CN106987642A - 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法 - Google Patents

检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106987642A
CN106987642A CN201710305007.8A CN201710305007A CN106987642A CN 106987642 A CN106987642 A CN 106987642A CN 201710305007 A CN201710305007 A CN 201710305007A CN 106987642 A CN106987642 A CN 106987642A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mpl
primer
genes
sequencing
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710305007.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李文静
吴鹏飞
王淑
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN ADICON MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Original Assignee
WUHAN ADICON MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN ADICON MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd filed Critical WUHAN ADICON MEDICAL TESTING INSTITUTE Co Ltd
Priority to CN201710305007.8A priority Critical patent/CN106987642A/zh
Publication of CN106987642A publication Critical patent/CN106987642A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了检测MPL基因全外显子的方法和试剂盒，所述引物、试剂盒包括扩增覆盖MPL基因全外显子序列的8对正、反向引物，所述PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了长18bp的M13‑F引物序列和长16bp的M13‑R引物序列。基于采用Sanger测序法，利用一对通用引物M13作为测序引物，检测MPL基因全外显子序列的突变情况。可应用于先天性无巨核细胞性血小板减少患者的基因诊断方面。

Description

检测MPL基因全外显子的试剂盒和方法
技术领域
本发明属医学生物技术领域，特别涉及检测MPL基因全外显子突变的试剂盒、引物和方法
背景技术
无巨核细胞性血小板减少可分为先天性和获得性两种，先天性无巨核细胞性血小板减少(CAMT)是新生儿的一种少见病，伴有多种先天性异常，畸形及再生障碍性贫血。新生儿期发病，皮肤可见紫癜、瘀斑。50％有先天性畸形，小头、发育迟缓、小脑及脑萎缩、先天性心脏病(房室间隔缺损、动脉导管未闭、法洛四联症、主动脉缩窄)，其他如兔唇或高弓形腭、肾、眼、足异常。人类c-mpl基因(MPL)在巨核细胞和血小板的生长发育及造血干细胞的自我更新中都起到重要作用，然而，在造血系统疾病中，检测到很多的MPL基因突变，这些突变改变了正常的调控机制，并导致自主性激活或信号传导缺陷。自从1999年，在先天性无巨核细胞性血小板减少(CAMT)患者中检测到第一例MPL突变，在原发性血小板增多症(HT)、骨髓增生性肿瘤(MPNS)，伴环形铁粒幼细胞与血小板显著相关的难治性贫血((RARS-t))，急性髓系白血病(AML)都已检测到MPL基因突变。
MPL(myeloproliferative leukaemia virus oncogene)位于人染色体lp34，包括12个外显子，并编码人血小板生成素受体。与CAMT疾病相关的MPL基因突变是常染色体，隐形基因突变，在疾病的发生中起到决定性作用。根据ballmaier等人收集的数据显示，61例CAMT患者进行MPL基因突变检测，56例检测出MPL基因突变，突变率高达91.8％。据文献报道，在CAMT患者中发现了41种不同的MPL基因突变，包括无义突变、缺失突变和移码突变，错义突变和剪接位点突变等。
多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法。但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于MPL容量大、突变类型多、突变位点散在分布，故而阻止了对MPL基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。
发明内容
本发明提供检测MPL基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测MPL基因全外显子突变的情况，用于MPL的基因诊断。
本发明的目的在于提供检测MPL基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子突变的8对正、反向引物；其碱基序列分别是：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
进一步地，所述8对正、反向引物的使用浓度比为：
MPL-1-2F:MPL-1-2R＝1:1；MPL-3F:MPL-3R＝1:1；MPL-4F:MPL-4R＝1:1；
MPL-5-6F:MPL-5-6R＝1:1；MPL-7-8F:MPL-7-8R＝1:1；MPL-9F:MPL-9R＝1:1；
MPL-10F:MPL-10R＝1:1；MPL-11-12F:MPL-11-12R＝1:1。
进一步的，还包括测序引物M12-F和M12-R：
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的目的还在于提供一种检测MPL基因全外显子的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用8对扩增引物MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F与MPL-5-6R；MPL-7-8F与MPL-7-8R；MPL-9F与MPL-9R；MPL-10F与MPL-10R；MPL-11-12F与MPL-11-12R，对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖检测MPL基因全外显子序列的扩增产物；
(3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型MPL基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
进一步的，还包括测序引物M12-F和M12-R：
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的目的还在于提供一种检测MPL基因全外显子的试剂盒，包括样品DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括8对扩增引物MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F与MPL-5-6R；MPL-7-8F与MPL-7-8R；MPL-9F与MPL-9R；MPL-10F与MPL-10R；MPL-11-12F与MPL-11-12R，测序体系包括1对测序引物M13-F与M13-R，包括：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG
进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNAPolymerase。
进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明设计了扩增覆盖检测MPL基因全外显子序列的8对正、反向引物，并创新性的在PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了一段长18bp的M13-F引物序列和长16bp的M13-R引物序列。这样扩增产物两端都会带上所引入的M13-F及M13-R引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的M13-F和M13-R引物进行正反向测序。因为MPL基因有12个外显子，每个样本检测需要扩增12个PCR产物，如果每个产物使用各自的测序引物进行测序，操作将会十分繁琐，也极易引起污染。而本试剂盒这样的设计有效的避免了这一问题，大大简化了测序反应的操作步骤，使整个过程非常便捷。同时通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
有益效果：利用本发明所述扩增引物和测序引物，可以扩展整个全外显子序列，通过Sanger测序法对测序结果的分析，可以很直观了解MPL基因全外显子的基因突变情况，并不受MPL突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1样品1的检测结果图。
图2样品2的检测结果图。
图3样品3的检测结果图。
图4样品4的检测结果图。
图5样品5的检测结果图。
图6样品6的检测结果图。
图7样品7的检测结果图。
图8样品8的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测检测MPL基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子的8对正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
所述引物还包括1对测序引物，其碱基序列为
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG
在检测中，先利用上述8对正、反向扩增引物对覆盖检测MPL基因全外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述1对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。
在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧，即扩增区域包括了该外显子的全部序列。因为MPL的突变位点很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。因为第1、2、5、6、7、8、11、12号外显子序列都较短，因此本发明在检测第1和2号外显子,第5和6号外显子，第7和8号外显子，第11和12号外显子时，分别采用一对对扩增引物。
检测检测MPL基因全外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中，
检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；检测目的基因用的8对上、下游引物MPL-1-2F(10μm)与MPL-1-2R(10μm)；MPL-3F(10μm)与MPL-3R(10μm)；MPL-4F(10μm)与MPL-4R(10μm)；MPL-5-6F(10μm)与MPL-5-6R(10μm)；MPL-7-8F(10μm)与MPL-7-8R(10μm)；MPL-9F(10μm)与MPL-9R(10μm)；MPL-10F(10μm)与MPL-10R(10μm)，MPL-11-12F(10μm)与MPL-11-12R(10μm).
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液配制如下：
其中，MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F与MPL-5-6R；MPL-7-8F与MPL-7-8R；MPL-9F与MPL-9R；MPL-10F与MPL-10R；MPL-11-12F与MPL-11-12R的碱基序列为：
阳性对照品：含有MPL序列的溶液。
阴性对照品：无MPL序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA:
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入3个检测体系PCR反应液中各2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
(5)sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与测序引物：M13-F(3.2μm)与M13-R(3.2μm)，按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_007525.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床CAMT患者样本8份，检测该8份样本是否存在MPL突变。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
样品1的第1-2号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品2的第3号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品3的第4号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品4的第5-6号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品5的第7-8号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品6的第9号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品7的第10号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
样品8的第11-12号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示，为野生型，未检测出MPL突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出MPL基因全外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出MPL基因全外显子序列，无论是野生型还是突变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测MPL基因全外显子的试剂盒和方法
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtcc tgaagggagg atgggcta 38
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatggcag ggacagatac atgggga 37
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtcc gcatggtggc tgtgtaggag 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgaagt ctgattccgg gagctggac 39
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtag actgtggtac tcagagtt 38
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatggggc aagattgaag gtaggag 37
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtcc tagattgtga agctgggat 39
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatgcact cccatgacac caacctc 37
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagttt gggattagtc tctggggca 39
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgtccc ctgcgtagtg aggtctg 37
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtct ctttgtggga atctccgacc g 41
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatgcagg cgctgtgcgg ctttggtgc 39
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtag agtaggggct ggctggatga g 41
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatgcgga gatctggggt cacagag 37
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagtct cctccctgcc aatccactg 39
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacagctatg accatgtagg gaagttcaca gagaagt 37
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagctatg accatg 16

