CN115572329B - 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 - Google Patents

一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 Download PDF

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Abstract

利用蛋白质工程原理和方法，在蛋白质相互作用分析以及药理学实验基础上，本专利制备了具有较高抗凝血活性的菲牛蛭基因突变水蛭素HM2‑E60D‑I62D。以HM2‑E60D‑I62D为模板，在分析血液蛋白酶的酶切位点以及人工定向进化随机突变基础上，制备血浆代谢速度较缓慢的HM2‑E60D‑I62D突变蛋白：HM2‑E60D‑I62D‑K26H、HM2‑E60D‑I62D‑L30I、HM2‑E60D‑I62D‑K47H、HM2‑E60D‑I62D‑S48T、HM2‑E60D‑I62D‑K26H‑L30I‑K47H‑S48T和HM2‑E60D‑I62D‑T43S。本发明专利说明书详细介绍了以上菲牛蛭基因突变水蛭素以及它们的制备方法和药理学作用。

Description

一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备 方法
技术领域
本发明属于蛋白质工程制药领域，具体涉及一组一级结构经过改造的基因重组菲牛蛭水蛭素，及其制备和分离纯化方法。
背景技术
菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)水蛭素(HM2)是水蛭素(Hirudin)的一种，是由吸血水蛭菲牛蛭的唾液腺分泌的具有抗凝血活性的多肽类物质。HM2是由64个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子质量为6.8kD。在凝血途经中，水蛭素以凝血级联反应中的核心酶——凝血酶(Thrombin)作为靶标,与α-凝血酶按化学计量1:1的形式形成稳定的非共价复合物，从而阻断凝血酶催化纤维蛋白原形成不溶性纤维蛋白的能力。水蛭素—凝血酶复合物的晶体结构分析表明，水蛭素的球形N-末端结构与凝血酶的疏水性活性中心结合，富含酸性氨基酸的C-末端尾巴与凝血酶的“外部位点I”(ExositeⅠ)结合。“外部位点I”是凝血酶与纤维蛋白原的结合部位。水蛭素与凝血酶的结合方式为两相动态结合，C末端封闭凝血酶“外部位点I”，使凝血酶的构型发生细微变化，并促进N末端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性。多种动物模型和临床药理研究表明，水蛭素能够有效地预防和治疗血栓性疾病，特别是对于凝血酶在发病机制中起关键作用的疾病。
水蛭素主要从吸血水蛭的唾液中提取，近年来，也有研究者利用微生物表达基因重组水蛭素，但微生物表达水蛭素的C末端氨基酸残基不发生硫酸化，缺少与“外部位点I”相互作用的带有负电荷的基团，因此抗凝血活性低于野生型水蛭素。为了解决这一问题，我们利用基因工程技术将C末端的多个氨基酸残基突变为天冬氨基酸，以增加水蛭素C末端所带的负电荷，获得较高抗凝血活性的基因重组菲牛蛭水蛭素。在此突变型菲牛蛭水蛭素基础上，进一步构建表达多种基因突变水蛭素，以延缓HM2血浆代谢速度，本专利包括已经过筛选的活性强于野生型菲牛蛭水蛭素并且血液稳定性较高的菲牛蛭水蛭素突变体。
发明内容
1.发明的目的
利用大肠杆菌工程菌种表达并纯化出一组基因重组氨基酸突变蛋白，具有较强抗凝血活性并且血浆代谢较慢的菲牛蛭水蛭素突变体，及其制备方法。
2.发明的技术方案
一、用于提高抗凝血活性的重组菲牛蛭水蛭素HM2突变体的设计
氨基酸序列比对：从Uniprot中获取菲牛蛭水蛭素(HM2，核苷酸或氨基酸序列表中第1条序列)和日本医蛭水蛭素(HV1)的氨基酸序列，利用ClustalX2软件对HM2和HV1的氨基酸进行序列比对，HM2的C末端的关键氨基酸为第61位氨基酸为天冬氨酸(图1)。
突变体的设计：我们设计了多种用于提高水蛭素抗凝血活性的突变体，并进行筛选，本专利设计所描述的是经过筛选的HM2的突变体HM2-D61A,HM2-E60D-I62D。
二、用于提高抗凝血活性的重组水蛭素HM2及其突变体的表达质粒构建
模板的准备：从NCBI获得HM2的CDS序列。根据原核表达系统中密码子的偏好性，进行碱基序列优化(核苷酸或氨基酸序列表中第2条序列)，并合成。
序列的准备：设计PCR引物，利用上游引物引入His亲和纯化标签，利用下游引物序列引入氨基酸突变位点的碱基序列。
PCR扩增：将HM2的第61位天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)(核苷酸或氨基酸序列表中第3、4条序列)，将第60位谷氨酸(E)和第62位异亮氨酸(I)同时突变为天冬氨酸(D)(核苷酸或氨基酸序列表中第5、6条序列)，扩增得到两端带有限制性内切酶位点(NdeI和HindIII)的cDNA片段，分别为NdeI-HisTag-HM2-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-E60D-I62D-HindIII。
限制性内切酶酶切：双酶切DNA片段NdeI-HisTag-HM2-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-E60D-I62D-HindIII，和载体pET21a(+)，产生粘性末端。
T4连接酶连接：用T4连接酶分别将切出粘性末端的NdeI-HisTag-HM2-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-E60D-I62D-HindIII与切开的表达载体pET21a(+)连接，构建带有His亲和纯化标签的HM2 pET21a(+)、HM2-D61A pET21a(+)、HM2-E60D-I62D pET21a(+)原核表达重组质粒。
重组质粒的鉴定：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，阳性克隆子进行双酶切鉴定和DNA测序。
三、用于提高抗凝血活性的菲牛蛭基因突变重组水蛭素的原核表达
将构建成功的重组质粒通过热激法转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白小量表达；筛选高表达菌株，进行大量表达。
利用超声法破碎表达HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D的菌体，考马斯亮蓝染色法确定目标蛋白表达情况。
利用镍离子亲和层析方法，采用梯度浓度洗脱的方式分离、纯化带有His标签的HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D蛋白。透析后，4℃抽真空冻干，低温保存。
利用BCA法定量样品蛋白浓度。定量后的蛋白样品经SDS-PAGE分离(Bis-Tris胶)，考马斯亮蓝染色法检测纯化蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D纯度，Western blot鉴定纯化后的蛋白样品HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D。
【注】为避免名称冗长，尤其是后文在HM2-E60D-I62D基础上构建的多种突变蛋白，下文以HM2Δ60/62代表HM2-E60D-I62D。
