CN102574909A - 修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法，所述性质包括抑制程度、丝氨酸蛋白酶抑制剂被靶丝氨酸蛋白酶切割之后抑制的维持、与丝氨酸蛋白酶的结合速度、中和以及结合亲和性。本发明还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法。本发明还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。
背景技术
丝氨酸蛋白酶，也称作丝氨酸内肽酶，是在活性位点包含丝氨酸残基的蛋白消化酶。这些酶在自然界是广泛的，并且在多种生物学功能、包括消化、血液凝固、免疫系统和炎症中发挥作用。
由于丝氨酸蛋白酶的广泛分布和功能，这些酶的抑制剂是常见的。在自然界可以发现很多蛋白性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且已经开发了用于研究和治疗的很多合成的、化学的丝氨酸蛋白酶抑制剂。
凝血酶是在血液凝固中发挥重要作用的丝氨酸蛋白酶家族的成员；通过该过程，响应于血管损伤，丝氨酸蛋白酶的循环酶原通过有限蛋白水解被依次激活以产生纤维蛋白凝块。凝血酶与多数酶原和它们的辅因子相互作用，在血液凝固中发挥多种促凝剂和抗凝剂作用(Huntington(2005)，和Di Cera(2003))。作为促凝剂蛋白酶，在起始期产生的最初的痕量凝血酶激活因子V(FV)和因子VIII(FVIII)以提供阳性回馈，引起凝血酶的爆发。凝血酶也可以激活因子XI，激发内在途径。凝血酶将纤维蛋白原切割为纤维蛋白，形成不可溶的凝块。通过凝血酶激活的因子XIII驱动的共价交联，纤维蛋白聚合物被进一步加固和稳定化。凝血酶还促成血小板栓的产生，可能是通过两个机制：(a)其通过与蛋白酶激活的受体(PAR)和糖蛋白V相互作用而激活血小板；和(b)通过灭活ADAMTS13，其防止血小板栓的脱稳定化，ADAMTS13是具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解离素和金属蛋白酶，其切割von Willebrand因子(VWF)。作为抗凝剂蛋白酶，凝血酶在存在辅因子血栓调节蛋白的情况下激活蛋白C(APC)。APC灭活因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)，下调凝血酶的产生(Huntington(2005)，Di Cera(2003)，Davie等人(1991)，Davie(2003)和Lane等人(2005))。
由于凝血酶的重要作用，其是抑制以控制凝结级联的主要靶标，很多凝血酶抑制剂已经被用于治疗和研究很多年了。肝素是原型的凝血酶抑制剂，其作为凝血酶的间接抑制剂发挥作用，意思是其通过抗凝血酶复合物作用，不与凝血酶的活性位点直接相互作用。凝血酶的间接抑制剂仅能与可溶性凝血酶相互作用，因此，一旦形成凝块，则不能抑制凝血酶。
更近期以来，已经分离和/或开发了多种凝血酶直接抑制剂，包括蛭素(hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和达比加群酯(dabigatran etexilate)。这些具有能够抑制可溶形式和与纤维蛋白结合的形式的凝血酶的治疗性优点。然而，此类直接抑制剂具有某些性质，远远达不到最佳。例如，蛭素引起出血风险、依赖于肾功能的药代动力学、缺乏解毒药、有免疫原性和反跳性高凝性。比伐卢定被蛋白水解和肾途径的组合清除，其具有可忽略的免疫原性潜能，但仍具有亚适治疗性质。
鉴于丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗上的重要性，需要鉴定显示出改进的性质的另外的丝氨酸蛋白酶抑制剂。特别地，需要鉴定这样的凝血酶直接抑制剂：具有抑制可溶形式和与纤维蛋白结合形式的凝血酶的能力但不具有与目前可获得的凝血酶直接抑制剂相关的缺点。
发明内容
本发明提供了修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂，产生修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，以及使用修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂例如抑制受试者中的靶丝氨酸蛋白酶的方法。
因此，在第一方面，本发明提供了产生显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，包括：修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。
在该方面的一个实施方式中，该方法包括：将能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基导入SPI。在另一个实施方式中，方法产生修饰的SPI，其显示出延长的抑制持续时间。在一个实施方式中，所述的一个或多个导入的氨基酸残基是通过置换或插入导入的。
在该方面的另一个实施方式中，所述的能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个残基包括催化性丝氨酸残基。
在该方面的另一个实施方式中，该方法进一步包括修饰SPI使其能被中和的步骤，包括：将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，将所述导入的离子电荷区域导向SPI的羧基末端。在另一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域是阴离子电荷区域。在一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。在另一个实施方式中，所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。在另一个实施方式中，所述中和试剂是硫酸精蛋白。
在前述方法的示例性实施方式中，SPI是凝血酶抑制剂。在另一个示例性实施方式中，SPI选自由SEQ ID NO：14和17-153中的任一项组成的组。
在另一个方面，本发明提供了通过任意前述方法可获得的或获得的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在一个实施方式中，所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。在示例性实施方式中，修饰的SPI包含下列共有序列：N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO：771)。
在另一个方面，本发明提供了显示出靶SP的增强的抑制的修饰的SPI，其中SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。在该方面的一个实施方式中，修饰的SPI包括能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方式中，修饰的SPI显示出延长的抑制持续时间。
在该方面的另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在另一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个氨基酸残基包括催化性丝氨酸残基。
在该方面的另一个实施方式中，修饰的SPI进一步包括离子电荷区域，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，离子电荷区域向SPI的羧基末端放置。在另一个实施方式中，离子电荷区域是阴离子电荷区域。在一个实施方式中，离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。在另一个实施方式中，所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。在示例性实施方式中，所述中和试剂是硫酸精蛋白。在另一个示例性实施方式中，前述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。在一个实施方式中，修饰的SPI含有下列共有序列：N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO：771)。
在另一个方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在另一个方面，本发明提供了由选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列组成的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。
在另一个方面，本发明提供了编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子。在另一个方面，本发明提供了在高度严格杂交条件下与编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。
在一个实施方式中，本发明包括载体，其包含：编码本文描述的修饰的SPI的核酸序列，或在高度严格杂交条件下与编码本文描述的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。在另一个实施方式中，本发明提供了包含前述载体和/或前述核酸分子的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了抑制靶SP的方法，包括施用如本文描述的修饰的SPI。在另一个方面，本发明提供了治疗患有凝血病的受试者或预防患者患上凝血病的方法，包括施用如本文描述的修饰的SPI，例如凝血酶抑制剂。在另一个实施方式中，本发明提供了在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括施用如本文描述的修饰的凝血酶抑制剂，然后向所述受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
本发明的其它特征和优点将通过如下的详细描述和权利要求变得明显。
具体实施方式
本发明提供了产生显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，包括：修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。
如上文所讨论，丝氨酸蛋白酶是切割肽的酶。本领域中接受：这些酶通过催化三联体发挥作用，所述催化三联体存在于酶的活性位点中并且包括丝氨酸残基、组氨酸残基和天冬氨酸残基。组氨酸和天冬氨酸残基的功能是通过电荷中继系统激活丝氨酸残基，使其变为亲核性的并能够切割底物的裂解键(scissile bond)。典型的丝氨酸蛋白酶中的催化三联体的残基之间的相互作用显示于图1。
本发明人已经令人惊奇地证明：除了通过常规竞争性抑制剂的方式空间阻断活性位点之外，variegin，一种丝氨酸蛋白酶凝血酶的直接抑制剂，也通过打乱凝血酶的催化三联体的残基之间的相互作用而发挥作用，从而抑制其催化活性。Variegin是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质。其是源自蜱的蛋白，最早描述于WO03/091284。在WO08/155658中描述了variegin与凝血酶结合的能力。然而，这两篇文献都没有暗示variegin打乱凝血酶的催化三联体中的氨基酸之间的相互作用。WO03/091284和WO08/155658的内容通过引用方式全文并入本文。
图9A显示了凝血酶的催化三联体的残基的位置和这些残基之间的相互作用，它们发挥激活催化性丝氨酸残基的功能。图9B显示了variegin的与催化三联体相互作用的残基，以及该相互作用对于催化三联体的残基的定位的影响。该图图示性地显示了预料不到的发现：variegin的组氨酸残基发挥使丝氨酸的γO移位
的功能，打乱催化三联体的丝氨酸与组氨酸残基之间的相互作用，并显著降低凝血酶的活性。据本发明人所知，variegin是已发现的通过移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子而发挥作用的第一个SPI。
本发明人意识到，variegin的有力的抗凝血酶活性至少部分是由于凝血酶的活性位点中的催化三联体的打乱，并且，实现这一点的机理可以适用于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括凝血酶抑制剂。特别地，可以通过修饰来改善已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂的性质，从而它们打乱靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体的残基之间的相互作用。此类修饰发挥了改善丝氨酸蛋白酶抑制剂性质的功能，并且克服了现有的丝氨酸蛋白酶抑制剂、尤其是已知的凝血酶直接抑制剂的很多缺点。
术语“靶丝氨酸蛋白酶”或“靶SP”涉及通常被给定的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制的丝氨酸蛋白酶。靶SP的一个实例是凝血酶。根据本发明的靶SP的其它实例包括凝固因子FXa、FVIIa、FXIIa、FXIa和FIXa。
通过本发明的方法修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂或SPI可以是直接SPI或间接SPI。术语“直接SPI”意思是SPI在SP的活性位点与其靶SP相互作用，不以抗-SP复合物的一部分存在或通过中间体发挥作用。术语“间接SPI”意思是SPI不与靶SP的活性位点直接相互作用。间接SPI可以与靶SP上的不同于活性位点的位点相互作用，或者间接SPI可以通过包含间接SPI的抗-SP复合物而与靶SP上的活性位点或另一个位点相互作用。
可以通过本发明的方法修饰的SPI的实例包括蛭素类似物(hirulog)(SEQ ID NO：14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO：776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α1-抗胰蛋白酶样serpins、kazal型直接抑制剂和kunitz型/STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂。可以通过本发明的方法修饰的SPI的另外的实例显示于SEQ ID NO：17-153。
“移位的”意思是，靶SP中的氨基酸残基或所述氨基酸残基内的一个或多个原子占据的空间构象不同于在不存在任何外部影响的情况下其通常采纳的空间构象。应该认识到，此类移位可以是任何方向的。
在一个方面，移位可以使靶SP的催化三联体的氨基酸残基之间的相互作用被打乱。此类打乱可以是完全的，即，催化三联体的残基不再相互作用；或者其可以是部分的，即，残基之间的相互作用仅为催化三联体的一个或多个残基不被移位时的相互作用强度的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％或更低。催化三联体的氨基酸残基之间的相互作用的存在可以通过本领域已知的任何方法来测定，例如结晶学或NMR，计算性方法，包括但不限于：分子力学、分子动力学和对接、氢/氘交换和质谱法。
靶SP的催化三联体的一个或多个残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的移位可以打乱靶SP的催化三联体的电荷中继系统。
在本发明的一个方面，靶SP的催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的丝氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的γO原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的βC可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的αC可以被移位。
在一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的原子可以被移位
在其它方面，催化三联体的丝氨酸残基的原子可以被移位
或更多。
