CN106520967A - 检测遗传性凝血因子xi（f11）基因的方法和引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测与遗传性凝血因子XI(F11)有关的基因突变的引物和方法，其包括扩增检测全外显子序列的15对引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将遗传性凝血因子XI(F11)缺陷症全外显子及相关的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断遗传性凝血因子XI(F11)缺陷症，对早期干预、早期治疗和产前诊断有重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明属医学检测领域，特别涉及检测与遗传性凝血因子XI(F11)有关的基因突变的引物和方法。
背景技术
凝血因子XI(F11)基因位于4号染色体长臂(4q35)，全长23kb，共含有15个外显子和14个内含子(A～N)，1号外显子编码为5′端非翻译区，2号外显子编码为18个氨基酸的信号肽，3号外显子到10号外显子编码成熟蛋白，位于氨基端的四个90个或91个氨基酸的串联重复形成的球形结构域，其中每2个外显子编码一个串联重复，每一个串联重复中编码有6个保守的半胱氨酸(Cys)，它们之间的内含子在这4个串联重复中的位置基本相同。11～15号外显子编码为多肽链羧基端，被5个内含子隔开，其中最后面4个内含子位置与人类组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶基因相同。成熟的F11为2个亚单位组成的同源二聚体，2个单体间以二硫键相连。F11在Arg369～Ile370处被催化裂解成为活化的F11(F11a)，F11a由两条轻链和两条重链组成。遗传性凝血因子XI(F11)缺陷症是1种少见的常染色体不完全隐性遗传性疾病，是由于编码FXI的基因突变导致，曾命名为血友病C。凝血因子XI(F11)是内源凝血途径中的酶原之一，在高分子量激肽原(HMWK)的作用下，它可被凝血酶激活，促进凝血过程的发生，另外由于FXI还可促进凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的产生，从而可以稳定已经形成的凝血块。遗传性FXI缺陷症是一种相对少见的遗传性出血性疾病，本病在人群中发病率为1/10万－1/100万，无性别差异，男女均可成为患者或携带者。通常因子FXI缺乏都是由于FXI合成量减少所导致的，只有个别病例是由于FXI功能异常造成的。在接触因子中，只有因子FXI缺乏时，会出现出血倾向。由于可能存在其他的调控止血的因素。因此，FXI水平与临床出血表现并不完全相符。但是，FXI水平较低的患者可能更容易发生出血，尤其是在纤溶活性较高的部位，如口腔、泌尿系统等部位进行手术操作后，更易发生出血。应用阿司匹林类药物也是某些患者发生出血的原因。临床出血症状轻重不一，一般无自发性出血倾向， 多因创伤或手术时明显凝血功能障碍而获得诊断。
截止目前一共发现了至少40种与遗传性凝血因子XI有关的基因突变,其中22种为错义突变,其他为无义突变(7种)、碱基或核酸片段的插入或缺失(5种)、剪切位点异常导致mRNA异常剪切(6种)。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测遗传性凝血因子XI(F11)基因多态突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测遗传性凝血因子XI(F11)缺陷症患者体内凝血因子XI(F11)基因多态位点的突变情况。所述检测凝血因子XI(F11)基因多态突变情况的引物，包括：
扩增凝血因子XI(F11)基因的引物，其碱基序列为：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测凝血因子XI(F11)基因的测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
进一步地，引物序列F11E1F和F11E1R是扩增凝血因子XI(F11)基因第1外显子序列的引物，引物序列F11E2F和F11E2R是扩增凝血因子XI(F11)基因第2外显子序列的引物，以此类推，引物序列F11E15F和F11E15R是扩增凝血因子XI(F11)基因第15外显子序列的引物。
本发明还提供了检测凝血因子XI(F11)基因全外显子突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定凝血因子XI(F11)基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增凝血因子XI(F11)基因的引物，其碱基序列为：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测凝血因子XI(FXI)基因的测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
本发明还提供了一种检测凝血因子XI(F11)基因多态突变位点的试剂盒，包括：
(i)全血基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
扩增凝血因子XI(FXI)基因的引物，其碱基序列为：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
有益效果：本发明设计了扩增凝血因子XI(F11)15个外显子序列的引物。通过加接头，使所有15对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。凝血因子XI(F11)基因的突变类型种类多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述XI(F11)全部外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。本发明的15对引物涵盖了凝血因子XI(F11)基因全部外显子区域，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。
附图说明
图1为凝血因子XI(F11)基因在染色体上定位图。
图2为15对扩增引物的电泳图，M为Marker，如图2所示，引物扩增有效， 且条带单一。第1对引物扩增产物长度为490bp；第2对引物扩增产物长度为279bp；第3对引物扩增产物长度为315bp；第4对引物扩增产物长度为250bp；第5对引物扩增产物长度为287bp；第6对引物扩增产物长度为287bp；第7对引物扩增产物长度为372bp；第8对引物扩增产物长度为383bp；第9对引物扩增产物长度为574bp；第10对引物扩增产物长度为399bp；第11对引物扩增产物长度为278bp；第12对引物扩增产物长度为433bp；第13对引物扩增产物长度为370bp；第14对引物扩增产物长度为535bp；第15对引物扩增产物长度为823bp。
图3显示是样本的F11 2号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测凝血因子XI(F11)基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对凝血因子XI(F11)全外显子设计的扩增引物，包括：
扩增凝血因子XI(F11)基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA一种检测凝血因子XI(F11)基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)全血基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，外周血基因组DNA提取所用试剂盒由天根生物科技有限公司提供。检测体系PCR扩增反应液包括：
PCR反应程序如下：
PCR所用KOD FOX由TOYOBO公司提供。引物由上海英潍捷基公司合成。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸 附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25 min，凝胶成像系统观察。
如图2所示，即为15例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15：l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50l70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与凝血因子XI(F11)基因参考序列(Genbankaccn：AC_000184.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