四、菲牛蛭基因突变重组水蛭素的体外抗凝血活性分析
通过测定重组水蛭素对人α-凝血酶的竞争性抑制常数Ki，分析水蛭素对凝血酶的结合能力。采用发色底物法，酶促反应动态测定Ki。其中发色底物为凝血酶特异性发色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)。
采用发色底物法，通过测定重组水蛭素对人α-凝血酶的半抑制常数IC50，分析重组水蛭素的体外抗凝血活性，凝血酶特异性底物为S-2238。
将重组水蛭素在体外与健康人血浆孵育，通过测定血浆凝血指标，包括测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)，进一步分析重组水蛭素的体外抗凝血活性。实验结果表明，HM2Δ60/62的体外抗凝作用强于野生型HM2(图10-13)。
五、菲牛蛭基因突变重组水蛭素的体内抗凝血活性分析
通过γ-角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型，分析重组水蛭素的体内抗血栓和抗凝血活性。昆明小鼠皮下注射重组水蛭素5天，第3天给药后腹腔注射γ-角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成，连续给药5天后检测血栓小鼠凝血指标APTT、PT和TT，评价重组水蛭素的抗血栓和抗凝血效果。实验结果表明，HM2Δ60/62在血栓模型小鼠体内的抗凝作用强于野生型HM2(图14)。
六、血液中存在多种蛋白酶可以将部分水蛭素降解，降解速度和肾脏排泄速度影响水蛭素在血浆中的浓度。我们分析了重组水蛭素HM2Δ60/62蛋白在人血液中的酶切位点(不包括HM2Δ60/62蛋白的N端前3位氨基酸和C末端第51-64位氨基酸)(表2)，并以分析结果为基础，引入人工定向进化随机突变策略，设计表达多种HM2Δ60/62突变体，本专利包括其中效果较为显著的HM2Δ60/62突变蛋白K26H、L30I、K47H、S48T、K26H-L30I-K47H-S48T和T43S。
七、用于延缓HM2Δ60/62代谢的基因重组质粒的构建
以下以突变蛋白HM2Δ60/62-K26H为例，其它五种突变蛋白同法构建。
碱基序列的准备：以HM2Δ60/62的碱基序列为模板，设计大肠杆菌偏好的氨基酸突变蛋白的碱基序列。HM2Δ60/62-K26H蛋白的cDNA架构：NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-K26H-HindIII，并在序列两端添加酶切位点保护碱基。
限制性内切酶酶切：双酶切重组质粒K26H pUC57和表达载体pET21a(+)，得到具有粘性末端的DNA片段NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-K26H-HindIII和载体pET21a(+)。
T4连接酶连接：用T4连接酶分别将切出粘性末端的NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-K26H-HindIII和载体pET21a(+)连接，构建HisTag-HM2Δ60/62-K26H pET21a(+)原核表达重组质粒。
重组质粒的鉴定：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，阳性克隆子经双酶切鉴定和DNA测序。
采用同样的方法构建带有His标签的以下突变型HM2Δ60/62：HM2Δ60/62-L30IpET21a(+)、HM2Δ60/62-K47H pET21a(+)、HM2Δ60/62-S48T pET21a(+)、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T pET21a(+)和HM2Δ60/62-T43S pET21a(+)原核表达重组质粒。表达的各种HM2Δ60/62突变蛋白与核苷酸或氨基酸序列表中的序列对应关系如下：HM2Δ60/62-K26H对应第7、8条序列；HM2Δ60/62-L30I对应第9、10条序列；HM2Δ60/62-K47H对应第11、12条序列；HM2Δ60/62-S48T对应第13、14条序列；HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T对应第15、16条序列；HM2Δ60/62-T43S对应第17、18条序列。
八、用于延缓HM2Δ60/62代谢的突变蛋白的原核表达
将上述构建成功的重组质粒通过热激法转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，加入IPTG诱导目的蛋白小量表达；筛选高表达菌株，进行大量表达。
利用超声法破碎表达菌体，通过考马斯亮蓝染色法确定目的蛋白表达情况。利用镍离子亲和层析方法，采用梯度浓度洗脱的方式分离、纯化蛋白HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T和HM2Δ60/62-T43S等HM2Δ60/62突变蛋白。透析后，4℃抽真空冻干，低温保存。
利用BCA法定量样品蛋白浓度。定量后的蛋白样品经SDS-PAGE分离(Bis-Tris胶)，考马斯亮蓝染色法来检测HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T和HM2Δ60/62-T43S等HM2Δ60/62突变蛋白，Western blot定性鉴定纯化后的蛋白。
九、各种HM2Δ60/62突变蛋白的抗凝血酶活性分析
在上述基因突变水蛭素的体内抗凝血活性分析实验中已经确定，HM2Δ60/62体外IC50浓度约为4.3nM(图12)。在本部分实验中，利用凝血酶特异性发色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)，测定终浓度为4.5nM的HM2、HM2Δ60/62、HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T和HM2Δ60/62-T43S对凝血酶活性的抑制作用。实验结果表明，各种HM2Δ60/62突变蛋白对凝血酶的抑制程度之间没有显著性差别，并且作用强于基因重组HM2(图24)。
十、各种HM2Δ60/62突变蛋白静脉给药后30分钟血浆浓度分析
新西兰白兔耳静脉注射50μg/kg的HM2、HM2Δ60/62、HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T和HM2Δ60/62-T43S，30分钟后采血，利用ELISA法测定血浆中以上各种水蛭素的浓度。实验结果表明，上述HM2Δ60/62突变体蛋白在血浆中的代谢速度相对较慢(图25)。
3.发明的有益效果
本发明可以获得一组具有较高抗凝血活性并且血浆代谢较缓慢的基因重组菲牛蛭水蛭素突变蛋白，优于野生型或基因重组菲牛蛭水蛭素，具有生产周期短、成本低等优点。
附图说明
图1.日本医蛭水蛭素HV1、菲牛蛭水蛭素HM2以及在本专利中制备的菲牛蛭基因突变重组水蛭素的氨基酸序列比对。A：氨基酸保守性用深浅不同的灰色显示。B：氨基酸的化学性质用深浅不同的灰色表示(注：原图为彩色)。HM2Δ60/62：HM2-E60D-I62D。
图2.HisTag-HM2 pET21a(+)重组表达质粒图谱。
图3.HisTag-HM2-D61A pET21a(+)重组表达质粒图谱。
图4.HisTag-HM2-E60D-I62D pET21a(+)重组表达质粒图谱。
表1.普通PCR引物序列。酶切位点NdeI(AAGCTT)和HindIII(CATATG)用实体、下划线标示。