Claims (5)

1.检测检测MPL基因全外显子的试剂盒，其特征在于，包括：扩增覆盖检测MPL基因全外显子的正、反向引物；其碱基序列为：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述8对正、反向引物的使用浓度比为：MPL-F:MPL-R＝1:1。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括测序引物，其序列为：
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
4.一种检测检测MPL基因全外显子序列的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用8对扩增引物MPL-1-2F与MPL-1-2R；MPL-3F与MPL-3R；MPL-4F与MPL-4R；MPL-5-6F与MPL-5-6R；MPL-7-8F与MPL-7-8R；MPL-9F与MPL-9R；MPL-10F与MPL-10R；MPL-11-12F与MPL-11-12R。对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测MPL基因全外显子的扩增产物；
(3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型MPL序列进行比较，确定突变位点是否存在；
其中所述引物序列为：
MPL-1-2F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGAAGGGAGGATGGGCTA
MPL-1-2R:AACAGCTATGACCATGGCAGGGACAGATACATGGGGA
MPL-3F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCATGGTGGCTGTGTAGGAG
MPL-3R:AACAGCTATGACCATGAAGTCTGATTCCGGGAGCTGGAC
MPL-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGACTGTGGTACTCAGAGTT
MPL-4R：AACAGCTATGACCATGGGGCAAGATTGAAGGTAGGAG
MPL-5-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTAGATTGTGAAGCTGGGAT
MPL-5-6R：AACAGCTATGACCATGCACTCCCATGACACCAACCTC
MPL-7-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGGATTAGTCTCTGGGGCA
MPL-7-8R：AACAGCTATGACCATGTCCCCTGCGTAGTGAGGTCTG
MPL-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTTTGTGGGAATCTCCGACCG
MPL-9R：AACAGCTATGACCATGCAGGCGCTGTGCGGCTTTGGTGC
MPL-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTAGGGGCTGGCTGGATGAG
MPL-10R：AACAGCTATGACCATGCGGAGATCTGGGGTCACAGAG
MPL-11-12F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCTCCCTGCCAATCCACTG
MPL-11-12R：AACAGCTATGACCATGTAGGGAAGTTCACAGAGAAGT。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括测序引物，其序列为：
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
CN201710305007.8A 2017-05-03 2017-05-03 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法 Pending CN106987642A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710305007.8A CN106987642A (zh) 2017-05-03 2017-05-03 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710305007.8A CN106987642A (zh) 2017-05-03 2017-05-03 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106987642A true CN106987642A (zh) 2017-07-28