在本发明的一个方面，催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的组氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的组氨酸残基的γC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的δC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的εN2原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的ζC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的δN1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的δN1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的βC可以被移位。在另一个方面，催化三联体的组氨酸残基的αC可以被移位。
在一个方面，催化三联体的组氨酸残基的原子可以被移位
在其它方面，催化三联体的组氨酸残基的原子可以被移位
或更多。
在本发明的一个方面，催化三联体的一个或多个残基的移位可以包括催化三联体的天冬氨酸残基的移位。在一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的γO原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的βC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的αC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的γC原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的δO1原子可以被移位。在另一个方面，催化三联体的丝氨酸残基的δO2原子可以被移位。
在一个方面，催化三联体的天冬氨酸残基的原子可以被移位
在其它方面，催化三联体的天冬氨酸残基的原子可以被移位
或更多。
靶SP的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的移位可以通过本领域已知的任何方法来测定，例如结晶学或NMR，计算性方法，包括但不限于：分子力学、分子动力学和对接、氢/氘交换和质谱法。
在本发明的一个方面，SPI是蛋白质并且修饰包括将能够移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基导入SPI。这些氨基酸残基可以通过与催化三联体中的氨基酸残基相互作用而使它们移位。导入的氨基酸残基可以包括组氨酸残基。此组氨酸残基可以作为除了该组氨酸残基之外的可导入SPI中的任何其它序列的一部分而存在。在一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸(MH)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸(MHK)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸(MHR)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸(MHKT)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸-苏氨酸(MHRT)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸(MHKTA)序列。在另一个实施方式中，导入的氨基酸可以包括甲硫氨酸-组氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸(MHRTA)序列。
也可以导入备选的氨基酸残基，只要它们能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子。当考虑MHKT序列时，可以使用例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸替代甲硫氨酸和/或赖氨酸，可以使用精氨酸或酪氨酸替代组氨酸，和/或，可以使用丝氨酸或丙氨酸替代苏氨酸。
在另一个方面，导入的一个或多个氨基酸残基可以包括连接区域。在另一个方面，连接区域可以包括一个或多个氨基酸，例如甘氨酸或丙氨酸。在另一个方面，接头区域可以包括1、2、3、4、或5个甘氨酸残基。在另一个方面，接头区域可以由1、2、3、4或5个甘氨酸残基组成。
在本发明的涉及靶SP是凝血酶的方面，产生修饰的SPI的方法可以包括导入或维持能够与凝血酶的外部位点I相互作用的肽序列。“维持此类肽序列”意指所述肽序列在修饰之前已经存在于SPI序列中，并且该序列不通过修饰被打乱或除掉。
在一个方面，能够与凝血酶的外部位点I相互作用的肽序列可以包括下列序列：
FEEIPEEYL；
YEPIPEEA；
NGDFEEIPEEYL；或
APPFDFEAIPEEYL。
相对于未修饰的SPI，通过本发明的任何方法产生的修饰的SPI显示出其靶SP的增强的抑制。
对于本领域技术人员明显的是，可以使用多种测定法中的任一个来测定SP的抑制程度，并确认该修饰增强靶SP的抑制。举例而言，当SP是凝血酶时，此类测定法可以是胺裂解测定，其中检测在存在S2238的情况下，将凝血酶与修饰的凝血酶抑制剂一起温育之后，对硝基苯胺的形成。
本发明的修饰的SPI可以具有下列IC50：小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小于14nM，小于13nM，小于12nM，小于11nM，小于10nM，小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM或小于1nM。通过本发明的方法产生的SPI可以具有下列Ki小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于1nM，小于750pM，小于500pM，小于400pM，小于300pM，小于250pM，小于200pM，小于150pM，小于100pM，小于50pM，小于30pM，小于25pM，小于20pM，小于15pM，小于10pM，小于5pM，小于1pM，或小于100pM。
已经证明：常规的直接SPI通过与靶SP的至少活性位点结合而发挥作用，其中它们可能被靶SP切割，从而与靶SP的底物竞争结合，并竞争性抑制靶SP。通过这种方式作用的SPI的实例是蛭素类似物-1。虽然此类竞争性抑制可以是有效的抑制性机制，但其具有某些缺点，尤其是就抑制的短暂性和SPI的迅速消除而言。
如在生物化学杂志，2007，282(40)29101-29113(Cho Yeow Koh，MariaKazimirova，Adama Trimnell，Peter Takac，Milan Labuda，Patricia A.Nuttall，和R.Manjunatha Kini)中所描述，variegin通过与其它直接SPI相同的方式以竞争性抑制剂发挥作用。然而，在variegin被凝血酶切割之后，variegin的片段被称作MH22的片段(显示为SEQ ID NO：3)仍然保持与凝血酶结合，并作为凝血酶的非竞争性抑制剂发挥功能。这增加了variegin的抑制潜力，并克服了其它直接SPI的一些缺点。在分析了与凝血酶结合的variegin的晶体结构之后，本发明人惊奇地发现：MH22与凝血酶的活性位点结合。这是不寻常的，因为非竞争性抑制剂一般结合于与酶活性位点不同的位点。此外，晶体结构揭示：负责移位凝血酶的催化三联体的一个或多个残基的variegin的组氨酸残基是MH22序列的一部分，因此，在variegin被切割之后，该variegin片段打乱凝血酶的催化三联体，导致增加的抑制持续时间。
因此，本发明的方法可以产生修饰的SPI，在修饰的SPI被靶SP切割之后，所述修饰的SPI保持与靶SP结合。此类修饰的SPI显示出增加的抑制持续时间。
术语“延长的作用持续时间”意指：靶SP的抑制持续时间相对于使用非修饰的SPI时的抑制持续时间增加。在一个方面，作用持续时间可以增加至少2倍。在另一方面，相对于使用非修饰的SPI时的抑制持续时间，作用持续时间可以增加至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或更多。修饰的SPI的抑制持续时间可以大于5分钟，大于10分钟，大于15分钟，大于20分钟，大于25分钟，大于30分钟，大于1小时，大于2小时，大于3小时，大于4小时，大于5小时，大于6小时，大于12小时，大于1天，大于2天，大于3天或更多。上文已经描述了用于测定靶SP的抑制程度的方法。在本发明的一些方面，上文描述的一个或多个导入的氨基酸残基可以向被靶SP切割之后保留在活性位点中的修饰的SPI的部分的氨基末端放置。
“向氨基酸末端”意指：一个或多个导入的残基在被靶SP切割之后的SPI的保留部分的氨基末端的5个氨基酸之内。在一些方面，一个或多个导入的残基可以在被靶SP切割之后保留在活性位点中的修饰的直接SPI的部分的氨基末端的1个残基之内、2个残基之内、3个残基之内、4个残基之内或5个残基之内。
对本领域技术人员明显的是，为了使一个或多个导入的残基“向被靶SP切割之后保留在活性位点中修饰的直接SPI的部分的氨基末端”，一个或多个导入的残基必须在修饰的直接SPI的切割位点的5个残基之内。
在一个方面，本发明的方法可以包括修饰SPI以使其能够被中和的另外的或备选的步骤，包括：将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用，从而修饰的SPI与中和试剂之间的所产生的离子相互作用中和修饰的SPI抑制活性，从而，修饰的SPI不再使靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。
基于variegin的序列和从结合于凝血酶的variegin的晶体结构获得的数据，本发明人惊奇地发现variegin的抑制活性可以被中和。该中和机理是基于发现了variegin的羧基末端上的离子电荷区域与中和试剂上的相反离子电荷区域之间的离子相互作用。variegin与中和试剂之间的离子相互作用似乎通过打乱variegin上的离子电荷区域与凝血酶上的相反离子电荷区域之间的离子相互作用而中和variegin的抑制活性。从结合于凝血酶的variegin的结构的分析认为：凝血酶上的离子电荷区域在外部位点-I内。
该信息允许对其它SPI进行修饰，从而使它们能够被中和。鉴于SPI的治疗用途(上文已讨论)，能够被中和的修饰的SPI将具有重要的治疗益处。“能够被中和”意思是：能够通过加入中和试剂全部或部分解除SPI的活性，即，在加入中和试剂之后能够恢复SP的活性。在该定义下，可以恢复10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％的SP活性。换言之，在打乱了修饰的SPI与靶SP之间的离子相互作用之后，可以保留90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，1％的SPI抑制活性。
对本领域技术人员明显的是：由于在结合的与未结合的抑制剂之间建立的内在平衡，多数通过与其靶标结合而发挥作用的抑制剂(包括但不限于竞争性抑制剂)的作用可以在一定程度上被中和。在加入某些物质之后，该平衡位置被改变；所述物质在本文中被称作“中和试剂”，其使所述平衡偏向有利于未结合的抑制剂；因此，解除抑制剂的抑制效应。然而，在“非可中和”抑制剂的情况下，该平衡严重偏向结合的抑制剂，中和试剂的加入不扰乱平衡。图8显示了variegin与凝血酶结合的平衡示意图。该示意图仅以举例方式提供。
在本发明的上下文中，术语“中和”意指仅涉及通过加入中和试剂而引起的中和，其打乱平衡；不指作为内在平衡的副产物的内在中和。
中和试剂可以通过拥有与导入到修饰的SPI上的离子电和区域相反的离子电荷区域而发挥中和修饰的SPI的抑制活性的功能。修饰的SPI与中和试剂之间的离子相互作用的形成可能导致修饰的SPI上的离子电荷区域与靶SP上的相反离子电荷区域之间的相互作用被打乱。靶SP上的离子电荷区域可以在外部位点之一以内。在另一个方面，离子电荷区域可以在外部位点-I以内。在本发明的一个方面，中和试剂上的离子电荷区域可以是阳离子电荷区域。因此，在本发明的该方面，通过本发明的方法导入到SPI中的离子电荷区域可以是阴离子电荷区域。在本发明的另一方面，靶SP上的离子电荷区域可以是阳离子电荷区域。
导入到SPI中的离子电荷区域可以导向SPI的羧基末端。“向羧基末端”意指导入的离子电荷区域位于修饰的SPI的羧基末端的10个氨基酸之内。导入的离子电荷区域可以在修饰的SPI的羧基末端的1个残基之内、2个残基之内、3个残基之内、4个残基之内、5个残基之内、6个残基之内、7个残基之内、8个残基之内、9个残基之内或10个残基之内。
中和试剂可以是阳离子物质。此类阳离子物质可以与SP竞争与靶SPI上的阴离子电荷区域的结合，引起修饰的SPI的移位，和靶SP的抑制的丧失。中和试剂可以是阳离子肽，例如硫酸精蛋白。
导入到SPI中的离子电荷区域可以包括一个或多个酸性残基。一个或多个酸性残基可以包括1、2、3、4、5或更多个酸性残基。术语“酸性残基”可以包括天冬氨酸和谷氨酸。一个或多个酸性残基可以包括谷氨酸残基和/或天冬氨酸残基。
可以导入的离子电荷区域的具体实例包括两个谷氨酸氨基酸残基和两个天冬氨酸氨基酸残基。在另一个具体实例中，可以导入的离子电荷区域包括序列glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意氨基酸残基。在另一个实例中，可以导入的离子电荷区域包括序列glu-glu-tyr-lys-asp-asp。
一般内容
现在将描述本发明的一些一般性方面。该部分中包括的特征和方法适用于上文描述的本发明的任何方法。
如在前面的部分中所描述，本发明的方法可以包括将一个或多个残基导入SPI。在一个方面，此类导入的残基可以通过插入导入。在另一个方面，可以通过置换导入残基。
置换或插入的方法对于本领域技术人员将是明显的。举例而言，但不限于此：这些可以包括定点诱变、PCR诱变、转位子诱变、定向诱变、插入诱变、靶向诱变和化学蛋白合成(Sambrook等人(2000))。
在本发明的一些方面，修饰SPI的方法可以包括一个或多个另外的步骤。在一些实施方式中，一个或多个另外的步骤可以是最初的另外步骤，意思是这些步骤发生在修饰方法的其它步骤之前。
在一个方面，本发明的方法可以包括下列的另外步骤：分析SPI的结构以确定要对SPI进行的修饰。分析可以包括分析SPI的氨基酸序列和/或SPI的结构的计算机模拟。另外或备选地，方法可以包括分析SP的结构或与SP结合的SPI的结构。此类结构可以是晶体结构、红外谱、圆形二色性数据、紫外谱、NMR光谱的形式，计算性方法包括但不限于：分子力学、分子动力学和对接、或氢/氘交换和质谱法。
分析可以包括确定负责SP与SPI之间的相互作用(该相互作用将通过修饰SPI的方法被改变)的SPI的区域。例如，修饰SPI以增强如上文描述的靶SP的抑制的方法可以包括鉴定SPI中的与靶SP的催化三联体相互作用的残基的最初步骤。然后，可以修饰与催化三联体相互作用的氨基酸残基以移位催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子，例如，通过在该位置导入MHKT序列。
本发明可以包括下列的另外步骤：分析靶SP的结构以确定要对SPI进行的修饰。分析可以包括确定负责靶SP与SPI之间的相互作用(该相互作用将通过修饰SPI的方法被改变)的靶SP的区域和/或残基。分析可以包括SP的结构分析，其可以是晶体结构、红外谱、圆形二色性数据、紫外谱、NMR光谱的形式，或来自计算性方法的数据。上述分析可以包括将SPI的结构与另一个结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI的结构进行比较。此类分析可以在关于待修饰的SPI与另一SP所产生的任何数据上进行。特别地，此类数据可以源自晶体结构、红外谱、圆形二色性数据或紫外谱和NMR光谱或来自计算性方法的数据。
在本发明的另一个方面，结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI可以是凝血酶抑制剂。在本发明的另一个方面，结构和/或功能在之前已经被分析了的SPI可以是variegin。
