CN102559720A - 人源凝血因子ⅺ催化结构域的表达、纯化及结晶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人凝血因子XI催化结构域突变体。本发明提供了一种人凝血因子XI催化结构域突变体(N432Q/N473Q/C482S)在巴斯德毕氏酵母中高效稳定表达、纯化以及结晶的技术方法。本发明培养的人凝血因子XI催化结构域突变体晶体空间群为P3₁，单胞参数为：

α＝β＝90°，γ＝120°。该蛋白不需要任何激活就有丝氨酸蛋白酶活性，可用于人凝血因子XI抑制剂的高通量筛选；而其所结晶出的高分辨率晶体，则为人凝血因子XI抑制剂的设计、开发提供一个研发平台。

Description

人源凝血因子Ⅺ催化结构域的表达、纯化及结晶

技术领域：

本发明涉及医药、生物技术、结构生物学领域。 

背景技术：

人凝血因子XI(Human Coagulation factor XI，hFXI)是一种丝氨酸水解酶原，FXI在肝脏中合成，以两个相同的多肽链组成的二聚体形式分泌到血液中去，分子量约为160KD。FXI每条肽链由607个氨基酸组成，包括N端的重链和C端的轻链，重链包含4个Apple结构域，每个结构域含90-91个氨基酸，轻链含有催化结构域，由第370～607位的氨基酸组成。在传统的内源性凝血途径中，FXI是个关键的成份，当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与FXII结合，在高分子量激肽原和激肽释放酶的参与下被活化为FXIIa，活化的FXIIa将FXI激活。在钙离子的存在下，活化的XIa又激活了凝血因子IX。激活的凝血因子IX与凝血因子VIII结合并在Ca²⁺和磷脂存在的条件下，激活凝血因子X，活化的凝血因子X再激活凝血酶，凝血酶又激活纤维蛋白原，从而最终导致血液凝固。近来研究发现，FXI也能被凝血酶激活，被激活的FXIa反过来又促进凝血酶的大量产生。 

血液凝血过程出现失调可能导致危及生命的疾病，如急性心肌梗死，肺栓塞和动脉或静脉形成血栓的造成中风。目前常用的抗凝血药物，包括肝素、低分子肝素与华法林，存在着严重的局限性，治疗时需要严格监测。而作为一种参与凝血途径放大阶段的酶，FXIa的活性调节不影响凝血途径的起始阶段，但能减少血栓形成，而且不会引起严重的出血负作用。抑制丝氨酸蛋白酶是一种技术上可行的方案，例如，通过基于结构的药物设计已经发现多种凝血因子X以及凝血酶的抑制剂，部分抑制剂已应用于临床治疗，并且有部分抑制剂已经开 始应用于临床治疗。因此，结合FXI的重要生理作用，FXI催化结构域可以作为重要的靶标开发新颖的抗凝血剂，用于预防和治疗血栓疾病。 

发明内容：

本发明的目的在于提供了一套完善的人凝血因子XI在巴斯德毕氏酵母体系中表达、纯化、活性测定以及体外蛋白结晶的技术方法。本发明表达的重组蛋白具有有活性，成本低，稳定性高，表达量高等特点。 

本发明采用如下技术方案： 

1、人凝血因子XI催化结构域突变体的表达方法，其特征在于：本突变体在巴斯德毕氏酵母体系中表达，并且包含如下步骤： 

(1)以肝库为模板，用PCR法从肝库扩增出FXI催化结构域，正向引物S(5‘-3’)：CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC；反向引物AS(5‘-3’)：ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA，引物分别含Xho I和Sal I位点(用下划线标注)，用Xho I和Sal I双酶切FXI催化结构域片段和载体pPICZ_αA；将处理好的片段和载体用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；采用重叠延伸PCR的方法对FXI催化结构域基因的432和473位点进行定点突变，第一轮PCR：以构建好含有FXI催化结构域基因的质粒为模板，分别用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC  和反向引物P1 AS：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行第一轮PCR，PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收纯化；第二轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P2 S：GGCATTTTACAACAATCTGAAATA和反向引物P2 AS：GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT进行扩增，并回收目的DNA片段；第三轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P3 S： AAACCACAGTGCAATACACAGATTC  和反向引物P1 AS  ：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行扩增，并回收目的DNA片段；第四轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二轮PCR的产物为反向引物进行扩增，并回收目的DNA片段；第五轮PCR：以第三轮和第四轮PCR回收得到的2个DNA片段为模板，用带有Xho I和Sal I的正反引物，扩增出一条完整的带有突变位点的FXI催化结构域基因，克隆至pPICZ_αA载体，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；以构建好的pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q)质粒为模板，通过定点突变C482S，正向引物：AACGACCCATATCTCTGCCTTCC  ，反向引物：GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT构建重组质粒pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)，克隆测序； 