图5.HisTag-HM2 pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图6.HisTag-HM2-D61A pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图7.HisTag-HM2-E60D-I62D pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图8.重组表达质粒HisTag-HM2 pET21a(+)、HisTag-HM2-D61A pET21a(+)、HisTag-HM2-E60D-I62D pET21a(+)表达产物及产物经镍亲和纯化后的考马斯亮蓝染色图。图A-C依次对应以上三种重组质粒的结果。重组表达质粒在BL21(DE3)工程菌中表达后，经超声破碎，离心后的上清液用镍柱纯化后，经SDS-PAGE(Bis-tris)分离，考马斯亮蓝R-250原位染色。其中，M为预染蛋白Marker(ThermoFisher，26616或26610)；泳道1为未诱导菌体表达产物；泳道2为诱导菌体表达产物；泳道3为诱导菌体超声破碎后上清溶液；泳道4为诱导菌体超声破碎后沉淀；泳道5为上清液经镍亲和纯化后HM2蛋白或HM2-D61A蛋白或HM2Δ60/62蛋白。箭头指示目的条带。
图9.纯化后蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D的Western blot检测结果图。HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D蛋白用SDS-PAGE(Bis-tris胶)分离后，转印到低荧光背景NC膜检测，一抗为抗6x HisTag鼠抗单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 488，最后用Typhoon FLA 9500(GE Healthcare)检测荧光条带。其中，M为预染蛋白Marker(ThermoFisher，26616)；泳道1-3分别为纯化蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D。箭头指示目的条带。
图10.重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D对人α-凝血酶表观Km的测定结果。结果表明：与野生型(WT)水蛭素比较，HM2-D61A对凝血酶的亲和力降低，而HM2-E60D-I62D对凝血酶的亲和力提高。Con：空白对照，WT：野生型菲牛蛭水蛭素，HM2：基因重组菲牛蛭水蛭素，HM2-D61A：61位天冬氨酸突变为丙氨酸的基因重组HM2菲牛蛭水蛭素，HM2-E60D-I62D：60位谷氨酸与62位异亮氨酸突变为天冬氨酸的基因重组HM2菲牛蛭水蛭素。
图11.重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D对人α-凝血酶竞争性抑制常数Ki的测定结果。其中，图A-D分别对应野生型(WT)菲牛蛭水蛭素、基因重组HM2菲牛蛭水蛭素(HM2)、61位天冬氨酸突变为丙氨酸的基因重组HM2菲牛蛭水蛭素(HM2-D61A)、60位谷氨酸与62位异亮氨酸突变为天冬氨酸的基因重组HM2菲牛蛭水蛭素(HM2-E60D-I62D)。结果显示，HM2-D61A的Ki值是HM2的5倍，HM2-E60D-I62D的Ki值低于WT。
图12.重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62半抑制常数IC50的测定结果。WT：野生型菲牛蛭水蛭素。结果表明，与野生型比较，HM2-D61A抑制凝血酶活性的能力降低；HM2-E60D-I62D对凝血酶活性的抑制能力高于野生型菲牛蛭水蛭素。Activity：活性，Concentration：浓度。
图13.重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D对人血浆凝血指标APTT、PT和TT影响。图A、B、C分别对应凝血指标APTT、PT、TT测定结果。柱形图数据为平均值±SD，*P<0.05或**P<0.01，与野生型水蛭素(WT)比较；#P<0.05或##P<0.01,与未突变重组蛋白(HM2)比较；n＝4。结果均显示，与野生型WT组和未突变HM2组比较，HM2-D61A组的凝血指标显著降低；HM2-E60D-I62D组的凝血指标显著高于WT组。
图14.重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2-E60D-I62D对血栓模型小鼠凝血指标APTT、PT和TT的影响。图A、B、C分别对应凝血指标APTT、PT、TT测定结果。柱形图数据为平均值±SD，*P<0.05或**P<0.01，与野生型菲牛蛭水蛭素(WT)比较，#P<0.05或##P<0.01，与基因重组菲牛蛭水蛭素(HM2)比较，n＝12。结果表明，与WT或HM2组比较，HM2-D61A在小鼠体内的抗凝血活性显著降低，而HM2-E60D-I62D在小鼠体内具有更高的抗凝血活性。
表2.HM2-E60D-I62D蛋白的血液蛋白酶切割位点分析结果。黑色竖线代表可能存在的酶切位点。
图15.HisTag-K26H pET21a(+)重组表达质粒图谱。红色弧线显示重组质粒的开放阅读框及转录方向。
图16.HisTag-HM2-E60D-I62D-K26H pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图17.HisTag-HM2-E60D-I62D-L30I pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图18.HisTag-HM2-E60D-I62D-K47H pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图19.HisTag-HM2-E60D-I62D-S48T pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图20.HisTag-HM2-E60D-I62D-K26H-L30I-K47H-S48T pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图21.HisTag-HM2-E60D-I62D-T43S pET21a(+)重组质粒测序结果峰图。测序峰图展示的是从目的基因序列的起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图22.K26H、L30I、K47H、S48T、K26H-L30I-K47H-S48T和T43S等HisTag-HM2-E60D-I62D pET21a(+)突变重组质粒表达产物及产物纯化后的考马斯亮蓝染色图。其中，图A、B、C、D、E、F分别为重组质粒HisTag-HM2-E60D-I62D-K26H pET21a(+)、HisTag-HM2-E60D-I62D-L30I pET21a(+)、HisTag-HM2-E60D-I62D-K47H pET21a(+)、HisTag-HM2-E60D-I62D-S48T pET21a(+)和HisTag-HM2-E60D-I62D-K26H-L30I-K47H-S48T pET21a(+)和HisTag-HM2-E60D-I62D-T43S pET21a(+)表达产物及产物纯化后的考马斯亮蓝染色图。A、B、F中，泳道1为未诱导菌体表达产物；泳道2为诱导菌体表达产物；泳道3为诱导菌体表达产物上清液；泳道4为诱导菌体表达产物沉淀；泳道5为上清液经镍柱纯化后组分。C、D、E中，泳道1为未诱导菌体表达产物；泳道2为诱导菌体表达产物；泳道3为诱导菌体表达产物上清液；泳道4为上清液经镍柱纯化后组分。M为预染蛋白Marker(ThermoFisher，26616)。
