CN111004849B - 检测cdh1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒 - Google Patents

检测cdh1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测CDH1基因的多位点碱基突变的引物，方法和试剂盒，包括扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937‑13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性胃癌患者体内CDH1基因的c.2076T>C、c.1937‑13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对遗传性胃癌的临床鉴别诊断有重要的参考意义。

Description

检测CDH1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测CDH1基因位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性胃癌患者体内CDH1基因位点的突变情况。
背景技术
中国是胃癌高发国家，全世界42％的胃癌发生在我国，是第三大常见肿瘤(在男性中排在肺癌和肝癌之后，女性排在乳腺癌和肺癌之后)。胃癌人群中大多数为散发病例，约10％的患者表现有家族聚集性，这种聚集性可能与基因有关，也可能是由于共同的生活环境和饮食习惯所致，而HDGC(hereditary diffuse gastric cancer，遗传性弥漫型胃癌)是已知的以胃腺癌为主的癌症综合征，占所有胃癌总数的1-3％。CDH1基因突变是HDGC遗传的主要原因，也是第一个发现的与遗传性胃癌相关的基因。
CDH1是一个抑癌基因，位于16q22.1，由16个外显子组成，长度约105kb，转录mRNA长4.8kb，编码的E-钙粘蛋白(E-cadherin)分子量为120kd。E-cadherin是一类Ca2+依赖跨膜糖蛋白，由N端信号肽、前肽和成熟蛋白三部分组成，是目前公认的抑癌蛋白和肿瘤转移抑制蛋白，当它表达减少或功能异常时，将导致肿瘤的侵袭和转移。E-钙粘素在弥漫性胃癌中经常表达缺失，但是在其他类型胃癌中并没有这种现象。
至今已发现有150多种CDH1基因的突变类型，遍布CDH1基因的所有外显子。其中70％左右为致病型突变，包括截短突变(truncated mutation)、剪接突变(splicingmutation)、无义突变(nonsense mutation)；30％左右为错义突变(missense mutation)，其临床意义还有争议。CDH1基因突变率在不同地区、种族的遗传性弥漫型胃癌检出差别很大，提示不同地区胃癌的发病机制可能不同。符合遗传性胃癌诊断标准的家系中，CDH1基因突变携带者一生中患胃癌的概率大约为70％。弥漫性胃癌一旦出现临床症状，大部分已不可治愈，因此遗传性胃癌家系的CDH1基因检测成为必要。其目的是尽可能明确发病原因，并对有发病危险的家族成员提供遗传性检测，以便早期发现突变基因携带者，及时采取干预措施以提高预后。
Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对CDH1基因突变进行检测可发现CDH1基因已知和未知的全部类型的异常，为遗传性胃癌患者的诊断提供依据。本发明中发现CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA四个位点的突变在中国人群中普遍存在。因此，临床在利用CDH1基因突变辅助诊断遗传性胃癌时需格外谨慎，加以区别。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测遗传性胃癌家系成员体内CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的突变情况。所述检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的引物，包括：
扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的试剂盒，包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAGCDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
有益效果：本发明只用1对引物，可同时检测CDH1基因c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA4个突变，高效简便。其中还发现了c.2164+66A>C这个新突变(未见文献报道，属首次发现)，在本次检测中突变率为60％。本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度，荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计4个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1-20为血液样本1-20，经引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。
图2为样本3检测CDH1 c.2076T>C位点的测序截图结果。
图3为样本6检测CDH1 c.1937-13T>C位点的测序截图结果。
图4为样本11检测CDH1 c.2164+66A>C位点的测序截图结果。
图5为样本17检测CDH1 c.2164+17dupA位点的测序截图结果。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的引物，该引物是针对CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增CDH1基因c.2076、c.1937-13、c.2164+66和c.2164+17位碱基的引物，其碱基序列为：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC；
一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的试剂盒，包括
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；CDH1上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA的上、下游引物(3.2μm)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
Figure BDA0002316320050000061
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
Figure BDA0002316320050000062
其中，引物序列为：
Figure BDA0002316320050000063
注：F为上游引物，R为下游引物
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为20例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
Figure BDA0002316320050000064
Figure BDA0002316320050000071
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
Figure BDA0002316320050000072
测序反应程序：
Figure BDA0002316320050000073
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。(7)结果判断：分别将测序结果与CDH1(NG_008021.1)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取20例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。检测结果见下表，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，测序图如图2-5所示。
Figure BDA0002316320050000074
Figure BDA0002316320050000081
注：+表示阳性突变，-表示无突变
序列表
<110> 北京艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测CDH1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg cttgcgggtg tctttag 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgtcca ggaaataaac ctcctcc 37
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16

Claims (3)

1.一种引物在制备检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的试剂盒中的应用，其特征在于，包括：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
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