的SMN1基因复合杂合突变，皆能准确检测，提高微小突变诊断率，满足临床需求。
(2)利用本发明的SMN1长片段扩增的特殊引物设计，无须进行第二次PCR扩增，可直接利用测序引物，进行SMN1基因与SMN1-SMN2基因全外显子与内含子进行测序，以实现SMN1基因微小突变的标准化检测。同时DNA加样量为5-300ng，灵敏度高，样本浓度低至1ng/ul，依旧能准确检测出SMN1基因与SMN1-SMN2基因的微小突变。
附图说明
图1为SMN基因单倍型图示，SMN1与SMN2基因序列上仅有5个碱基的差异，分别一个在内含子6、一个在外显子7、两个在内含子7和一个外显子8，正常情况下SMN1单倍型为g-C-a-a-G和SMN2单倍型为a-T-g-g-A，若发生部分转换产生的SMN1-SMN2融合基因，如SMN基因在外显子7为SMN1基因序列，外显子8为SMN2基因序列，可能的单倍型为g-C-g-g-A或g-C-a-g-A或g-C-a-a-A。
图2为引物设计示意图，检测微小突变引物组合包括长片段扩增引物与测序引物，透过第一引物与第二引物进行长片段扩增产出全长27312bp的扩增产物1，第三引物与第四引物扩增外显子7和8为融合基因的区域，产出全长1225bp的扩增产物2，两种扩增产物分别以SEQ ID NO.5～14进行测序并分析，确认是否有微小突变。
图3为长片段PCR产物的电泳结果图，实施例3的11例样本，箭头所指为扩增产物1(27312bp)。
图4为样本5的定序结果图。扩增产物1以SEQ ID NO.12针对外显子7进行测序，可见内含子6为SMN1的G，外显子7为SMN1的C。扩增产物2以SEQ ID NO.13针对外显子7进行测序，可见外显子7为SMN1的G(反向测序)、内含子7分别为SMN1的T与SMN2的C(反向测序)；扩增产物2以SEQ ID NO.14针对外显子8进行测序，可见外显子8为SMN2的A。由以上结果，样本5的单倍型为g-C-a-g-A，为SMN1-SMN2融合基因，外显子7为SMN1基因，外显子8为SMN2基因。
图5为样本1与样本5的定序结果图。样本1在外显子1经序列比对后，正常无突变，样本5具有c.22_23insA突变。
图6为样本1与样本6的定序结果图。样本1在外显子2b经序列比对后，正常无突变，样本6具有c.156-165delinsCA突变。
图7为样本1与样本7的定序结果图。样本1在外显子5经序列比对后，正常无突变，样本7具有c.683T>A突变。
图8为样本1与样本10的定序结果图。样本1在外显子1经序列比对后，正常无突变，样本10具有c.81+2_3delTG突变。
图9为样本1与样本11的定序结果图。样本1在外显子3经序列比对后，正常无突变，样本11具有c.373G>A突变。
具体实施方式
实施例1
1、扩增反应液与引物混合液配制
表1扩增反应液组份配制表
表2 SMN ex1-7引物混合液组份配制表
| 组分 | 每反应终浓度 |
| SEQ ID No.1 | 0.5μM |
| SEQ ID No.2 | 0.5μM |
| 1X TE缓冲液 | 1X |
表3 SMN ex7-8引物混合液组份配制表
| 组分 | 每反应终浓度 |
| SEQ ID No.3 | 0.5μM |
| SEQ ID No.4 | 0.5μM |
| 1X TE缓冲液 | 1X |
实施例2长片段PCR扩增与SMN1基因外显子定序
1、样本处理：采用核酸提取试剂盒(Qiagen,QlAmp DNA Blood Mini Kit，货号51104)提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应，DNA浓度为1ng/uL～150ng/uL，OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间。
2、扩增试剂配制：
(1)从试剂盒取出扩增反应液、SMNex1-7引物混合液、SMNex7-8引物混合液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。
(2)扩增试剂配制：按下表4分别配置扩增试剂1和扩增试剂2
表4扩增试剂配制表
(3)将配制好的试剂用震荡器震荡均匀，用微量离心机短暂离心，使液体沉降于管底。
(4)在PCR反应管中分别加入45μL配制好的扩增试剂，转移到样本处理区加样。
3、加样：在对应的含有45μL的扩增试剂的PCR反应管中分别加入5μL待测样本基因组DNA，盖上PCR反应管盖后，短暂离心。
4、PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳分析：
(1)将PCR反应管放入PCR仪按表5方法设定反应程序，反应体积设定：50μL；
表5扩增反应程序
(2)琼脂糖凝胶电泳分析：PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段大小与预期目的片段大小一致(如图3所示)，第一引物与第二引物进行长片段扩增得到的目的条带大小为27312bp。
5、SMN1基因外显子定序：
PCR产物纯化后采用ABI公司BigDye3.1测序试剂盒，在ABI公司3500基因测序仪以SMN测序引物(SEQ ID No.5～SEQ ID No.14)直接进行测序，用Chromas软件将测序结果与GeneBank中的正常参考序列进行比对分析，确定基因突变位点。
6、结果分析
(1)针对SMN1和SMN2基因在第7外显子的差异位点进行分析，以确认长片段PCR扩增产物皆为SMN1基因，证实长片段PCR的专一性，只扩增出SMN1基因，如图4所示。
(2)将SMN测序引物针对长片段PCR扩增产物直接测序的结果与SMN1基因参考序列(NG_008691.1)比对，分析待测样本的测序结果。
实施例3临床样本检测
1.收集11例EDTA抗凝全血样本，用核酸提取试剂盒(Qiagen,QlAmpDNABloodMiniKit,货号51104)提取人类基因组DNA用于后续的PCR反应。