图23.纯化后的K26H、L30I、K47H、S48T、K26H-L30I-K47H-S48T和T43S等HM2-E60D-I62D突变蛋白的Western blot检测结果图。M：预染蛋白分子量标记(ThermoFisher，26616)；泳道1：纯化HM2-E60D-I62D-K26H蛋白；泳道2：纯化HM2-E60D-I62D-L30I蛋白；泳道：纯化HM2-E60D-I62D-K47H蛋白；泳道4：纯化HM2-E60D-I62D-S48T蛋白；泳道5：纯化HM2-E60D-I62D-K26H-L30I-K47H-S48T蛋白；泳道6：纯化HM2-E60D-I62D-T43S蛋白。
图24.各种HM2-E60D-I62D突变蛋白的对凝血酶的抑制作用。HM2Δ60/62：HM2-E60D-I62D。柱形图数据为平均值±SE，**P<0.01，与HM2组比较，n＝6。
图25.各种HM2-E60D-I62D突变蛋白静脉注射30分钟后的血浆浓度。HM2Δ60/62：HM2-E60D-I62D。柱形图数据为平均值±SE，*P<0.05或**P<0.01，与HM2组比较，n＝4。
具体实施方案
具体实施方式一：本实施方式是原核表达并分离纯化重组菲牛蛭水蛭素蛋白HM2、HM2-D61A和HM2Δ60/62，按以下步骤进行：
一、提高抗凝活性的重组水蛭素HM2及其突变体的表达质粒构建
根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计HM2的CDS序列，以适于在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中高效表达。设计PCR引物引入氨基酸突变位点，并以NdeI和HindIII作为重组蛋白CDS序列的上下游两端的酶切位点，构建带有His标签的原核表达序列NdeI-HisTag-HM2HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-HindIII。具体步骤如下：
引物设计：设计扩增HisTag-HM2的上游引物F：NdeI-HisTag-HM2-F(核苷酸或氨基酸序列表中第19条序列)，下游引物R：HM2-HindIII-R(核苷酸或氨基酸序列表中第20条序列)；设计扩增HisTag-HM2-D61A的上游引物F：NdeI-HisTag-HM2-F,下游引物R：D61A-HindIII-R(核苷酸或氨基酸序列表中第21条序列)；设计扩增HisTag-HM2Δ60/62的上游引物F：NdeI-HisTag-HM2-F，下游引物R：E60D-I62D-HindIII-R(核苷酸或氨基酸序列表中第22条序列)(表1)。
目的基因扩增：用普通PCR法，以人工合成的HM2序列为模板，用引物F和R分别扩增出目的条带NdeI-HisTag-HM2-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-HindIII。
限制性内切酶双酶切：用NdeI和HindIII分别双酶切片段
NdeI-HisTag-HM2-HindIII、NdeI-HisTag-HM2-D61A-HindIII、NdeI-HisTag-HM2Δ60/62-HindIII和空载体pET21a(+)。
T4 DNA连接酶连接：用T4 DNA连接酶分别连接目的片段和载体，构建表达质粒HisTag-HM2 pET21a(+)、HisTag-HM2-D61A pET21a(+)、HisTag-HM2Δ60/62pET21a(+)(图2～4)。
重组质粒鉴定：将构建好的重组质粒转入大肠杆菌，扩增后提取质粒，测序结果正确(图5～7)。
二、提高抗凝活性的重组水蛭素蛋白的原核表达，具体步骤如下：
诱导表达：42℃，45s将表达质粒HisTag-HM2 pET21a(+)、HisTag-HM2-D61ApET21a(+)、HisTag-HM2Δ60/62pET21a(+)转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，37℃恢复菌体1小时，取50μL涂布于含有氨苄抗生素的LB固体培养板，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至10ml含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振摇12h，将菌液按1:50转接培养至OD600nm＝0.6，然后加入终浓度为1.0mM的IPTG于180rpm，25℃诱导表达9h。
亲和纯化：将上述表达菌体收集在离心管中，以6,000rpm，在4℃条件下，离心15min，弃掉上清。加入非变性裂解液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)柔和洗涤菌体，12,000rpm，4℃离心15min，收集沉淀，洗涤3次，每次15min。每克湿重加入8mL非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400W，破碎3s,停5s共破碎200次。12,000rpm，4℃离心20min，收集上清，利用镍柱进行重组水蛭素蛋白的纯化。具体步骤如下：
平衡：用5倍柱体积的10mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑)平衡镍柱。上样：将超声破碎离心后的上清液加到镍柱里，重复3次。漂洗：依次利用3倍柱体积的30mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、30mM咪唑)和3倍柱体积的50mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、50mM咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白。洗脱：利用250mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱组分，每1mL洗脱目的蛋白的流出液储存在一个EP管内。
蛋白鉴定：用BCA法测定样品蛋白浓度。经SDS-PAGE(Bis-Tris胶)分离定量后的样品蛋白，考马斯亮蓝染色分析蛋白纯化效果(图8)，Western blot鉴定纯化蛋白的分子质量。其中，Western blot采用湿法转印将目的蛋白转印(条件：200mA,100V,30min)到硝酸纤维素(NC)膜，一抗为抗HisTag鼠抗单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa488)，最后用Typhoon FLA 9500(GE Healthcare)检测荧光条带(图9)。
三、提高抗凝活性的重组水蛭素蛋白HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62体内外药理学实验，分为体外抗凝血活性测定和体内抗凝血活性分析两部分。
四、重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62体外抗凝血活性的测定，包括重组蛋白与人凝血酶竞争性抑制常数Ki的测定、半抑制常数IC50的测定、人血浆凝血指标APTT、PT和TT的测定。具体步骤如下：