在本发明的一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以是凝血酶抑制剂。根据本发明的另一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以选自蛭素类似物(SEQ ID NO：14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO：776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α1-抗胰蛋白酶样serpins、kazal型直接抑制剂和kunitz型/STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂。在另一个方面，要通过本发明的方法修饰的SPI可以是SEQ ID NO：17-153的任一项。
修饰的SPI
本发明还包括通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI。
在另一个方面，本发明涉及通过任何方法获得的修饰的SPI。例如，通过本发明的方法可获得的修饰的SPI也可以通过本领域已知的任何方法来产生。用于产生本文描述的修饰的SPI的示例性技术包括化学肽合成、固相或溶液相肽合成、从编码修饰的SPI的核酸分子进行体外翻译，或基于细胞的生产方法，其利用原核或真核重组表达系统。在示例性实施方式中，修饰的SPI是包含如SEQ ID NO：158-770所示的任意序列的多肽。此类修饰的SPI成分可用于本发明的方法，包括抑制SP的方法，如下文所描述。在本发明的一个方面，通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI可以是修饰的凝血酶抑制剂。
在本发明的一个方面，通过本发明的方法可获得或获得的修饰的SPI可以是蛭素类似物(SEQ ID NO：14)、Kunitz/BPTI-型抑制剂(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制剂，显示于SEQ ID NO：776)、蛭素-相关凝血酶抑制剂、serpins、肝素辅因子、α1-抗胰蛋白酶样serpins、kazal型直接抑制剂和kunitz型/STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制剂的修饰的形式。在另一个方面，通过本发明的方法修饰的SPI可以是SEQ ID NO：17-153的任一项。
通过本发明的方法可获得或获得的修饰的蛭素类似物的修饰的形式可以具有下列共有序列：
(N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO：771)。
在一个方面，N-末端肽可以包括序列苯丙氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸，或苯丙氨酸-脯氨酸，赖氨酸。
在另一个方面，氨基末端苯丙氨酸残基可以是修饰的苯丙氨酸残基。在一个实例中，该修饰的残基可以是D-苯丙氨酸残基。
在一个方面，X1可以是任意氨基酸。在另一个方面，X1可以是甲硫氨酸残基。
在一个方面，X2可以是任意氨基酸。在另一个方面，X2可以是赖氨酸或精氨酸残基。
在一个方面，n可以是一个或多个甘氨酸氨基酸残基。在另一个方面，n可以是2、3、4、5或更多个甘氨酸氨基酸残基。
在一个方面，修饰的SPI可以包括一个或多个硫酸化氨基酸残基。在另一个方面，SPI可以包括一个或多个硫酸化酪氨酸残基。
在一个方面，外部位点I结合肽可以包括下列序列之一：
FEEIPEEYL(SEQ ID NO：772)；
YEPIPEEA(SEQ ID NO：773)；
NGDFEEIPEEYL(SEQ ID NO：774)；或
APPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO：775)。
外部位点I结合肽还可以包括含有一个或多个酸性残基的离子电荷区域。所述一个或多个酸性残基可以包括1、2、3、4、5或更多个酸性残基。术语“酸性残基”可以包括天冬氨酸和谷氨酸。一个或多个酸性残基可以包括谷氨酰胺残基和/或天冬氨酸残基。离子电荷区域可以包括两个谷氨酸氨基酸残基和两个天冬氨酸氨基酸残基。离子电荷区域可以包括序列glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意氨基酸残基。在另一个实例中，离子电荷区域可以包括序列glu-glu-tyr-lys-asp-asp。
在一个方面，修饰的SPI可以包括选自SEQ ID NO：158-770的序列。在另一个方面，修饰的SPI由SEQ ID NO：158-770的一个或多个序列组成。
本发明的修饰的SPI可以通过化学肽合成、通过重组肽合成或使用宿主细胞细胞来产生。
本发明还包括根据本发明的修饰的SPI的功能等同物，其保留抑制SP的增强的能力，如上文所述。在一个方面，术语“功能等同物”意在包括与根据本发明的方法产生的修饰的SPI具有至少50％序列同一性的肽分子。在另一个方面，功能等同物可以与根据本发明的方法产生的修饰的SPI具有60％，70％，85％，90％，95％，98％，99％或更高的序列同一性。此类功能等同物保留抑制靶SP的增强的能力，如上文所述。
术语“功能等同物”还包括：与本发明的修饰的SPI相比，包含一个或多个保守性置换的任意多肽。在一个方面，多肽包含一个或多个保守性置换。在另一个方面，与本发明的修饰的SPI相比，多肽包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，或五个或更多个保守性置换。保守性置换是这样的氨基酸置换：其中被置换的氨基酸的性质相对于在该位置通常存在的氨基酸而言不发生实质上的变化。保守性置换包括酸性氨基酸置换为另一酸性氨基酸，碱性氨基酸置换为另一碱性氨基酸，不带电荷的氨基酸置换为另一不带电荷的氨基酸，非极性氨基酸置换为另一非极性氨基酸，小氨基酸置换为另一小氨基酸，或大氨基酸置换为另一大氨基酸。酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸是精氨酸、组氨酸和赖氨酸。不带电荷的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。非极性侧链是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。在非极性氨基酸的类别内，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸被认为是小氨基酸，脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸被认为是大氨基酸。
在另一个方面，本发明包括通过本发明的方法产生的SPI的片段。在另一个方面，片段可以包括2个或更多个氨基酸。在另一个方面，片段可以包括3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45或50个氨基酸。在另一个方面，片段可以由2个或更多个氨基酸组成。在另一个方面，片段可以由2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45或50个氨基酸组成。此类片段保留抑制靶SP的增强的能力，如上文所述。
在另一个方面，功能等同物可以是融合蛋白，其通过例如将编码本发明的修饰的SPI或其变体或片段的多核苷酸在框内克隆于异源蛋白序列的编码序列而获得。如本文使用的术语“异源的”意指除了修饰的SPI或其功能等同物之外的任意多肽。构成融合蛋白的异源序列(在N-末端或在C-末端)的实例是下列：与膜结合的蛋白的细胞外结构域、人免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚体结构域、细胞外蛋白的结构域、信号序列、输出序列，或允许通过亲和色谱纯化的序列。很多这些异源序列可通过商业途径获得(在表达质粒中)，因为这些序列通常包括在融合蛋白中以提供另外的性质而不显著破坏融合于它们的蛋白的特定生物活性(Terpe(2003))。此类另外的性质的实例是：体液中的持续较长的半衰期、细胞外定位，或由于标签例如组氨酸或HA标签而允许更容易地纯化程序。
异源蛋白也可以是标记物结构域。在一个方面，标记物结构域可以是荧光标签、允许通过亲和结合纯化的表位标签、允许组织化学或荧光标记的酶标签，或放射性化学标签。在另一实施方式中，标记物结构域可以是放射性化学标签。此类融合蛋白可用作诊断工具。
用于产生融合蛋白的方法是本领域中的标准技术，是本领域技术人员已知的。例如，多数一般性的分子生物学、微生物、重组DNA技术和免疫技术可以见于Sambrook等人(2000)。一般地，融合蛋白可以最方便地从核酸分子重组产生，在所述核酸分子中两个核酸序列在框内融合在一起。这些融合蛋白将由含有所讨论的融合蛋白的相关编码序列的核酸分子编码。
在一个方面，根据本发明的修饰的SP的功能等同物可以包括：包含适合移位靶SP的催化三联体的残基的之一的部分的任意分子。在一个方面，该分子可以是蛋白分子，适合移位催化三联体的残基之一的部分可以是氨基酸残基。对本领域技术人员明显的是，该定义不包括单独的任何残基，因为残基将需要另外的残基的存在以使适合移位靶SP的催化三联体的残基之一的残基定位于适合于移位催化三联体的残基之一的方向和位置。在一个方面，功能等同物可以包括蛋白分子内的组氨酸残基，其以适合移位靶SP的催化三联体的残基之一的方式定位和定向。本发明还包括如上所述的修饰的SPI的合成类似物。
通过本发明的方法产生的修饰的SPI的片段或功能等同物能够作为SPI发挥作用。“能够作为SPI发挥作用”意思是该片段或功能等同物能够抑制SP的SP活性。在另一个方面，片段或功能等同物能够抑制靶SP的SP活性。
对本领域技术人员明显的是，可以使用多种测定法来测定片段或功能等同物是否能够作为SPI发挥作用。举例而言，但不限于此，此类测定法可以是SP胺裂解测定，如上文所述，其中检测在存在S2238的情况下，将靶SP与修饰的SPI一起温育之后，对硝基苯胺的形成。当在此类SP胺裂解测定法中测定时，本发明的修饰的SPI可以具有下列IC50：小于30nM，小于25nM，小于20nM，小于15nM，小于14nM，小于13nM，小于12nM，小于11nM，小于10nM，小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM或小于1nM。当在此类SP胺裂解测定法中测定时，通过本发明的方法产生的SPI可以具有下列Ki：小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于1nM，小于750pM，小于500pM，小于400pM，小于300pM，小于250pM，小于200pM，小于150pM，小于100pM，小于50pM，小于30pM，小于25pM，小于20pM，小于15pM，小于10pM，小于5pM，小于1pM或小于100pM。
在一个方面，本发明包括编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子。在另一个方面，本发明包括与编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子具有至少50％序列同一性的核酸分子。在另一个方面，本发明包括与编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸分子。本发明还包括编码根据本发明的方法产生的修饰的SPI的核酸分子的片段。在一个方面，所述片段可以包括10个或更多个核苷酸。在另一个方面，所述片段可以包括12个或更多个、14个或更多个、16个或更多个、18个或更多个、10个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、80个或更多个、90个或更多个，或100个或更多个核苷酸。根据本发明的核酸分子可以是任意形式，包括双链和单链RNA、DNA和cDNA。
在另一个方面，本发明包括在高度严格杂交条件下与根据本发明的核酸分子杂交的反义核酸分子。高度严格杂交条件在本文中定义为：在42℃在包含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中过夜温育，然后在0.1X SSC中在大约65℃洗涤滤液。
本发明还包括含有本发明的核酸分子的克隆和表达载体。此类表达载体可以包含与本发明的核酸分子在框内连接的适当的转录和翻译控制序列，包括但不限于：增强子元件、启动子-操纵子区域、终止序列、mRNA稳定性序列、起始和终止密码子或核糖体结合位点。另外，使本发明的修饰的SPI从某些宿主中分泌出来可能是方便的。因此，此类载体的另外的成分可以包括编码分泌、信号和处理序列的核酸序列。
根据本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，以及其它的线性或环形DNA载体，例如利用可转位元件或同源重组技术的那些。很多此类载体和表达系统对于本领域技术人员将是明显的。特别适宜的病毒载体包括基于杆状病毒、腺病毒和牛痘病毒的载体。
用于重组表达的适宜的宿主包括通常使用的原核物种，例如大肠杆菌，或者可以被操作以表达高水平的重组蛋白并且可以容易地大量生长的真核酵母。在体外生长的哺乳动物细胞系也是适宜的，尤其是当使用病毒驱动的表达系统时。另一个适宜的表达系统是杆状病毒表达系统，其包括使用昆虫细胞作为宿主。表达系统也可以包括在其基因组中导入了DNA的宿主细胞。蛋白或蛋白片段也可以在体内表达，例如在昆虫幼虫或哺乳动物组织中。可以使用多种技术将载体导入原核或真核细胞中。适宜的转化或转染技术在文献中有完备的描述(Sambrook等人(2000))。在真核细胞中，表达系统可以是短暂的(例如，游离体)或永久的(染色体整合)，视系统的需要而定。
治疗方法
本发明还包括根据本发明可获得的或获得的修饰的SPI在治疗中的用途。
也可以使用通过任何方法获得的修饰的SPI来执行用途和方法。
本发明包括抑制SP的方法，包括向受试者施用本发明的分子。
“本发明的分子”意思是根据本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI分子，编码根据本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸，包含编码通过本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸的载体，和包含含有编码通过本发明的方法可获得的或获得的修饰的SPI的核酸的载体的宿主细胞。“本发明的分子”还包括通过本发明的方法可获得的、但通过任何方法产生的修饰的SPI。因此，本发明的修饰的SPI分子可以使用本领域已知的任何方法产生，例如，化学肽合成、固相或溶液相肽合成、从编码修饰的SPI的核酸分子进行体外翻译，或基于细胞的生产方法，其利用原核或真核重组表达系统。在示例性实施方式中，“本发明的分子”包括含有如SEQ ID NO：158-770所示的任意序列的多肽。此类修饰的SPI分子可用于本发明的方法，包括本文所述的任意治疗方法。
受试者一般是动物。术语“动物”包括分类为动物界的成员的任意生物。一般地，动物是哺乳动物，例如人、母牛、绵羊、猪、骆驼、马、狗、猫、猴子、小鼠、大鼠、仓鼠和兔子。
方法可以包括施用治疗有效量的本发明的分子。术语“治疗有效量”是指治疗或缓解靶疾病或病况所需的化合物的量。如本文使用的术语“预防有效量”是指预防靶疾病或病况所需的化合物的量。精确剂量一般将取决于给药时受试者的状态。当确定剂量时可以考虑的因素包括：受试者中的疾病状态的严重性、受试者的一般健康、年龄、体重、性别、膳食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和受试者对于治疗的耐受或应答。精确的量可以通过常规实验确定，但最终可以根据临床医生或兽医的判断。一般地，有效剂量将是0.01mg/kg(药物质量比受试者的质量)至50mg/kg，优选0.05mg/kg至10mg/kg。本发明的分子可以联合药学上可接受的载体以药物组合物的形式提供。
如本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和无活性的病毒颗粒或事实上任何其它试剂，只要赋形剂本身不诱导毒性效应或引起对接受药物组合物的个体有害的抗体的产生。药学上可接受的载体可以另外包括：液体，例如水、盐水、甘油、乙醇，或辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等。赋形剂能够使药物组合物配制为片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液以辅助受试者摄取之。关于药学上可接受的载体的详细讨论可以见Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