为了验证引物和整个检测系统的可行性，取15例临床体检血样(编号为1-15)。按实施例1和2的试剂和方法提取全基因组DNA、配制试剂、扩增和测序。样本加入检测体系PCR反应液中1μl。电泳结果如图2所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。
| Sample | 外显子(1-15)扩增产物 | 测序结果 | 点突变 | 多余基因插入 | 倍体 |
| 1 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 2 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 3 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 4 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 5 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 6 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 7 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 8 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 9 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 10 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 11 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 12 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 13 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 14 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
| 15 | 条带清晰单一 | 峰值单一无杂峰 | 无 | 无 | 无 |
图3显示是样本的F11 2号外显子野生型测序截图，说明测序结果峰值清晰无杂峰和重峰等影响结果的干扰。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩增凝血因子XI(F11)基因全部外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增凝血因子XI(F11)基因全外显子，通过结果表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出凝血因子XI(F11)基因所有外显子。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测遗传性凝血因子XI（F11）基因的方法和引物
<130>
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtag gcacacaggc aaaatc 36
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatggata ttagcggaac atctctac 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtac acagtcacac taaggaat 38
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgctct cccagcccat agtt 34
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtgc tacttgcctt gcctt 35
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatggtta agaatagcaa tctccc 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgc tttctgtgtg ctgact 36
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatgcgat gtggcgatat gtgta 35
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtct agaatctgga aggtactcat 40
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgggca taaagttgat ggcaaa 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtca ggtcctctct ccaaag 36
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatggctg gtatcctgag tgag 34
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtgg tgaattgagt ccctga 36
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatgagag tcctcggtaa tgttg 35
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagttg taactccgtg gtttatga 38
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacagctatg accatgaatg aagaatggca gaacac 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtcc gaggaggctg atacat 36
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagctatg accatggctt gagtgacagg agtg 34
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagttg aggagttagc ggtgag 36
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacagctatg accatgtgtt ctgatgctgg gaga 34
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagtct ttccctctgt tgtttgc 37
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aacagctatg accatggccg taagtctagt agtgtt 36
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aacagctatg accatggttg ttggcacaga ttgaa 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatggcaa ctgagtagtg tgact 35
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtag gtggaggtag cagtga 36
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aacagctatg accatgccaa cgcattaagc attcc 35
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgtaaaacga cggccagtgg aagcgtctga gttgat 36
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aacagctatg accatgcact gccactactt ggttat 36
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgtaaaacga cggccagtat cacgcttcta tggagtc 37