Ki和IC50测定的方法是发色底物法，凝血酶特异性底物为S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)。具体步骤是：设置对照孔和样本孔，对照孔加入样本稀释液40μL或样本稀释液20μL与人α-凝血酶20μL，待测样本孔加入待测样本20μL和人α-凝血酶20μL。用锡箔纸封住反应孔，室温孵育10min。随后，用排枪加入发色底物S-2238160μL并小心混匀，立即使用酶标仪测定10min内每10s间隔动态检测405nm波长处各孔的吸光度值，根据反应为一级反应时的吸光值变化计算表观Km值(图10)、竞争性抑制常数Ki值(图11)和半抑制常数IC50值(图12)。
人血浆凝血参数测定的具体方法：将新鲜冰冻的人血浆(海南省人民医院血液科)在37℃水浴锅中迅速融化，在室温条件下分别将重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62 5μg/ml与融化后血浆孵育10min，野生型水蛭素(WT)作为阳性对照组、生理盐水(NS)作为空白对照组，使用全自动血凝仪(CA-6500，Sysmex)测定凝血指标活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)(图13)。
五、重组蛋白HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62体内抗凝血活性的分析。具体步骤如下：
选择4周龄、体重为20g的雄性昆明小鼠(辽宁省长生生物技术股份有限公司)，分组为5组，分别是生理盐水(NS)空白对照组、野生型菲牛蛭水蛭素阳性对照组(WT)和三个实验组：HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62。给药组小鼠分别皮下注射WT、HM2、HM2-D61A、HM2Δ60/62，药物浓度为1mg/kg，空白对照组注射等体积生理盐水，连续注射5天。在注射第三天的30min后，各组小鼠按照100mg/kg剂量腹腔注射1％γ-角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成。在第五天给药30min后，摘眼球采血，分离血浆，用血凝仪(CA-6500，Sysmex)检测所收集的血浆样本的凝血指标APTT、PT和TT(图14A，B，C)。
六、以上体内外药理学实验结果表明，HM2Δ60/62是具有较强抗凝血活性的菲牛蛭基因突变重组水蛭素。
具体实施方式二：为了保证实施方式一中的重组蛋白HM2Δ60/62在人血液中有较高的稳定性，本实施方式分析了重组水蛭素蛋白HM2Δ60/62在人血液中的酶切位点(表2)。序列分析不包括HM2Δ60/62的N端前3位氨基酸和C末端第51-64位氨基酸。再分析结果基础上，还引入了人工定向进化随机突变策略，设计多种HM2Δ60/62突变体用于分析其血液代谢速度，以及对凝血酶的抑制作用。
七、提高HM2Δ60/62血液稳定性的基因重组质粒的构建
构建多种在血液中不易被代谢的HM2Δ60/62的氨基酸突变蛋白，本专利包括K26H、L30I、K47H、S48T、K26H-L30I-K47H-S48T和T43S。同样采用pET21a(+)为原核表达载体，进行重组表达质粒的构建。以构建K26H蛋白的重组表达质粒为例(其它五种突变蛋白同法)，步骤如下：
碱基序列的准备：以HM2Δ60/62的碱基序列为模板，设计大肠杆菌偏好的氨基酸突变蛋白的碱基序列，在序列的N末端依次添加保护碱基、酶切位点NdeI和组氨酸标签(HisTag)和酶切位点NdeI，在序列的C末端添加酶切位点HindIII和保护碱基。完整的碱基序列交由上海生工进行全基因合成。
限制性内切酶酶切：用NdeI、HindIII双酶切重组质粒K26H pUC57和表达载体pET21a(+)，得到具有粘性末端的DNA片段NdeI-HisTag-K26H-HindIII和切开的pET21a(+)载体
T4连接酶连接：用T4连接酶分别将切出粘性末端的NdeI-HisTag-K26H-HindIII和载体pET21a(+)连接，构建HisTag-K26H pET21a(+)原核表达重组质粒(图15)。
重组表达质粒的鉴定：将重组质粒通过热激法(42℃，45s)转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂布带有氨苄抗性的LB固体平板培养，扩增后，提质粒测序，结果如图16-21。
八、氨基酸突变蛋白的原核表达，具体步骤如下：
诱导表达：42℃，45s将表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，37℃恢复菌体1小时，取50μL涂布于含有氨苄抗生素的LB固体培养板，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至10mL有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振摇12h，将菌液按1:50转接培养至OD600＝0.6，然后加入终浓度为1.0mM的IPTG于180rpm，25℃诱导表达9h。
亲和纯化：将上述表达菌体收集在离心管中，以6,000rpm，在4℃条件下，离心15min，弃掉上清。加入非变性裂解液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)柔和洗涤菌体，12,000rpm，4℃离心15min收集沉淀，洗涤3次，每次15min。每克湿重加入8mL非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400W，破碎3s，停5s共破碎200次。12,000rpm，4℃离心20min，收集上清，利用镍亲和层析进行重组水蛭素蛋白的纯化。具体步骤如下：
平衡：用5倍柱体积的10mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑)平衡镍柱。上样：将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，重复3次。漂洗：依次利用3倍柱体积的30mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、30mM咪唑)和3倍柱体积的50mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、50mM咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白。洗脱：利用250mM咪唑缓冲液(50mMNaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱组分，每1mL洗脱目的蛋白的流出液储存在一个EP管内。
蛋白质鉴定：用BCA法测定样品蛋白浓度。经SDS-PAGE(Bis-Tris胶)分离定量后的样品蛋白，考马斯亮蓝染色分析蛋白纯化效果(图22)，Western blot鉴定纯化蛋白(图23)。其中，Western blot采用湿法转印将目的蛋白转印(条件：200mA,100V,30min)到硝酸纤维素膜，一抗为抗6xHisTag鼠抗单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa488)，最后用Typhoon FLA 9500(GE Healthcare)检测荧光条带。