2.采用荷兰MRC-Holland公司研制的ProbemixP021作为SMN1与SMN2拷贝数确认，若发生SMN1与SMN2基因部分转换，在外显子7与外显子8会有不同的拷贝数组合，下表6为11例样本MLPA拷贝数检测结果。
表6MLPA拷贝数检测结果
3.按实施例2的操作步骤，进行DNA加样，与长片段扩增反应并测序，分析是否具有微小突变，检测结果见下表7，变异的类型包括点突变(c.683T>A、c.373G>A)、缺失突变(c.81+2_3delTG)、插入突变(c.22_23insA)、与缺失插入突变(c.156-165delinsCA)。
表7微小突变检测结果
4.依据表7及图4到图9之结果，本发明可以精确分析SMN1-SMN2融合基因的序列，进而鉴定该样本为复合杂合突变的患者，或携带者。
应当理解的是，前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本领域所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明之例示性实施方式之结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组，其特征在于：包括长片段扩增引物与测序引物；
其中，所述长片段扩增引物包括：
第一引物：黏合SMN1和SMN2外显子1上游区域序列，
第二引物：特异性的黏合SMN1在外显子7与SMN2的差异位点区域，
第三引物：特异性的黏合SMN1在内含子6与SMN2的差异位点区域，
第四引物：黏合SMN1和SMN2外显子8下游区域序列；
其中，所述测序引物为根据SMN基因设计的特异性检测引物，包括针对SMN基因外显子1、SMN基因外显子2a、SMN基因外显子2b、SMN基因外显子3、SMN基因外显子4、SMN基因外显子5、SMN基因外显子6、SMN基因外显子7、SMN基因外显子8的测序引物。
2.根据权利要求1所述的一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组，其特征在于：所述长片段扩增引物序列如下：
第一引物SEQ ID No.1：5'- TGGAGTTCGAGACGAGGCCTAAG-3'；
第二引物SEQ ID No.2：5'- CTTTTTGATTTTGTCTGAAACCCTG-3' ；
第三引物SEQ ID No.3：5'- ATCTATATATAGCTATCTGTG-3'；
第四引物SEQ ID No.4：5'- ACAAAATGCTATGGTGGCATCC-3'。
3.根据权利要求1所述的一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组，其特征在于：所述测序引物序列如下：
SMN基因外显子1测序引物SEQ ID No.5：5'-CCGTACTGTTCCGCTCCCAGAAG-3'；
SMN基因外显子2a测序引物SEQ ID No.6：5'-TGTGTGGATTAAGATGACTCT-3'；
SMN基因外显子2b测序引物SEQ ID No.7：5'-AGGTGCTTTCTGAGGTGACG -3'；
SMN基因外显子3测序引物SEQ ID No.8：5'- TATCCTTCACCTCCCCACTG -3'；
SMN基因外显子4测序引物SEQ ID No.9：5'-ACACAGTTGTCAGTTTGATCC -3'；
SMN基因外显子5测序引物SEQ ID No.10：5'- TCTGTTTGACTTCAGGATTTG-3'；
SMN基因外显子6测序引物SEQ ID No.11：5'-GTTGGTTTTCTCCAAATGCTAG-3'；
SMN基因外显子7测序引物SEQ ID No.12：5'-GTAGGCATGAGCCACTGCA-3'和SEQ IDNo.13：5'-GTCTGCTGGTCTGCCTACTA-3'；
SMN基因外显子8测序引物SEQ ID No.14：5'-ACTGGAATTCGTCAAGCCTC-3' '。
4.根据权利要求1所述的一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组，其特征在于：所述SMN基因外显子7为SMN1基因外显子7，所述SMN基因外显子8为SMN2基因外显子8。
5.如权利要求1所述的一种SMN1-SMN2融合基因微小突变的检测套组在制备脊髓性肌萎缩症SMN1-SMN2融合基因微小突变检测试剂盒的应用。
6.一种脊髓性肌萎缩症SMN1-SMN2融合基因微小突变检测试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液、DNA聚合酶、SMN ex1-7引物混合液、SMN ex7-8引物混合液、SMN测序引物；
其中，所述SMN ex1-7引物混合液由SEQ ID No.1~2所示的引物组合获得；
其中，所述SMN ex7-8引物混合液由SEQ ID No.3~4所示的引物组合获得；
其中，所述SMN测序引物包含SEQ ID No.5~ SEQ ID No.14所示的引物。
7.一种非疾病诊断治疗目的的检测SMN1-SMN2融合基因微小突变的方法，其特征在于：利用权利要求6所述的试剂盒进行检测。
8.根据权利要求7所述的一种非疾病诊断治疗目的的检测SMN1-SMN2融合基因微小突变的方法，其特征在于：包含以下步骤：
(a)长片段扩增：于扩增反应液中混合待测DNA样品及SMN ex1-7引物混合液、SMN ex7-8引物混合液，进行长片段扩增反应，产生两种扩增产物；
(b)测序检测：将步骤(a)产生的长片段扩增产物，使用SMN测序引物通过Sanger测序进行测序检测，并与SMN基因进行比对，确认是否有微小突变。
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