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tgtaaaacga cggccagtga tggaaaggaa gatgtagga 39
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aacagctatg accatg 16
Claims (5)
1.检测凝血因子XI(F11)基因突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增凝血因子XI(F11)基因第1外显子序列的引物：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
扩增凝血因子XI(F11)基因第2外显子序列的引物：
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
扩增凝血因子XI(F11)基因第3外显子序列的引物：
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
扩增凝血因子XI(F11)基因第4外显子序列的引物：
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
扩增凝血因子XI(F11)基因第5外显子序列的引物：
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
扩增凝血因子XI(F11)基因第6外显子序列的引物：
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
扩增凝血因子XI(F11)基因第7外显子序列的引物：
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
扩增凝血因子XI(F11)基因第8外显子序列的引物：
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
扩增凝血因子XI(F11)基因第9和10外显子序列的引物：
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
扩增凝血因子XI(F11)基因第11外显子序列的引物：
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
扩增凝血因子XI(F11)基因第12外显子序列的引物：
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
扩增凝血因子XI(F11)基因第13外显子序列的引物：
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
扩增凝血因子XI(F11)基因第14外显子序列的引物：
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
扩增凝血因子XI(F11)基因第15外显子序列的引物：
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，所述测序碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列M13-F和M13-R是测序凝血因子XI(F11)基因扩增产物全外显子序列的引物。
4.检测凝血因子XI(F11)基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定凝血因子XI(F11)基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增凝血因子XI(F11)基因第1外显子序列的引物：
F11 E1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCACACAGGCAAAATC
F11 E1 R：AACAGCTATGACCATGGATATTAGCGGAACATCTCTAC
扩增凝血因子XI(F11)基因第2外显子序列的引物：
F11 E2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACAGTCACACTAAGGAAT
F11 E2 R：AACAGCTATGACCATGCTCTCCCAGCCCATAGTT
扩增凝血因子XI(F11)基因第3外显子序列的引物：
F11 E3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTACTTGCCTTGCCTT
F11 E3 R：AACAGCTATGACCATGGTTAAGAATAGCAATCTCCC
扩增凝血因子XI(F11)基因第4外显子序列的引物：
F11 E4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTCTGTGTGCTGACT
F11 E4 R：AACAGCTATGACCATGCGATGTGGCGATATGTGTA
扩增凝血因子XI(F11)基因第5外显子序列的引物：
F11 E5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAGAATCTGGAAGGTACTCAT
F11 E5 R：AACAGCTATGACCATGGGCATAAAGTTGATGGCAAA
扩增凝血因子XI(F11)基因第6外显子序列的引物：
F11 E6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGTCCTCTCTCCAAAG
F11 E6 R：AACAGCTATGACCATGGCTGGTATCCTGAGTGAG
扩增凝血因子XI(F11)基因第7外显子序列的引物：
F11 E7 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGTGAATTGAGTCCCTGA
F11 E7 R：AACAGCTATGACCATGAGAGTCCTCGGTAATGTTG
扩增凝血因子XI(F11)基因第8外显子序列的引物：
F11 E8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGTAACTCCGTGGTTTATGA
F11 E8 R：AACAGCTATGACCATGAATGAAGAATGGCAGAACAC
扩增凝血因子XI(F11)基因第9和10外显子序列的引物：
F11 E9-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGAGGAGGCTGATACAT
F11 E9-10 R：AACAGCTATGACCATGGCTTGAGTGACAGGAGTG
扩增凝血因子XI(F11)基因第11外显子序列的引物：
F11 E11 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTGAGGAGTTAGCGGTGAG
F11 E11 R：AACAGCTATGACCATGTGTTCTGATGCTGGGAGA
扩增凝血因子XI(F11)基因第12外显子序列的引物：
F11 E12 R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTCCCTCTGTTGTTTGC
F11 E12 F：AACAGCTATGACCATGGCCGTAAGTCTAGTAGTGTT
扩增凝血因子XI(F11)基因第13外显子序列的引物：
F11 E13 F：AACAGCTATGACCATGGTTGTTGGCACAGATTGAA
F11 E13 R：AACAGCTATGACCATGGCAACTGAGTAGTGTGACT
扩增凝血因子XI(F11)基因第14外显子序列的引物：
F11 E14 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGGTGGAGGTAGCAGTGA
F11 E14 R：AACAGCTATGACCATGCCAACGCATTAAGCATTCC
扩增凝血因子XI(F11)基因第15外显子序列的引物：
F11 E15 F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGCGTCTGAGTTGAT
F11 E15 R1：AACAGCTATGACCATGCACTGCCACTACTTGGTTAT
F11 E15 F2：TGTAAAACGACGGCCAGTATCACGCTTCTATGGAGTC
F11 E15 R2：TGTAAAACGACGGCCAGTGATGGAAAGGAAGATGTAGGA。
5.如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170322 |