九、各种HM2Δ60/62突变蛋白的抑制凝血酶作用分析，具体步骤如下：
在前述基因突变水蛭素的体内抗凝血活性分析实验中已经确定，HM2Δ60/62体外IC50浓度约为4.3nM(图12)。在本部分实验中，利用凝血酶特异性发色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)，测定终浓度为4.5nM的HM2、HM2Δ60/62、HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T和HM2Δ60/62-T43S对凝血酶活性的抑制作用。具体步骤如下：将20μL各种HM2Δ60/62突变蛋白(终浓度4.5nM)分别与20μLα-凝血酶室温孵育10min，加入160μL凝血酶特异性底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)溶液反应10min后，在405nm测定对硝基苯胺水平，结果表明，以上各种HM2Δ60/62突变蛋白抑制凝血酶的作用之间没有显著性差异，并且与HM2相比，抑制凝血酶的活性更强(图24)。
十、各种HM2Δ60/62突变蛋白的代谢稳定性分析，具体步骤如下：
雄性新西兰白兔，体重约2.4kg，随机分为7组，每组4只。耳静脉注射50μg/kg下列各种水蛭素：HM2、HM2Δ60/62、HM2Δ60/62-K26H、HM2Δ60/62-L30I、HM2Δ60/62-K47H、HM2Δ60/62-S48T、HM2Δ60/62-K26H-L30I-K47H-S48T以及HM2Δ60/62-T43S。药物注射30分钟后，耳缘静脉采血，以3.8％枸橼酸钠(9:1)抗凝，3000rpm离心10分钟后，收集血浆，用多克隆抗体ELISA法检测血浆中各种水蛭素浓度，结果表明，以上各种HM2Δ60/62突变蛋白的血浆清除速率低于HM2和HM2Δ60/62，较为缓慢(图25)。
序列表
<110> 王大勇
<120> 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法
<130> 20210618
<141> 2021-06-18
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)
<400> 14
gtttcttaca ccgactgcac cgaatctggt cagaactact gcctgtgcgt tggttctaac 60
gtttgcggtg aaggtaaaaa ctgccagctg tcttcttctg gtaaccagtg cgttcacggt 120
gaaggtaccc cgaaaccgaa aacccagacc gaaggtgact tcgaagaaat cccggacgac 180
gacgacctga ac 192
<210> 15
<211> 64
<212> PRT
<213> 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)
<400> 15
Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly His Asn Cys Gln Ile Ser Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro His Thr
35 40 45
Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Asn
50 55 60
<210> 16
<211> 192
<212> DNA
<213> 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)
<400> 16
gtttcttaca ccgactgcac cgaatctggt cagaactact gcctgtgcgt tggttctaac 60
gtttgcggtg aaggtcacaa ctgccagatc tcttcttctg gtaaccagtg cgttcacggt 120
gaaggtaccc cgaaaccgca cacccagacc gaaggtgact tcgaagaaat cccggacgac 180
gacgacctga ac 192
<210> 17
<211> 64
<212> PRT
<213> 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)
<400> 17
Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu Ser Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Ser Pro Lys Pro Lys Ser
35 40 45
Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Asn
50 55 60
<210> 18
<211> 192
<212> DNA
<213> 菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)
<400> 18
gtttcttaca ccgactgcac cgaatctggt cagaactact gcctgtgcgt tggttctaac 60
gtttgcggtg aaggtaaaaa ctgccagctg tcttcttctg gtaaccagtg cgttcacggt 120
gaaggttctc cgaaaccgaa atctcagacc gaaggtgact tcgaagaaat cccggacgac 180
gacgacctga ac 192
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
attccatatg caccaccacc accaccacgt ttcttac 37
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccaagcttt tattattagt tcaggatcgc ttcg 34
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccaagcttt tattattagt tcaggtcgtc gtcgtccg 38

Claims (3)

1.菲牛蛭水蛭素基因重组突变蛋白HM2-E60D-I62D，其特征在于，以氨基酸序列如SEQID NO：1所示的HM2为模板，通过将其第60位谷氨酸和第62位异亮氨酸同时突变为天冬氨酸制得。
2.基于权利要求1所述的菲牛蛭水蛭素基因重组突变蛋白HM2-E60D-I62D制备的基因重组突变蛋白，其特征在于，以HM2-E60D-I62D氨基酸序列为模板，将其第26位氨基酸、第30位氨基酸、第43位氨基酸、第47位氨基酸、第48位氨基酸突变、或将第26位、第30位、第47位和第48位氨基酸同时突变，得到HM2-E60D-I62D突变蛋白：HM2-E60D-I62D-K26H、HM2-E60D-I62D-L30I、HM2-E60D-I62D-K47H、HM2-E60D-I62D-S48T、HM2-E60D-I62D-T43S或HM2-E60D-I62D-K26H-L30I-K47H-S48T。
3.一种如权利要求1或权利要求2所述的基因重组突变蛋白的体外表达方法，其特征在于，利用可诱导表达质粒在大肠杆菌中表达；