在一个方面，本发明提供了涉及通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂的治疗方法。
本发明包括治疗患有凝血病的受试者或预防患者患上凝血病的方法，包括施用通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂。
本发明还包括用于治疗患有凝血病的受试者或预防患者产生凝血病的通过本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂。
“凝血病”意指血液凝固的任意病症。
当需要抗凝时的处理包括，为了诊断或治疗原因的涉及经皮、透过血管或透过器官的导管插入的程序。此类程序可以包括但不限于：冠状动脉血管成形术；血管内支架程序；通过动脉或静脉导管直接施用血栓溶解剂，例如在中风或冠状动脉血栓症之后；电心律转变法；心脏起搏器导线的放置；血管内和心脏内监控压力、气体饱和或其它诊断参数；涉及经皮或透过器官的导管插入的放射学和其它程序；以确保长期、留置的、血管内胃肠外营养导管的效能；以确保长期或短期血管接入端口的效能。
本发明的方法的另外的体内应用包括血栓栓塞事件之后的紧急抗凝，所述血栓栓塞事件包括但不限于：急性心肌梗塞；血栓形成性中风；深度静脉血栓；血栓性静脉炎；肺栓塞；栓和微栓发作，其来源可以是心脏、动脉粥样硬化斑、瓣膜或人造血管或未知的来源；弥散性血管内凝血(DIC)。
本发明的方法也可用于预防在器官灌注程序例如心肺分流术(cardiopulmonary bypass)、肝脏分流术(hepatic bypass)中以及作为器官移植的附属来预防凝固。由于心肺分流术而促成的大量血栓形成反应不能通过间接凝血酶抑制剂例如肝素及其类似物完全拮抗(Edmunds & Colman(2006))。
另外的需要抗凝的情况包括：血液透析、血液过滤或血浆交换程序。在涉及血管的交叉夹紧的手术程序时也可能需要抗凝，以使末梢循环中的凝固风险最小化。此类程序可以包括但不限于：动脉内膜切除术、人造血管的插入、主动脉和其它动脉瘤的修复。
另外，方法和根据本发明可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂可用于在肝素抗性受试者中诱导抗凝。
方法和根据本发明的方法可获得或获得的修饰的凝血酶抑制剂也可用于治疗或预防肝素诱导的血小板减少症。可以向患有或具有换HIT以及具有或不具有活性血栓的受试者施以此类治疗，并且可以施用直至血小板计数恢复至正常范围内或直至不再有血栓风险(Girolami & Girolami(2006)，Lewis & Hursting(2007))。
本发明的分子可以通过任意合适途径施用。优选的施用途径包括静脉内、肌肉内或皮下注射，口服施用，舌下施用和经皮施用。可以通过静脉内输注持续给予治疗或作为单一或重复的推注注射进行。本发明的分子可以单独向受试者施用，或者可以与其它试剂、药物或激素组合施用。例如，本发明的分子可以与口服抗凝剂例如香豆素(coumarin)衍生物一起施用，直至受试者变得稳定，然后可以单独以香豆素衍生物治疗该受试者。
本发明还提供了：通过本发明的方法产生的修饰的SPI可用于诊断。由于这些方法涉及通过与靶SP的相互作用特异性抑制SP活性，所以它们可用于检测靶SP的存在，从而诊断由SP的累积而引起的病况，例如纤维蛋白或血小板血栓，其由凝血酶的累积而引起。因此，本发明提供了诊断由SP累积引起的病况的方法，该方法是通过向受试者或分离自受试者的组织施用如上文描述的本发明的修饰的SPI，并检测所述SPI或其片段或功能等同物的存在，其中所述修饰的SPI或其片段或功能等同物与靶SP的结合的检测指示所述疾病或病况。修饰的SPI或功能等同物可以是包含标记物结构域的融合蛋白的形式，如上文更详细地所描述，以促进检测。在一个方面，标记物结构域可以是放射化学标签，从而可以使用已知的成像方法进行检测。
根据本发明的另一个方面，本发明的体内方法可用于治疗恶性疾病或与恶性疾病相关的病况。
数十年以来已经认识到，恶性疾病经常与血栓栓塞发作的增加的倾向相关，其是由SP凝血酶的增加的水平引起的。例如，Trousseau综合征的特征在于短暂的血栓性静脉炎和潜在的恶性质，凝血酶抑制剂例如肝素已经用于其管理(Varki(2007))。更近期以来，已经显而易见的是，促凝血因子包括凝血酶的产生可能是恶性疾病的某些方面的诱因而非结果(Nierodzik & Karpatkin(2006))。有很多这样的情况：其中需要抑制SP，然后中和此类抑制。举例而言，但不限于此，此类抑制和中和在手术中可能是有利的，其中，当手术正在进行时，需要靶SP抑制以防止凝血酶诱导的凝固；在完成手术之后，撤销抑制是有利的，以允许伤口愈合。
当SPI是凝血酶抑制剂时，可以通过施用阳离子肽例如硫酸精蛋白来中和凝血酶活性。因此，涉及如本文描述凝血酶抑制的任何治疗方法可以描述向受试者施用一定量的阳离子肽以引起凝血酶抑制的中和的另外的步骤。在一个方面，所施用的阳离子肽的量可以是0.01mg/ml至1mg/ml。在另一个方面，所施用的阳离子肽的量可以是0.01mg/ml或更多，0.02mg/ml或更多，0.03mg.ml或更多，0.04mg/ml或更多，0.05mg/ml或更多，0.06mg/ml或更多，0.07mg/ml或更多，0/08mg/ml或更多，0.09mg/ml或更多，0.1mg/ml或更多，0.11mg/ml或更多，0.12mg/ml或更多，0.13mg.ml或更多，0.14mg/ml或更多，0.15mg.ml或更多，0.16mg/ml或更多，0.18mg/ml或更多，0.19mg/ml或更多，0.2mg/ml或更多，0.3mg.ml或更多，0.4mg.ml或更多，0.5mg.ml或更多，或1mg/ml。
现在将通过举例方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方式。将认识到，可以不脱离本发明的范围进行细节的修饰。
附图说明
图1显示了典型的SP的催化反应图解。多肽底物与SP结合，从而裂解键被插入到酶的活性位点，并且其羰基碳位于SP的亲核丝氨酸附近。丝氨酸-OH攻击羰基碳，并且SP的组氨酸的氮接受来自丝氨酸的-OH的氢，从而产生四面体中间体。接下来，肽键中的氮-碳断裂，产生酰基酶中间体，水加入其中，产生另一种四面体中间体。在最后的反应中，肽的C-末端被射出，SP恢复至其原始状态。
图2显示了凝血酶-variegin复合物的结构，与其它凝血酶抑制剂结构相对比。
(A)凝血酶-variegin复合物的结构。凝血酶A链骨架显示为浅蓝色带状物，B链显示为白色带状物，s-variegin骨架和侧链原子显示为粉色的棍。
(B)凝血酶-蛭素类似物-1复合物的结构(PDB：2HGT)。蛭素类似物-1显示为红色的棍。
(C)凝血酶-蛭素类似物-3复合物的结构(PDB：1ABI)。蛭素类似物-3显示为黄色的棍。
(D)凝血酶-蛭素原(hirugen)复合物的结构(PDB：1HGT)。蛭素原显示为绿色的棍。
(E)凝血酶-PPACK复合物的结构(PDB：1PPB)。PPACK显示为橙色的棍。
(F)野生型、不含抑制剂、不含Na+的凝血酶(PDB：2AFQ)。结构代表“慢”形式的凝血酶，并且无抑制剂。
图3显示了在37℃和24℃凝血酶对s-variegin的切割的分析。通过积分RP-HPLC分析中的峰下面积而计算：未切割的s-variegin的相对百分比(■)、质量为1045的切割产物的相对百分比(代表N-末端片段SDQGDVAEPK；SEQ ID NO：2)
和质量为2582的切割产物的相对百分比(代表C-末端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES；MH22；SEQ ID NO：3)(■)。切割在37℃比在室温(24℃)进行得快(n＝2，误差条代表S.D.)。
(A)通过在37℃温育s-variegin与凝血酶而获得的结果。完成切割仅需要180分钟。
(B)通过在24℃温育s-variegin与凝血酶而获得的结果。完成～90％的切割需要360分钟。
图4显示：被凝血酶切割后s-variegin和EP25保留了它们的活性。
(A)S-variegin与凝血酶(3.33nM)在室温温育24小时，在多个时间点测定抑制凝血酶在100μM S2238上的胺裂解活性的能力(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)以EP25代替s-variegin进行类型的实验(n＝3，误差条代表S.D.)。
图5显示：MH22、s-variegin和蛭素类似物-1抑制人血浆凝血酶。使用活性位点定向底物S2238(100μM)测定MH22、s-variegin和蛭素类似物-1抑制源自人血浆的凝血酶的胺裂解活性的能力。当它们以相似的摩尔浓度与凝血酶一起存在时，MH22(○)、s-variegin(▲)和蛭素类似物-1(■)抑制凝血酶(1.65nM)的剂量应答曲线均显示出抑制。
用于MH22(■)和s-variegin的浓度分别是0.03nM，0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM和1000nM。抑制的IC50分别是11.46±0.71nM和8.25±0.45nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
用于蛭素类似物-1(▲)的浓度是0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM，3000nM和10000nM。抑制的IC50是72.6±3.9nM(n＝3误差条代表S.D)。
图6显示了MH22的表观抑制常数(Ki’)。由于MH22作为紧密结合抑制剂发挥其作用，所以使用不同浓度的S2238作为底物，检测了不同浓度(0.195nM，0.391nM，0.781nM，1.56nM，3.12nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM)的MH22对于凝血酶(1.65nM)的抑制。加入凝血酶时反应起始。图中显示了以100μM S2238进行的实验。将获得的数据拟合入等式以得出表观抑制常数(Ki’)(平均值±S.D.)是14.31±0.26nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图7显示了MH22的抑制常数Ki。使用6种不同浓度的底物S2238(12.5μM，25μM，50μM，75μM，100μM和150μM)测定MH22的表观抑制常数(Ki’)。Ki针对底物浓度的曲线一直保持恒定，这表明MH22非竞争性地(Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)]并且Ki’＝Ki)抑制凝血酶在S2238上的胺裂解活性。通过线性回归拟合Ki’值，得出抑制常数Ki是14.11±0.29nM(对于每个S2238浓度，n＝3，误差条代表S.D.)。
图8显示了variegin抑制凝血酶的平衡方案。在不存在variegin的情况下，S2238结合凝血酶(Ks是凝血酶-S2238解离的平衡常数，显示为蓝色箭头)，并且被凝血酶水解以释放有色产物pNA(Kp是形成pNA的正向速率常数，绿色箭头)。
在存在variegin的情况下，凝血酶结合variegin(Ki-v是variegin的抑制常数，显示为棕色箭头)，因此，S2238的水解被完全抑制。结合之后，凝血酶将variegin切割为MH22(kc是切割的正向速率常数，显示为紫色箭头)。
MH22保持与凝血酶结合，作为凝血酶的经典的非竞争性抑制剂(Ki-m是MH22的抑制常数)。MH22以相同的亲和性与游离的凝血酶或结合于S2238的凝血酶结合，α＝1，因此Ki-m＝αKi-m(显示为红色箭头)。类似地，Ks＝αKs，S2238与凝血酶的结合不受MH22的影响。
图9显示了结合于s-variegin和结合于蛭素原的凝血酶的结构中的催化三联体。
(A)当在凝血酶-蛭素原结构中未被占据时(绿色)，凝血酶的催化三联体THis57、TAsp102和TSer195具有完整的电荷中继氢结合系统。在凝血酶-s-variegin结构中(粉色)，TSer195 Oγ被移位
(青色箭头)。THis57 Nε与TSer195 Oγ之间的距离是
因此不形成氢键，电荷中继系统被破坏。
(B)TSer195 Oγ的移位是由于s-variegin(显示为灰色)与凝血酶的催化三联体之间的相互作用。VHis12骨架N(供体)通过氢键
啮合TSer195的Oγ(受体)，而VHis12侧链Nδ(受体)仅能与TSer195 Oγ(供体)形成弱的氢键
VHis12骨架N也与TGly193骨架N和TCys42 Sγ通过水分子(浅蓝色)形成氢键。因此，TSer195 Oγ被赋予弱亲核性，并且不能攻击底物的骨架碳。由于TGly193骨架N参与该氢键网络，氧负离子孔的形成也被破坏。
图10显示了凝血酶与s-variegin之间的首要次位点相互作用。对于s-variegin，仅显示了残基P2’至P5’(VHis12至VAla15)。在结构中不能描绘s-variegin P1’VMet11的密度。凝血酶S2’次位点(红色)(由TCys42，THis57，TTrp60D，TLys60F，TGlu192和TSer195形成)与蛭素类似物-3中保守的S1’次位点部分重叠。s-variegin P3’VLys13侧链与TGlu192侧链靠近且平行，并且其骨架与TLeu41接触，形成S3’次位点(青色)。S-variegin P4’VThr14侧链朝向自我裂解环的底部，占据由TGly142，TAsn143，TGlu192，TGly193和TGlu151形成的小袋，形成了S4’次位点(粉色)。底部的TLeu40沿着凝血酶S5’次位点(绿色)，这允许s-variegin P5’VAla15将其侧链埋于界面处。
图11显示：s-variegin紧密适合凝血酶的峡谷样裂口。
(A)凝血酶具有深谷样裂口(加框)，起始于活性位点，延伸至外部位点-I。
(B)整个s-variegin(粉色的CPK模型)紧密适合于延伸的构象中峡谷样裂口的底部，覆盖催化袋、首要次位点和外部位点-I。裂口的底部主要由非极性残基组成。裂口的壁由凝血酶活性位点附近的60-环和自我裂解环以及外部位点-I处的34-和70-环形成。
(C)根据位置以颜色显示了与s-variegin相互作用的凝血酶残基：催化袋——蓝色；60-环——红色；自我水解环——青色；34-环——黄色；70-环——绿色；裂口底部——橙色。以粉色显示了s-variegin的球棍模型。
(D)s-variegin通过特定侧链的接触与凝血酶相互作用。除了5个残基(VPhe18，VAsp19，VAla22，VGlu26和VTyr27，均以白色显示)之外，s-variegin上的所有残基的侧链都埋于与凝血酶的界面处。
图12显示了新的variegin变体的设计。设计了新的variegin变体以改善凝血酶-variegin相互作用。方法为：首先优化variegin的长度，然后优选variegin上的数个关键位置。
图13显示了variegin变体EP21对凝血酶的抑制，EP21是慢的紧密结合的竞争性抑制剂。
(A)EP21(0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM，3000nM和10000nM)对于凝血酶(1.65nM)胺裂解活性[使用S2238(100μM)]的抑制显示出预温育时间依赖性偏移，这是由于结合缓慢的缘故。无预温育时，IC50值是176.9±6.8nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是16.2±2.9nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)以100μM S2238，不同浓度的EP21(18.8nM，25nM，37.5nM，50nM，75nM，100nM和150nM)抑制凝血酶(1.65nM)的进程曲线(未显示)拟合入等式P＝Vft+(Vi-Vf)(1-e-kt)/k+Po(该等式描述了慢结合抑制剂)，以获得针对所用的每个EP21浓度的k值。k针对EP21浓度的曲线(实线)是由等式k＝K4+K3It/[It+Ki`(1+S/Km)]描述的双曲线，因此，拟合进入等式以得出Ki`为1.66±0.36nM，其代表了最初的碰撞复合物EI的解离常数。从等式Ki＝Ki`[K4/(K3+K4)]计算得出总体抑制常数(Ki)是0.315±0.024nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图14显示了variegin变体MH18对凝血酶的抑制；MH18是快的紧密结合的非竞争性抑制剂。