Family

ID=59417313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710305007.8A Pending CN106987642A (zh) 2017-05-03 2017-05-03 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106987642A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893117A (zh) * 2017-12-25 2018-04-10 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 检测il7r基因全外显子的方法和引物
CN108531573A (zh) * 2018-04-11 2018-09-14 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物、试剂盒和方法
CN108531574A (zh) * 2018-04-11 2018-09-14 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物和方法
CN109628577A (zh) * 2019-01-07 2019-04-16 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测冠状动脉硬化相关单核苷酸多态性位点的引物和方法
CN110564826A (zh) * 2019-09-19 2019-12-13 济南艾迪康医学检验中心有限公司 检测先天性肾性尿崩症avpr2基因突变的引物、方法和试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATE T. MONTGOMERY等: ""Mutation Detection Using Automated Fluorescence-Based Sequencing"", 《CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS》 *
MILOSEVIC FEENSTRA JD等: ""Whole-exome sequencing identifies novel MPL and JAK2 mutations in triple-negative myeloproliferative neoplasms"", 《BLOOD》 *
RASHMI KANAGAL-SHAMANNA等: "" Next-generation sequencing-based multi-gene mutation profiling of solid tumors using fine needle aspiration samples: promises and challenges for routine clinical diagnostics"", 《MODERN PATHOLOGY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893117A (zh) * 2017-12-25 2018-04-10 北京艾迪康医学检验实验室有限公司 检测il7r基因全外显子的方法和引物
CN108531573A (zh) * 2018-04-11 2018-09-14 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物、试剂盒和方法
CN108531574A (zh) * 2018-04-11 2018-09-14 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物和方法
CN109628577A (zh) * 2019-01-07 2019-04-16 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测冠状动脉硬化相关单核苷酸多态性位点的引物和方法
CN110564826A (zh) * 2019-09-19 2019-12-13 济南艾迪康医学检验中心有限公司 检测先天性肾性尿崩症avpr2基因突变的引物、方法和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106987642A (zh) 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法
CN104745697B (zh) 检测nf1基因第31‑34号全外显子的方法和引物
CN109486938A (zh) 检测smn1和smn2基因突变的方法、引物及应用
CN106834287B (zh) 一种用于检测RhD阴性表型的SNP标记
CN105441540A (zh) 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
CN106755399B (zh) 一种i型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂
CN111893173A (zh) 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒
CN104862407A (zh) 检测ezh2基因的引物和方法
CN108048565A (zh) 一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用
CN110358820A (zh) 检测ldlr基因突变的方法、引物和试剂盒
CN106399567A (zh) 检测wrap53基因突变的引物及其应用
CN111004849B (zh) 检测cdh1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒
CN110656112B (zh) 一种Liddle综合征基因检测试剂盒
CN106868174A (zh) 检测adamts13基因全外显子的试剂盒和方法
CN105177152B (zh) 检测hla-b*51等位基因的方法和引物
CN110951862A (zh) 检测cyp21a2基因突变的方法、引物和试剂盒
CN109628563A (zh) 检测piga基因启动子区域4972a&gt;g突变位点的引物、试剂盒和方法
CN104178487A (zh) Atm基因突变体及其应用
CN110358821A (zh) 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法
CN103131776A (zh) 一种tpmt*3c的a719g单核苷酸多态性检测试剂盒
CN114032303A (zh) 检测基因abcb11新突变的寡核苷酸和方法
CN107058531A (zh) 一种检测尼曼‑匹克病smpd1基因突变的试剂盒和方法
CN112626203A (zh) 检测ATP8B1基因的c.55C&gt;G、c.238C&gt;T位点突变的引物和方法
RU2645089C1 (ru) Способ экстракции днк, пригодной для проведения количественной пцр в реальном времени, из сухих пятен крови новорожденных
CN108531573A (zh) 检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物、试剂盒和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170728

RJ01 Rejection of invention patent application after publication