所述可诱导表达质粒为pET21a(+)；所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。
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Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991017250A1 (en) * 1990-05-10 1991-11-14 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Method for the recombinant production of hiridius and hirudin-like polypeptides
EP0511393A1 (en) * 1990-11-08 1992-11-04 Japan Energy Corporation Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism
CN1066272A (zh) * 1991-02-28 1992-11-18 法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司 抗凝血酶多肽的制备方法
US5166318A (en) * 1989-06-09 1992-11-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Polypeptide having thrombin inhibiting activity
WO1993000363A1 (en) * 1991-06-27 1993-01-07 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Anti-hirudin polyclonal antibodies and their use for the identification, immunopurification and quantitative determination of hirudin
WO1995003409A1 (en) * 1993-07-22 1995-02-02 Ministero Dell' Universita' E Della Ricerca Scientifica E Tecnologica Analogues of an anti-thrombin polypeptide and process for their preparation
US5472942A (en) * 1988-11-11 1995-12-05 Biopharm (Uk) Limited Anti-thrombins
US5919895A (en) * 1990-03-22 1999-07-06 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Secretion of hirudin derivatives
US5972648A (en) * 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients
CN1374970A (zh) * 1999-09-18 2002-10-16 阿文蒂斯药物德国有限公司 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu－水蛭素的信号序列
US6514730B1 (en) * 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
CN1536082A (zh) * 2003-04-07 2004-10-13 北京大学 水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株
WO2008071081A1 (zh) * 2006-12-15 2008-06-19 Institute Of Radiation Medicine, Academy Of Military Medical Sciences, Pla 低出血抗凝血融合蛋白的制备及其应用
CN102153646A (zh) * 2010-12-31 2011-08-17 中国药科大学 新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用
CN102574909A (zh) * 2009-05-05 2012-07-11 自然环境研究会 修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法
CN103059130A (zh) * 2012-12-22 2013-04-24 浙江工业大学 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌
CN103848914A (zh) * 2012-11-29 2014-06-11 河北以岭医药研究院有限公司 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
CN107098964A (zh) * 2017-05-19 2017-08-29 何向锋 一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途
CN109824772A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 海南大学 一组提高血清糖皮质激素水平的基因重组人促皮质素前体及制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1597279A1 (en) * 2003-02-27 2005-11-23 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants

Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5472942A (en) * 1988-11-11 1995-12-05 Biopharm (Uk) Limited Anti-thrombins
US5166318A (en) * 1989-06-09 1992-11-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Polypeptide having thrombin inhibiting activity
US5919895A (en) * 1990-03-22 1999-07-06 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Secretion of hirudin derivatives
WO1991017250A1 (en) * 1990-05-10 1991-11-14 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Method for the recombinant production of hiridius and hirudin-like polypeptides
EP0511393A1 (en) * 1990-11-08 1992-11-04 Japan Energy Corporation Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism
CN1066272A (zh) * 1991-02-28 1992-11-18 法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司 抗凝血酶多肽的制备方法
US5356875A (en) * 1991-02-28 1994-10-18 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Anti-thrombin polypeptides and pharmaceutical compositions thereof
US6514730B1 (en) * 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
WO1993000363A1 (en) * 1991-06-27 1993-01-07 Farmitalia Carlo Erba S.R.L. Anti-hirudin polyclonal antibodies and their use for the identification, immunopurification and quantitative determination of hirudin
WO1995003409A1 (en) * 1993-07-22 1995-02-02 Ministero Dell' Universita' E Della Ricerca Scientifica E Tecnologica Analogues of an anti-thrombin polypeptide and process for their preparation
US5972648A (en) * 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients
CN1374970A (zh) * 1999-09-18 2002-10-16 阿文蒂斯药物德国有限公司 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu－水蛭素的信号序列
CN1550502A (zh) * 1999-09-18 2004-12-01 ���ĵ�˹ҩ��¹����޹�˾ 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu-水蛭素的信号序列
CN1536082A (zh) * 2003-04-07 2004-10-13 北京大学 水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株
WO2008071081A1 (zh) * 2006-12-15 2008-06-19 Institute Of Radiation Medicine, Academy Of Military Medical Sciences, Pla 低出血抗凝血融合蛋白的制备及其应用
CN102574909A (zh) * 2009-05-05 2012-07-11 自然环境研究会 修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法
CN102153646A (zh) * 2010-12-31 2011-08-17 中国药科大学 新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用
CN103848914A (zh) * 2012-11-29 2014-06-11 河北以岭医药研究院有限公司 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
CN103059130A (zh) * 2012-12-22 2013-04-24 浙江工业大学 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌
CN107098964A (zh) * 2017-05-19 2017-08-29 何向锋 一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途
CN109824772A (zh) * 2019-02-28 2019-05-31 海南大学 一组提高血清糖皮质激素水平的基因重组人促皮质素前体及制备方法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A53883: hirudin HV1 homolog bufrudin - leech (Hirudinaria manillensis);GenBank;《GenBank》;标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分 *
AltName: Full=Bufrudin ; AltName: Full=Hirudin-HV1 ; Flags: Precursor.《GenBank》.2021,标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分. *
APA20848.1: hirudin variant HM4, partial [Hirudinaria manillensis];GenBank;《GenBank》;标题、PROTEIN、CDS、ORIGIN部分 *
GenBank.P81492.2: RecName: Full=Hirudin-HM2 *
NMR solution structure of a novel hirudin variant HM2, N-terminal 1-47 and N64-->V + G mutant;Giuseppe Nicastro等;《Biopolymers》;第41卷(第07期);第731-749页 *
Novel hirudin variants from the leech Hirudinaria manillensis. Amino acid sequence, cDNA cloning and genomic organization;Emanuela SCACHERI等;《European Journal of Biochemistry》;第214卷(第01期);第295-304页 *
The effects of overexpression of cytoplasmic chaperones on secretory production of hirudin-PA in E-coli;Nafiseh Alsadat Seyed Hosseini Fin等;《Protein Expression and Purification》;第157卷;第42-49页 *
分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌的构建;林陈水、陈微微;《浙江工业大学学报》;第42卷(第01期);第50-53页 *
广西菲牛蛭水蛭素基因cDNA的克隆与序列分析;黎渊弘;《中国生化药物杂志》;第32卷(第02期);第92-98页 *
水蛭抗凝血活性物质提取方法研究;杨思毅等;《山东化工》;第45卷(第05期);第42-44页 *
重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究;谭树华等;《中国生物工程杂志》;第23卷(第08期);第69-73页 *

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