(A)以100μM S2238，测定了MH18(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM，3000nM和10000nM)抑制凝血酶(1.65nM)的胺裂解活性的能力。剂量应答曲线不依赖于预温育时间。无预温育时，IC50值是10.9±1.2nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是11.7±1.9nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)由于MH18作为快且紧密结合抑制剂发挥作用，所以在100μM ofS2238下，以0.39nM，0.78nM，1.56nM，3.13nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM和200nM MH18测定了对凝血酶(1.65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki’)是14.9±3.5nM。基于等式Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)]和Ki’＝Ki计算的抑制常数(Ki)是14.9±3.5nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图15显示了variegin变体DV24对凝血酶的抑制；DV24是快的紧密结合的竞争性抑制剂。
(A)以100μM S2238，DV24(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM和3000nM)对于凝血酶(1.65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC50值是7.49±0.28nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是10.07±0.60nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)由于DV24作为快且紧密结合的抑制剂发挥作用，以100μMS2238，测定了0.39nM，0.78nM，1.56nM，3.13nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM和200nM DV24对于凝血酶(1.65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki’)是9.74±0.91nM。基于等式Ki’＝Ki(1+S/Km)计算的抑制常数(Ki)是0.306±0.029nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图16显示了variegin变体DV24K10R对凝血酶的抑制；DV24K10R是快的紧密结合的竞争性抑制剂。
(A)以100μM S2238，DV24K10R(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM和3000nM)对于凝血酶(1.65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC50值是6.98±0.76nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是12.01±0.41nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)由于DV24K10R作为快且紧密结合的抑制剂发挥作用，以100μMS2238，测定了0.39nM，0.78nM，1.56nM，3.13nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM和200nM DV24K10R对于凝血酶(1.65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki’)是8.27±0.85nM。基于等式(4)计算的抑制常数(Ki)是0.259±0.015nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图17显示：s-variegin中的二肽序列VPro16-VPro17(黄色)的存在导致其骨架中的纽结。基于它们的凝血酶结构的s-variegin(粉色，仅显示了Cα的位置)和蛭素类似物-3(绿色，仅显示了Cα的位置)的覆盖图揭示了VPhe18和VAsp19从蛭素类似物-3的它们的对应残基Gly10和Asp11移位
和(通过Cα位置测定)(青色的双箭头)。因此，VAsp19侧链以相反方向指向蛭素类似物-3中的类似的Asp11侧链。蛭素类似物-3中的该Asp11与TArg73形成强离子对(白色)。由于VAsp19的移位，TArg73NH2与VAsp19 OD1之间的最接近的可能距离是
这使得凝血酶-s-variegin结构中的这种相互作用不可能发生。
图18显示了variegin变体DV23对凝血酶的抑制；DV23是快的紧密结合的竞争性抑制剂。
(A)以100μM S2238，DV23(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM和3000nM)对于凝血酶(1.65nM)的抑制的剂量应答曲线显示出随着预温育时间的增加而右移，这是由于切割造成的。没有温育时，IC50是45.4±1.6nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是77.8±6.1nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)以100μM S2238，测定了3.91nM，7.81nM，15.6nM，31.3nM，62.5nM，125nM，250nM和500nM DV23对于凝血酶(1.65nM)的抑制。通过将数据拟合进入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki’)是69.6±7.8nM。基于等式Ki’＝Ki(1+S/Km)计算的抑制常数(Ki)是2.19±0.23nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图19显示了variegin变体DV23K10R对凝血酶的抑制；DV23K10R是快的紧密结合的竞争性抑制剂。
(A)在存在100μM S2238的情况下，DV23K10R(0.1nM，0.3nM，1nM，3nM，10nM，30nM，100nM，300nM，1000nM和3000nM)抑制凝血酶(1.65nM)。切割后活性的丧失是迅速的，如剂量应答曲线的强烈右移所示。没有温育时，IC50值是12.9±1.0nM(实线)；有20分钟预温育时，IC50值是101.9±1.2nM(虚线)(n＝3，误差条代表S.D.)。
(B)以100μM S2238，测定了3.91nM，7.81nM，15.6nM，31.3nM，62.5nM，125nM，250nM和500nM DV23K10R对于凝血酶(1.65nM)的抑制(实线)。通过将数据拟合进入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}而获得的表观抑制常数(Ki’)是19.1±1.9nM。基于等式Ki’＝Ki(1+S/Km)计算的抑制常数(Ki)是0.600±0.010nM(n＝3，误差条代表S.D.)。
图20显示了注射了不同肽的斑马鱼幼虫的延迟阻塞时间(time-to-occlusion，TTO)。向斑马鱼4dpf(受精后天数)幼虫中注射10nl500μM的不同肽或10nl PBS作为对照。通过在注射肽或PBS之后激光切除20分钟使幼虫尾静脉损伤。记录激光切除之后的TTO，持续150秒，以比较不同肽的抗血栓效应。PBS、蛭素类似物-1、s-variegin、EP25和MH22的TTO分别是19.0±3.2秒、45.0±5.5秒、120.8±7.4秒、22.5±6.2秒和33.3±2.9秒。在150秒内，在注射了DV24K10RYsulf的幼虫中没有形成血栓。除了慢结合抑制剂EP25之外，肽的延长TTO的能力大体上与它们的Ki相关(n＝4误差条代表S.D.)。
图21显示了硫酸精蛋白的中和肽对于凝血酶胺裂解活性的抑制的能力：使用发色底物S2238进行测定。将硫酸精蛋白(3mg/ml，1mg/ml，0.3mg/ml，0.1mg/ml，0.03mg/ml，0.01mg/ml，0.003mg/ml和0.001mg/ml)与浓度为其IC50的肽一起温育10分钟(实线)-8.25nM s-variegin(■)，11.5nMMH22(●)和1.4nM DV24K10RYsulf(▲)，然后加入凝血酶(1.65nM)。以100μM S2238测定凝血酶的胺裂解活性。比较了存在和不存在硫酸精蛋白的情况下的抑制百分比，以计算撤销百分比。s-variegin和MH22可以被撤销至相似程度，但是需要更高浓度的硫酸精蛋白以有效撤销DV24K10RYsulf。
以浓度为其IC90的肽进行了类似的实验(虚线)：对于s-variegin是167nM(□)，对于MH22是224nM(○)，对于DV24K10RYsulf是13.6nM(△)。需要更高浓度的硫酸精蛋白以撤销所有3种肽。s-variegin和MH22仍然被中和至相同的程度，中和DV24K10RYsulf则更难。因此，肽的酸性C-末端残基最有可能负责与硫酸精蛋白的结合。
本发明通过以下实施例进一步诠释，以下实施例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用方式并入本文。
实施例
在全部实施例中使用以下参数的实例和定义：
V＝(VmaxS)/(S+Km)
其中V是反应的最初速率，S是底物S2238的浓度，Km是底物对于酶(凝血酶)的Michaelis-Menten常数。
y＝A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)H]
其中y是抑制百分比，A2是右水平渐近线，A1是左水平渐近线，x是抑制剂浓度的log10，x0是拐点，H是曲线的斜率。通过将‘50’代入y计算IC50。
Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}
其中Vs是在存在抑制剂的情况下的稳态速率，Vo在不存在抑制剂的情况下观察到的速率，Et是总酶浓度，It是总抑制剂浓度，Ki’是表观抑制常数。
Ki’＝Ki(1+S/Km)
其中Ki’随着S线性增大，Ki是抑制常数，S是底物浓度，Km是对于S2238的Michaelis-Menten常数。
Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)]
其中α是抑制剂对于酶针对酶底物的亲和性的修饰常数，同样地，底物对于酶针对抑制剂的亲和性的效应。当一个的结合支持另一个时，α＜1；当一个的结合阻止另一个时，α＞1；当α＝1时，一个的结合对于另一个无影响。对于混合类型的非竞争性抑制剂，α＜1或者＞1。
Ki’＝Ki
其中Ki’随着S增大而保持恒定，Ki是抑制常数，S是底物S2238的浓度，Km是S2238的Michaelis-Menten常数。
P＝Vft+(Vi-Vf)(1-e-kt)/k+Po
k＝K4+K3It/[It+Ki`(1+S/Km)]
其中Ki是总体抑制常数。
Ki＝Ki`[K4/(K3+K4)]
其中P是形成的产物的量，Po是产物的最初的量，Vf是最终稳态速率，Vi是初速率，t是时间，k是表观一级速率常数。
实施例1-结合于凝血酶的s-variegin的晶体结构的测定
材料s
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、HEPES钠盐和聚乙二醇(PEG)8000来自Sigma Aldrich(St.Louis，Missouri，USA)。结晶托盘和油脂购自Hampton Research(Aliso Viejo，California，USA)。
肽的合成、纯化和质谱
使用固相肽合成方法在Applied Biosystems Pioneer Model 433APeptide Synthesizer(Foster City，California，USA)上合成本研究中使用的所有肽。在预装载了各个C-末端氨基酸的支持物树脂上组装合成的肽，其切割以释放在C-末端具有游离羧酸的肽。通过DMF中的20％v/v哌嗪除掉氨基酸的Fmoc基团，并使用HATU/DIPEA以原位中和化学法偶联。合成的肽从树脂上的切割以及侧链保护基团的切割通常使用TFA/1，2-乙二硫醇/茴香硫醚/水(90∶4∶4∶2％v/v)的混合物在室温进行，持续2小时。使用冷的乙醚沉淀合成的肽。将沉淀的肽溶解于水或0.1％TFA中并冻干，然后纯化。
通过RP-HPLC在
纯化系统(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上使用SunFireTM C18(
5μm；250mm x 10mm)(Waters，Milford，Massachusetts)柱将合成的粗肽纯化至匀质。通常使用由两种溶剂的组合产生的优化的线性洗脱梯度(溶剂A：水中的0.1％TFA；溶剂B：水中的0.1％TFA和80％乙腈)洗脱肽。
要特别注意的是含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MH18Ysulf)，其中硫酸酯基团是酸不稳定的。使用90％含水TFA在冰上进行这些肽的切割，持续5小时，如之前所描述过的(Kitagawa等人，2001)。使用含有0.1％FA作为离子配对剂而非TFA的溶剂进行含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MH18Ysulf)和含有磷酸酪氨酸的肽(DV24Yphos和DV24K10RYphos)的纯化。在质谱分析的离子化过程中，Tyr27上的硫酸酯部分不稳定的，因此观察到非硫酸化的物质。硫酸化肽的鉴定是基于：(1)肽的非硫酸化的物质；(2)与酪氨酸残基在280nm吸收UV不同，硫代酪氨酸残基不吸收；和(3)硫酸化和非硫酸化肽在RP-HPLC不共同洗脱。
凝血酶
α-凝血酶的两种不同来源——重组α-凝血酶(基于人α-凝血酶的序列)和源自人血浆的凝血酶，均为Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute(KAKETSUKEN，Japan)惠赠。重组α-凝血酶在HiTrapTM Desalting Column(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上以20mM碳酸氢铵(NH4HCO3)脱盐并冻干，然后用于结晶。源自人血浆的凝血酶用于测定肽对于凝血酶的抑制活性。
凝血酶-s-variegin复合物的结晶
修改并优化了已报道的用于结晶人α-凝血酶的凝血酶-蛭素原和凝血酶-蛭素类似物-1复合物的结晶条件(Skrzypczak-Jankun等人，1991)。将冻干的s-variegin溶解于含有375mM NaCl的50mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中，达到8.34μM(3mg/ml)的浓度。然后，将脱盐的、冻干的、重组的α-凝血酶溶解于该s-variegin溶液中，达到5.56μM(20mg/ml)的终浓度。该混合物中的s-variegin的量相对于凝血酶为1.5倍过量。使用悬滴气相扩散法进行凝血酶-s-variegin复合物的结晶。通常而言，将1μl蛋白溶液与1μl沉淀剂缓冲液(100mM HEPES缓冲液pH 7.4，其中含有20％-25％(w/v)PEG 8000)混合，然后在4℃以1ml沉淀剂缓冲液进行平衡。在大约4周之后出现晶体，2周后收获之以进行数据收集。设立、生长和收获晶体的整个过程在冷室(4℃)中进行，因为晶体在室温是不稳定的。
数据收集
在数据收集之前，将晶体简单地浸于含有母液的补充了25％(v/v)甘油的冷冻保护溶液中，并闪冷于100K的氮(气)冷流(Cryostream cooler，Oxford Cryosystem，Oxford，United Kingdom)。在Beamline X29(NationalSynchrotron Light Source，Brookhaven，USA)中测定同步加速器数据。使用Quantum 4-CCD检测器收集数据集(表1)。使用程序HKL2000(Otwinowskiand Minor，1997)处理衍射数据。晶体属于单斜晶系空间组C2并衍射最大至的分辨率， 