(2)目的基因的克隆与表达：酶切去磷酸化的PCR回收产物连接到表达载体pPICZαA上，重组质粒转入大肠杆菌进行扩增，抽提质粒，测序；测序正确后，大量抽提重组质粒，重组质粒经Sac I酶切后，电转入新制的感受态细胞X-33，重组的转化子在甲醇的诱导下表达的蛋白分泌在培养液中，SDS-PAGE电泳检测培养液中含有与目的蛋白相同分子量的条带。 

2、一种由项1所述的方法表达的人凝血因子XI催化结构域突变体。 

3、项2的人凝血因子XI催化结构域突变体的纯化方法，其特征在于：甲醇诱导后的培养基首先用阳离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱分离纯化，可获得纯度达98％以上蛋白。 

4、项2的人凝血因子XI催化结构域突变体的活性测定方法，采用S-2366发色底物检测活性，其特征在于：5nM蛋白在20mM Tris pH7.4，150mM Nacl，1％BSA 反应条件下与不同浓度的S2366反应，37℃反应持续10分钟，每30秒测其A₄₀₅吸收值，并通过以下公式计算酶比活力： 

式中：V为反应体系体积(ml)、v为样品量(ml)、ΔA为吸光度变化。 

5、项2的人凝血因子XI催化结构域突变体的晶体的培养方法，为坐滴水蒸气扩散法，其特征在于：缓冲溶液为30％PEG2000MME，0.1M Tris-Hcl，pH8.5。 

6、项2的人凝血因子XI催化结构域突变体的晶体，其特征在于：该晶体空间群为P3₁，单胞参数为： 

α＝β＝90°，γ＝120°。 

7、项2的人凝血因子XI催化结构域突变体在药物设计颖抗凝血剂中的应用。 

本项发明的内容之一是无需激活的人凝血因子XI催化结构域的设计和表达。人凝血因子XI催化结构域为370-607氨基酸肽段，突变点为N432Q/N473Q/C482S。以人肝cDNA库为模板，扩增出hFXI的370～607催化结构域片段，并通过重叠延伸PCR获得突变基因rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)。扩增出来的突变基因克隆到巴斯德毕氏酵母表达载体，经抗生素高拷贝筛选，获得高效稳定表达人凝血因子XI催化结构域突变体的酵母菌株；利用甲醇诱导可获得目的蛋白。 

本项发明的内容之二是突变体蛋白的纯化及活性测定。用阳离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱分离纯化，可获得纯度达98％以上蛋白。使用FXIa专一性发色底物S2366(pyroGlu-Pro-Arg-p-nitroanilide)测定重组蛋白的活性。这些实验说明，本项申请设计的人凝血因子XI突变体无须任何激活，即具有活性，可用于人凝血因子XI抑制剂的高通量筛选。 

本项发明的内容之三是人凝血因子XI催化结构域突变体蛋白的结晶，为研发和改进人凝血因子XI抑制剂提供一个崭新的研究平台。用水蒸气扩散法结晶蛋白，用X-ray射线单晶衍射仪温度100K衍射晶体，收集分辨率为 