和
并对应于59.09％的溶剂含量。
结构之解决和精修
使用MolRep程序(Vagin and Teplyakov，2000)，通过分子替代法解决凝血酶-s-variegin复合物的结构。使用凝血酶-蛭素类似物-3结构的坐标(PDB代码1ABI)(Qiu等人，1992)作为搜索模型。旋转搜索定位了非对称单元中的一个凝血酶-肽复合物分子。确定转换成分之后的刚性体精修给出了0.60的相关系数，并且R＝0.48。得到的电子密度图质量很好。傅立叶和差别傅立叶图谱清楚地显示了s-variegin的电子密度。使用7.0版本的程序O(Jones等人，1991)进行的图谱拟合和使用1.1版本的程序CNS(Brunger等人，1998)进行的精修的数个循环产生R值的收敛。结晶学和精修统计显示于表1。使用PROCHECK(Laskowsi等人，1993)验证该模型的空间化学的正确性。使用在线服务器PISA(Krissinel and Henrick，2007)分析蛋白(图2)。
表1-来自当前模型的结晶学数据和精修统计
结晶学数据和精修统计*
*来自当前模型的统计。
aRsym＝∑hkl∑I[|Ii(hkl)-<I(hkl)>|]/∑hklI(hkl)
bRwork＝∑|Fobs-Fcalc|/∑|Fobs|其中Fcalc和Fobs分别是计算的和观察的结构因子幅度。
cRfree＝关于Rwork，但是对于随机选择的8.0％的总反射并且从精修中省略。
表2-凝血酶-s-variegin复合物与其它结构之间的均方根偏差(RMSD)
2HGT和1ABI表示在活性位点和外部位点-I均抑制的凝血酶，类似于凝血酶-s-variegin复合物。1HGT表示仅在外部位点-I抑制的凝血酶。1PPB表示仅在活性位点抑制的凝血酶。2AFQ表示抑制剂和无-Na+凝血酶。与2AFQ相比发现最高差别，主要由于在“慢”型凝血酶中表面环中的广泛变化。RMSD由Cα，凝血酶A-链和B-链以及C末端区段(DFEA(E)IPEEYL)的骨架和侧链原子计算，该区段在s-variegin，蛭素类似物-1，蛭素类似物-3和蛭素原中是相同的。NP：相关原子不存在。
实施例2-被凝血酶切割之后产生variegin的非竞争性抑制剂
材料、凝血酶、合成方法、纯化和肽的质谱分析如实施例1所描述。
切割的RP-HPLC分析
在室温在含有100mM NaCl和1mg/ml BSA的50mM Tris缓冲液(pH7.4)中温育肽与重组α-凝血酶。设立无凝血酶的反应混合物作为对照。在多个温育时间之后，以0.1％TFA缓冲液(pH 1.8)猝灭反应并装载入连接于
纯化器的SunFireTM C18柱。除了存在于对照反应混合物与0分钟的温育的色谱图中的那些峰之外的新的峰鉴定为切割产物，并进行ESI-MS以验证它们的质量。将峰积分以计算峰下面积和每个峰的相对百分比，以确定切割程度。
凝血酶对肽的切割
Variegin被假设为规范地结合凝血酶的活性位点，因此认为其可以被凝血酶切割，这类似于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂(Witting等人，1992；Bodeand Huber，1992)。因此，我们检测了凝血酶对s-variegin的切割及其对于肽活性的效应。RP-HPLC分析显示在37℃和室温(～25℃)，凝血酶的确切割s-variegin。在温育0分钟时，仅存在对应于全长s-variegin和凝血酶的峰。随着温育时间的延长，出现了2个新的切割产物峰并增大(图3)。这些新的峰分别具有1045Da(SDQGDVAEPK；SEQ ID NO：2)和2582Da(MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES；MH22；SEQ ID NO：3)的质量，并对应于Lys10-Met11肽键处的切割。切割在37℃(图3A)比在25℃(图3B)时快。
切割产物MH22对于凝血酶胺裂解活性的抑制
为了测定variegin的切割产物是否确实负责其延长的活性，合成了切割的C-末端片段(MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES；MH22；SEQ ID NO：3)。选择该片段主要是由于：通过X-射线衍射获得的凝血酶-variegin结构的初步数据表明MH22在切割后与凝血酶结合。
MH22的抑制常数Ki
使用S2238作为底物测定MH22的抑制常数Ki。MH22是快且紧密结合的抑制剂。在存在不同浓度的S2238的情况下，使用等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}确定表观抑制常数Ki’。s-variegin的Ki’随着S2238的浓度增大而线性增大(如等式Ki’＝Ki(1+S/Km)所示)，与其不同，MH22的Ki’值随着S2238浓度的变化保持恒定。曲线的该行为适合描述非竞争性抑制剂的等式，其中α＝1(使用等式Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)])，因此Ki’＝Ki(如等式Ki’＝Ki所示)。通过线性回归拟合Ki’值得出Ki值为14.11±0.29nM(图7)。当以源自人血浆的凝血酶测定时，s-Variegin显示出0.318±0.020nM的Ki(重组α-凝血酶的Ki是0.146±0.014nM)。因此，全长的肽s-variegin是竞争性抑制剂，其切割产物MH22是凝血酶活性位点功能的非竞争性抑制剂。
MH22以等摩尔浓度(～15％)抑制凝血酶的胺裂解活性，并且抑制的进程曲线显示：在混合后达到了稳态平衡。因此，类似于s-variegin，MH22是快且紧密结合的抑制剂。剂量应答曲线显示IC50值为11.46±0.71nM(图5)。源自人血浆的凝血酶的s-Variegin抑制具有8.25±0.45nM的IC50值(图5)，稍高于重组α-凝血酶(5.40±0.95nM)的IC50值(数据未显示)。
证明了MH22非竞争性抑制凝血酶。通常而言，非竞争性抑制剂结合于远离酶活性位点的位点，并且空间异构地抑制活性位点功能。然而，MHKT四肽紧邻裂解键。直观上讲，该区段与凝血酶的结合似乎在活性位点内。本实验中使用的底物S2238具有D-Phe-Pipecolyl-Arg-pNA的化学结构，其Arg侧链插入凝血酶S1次位点，切割发生于Arg-pNA之间。由于pNA部分在胺裂解过程在紧邻裂解键处也占据S1’，因此，理论上其存在应该干扰MH22与相同位点的结合。在这样的情况下，α应该＞1(使用等式Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)])，并且Ki针对底物浓度的作图应该随着底物浓度的增加而以双曲线方式增加(Copeland，2000)。这种类型的非竞争性抑制通常被称作“混合抑制”。然而，在我们的实验条件下，表观抑制常数Ki’随着底物浓度的变化保持严格恒定。因此，MH22作为经典的非竞争性抑制剂发挥作用，其以相同的亲和性与游离的凝血酶和凝血酶-底物复合物结合(图8)。同样地，关于pNA干扰MH22结合的假设是不成立的。因此，MH22与pNA在凝血酶上的结合位点是非重叠的，这说明紧邻裂解键之后的残基(Met11)可能不与凝血酶结合或在除了通常观察到的S1’之外的不同位点结合。
实施例3-variegin变体的设计和表征
基于凝血酶-s-variegin结构以及凝血酶相互作用中可获得的背景信息设计了13种新的variegin变体。一般方法是：首先优化variegin的长度，然后优化variegin上的数个关键位置以获得与凝血酶的最大相互作用(图12)。
实施例4-凝血酶抑制活性
通过它们在S2238上抑制凝血酶胺裂解活性的能力测定s-variegin(SEQ ID NO：1)、EP25(SEQ ID NO：6)、MH22(SEQ ID NO：3)和蛭素类似物-1(SEQ ID NO：14)的活性。
使用发色底物S2238，通过抑制重组α-凝血酶的胺裂解活性来测定每种肽的活性。所有的测定在96孔微量滴定板中在含有100mM NaCl和1mg/ml BSA的50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中在室温进行。通常将100μl肽与100μl重组α-凝血酶预温育不同的时间段，然后加入100μl S2238。每个实验的细节与代表所获得的结果的图形一起描述。使用SPECTRAMaxPlus微板分光光度计，在405nm追踪有色产物pNA的形成速率，持续10分钟。通过将不存在抑制剂的情况下吸收值的增加速率定为0％来计算抑制百分比。使用Origin软件拟合剂量应答曲线，以计算IC50值，使用下列logistic sigmoidal等式：y＝A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)H]，其中y是抑制百分比，A2是右水平渐近线，A1是左水平渐近线，x是抑制剂浓度的log10，x0是拐点，H是曲线的斜率。通过将‘50’代入y计算IC50。
使用相同的测定法确定预温育时间(及由此的切割)对于肽的凝血酶抑制活性的影响：改变预温育时间和/或BSA的浓度。对于用来确定在延长的温育时间内凝血酶外部位点-I的完整性的实验，通过在28小时预温育后加入或不加入新鲜制备的抑制剂来进行平行实验组。将获得的所有数据使用Origin软件拟合进入y＝A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)H]等式以计算IC50值，
对于紧密结合抑制，拟合进入等式：Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}；
对于竞争性抑制，拟合进入等式Ki’＝Ki(1+S/Km)；
对于非竞争性抑制，拟合进入等式Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)]；
对于经典的非竞争性抑制，拟合进入等式Ki’＝Ki；
对于慢结合抑制，拟合进入等式P＝Vft+(Vi-Vf)(1-e-kt)/k+Po；
对于计算解离常数，拟合进入等式k＝K4+K3It/[It+Ki`(1+S/Km)]；
对于计算总抑制常数，拟合进入Ki＝Ki`[K4/(K3+K4)]。
EP21和MH18对凝血酶胺裂解活性的抑制
复合物结构中的4个s-variegin C-末端残基[V(29DDES32)]的电子密度的缺失表明这4个残基不可能与凝血酶强烈地相互作用。此外，这些残基不存在于蛭素类似物或蛭素原中。考虑到s-variegin与蛭素类似物/蛭素原的C-末端构象之间的巨大差异，研究这些残基的作用将是有趣的。设计并表征了两个截短的变体：EP21(SEQ ID NO：8)和MH18(SEQ ID NO：9)，它们分别对应于EP25和MH22，但缺少那些4个C-末端残基。由于EP25和s-variegin以相同的亲和性与凝血酶结合，所以没有合成s-variegin的C-末端截短变体。
EP21(SEQ ID NO：8)对凝血酶的抑制的进程曲线显示了在不存在预温育的情况下的两相平衡，其为典型的慢结合抑制剂。EP21活性依赖于预温育的时间。IC50从176.9±6.8nM(无预温育时)下降至16.2±2.9nM(在20分钟预温育之后)(图13A)。通过将数据拟合进入等式P＝Vft+(Vi-Vf)(1-e-kt)/k+Po，k＝K4+K3It/[It+Ki`(1+S/Km)]，和Ki＝Ki`[K4/(K3+K4)]，计算出EP21抑制凝血酶的抑制常数Ki为0.315±0.024nM(图13B)。所有的数值类似于EP25(SEQ ID NO：6)的数值，这表明4个C-末端残基的截短不显著改变肽活性。
MH18(SEQ ID NO：9)以等摩尔浓度(～15％)抑制凝血酶胺裂解活性，并且在混合之后达到了稳态平衡。因此，MH18是凝血酶的快的紧密结合抑制剂。剂量应答曲线显示IC50值为10.9±1.2nM(无预温育)和11.7±1.9nM(在20分钟预温育之后)(图14A)。这些值基本上与使用MH22(SEQ IDNO：3)获得的数据相同。使用100μM S2238获得了MH18的表观抑制常数Ki’，将数据拟合进入等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}(图14B)。假设MH18是如同MH22一样的非竞争性抑制剂，使用等式Ki’＝(S+Km)/[(Km/Ki)+(S/αKi)]和Ki’＝Ki得出抑制常数Ki为14.9±3.5nM，这与MH22的Ki是一致的。这组数据确认了以上的结论：4个C-末端残基不参与凝血酶结合。
DV24对凝血酶胺裂解活性的抑制
我们之前的数据证明了variegin的7个N-末端残基负责其快速结合动力学；当被除掉时，结合特性从快速变为慢速，亲和性不变(数据未显示)。然后，我们推论高度碱性的凝血酶外部位点-II可以辅助操纵variegin的N-末端残基(在其序列1SDQGDVA7中含有2个带负电的残基)成为接近活性位点的最佳方向，从而允许迅速形成短期相互作用。由于凝血酶外部位点-II位于距离活性位点大约处(Page等人，2005)，所以该距离理论上可以被延伸的构象中的至少3个N-末端残基包括。为了产生保留快速结合性质的肽，我们设计并表征了在EP21的N-末端延伸了3个残基的肽。2个酸性N-末端残基中的1个，VAsp5，存在于该变体中，该变体被称作DV24(SEQ ID NO：10)。
与就慢结合抑制剂通常所观察到的两相平衡不同，DV24(SEQ ID NO：10)对于凝血酶抑制的进程曲线类似于s-variegin：在混合之后达到稳态平衡。因此，DV24是快的紧密结合抑制剂。DV24的活性随着预温育时间的增加而降低，这是由于被凝血酶切割。剂量应答曲线显示IC50值为7.49±0.28nM(无预温育)和10.07±0.60nM(20分钟预温育之后)(图15A)。假设其为竞争性抑制，使用等式Vs＝(Vo/2Et){[(Ki’+It-Et)2+4Ki’Et]1/2-(Ki’+It-Et)}和Ki’＝Ki(1+S/Km)得出抑制常数Ki为0.306±0.029nM，这与s-variegin的Ki一致(图15B)。因此，我们设法设计出比s-variegin短8个残基但保留快速结合动力学和相同的Ki的肽。
DV24K10R对凝血酶胺裂解活性的抑制
variegin与其它凝血酶底物/抑制剂之间的一个区别是在裂解键的P1位置存在Lys。通常而言，在凝血酶底物中，Arg存在于该位置。Arg的侧链胍基团与S1次位点中的TAsp189的侧链羧基之间的静电相互作用通常是优选的。相反，P1 Lys通常通过水分子与Asp189相互作用(Perona和Craik，1995)，导致降低的亲和性和特异性(Vindigni等人，1997)。凝血酶-s-variegin结构中的裂解键[V(1SDQGDVAEPK10)]之前的残基的电子密度的缺失可能暗示了该区段内对于凝血酶的强亲和性的缺乏。因此，使用DV24作为模板序列，在新变体中将P1残基Lys10替换为Arg，该新变体被称作DV24K10R(SEQ ID NO：11)。
在无预温育的情况下获得的DV24K10R的IC50是6.98±0.76nM，其类似于DV24的IC50(7.49±0.28nM)。然而，在20分钟预温育之后，DV24K10R的IC50是12.01±0.41nM，稍高于DV24(10.07±0.60nM)的IC50。在存在P1Arg的情况下，肽的切割有可能进行得较快(图16A)。对于凝血酶的亲和性稍有增大，如Ki值少量下降至0.259±0.015nM所示(与DV24的0.306±0.029nM相比)(图16B)。因此，将Lys10替换为Arg仅仅极小地改善了variegin对于凝血酶的亲和性，虽然之前观察到P1Lys的结合一般是P1Arg的1/10(Page等人，2005)。考虑到该观察结果，随后在设计新变体时通常在P1位置上的Lys和Arg二者上进行。
DV23和DV23K10R对凝血酶胺裂解活性的抑制
将VPhe20的苯基插入到凝血酶的非极性腔中并通过π-π堆积与TPhe34相互作用。该相互作用也存在于蛭素类似物、蛭素原和蛭素复合物结构中，并标记C-末端区段的起始-DFEA(E)IPEEYL-其中s-variegin和蛭素类似物/蛭素原几乎是相同的。在s-variegin中，在P1Lys残基与Phe之间存在9个残基[V(11MHKTAPPFD19)]。然而，在蛭素类似物-1/3中，相同的距离上仅有8个残基(4PGGGGNGD11)。凝血酶-s-variegin的结构分析显示：VPro16和VPro17在其骨架中诱导了纽结，引起远离凝血酶稍向上弯曲。这继而又引起VPhe18和VAsp19从蛭素类似物-3中的它们的对应残基处-Gly10和Asp11-移位大约
和
如通过它们的Cα原子之间的距离所测(图17)。重要的是，蛭素类似物-3的Asp11与TArg73形成离子配对，在类似的VAsp19与TArg73之间是不存在的。事实上，VAsp19侧链以相反方向指向溶剂，在VAsp19 Oδ与TArg73 NH2之间产生
的距离(图17)。因此，从s-variegin序列中删除了Pro16以除掉骨架中的纽结，以使VAsp19重新定位，以恢复离子相互作用。使用DV24和DV24K10R作为模板序列，设计、合成并表征了变体DV23(SEQ ID NO：13)和DV23K10R(SEQ ID NO：12)。
DV23和DV23K10R都显示出低于它们的模板的活性。DV23的IC50值是45.4±1.6nM(无预温育)和77.8±6.1nM(在20分钟预温育之后)(图18A)。DV23的Ki是2.19±0.23nM(图18B)。所有的数值的平均值是DV24活性的～1/7。另一个变体DV23K10R的活性也低于其模板DV24K10R。该肽对于肽的IC50值是12.9±1.0nM(无预温育)和101.9±1.2nM(20分钟预温育)(图19A)。DV23K10R的Ki是0.600±0.010nM(图19B)。其对于凝血酶的亲和性是大约DV24K10R的1/2。虽然不与凝血酶预温育时DV23K10R的活性高于DV23，但是在20分钟预温育之后，趋势相反。这与下列观察是一致的：在P1具有Arg的肽(DV24K10R)以快于在P1具有Lys的肽(DV24)的速率被凝血酶水解。此外，活性的迅速丧失也暗示：切割产物不再有力地抑制凝血酶。因此，VPro16的删除似乎对于完整肽和切割产物二者的活性都具有不利影响。考虑到variegin的P’残基靠近VPro16，该残基的除掉可能破坏了首要次位点内的相互作用。
实施例5-凝血酶抑制剂与凝血酶活性位点之间的相互作用以及催化三联体的残基的移位
在所观察的17个s-variegin残基中，选择的少数N-末端残基是特别受关注的。将凝血酶-s-variegin的结构与凝血酶-蛭素原的结构(PDB：1HGT)进行比较，因为它们具有一个共同特征——二者都占据外部位点-I而非活性位点的非首要次位点(因为s-variegin的N-末端切割片段不存在)。在3个催化残基(THis57、TAsp102和TSer195)中，最显著的区别在于TSer195的Oγ原子。在凝血酶-s-variegin结构中，TSer195 Oγ被移位结果，在凝血酶-s-variegin结构中不存在与THis57的Nε之间的氢键(其本该是催化电荷中继系统的一部分)。两个原子之间的距离增加至
(图9A)。凝血酶-蛭素原中的对应距离是
(图9A)。TSer195 Oγ的移位是由于与s-variegin的相互作用。特别地，VHis12、TSer195、TGly193和TCys42之间的新的和更广泛的氢键网络以及水分子打乱了催化电荷中继网。重要的是，VHis12骨架N(供体)通过氢键
啮合TSer195的Oγ(受体)，而VHis12侧链Nδ(受体)能与TSer195 Oγ(供体)形成弱的氢键另外，VHis12骨架N也与TGly193的骨架N和TCys42的Sγ通过水分子形成氢键。有效地，TSer195的Oγ上的电子离开原位进入该氢键网络，赋予它弱亲核性，并且不能有效攻击底物的骨架碳。另外，由于TGly193的主链N参与该氢键网络，阻止了氧负离子孔的形成，进一步降低了该复合物的催化能力(图9B)。
在活性位点裂口周围，包括非首要次位点(由裂解键N-末端的底物残基占据)和Na+结合环，没有观察到其它主要的结构变化。这说明s-variegin的C-末端切割片段(MH22；SEQ ID NO：3)不影响小的肽基底物例如S2238的结合亲和性。该观察支持就MH22观察到的经典的非竞争性抑制剂。如图8所示，底物(S2238)与凝血酶的结合(Ks)不受MH22的影响，但是由于效率低的催化，反应的产物形成速率(kp)降低。所观察到的经典的非竞争性抑制的条件排除了由S2238的pNA部分占据的相同位点中VMet11的结合。该假设得到下列的支持：在该结构中不存在VMet11密度。因此，VMet11可能不与凝血酶直接接触，并且在复合物中是混乱的。在VMet11与凝血酶之间不存在相互作用与下列想法是一致的：凝血酶S1’优选具有小侧链的残基，例如Gly、Ala或Ser(Bode等人，1992)。
实施例6-variegin与凝血酶的外部位点之间的相互作用以及variegin平滑适合进入凝血酶的峡谷样裂口中
除了氢键的广泛网络之外，s-variegin P2’至P5’(VHis12、VLys13、VThr14和VAla15)与凝血酶之间的其他相互作用进一步使该部分锚定于凝血酶的首要次位点。观察到由60-环、自我水解环和34-环中的残基形成的s-variegin的VHis12至VAla15与凝血酶表面之间的广泛界面接触(图10)。将残基与残基对比发现：相对于蛭素类似物-3的P2’(Gly5)，s-variegin的P2’(VHis12)朝着活性位点被移位
(通过Cα原子的移位来测定)。该差异可以部分通过下列解释：在蛭素类似物-3中使用β-同-Arg作为P1，这使P1’的骨架原子移位大约1个键长。也可能是由于VHis12参与凝血酶活性位点中的广泛的氢键网络，这使残基更靠近TSer195(图9B)。因此，VHis12侧链占据了在蛭素类似物-3中观察到的小的S1’次位点的一部分。VHis12骨架O与TLys60F Nζ形成氢键
s-variegin结构中的P2’VHis12被TCys42、THis57、TTrp60D、TLys60F、TGlu192和TSer195围绕并与其接触。VHis12占据S1’的一部分限制了可用于容纳P1’VMet的大侧链的空间。因此，P1’VMet可能指向溶剂。P3’VLys侧链与TGlu192侧链靠近且平行，允许这俩碱基的脂肪族侧链之间的疏水性相互作用。然而，VLys13与TGlu21之间的强离子配对是不太可能的，因为两个电荷之间的距离大于 VLys13的骨架也与TLeu41接触。P4’VThr侧链似乎直接朝向自我水解环的底部，由于环的柔性性质，使得分析较不确定。但是，侧链占据由TGly142，TAsn143，TGlu192，TGly193和TGlu151排列成的小腔。在VThr14 Oγ与TGlu192骨架O
和TAsn143 Oδ
之间形成氢键。P5’Ala侧链深埋于Leu40排列的峡谷样裂口的底部，提供了疏水性接触。
凝血酶-s-variegin在外部位点-I中的结合主要由疏水性相互作用驱动。整个s-variegin紧密适合进入从凝血酶活性位点延伸至外部位点-I的峡谷样裂口中(图11A&B)。这些环之间的很多非极性残基排列于裂口的底部。裂口的壁由凝血酶活性位点附近的60-环和自我水解环以及外部位点-I附近的34-环和70-环形成(Rydel等人，1991；Bode等人，1992；Huntington，2005)。s-variegin与凝血酶的结合主要由非极性底部和裂口壁中的疏水性接触驱动。参与结合的凝血酶残基是：(i)在这些表面环的底部：TMet32、TLeu40、TLeu41、TCys42、TLeu65、TArg67、TLys81、TIle82和TMet84；(ii)在60-环中：TTrp60D和TLys60F；(iii)在自我水解环中：TGly142、TAsn143和TGln151；(iv)在34-环中：TPhe34、TLys36、TPro37、TGln38和TGlu39；(iv)在70-环中：TArg73、TThr74、TArg75、TTyr76和TArg77A(图11C)。特定的侧链相互作用是重要的，因为除了整个s-variegin多肽链上的5个残基(VPhe18、VAsp19、VAla22、VGlu26和VTyr27)之外的所有残基的侧链都埋于与凝血酶的界面中(图11D)。同样，所观察到的最强的疏水性接触中的一些包括：(1)VPhe20与TMet32、TPhe34(π-π堆积)和TLeu40；(2)VIle23与TPhe34、TLeu65、TTyr76和TIle82；(3)VPro24与TTyr76。
与峡谷样裂口的底部的非极性性质不同，这些环、尤其是70-环的顶部表面主要是带正电的残基。这些碱性残基包括TArg35、TLys36、TArg73、TArg75、TLys81、TArg77A、TLys109、TLys110和TLys149E，在非极性的峡谷样裂口上形成带正电的入口。虽然在s-variegin C-末端中存在多个酸性残基(VAsp19、VGlu21、VGlu25和VGlu26)，但在VGlu21与TArg75之间仅形成1个离子对。有趣的是，在蛭素类似物、蛭素原和蛭素结构中，类似的Glu与2倍对称相关分子的TArg75形成离子对(Rydel等人，1990；Skrzypczak-Jankun等人，1991；Qiu等人，1992)。
该相互作用被指发生于溶液中的相同的凝血酶-抑制剂对中，虽然在结构上没有观察到它(Rydel等人，1990)。相对于蛭素类似物-3的TArg75，在我们的结构中，TArg75侧链在Cγ周围被旋转96.8°，以促进与VGlu21的静电相互作用，提供了关于存在预测的相互作用的结构上的证据。类似地，在蛭素类似物-1/3和蛭素原结构中，仅观察到1个离子对。然而，该相互作用是在TArg73和对应于VAsp19的Asp之间。在凝血酶-s-variegin结构中形成等同的离子对是不可能的，因为VAsp19侧链以相反方向指向溶剂。侧链方向上的该变化最可能是由于s-variegin中的扭结，其是由Pro16-Pro17诱导的。
在峡谷样裂口的底部是相对平坦的由凝血酶残基TAsp63-TIle68和TLys81-TLeu85形成的表面。虽然彼此靠近地存在，但是s-variegin的C-末端残基VPro24至VLeu28在该表面的顶部松散地堆积，其中两个侧链(VGlu26和VTyr27)指向溶剂(图11D)。虽然具有相似的序列，但是，当与蛭素类似物-3/蛭素原比较时，该s-variegin区段为不同的构象。相对于受限的峡谷样裂口，该区域周围的相对开放的表面可以负责以上讨论的蛭素/蛭素类似物/蛭素原/s-variegin C-末端的构象异质性。
实施例7-静脉血栓的动物模型
材料
成年斑马鱼和斑马鱼幼虫维持于北德克萨斯大学生物科学系(Department of Biological Sciences，University of North Texas，Denton，Texas，USA)。
肽的合成、纯化和质谱
所有的肽的合成、纯化和质谱分析沿用实施例1中描述的程序。
斑马鱼的饲养
以两个1L的槽组装饲养斑马鱼的槽。切掉1个槽的底部并置于无菌网上。然后，将该槽插入具有完整底部的第二个槽中。然后，在光循环的末期，将一对斑马鱼置于饲养槽中。所述的网用于分离顶部槽中的斑马鱼的对。在下一次光循环的前2小时内，第一条开始产卵，在网的保护下，在饲养槽的底部收集卵。除掉鱼后，将饲养槽中的水通过盐水捕虾网过滤，其保留卵。立即将网在含有E3培养基(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mMCaCl2，0.33mM MgSO4和10-5％亚甲蓝)的Petri培养皿中倒置，释放卵和其它污染性物质，例如粪便。然后将卵转移至具有塑料巴斯德移液管的新鲜的E3培养基中。重复该清洗步骤2次，然后将卵转移至新的槽并维持于28.5℃以孵化。
微注射
使用受精后4天(dpf)的幼虫测定肽在静脉血栓模型中的体内活性。使用具有牵引于垂直的移液管拔具(Knopf，Tujunga，California)上的玻璃注射针头(3.5-in.capillaries)的Nanoject II(Drummond，Broomall，Pennsylvania，USA)进行肽的静脉内微注射。使用小的剪刀夹住牵引的针头的尖端并注入溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中的500μM的肽。将10nl肽或PBS通过后(尾部)主静脉注射进入幼虫的循环。
斑马鱼幼虫封装于琼脂糖中
将每个注射了肽的幼虫置于加入了6μl三卡因溶液(用于麻醉)的10mM 0.5ml蒸馏水中。向其中加入含有幼虫等体积的1％低熔点琼脂糖溶液(维持于35℃水浴中)的水。将混合物(含有麻醉的幼虫)倒入玻璃显微镜载玻片上的长方形垫圈内，以将幼虫恰好以其大小封装于琼脂糖中。
激光切除
使用通过香豆素440染料(445nm)泵运的脉冲的氮激光(MicroPointLaser system，Photonic Instrument，St Charles，Illinois，USA)，以10个脉冲/秒，以设定为10的激光强度，进行幼虫静脉的激光切除。在切除之前测定激光的精确性。在微注射肽之后20分钟进行每个幼虫的激光切除。将玻璃载玻片置于Optipnot相差荧光显微镜(Nikon，Melville，New York，USA)下。以20倍镜头(10倍目镜)观察幼虫以定位用于激光切除的位点，其为：距离肛门孔的尾部末端5个体节处(数据未显示)。瞄准切除位点内的尾部静脉的激光束被激发3秒。使用连接于家庭影院系统(VHS)记录仪和监视器的数码相机记录该过程。监视由于激光切除造成的静脉损伤之后的血栓的形成，并记录损伤的静脉完全阻塞所需的时间。
使用斑马鱼幼虫的静脉血栓模型，选择了5种抑制剂作为代表性的肽以测定它们的体内抗血栓效应。它们是：(1)s-variegin(天然variegin的全长序列；快速紧密结合竞争性抑制剂；Ki＝0.318±0.020nM；SEQ ID NO：1)；(2)EP25(无7个N-末端残基，具有类似于凝血酶的亲和性，但其为慢结合抑制剂；Ki＝0.370±0.11nM；SEQ ID NO：6)；(3)MH22(切割产物，其为快速紧密结合非竞争性抑制剂；Ki＝14.11±0.29nM；SEQ ID NO：3)；(4)DV24K10RYsulf(具有有力的体外活性的肽；Ki＝0.0420±0.0061nM；SEQ ID NO：16)；和(5)蛭素类似物-1(目前市场上的快速紧密结合竞争性抑制剂；Ki＝2.94±0.12nM；SEQ ID NO：14)。蛭素类似物-1用作实验的阳性对照。
所有5种肽以单剂(500μM，10nl)通过后(尾部)主静脉注射进入斑马鱼幼虫的循环。通过在激光切除之后所有的肽延迟尾静脉的阻塞时间(TTO)的能力来测定肽的抗血栓效应。在激光切除之后，野生型4dpf幼虫的对照TTO是大约21秒(Jagadeeswaran等人，2006)。通常而言，如果血栓形成被抑制(由于抗血栓试剂或遗传缺陷)，TTO可以被延长至150秒，在这之内不会发生完全阻塞(Seongcheol Kim，私人通信)。因此，基于一些初步实验仔细选择了注射剂量(500μM，10nl)，以使得可以获得多数(如果非全部)肽的确定的TTO(数据未显示)。
注射了相同体积的PBS的斑马鱼幼虫具有19.0±3.2秒的TTO(平均值±S.D.)(图20)。s-variegin(Ki＝0.318±0.020nM)强烈抗血栓，具有120.8±7.4秒的TTO。与此相反，EP25虽然具有类似于s-variegin的Ki，但不显示任何活性。EP25的TTO为22.5±6.2秒，相对于注射了PBS的相同批次的幼虫，其不显示任何显著的抗血栓效应。MH22(Ki＝14.11±0.29nM)显示出良好的活性，TTO为33.3±2.9秒。DV24K10RYsulf(Ki＝0.0420±0.0061nM)是最有力的抑制剂，其完全抑制了血栓形成(数据未显示)。蛭素类似物-1/比伐卢定(Ki＝2.94±0.12nM)，作为参考药物，延长了TTO至45.0±5.5秒。总体上，除了EP25之外，肽的抗血栓效应与它们对于凝血酶的亲和性良好相关联。因此，慢结合抑制模式(EP25)对于体内功效是不理想的，而快速竞争性(s-variegin、DV24K10RYsulf及蛭素类似物-1)和快速非竞争性(MH22)抑制是有效的(图20)。我们的结果与之前报告的关于快速凝血酶抑制对于有效抗血栓试剂的重要性的类似观察(Stone和Tapparelli，1995)是一致的。
实施例8-肽对于凝血酶的抑制活性的中和
使用发色底物S2238测定了硫酸精蛋白中和肽对凝血酶胺裂解活性的抑制的能力。精蛋白是最初提取自鱼精子细胞核的高度阳离子性肽的混合物。硫酸精蛋白在临床上用于通过结合阴离子性肝素分子而撤销肝素的抗凝效应(Schulman和Bijsterveld，2007)。Variegin在其C-末端具有数个可作为硫酸精蛋白靶标的酸性残基。该选择是首次开创，因为关于施用硫酸精蛋白具有充分的临床经验。
所有的测定在96孔微量滴定板中在含有100mM NaCl和1mg/mlBSA的50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中在室温进行。通常将100μl肽与100μl硫酸精蛋白预温育10分钟，然后加入50μl源自人血浆的凝血酶。加入50μl S2238以启动反应。使用SPECTRAMax Plus微板分光光度计(Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)，在405nm测定有色产物pNA的形成速率，持续10分钟。比较了存在和不存在硫酸精蛋白的情况下的抑制百分比以计算撤销百分比。