数据，确定为P3₁空间群，单胞参数为： 

α＝β＝90°，γ＝120°。 

附图说明：

图1 1.0％DNA凝胶电泳分析rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)PCR产物 

图2 rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)突变位点测序图谱，红色下划线为突变后碱基。 

图3重组蛋白经凝胶层析柱Superdex 75的洗脱以及收集峰处蛋白跑SDS-PAGE电泳检验结果图； 

图4蛋白晶体图 

具体实施方式：

实施例一  表达目的基因的扩增 

1、申请人设计并由引物合成公司合成如下PCR引物： 

①起始引物(正向)：5’-CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC-3’； 

②末端引物(反向)：5’-ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA-3’； 

③突变点(C279A)引物(正向)：5’-GACCATCGCCCTGCCCTC-3’； 

④突变点(N302Q)引物(反向)：5’-GTCGGTAGATTGCTCTTTTCCAA-3’； 

⑤变点(N473Q)引物(反向)：5’-GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT-3’； 

⑥突变点(C482S)引物(正向)：5’-AACGACCCATATCTCTGCCTTCC-3’； 

⑦突变点(C482S)引物(反向)：5’-GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT-3’。 

注明：其中①②引物中的下划线表示限制性内切酶Xho I和Sal I酶切位点；③④⑤⑥⑦引物中下划线表示突变氨基酸的位点。 

2、重叠延伸PCR方法扩增和定点突变人凝血因子XI催化结构域(N432Q/N473Q/C482S)：以肝库为模板，用PCR法从肝库扩增出FXI催化结构域，正向引物S(5‘-3’)：CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC；反向引物AS(5‘-3’)：ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA，引物 带有XhoI和SalI位点(用下划线标注)，用XhoI和SalI双酶切FXI催化结构域片段和载体pPICZ_αA。将处理好的片段和载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定。 

采用重叠延伸PCR的方法对FXI催化结构域基因的432和473位点进行定点突变，第一轮PCR：以构建好含有FXI催化结构域基因的质粒为模板，分别用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和反向引物P1 AS：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行第一轮PCR，PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收纯化。 

第二轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P2 S：GGCATTTTACAACAATCTGAAATA和反向引物P2 AS  ：GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT进行扩增，并回收目的DNA片段。 

第三轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P3 S：AAACCACAGTGCAATACACAGATTC和反向引物P1 AS  ：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行扩增，并回收目的DNA片段。 

第四轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二轮PCR的产物为反向引物进行扩增，并回收目的DNA片段。 

第五轮PCR：以第三轮和第四轮PCR回收得到的2个DNA片段为模板，用带有Xho I和Sal I的正反引物，扩增出一条完整的带有突变位点的FXI催化结构域基因，克隆至pPICZ_αA载体，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定。 

以构建好的pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q)质粒为模板并通过定点突变C482S，构建重组质粒pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)，克隆由 DNA测序公司测序(图1)。 

实施例二目的基因的克隆 

人凝血因子XI催化结构域突变体的克隆：PCR回收产物，用限制性内切酶Xho I酶切过夜，乙醇沉淀回收；同样限制性内切酶Xho I酶切线性化毕赤酵母表达载体pPICZαA，去磷酸化，胶回收试剂盒回收线性化产物。PCR回收产物和去磷酸化的质粒pPICZαA混合，用T4 DNA连接酶，16℃过夜，65℃灭活5分钟；取1.5μl连接物与预冷的感受态细胞TOP10F’混合，2.5kV放电，电击，加入1毫升SOC溶液，37℃温育1小时，取200μl涂LB平板(25μg/ml Zeocin)，37℃，培养14小时，挑选菌落，培养，小量抽提重组质粒，酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆由DNA测序公司测序。 

实施例三  突变体蛋白的表达、纯化 

重组质粒在巴斯德毕氏酵母X-33中的表达、纯化：线性化重组质粒电转化酵母X-33菌株，涂100μg/ml Zeocin YPDS平板，挑菌落，抽提基因组，PCR鉴定。正确的重组子发酵表达，每天加入终浓度1％甲醇诱导，发酵4天的培养液，离心取上清，15％SDS-PAGE电泳检验分子量。表达量高的菌株扩大培养，甲醇诱导表达的重组蛋白分泌到酵母细胞培养液中，4天后收获.培养液离心，取清液加4倍体积水稀释，过阳离子亲和层析柱，200ml起始缓冲液(50mM Tris-Hcl，50mMNacl pH7.4)洗柱，缓冲液(50mM Tris-Hcl，1M Nacl pH7.4)进行洗脱，收集洗脱峰处蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白；用凝胶层析柱Superdex75 HR 10/30检测蛋白的纯度，单一洗脱峰，收集峰尖蛋白，电泳检测分子量(图2)。 

实施例四  突变体蛋白活性实验 

通过发色底物测定活性 

使用FXIa专一性发色底S2366(pyroGlu-Pro-Arg-p-nitroanilide)测定重组蛋白 的活性。5nM蛋白在20mM Tris pH7.4，150mM Nacl，1％BSA反应条件下与不同浓度的S2366反应，37℃反应持续10分钟，每30秒测其A₄₀₅吸收值，并通过公式1计算酶比活力。 

$\mathrm{nKat}/\mathrm{mL}=1.74\×\frac{V}{v}\×\frac{\mathrm{\ΔA}}{\min }$ 公式1 

式中：V为反应体系体积(ml)、v为样品量(ml)、ΔA为吸光度变化。 

实施例五  突变体蛋白结晶实验 

纯化后的突变体蛋白，经浓缩换液脱盐，浓缩至蛋白浓度约为12mg/ml，用坐滴汽相扩散法结晶蛋白，结晶使用的缓冲溶液为30％PEG2000 MME，0.1M Tris-Hcl，pH8.5。长出的晶体(图3)，用X-ray射线单晶衍射仪温度100K衍射，收集数据，分辨率达 P3₁空间群，单胞参数为： 

α＝β＝90°，γ＝120°。 

Claims (7)

1.人凝血因子XI催化结构域突变体的表达方法，其特征在于：本突变体在巴斯德毕氏酵母体系中表达，并且包含如下步骤：

(1)以肝库为模板，用PCR法从肝库扩增出FXI催化结构域，正向引物S(5‘-3’)：CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC；反向引物AS(5‘-3’)：ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA，引物分别含Xho I和Sal I位点(用下划线标注)，用Xho I和Sal I双酶切FXI催化结构域片段和载体pPICZ_αA；将处理好的片段和载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；采用重叠延伸PCR的方法对FXI催化结构域基因的432和473位点进行定点突变，第一轮PCR：以构建好含有FXI催化结构域基因的质粒为模板，分别用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC  和反向引物P1 AS：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行第一轮PCR，PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收纯化；第二轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P2 S：GGCATTTTACAACAATCTGAAATA和反向引物P2 AS：GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT进行扩增，并回收目的DNA片段；第三轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P3 S：AAACCACAGTGCAATACACAGATTC  和反向引物P1 AS  ：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行扩增，并回收目的DNA片段；第四轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二轮PCR的产物为反向引物进行扩增，并回收目的DNA片段；第五轮PCR：以第三轮和第四轮PCR回收得到的2个DNA片段为模板，用带有Xho I和Sal I的正反引物，扩增出一条完整的带有突变位点的FXI催化结构域基因，克隆至pPICZ_αA载体，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；以构建好的pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q)质粒为模板，通过定点突变C482S，正向引物：AACGACCCATATCTCTGCCTTCC，反向引物：GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT构建重组质粒pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)，克隆测序；

(2)目的基因的克隆与表达：酶切去磷酸化的PCR回收产物连接到表达载体pPICZαA上，重组质粒转入大肠杆菌进行扩增，抽提质粒，测序；测序正确后，大量抽提重组质粒，重组质粒经Sac I酶切后，电转入新制的感受态细胞X-33，重组的转化子在甲醇的诱导下表达的蛋白分泌在培养液中，SDS-PAGE电泳检测培养液中含有与目的蛋白相同分子量的条带。

2.一种由权利要求1所述的方法表达的人凝血因子XI催化结构域突变体。

3.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的纯化方法，其特征在于：甲醇诱导后的培养基首先用阳离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱分离纯化，可获得纯度达98％以上蛋白。

4.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的活性测定方法，采用S-2366发色底物检测活性，其特征在于：5nM蛋白在20mM Tris pH7.4，150mM Nacl，1％BSA反应条件下与不同浓度的S2366反应，37℃反应持续10分钟，每30秒测其A₄₀₅吸收值，并通过以下公式计算酶比活力：

式中：V为反应体系体积(ml)、v为样品量(ml)、ΔA为吸光度变化。

5.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的晶体的培养方法，为坐滴水蒸气扩散法，其特征在于：缓冲溶液为30％PEG2000MME，0.1M Tris-Hcl，pH8.5。

6.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的晶体，其特征在于：该晶体空间群为P3₁，单胞参数为：

α＝β＝90°，γ＝120°。

7.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体在药物设计颖抗凝血剂中的应用。

Images