将固定浓度的s-variegin、DV24K10RYsulf和MH22(在它们各自的IC50和IC90)与多个浓度的硫酸精蛋白一起温育，然后测定它们的残余的凝血酶抑制活性。硫酸精蛋白以剂量依赖性方式撤销了所有3种肽的效应(图21)。s-variegin和MH22的活性被撤销至相似的程度。在s-variegin(8.25nM)和MH22(11.5nM)的IC50，以0.1mg/ml的硫酸精蛋白达到了大约50％的撤销。撤销百分比在大约75％达到饱和，虽然有高浓度的硫酸精蛋白。与此相反，对于DV24K10RYsulf的IC50浓度(1.4nM)，需要1mg/ml的硫酸精蛋白以达到～50％的撤销。如所预期，中和IC90时的肽所需的硫酸精蛋白的浓度更高于IC50时的肽所需的硫酸精蛋白的浓度(图21)。因此，硫酸精蛋白能够中和多数variegin肽的效应。s-variegin和MH22具有相同的C-末端(由MH22序列代表)，但是DV24K10RYsulf C-末端(由MH18Ysulf序列代表)是硫酸化的并且具有针对凝血酶的更强的亲和性。s-variegin和MH22被中和至相似的程度。需要更高浓度的硫酸精蛋白以撤销DV24K10RYsulf。因此，硫酸精蛋白与肽之间的结合可能是通过variegin肽的酸性C-末端介导的。
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Witting，J.I.，Bourdon，P.，Brezniak，D.V.，Maraganore，J.M.，and Fenton，J.W.(1992).蛭素类似物-1对凝血酶的特异性抑制和缓慢切割.生化杂志.283(Pt 3)，737-743(Thrombin-specific inhibition by and slow cleavage ofhirulog-1.Biochem.J.283(Pt 3)，737-743).
Cho Yeow Koh，Maria Kazimirova，Adama Trimnell，Peter Takac，MilanLabuda，Patricia A.Nuttall，and R.Manjunatha Kini(2007)生物化学杂志，282(40)29101-29113(J.Biol.Chem，282(40)29101-29113).
序列表
SEQ ID NO：1(s-variegin)
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES
SEQ ID NO：2(varigein切割产物)
SDQGDVAEPK
SEQ ID NO：3(MH22)
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES
SEQ ID NO：4(variegin E31H)
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS
SEQ ID NO：5(MH22A22E)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
SEQ ID NO：6(EP25)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES
SEQ ID NO：7(EP25A22E)
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
SEQ ID NO：8(EP21)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：9(MH18)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：10(DV24)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：11(DV24K10R)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：12(DV23K10R)
DVAEPRMHKTAPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：13(DV23)
DVAEPKMHKTAPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：14(蛭素类似物)
DFPRPGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：15(MH22A22E)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES
SEQ ID NO：16(DV24K10RYsulf)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEY*L(*Y是硫酸化的)
SEQ ID NO：17(Hirullin-P18)
VSYTDCTSGQNYCLCGGNFCGDGKHCEMDGSENKCVDGEGTPKRQTSGPSDFE
EFSLDDIEQ
SEQ ID NO：18(蛭素变体-1)
VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：19(蛭素变体-2)
AICVSQAITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPN
PESHNNGDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：20(蛭素-3B′)
VVYTDCTESGQNLCLCQGSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：21(蛭素-3B)
VVYTDCTESGQNLCLCQDSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：22(蛭素-3A′)
VVYTDCTESGEDLCLCEGSNVCGEGNKCILGSDGEKNECVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：23(蛭素-3A)
VVYTDCTESGQNLCLCEDSNVCGEGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：24(蛭素)
VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPGPQSHND
GDFEEPEEYL
SEQ ID NO：25(蛭素-HM2)
MFSLKLFVVFLAVCICVSQAVSYTDCTESGQNYCLCVGSNVCGEGKNCQLSSSG
NQCVHGEGTPKPKSQTEGDFEEIPDEDILN
SEQ ID NO：26(蛭素-HM1)
MFSLKLFVVFLAVCICVSQAVSYTDCTESGQNYCLCVGGNLCGGGKHCEMDGS
GNKCVDGEGTPKPKSQTEGDFEEIPDEDILN
SEQ ID NO：27(蛭素-3)
VVYTDCTESGQNLCLCEDSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：28(蛭素-2B)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDG
DFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：29(蛭素-2′)
ITYTDCTESGQDLCLCEGSDVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDG
DFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：30(蛭素-2)
ITYTDCTESGQDLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDG
DFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：31(蛭素-2A)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGNGNKCKLGSDGEENQCVTGEGTPKPQSHND
GDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：32(蛭素-P6)
MRYTACTESGQNQCICEGNDVCGQGRNCQFDSSGKKCVEGEGTRKPQNEGQH
DFDPIPEEYLS
SEQ ID NO：33(蛭素-PA)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSQGKDNQCVTGEGTPKPQSHNQG
DFEPIPEDAYDE
SEQ ID NO：34(来自美国专利US 5985833的序列25)
NGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：35(来自美国专利US 5985833的序列24)
VEYEALYPEDD
SEQ ID NO：36(来自美国专利US 5985833的序列23)
EVEYEALYPEDD
SEQ ID NO：37(来自美国专利US 5985833的序列22)
AEVEYEALYPE
SEQ ID NO：38(来自美国专利US 5985833的序列21)
AEVEYEALYPED
SEQ ID NO：39(来自美国专利US 5985833的序列20)
AEVEYEALYPEDD
SEQ ID NO：40(来自美国专利US 5985833的序列19)
EALYPEDDL
SEQ ID NO：41(来自美国专利US 5985833的序列3)
VSVEHEVDVEYP
SEQ ID NO：42(来自美国专利US 5985833的序列4)
VRVEHHVEIEYD
SEQ ID NO：43(来自美国专利US 5985833的序列5)
NGDFEEIPEEYLQ
SEQ ID NO：44(来自美国专利US 5985833的序列6)
FPRFPRP
SEQ ID NO：45(来自美国专利US 5985833的序列7)
QSHNDG
SEQ ID NO：46(来自美国专利US 5985833的序列9)
AVRPEHPAETEYESLYPEDDL
SEQ ID NO：47(来自美国专利US 5985833的序列10)
PEHPAETEY
SEQ ID NO：48(来自美国专利US 5985833的序列11)
EHPAETEYESLYPEDDL
SEQ ID NO：49(来自美国专利US 5985833的序列12)
EHPAETEFESLYPEDDL
SEQ ID NO：50(来自美国专利US 5985833的序列13)
AETEYESLYPEDDL
SEQ ID NO：51(来自美国专利US 5985833的序列14)
VRPEHPAEVEYEALYPEDDL
SEQ ID NO：52(来自美国专利US 5985833的序列15)
PEHPAEVEY
SEQ ID NO：53(来自美国专利US 5985833的序列16)
EHPAEVEYEALYPEDDL
SEQ ID NO：54(来自美国专利US 5985833的序列17)
AEVEYEALYPEDDL
SEQ ID NO：55(来自美国专利US 5985833的序列18)
EYEALYPEDDL
SEQ ID NO：56(来自美国专利US 5985833的序列1)
AGDV
SEQ ID NO：57(来自美国专利US 5985833的序列2)
VRPEHPAETEYESLYPEDDL
SEQ ID NO：58(推定的凝血酶抑制剂[黑脚硬蜱(Ixodes scapularis)])
MHQEGDFKMGHCSDLKVSALEIPYKGNKMSMVILLPEDVEGLSDLEEHLTAPK
LLALLGGMYVTSDVNLHFPKFKLEQSMGLKDVLMAMGVKDFFTFLADLSGISA
TGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAILMDCIPQVVNFFVDHPFMFLICSH
DPDAVLFMGSIREL
SEQ ID NO：59(推定的抑制剂[黑脚硬蜱])
MHQKGDFKMGHCSDLKVTALEIPYKGNKMSMIILLPEDVEGLSVLEEHLTAPKL
SALLGGMYVTPDVNLRLPKFKLEQSIGLKDVLMAMGVKDFFTSLADLSGISAAG
NLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAIPMMLMCARFPQVYNFFVDHPFMFLIH
SHDPDVVLFMGSIREL
SEQ ID NO：60(推定的凝血酶抑制剂[黑脚硬蜱])
MASDFSNSLISFSVDLYKKLKSESDGASNFICSPFSIAAALSMTLAGAKHDTAKQI
SNALHMQDTTVHENFAYFFSKLPGYAPDVILHVANRLYAEETYNTLDEFTHLLE
KSYSTTVEKVDFKRNAEKTRLQVNTWVEEVTQSKIKDLLAEGTIDDFTSLIIINA
VYFKGLWHDQFDPKRTSQQEFHLTADRTKMVDMMHHKQRFRMCRHPNFKVS
ALEIPYKGQKMSMVILLPEEIDGLADLEETLTSSKIREIIQELSYQGDIELSLPRFKL
EHTVGLKNVLAAMGIEDMFDALKCDLSGISPDNALVVSDVVHKAFIEVNEEGTE
AAAATAMVMLCCMSFPTRFTVDHPFLFLIRCHDPDVILFIGSVAQI
SEQ ID NO：61(丝氨酸蛋白酶抑制剂[多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)])
MFAKTSFIPFTQALYAQLQPSEGRSNFFMSPLSVYSALSLALAGSESETREELVSV
LGLAPGKDIDTIVKSLGENLQAVADGDAKKTLVEANGVFIQAGSQIRETYTSAV
SKHLKADMKQLDFGGDSEGSRISINRWIAEKTREKVKDLLAQGSITPMTHVVLA
NAVYFKGVWKCKFEKSKTDRSGVFHSLDSGDVRVSMMTQKASYPMADFVDLE
VRALKVPFETHEMLIVLPEKNDGLPNLLKQLSANAKHLEEMLTSDQYFDTEVVL
KLPKFSLGGHNMKLKEPLHKMGLKSAFDAERADFSGITNDRSLAVSDVYHQAV
IDVDEEGAEAAAATAMPMMVRCMPAPPVDFFVDHPFIFFIVTKTGIPVFMGHVV
HPESK
SEQ ID NO：62(thrombostasin前体[厩刺蝇(Stomoxys calcitrans)])
MKYFVFIGIIALSAVSQAQNGRWQGDLHGLSGHRGSGLPGLSGHRGSGQPGLSG
HRGSEQSGEAGAPSYDYFSQPGLSGSRRHGQRDLEVEDSRPARSLDPLNSVPEW
NENDEDDHEFGPYRKPQDNQRDRRRPQRSFDS
FYSVPEWNEDNEADQGYRKRQDNQQNRHRAQPQRPLHPHYSHPEWEEEDEGD
QQFGRYRKPHDNQQDRRRGKAQPQMRLHPFNSHPEWEDEDEGDQQFGPYRRP
QDNQQNRRGESRPIRSNGDELSSDDQLASFFGFPAGDVPEDLKNLVRLFSGPNN
DFGGNNQFEED
SEQ ID NO：63(抗凝血酶-III)
MISNGIGTVTAGKRSICLLPLLLIGLWGCVTCHRSPVEDVCTAKPRDIPVNPMCIY
RSSEKKATEGQGSEQKIPGATNRRVWELSKANSHFATAFYQHLADSKNNNDNIF
LSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYR
KANKSSELVSANRLFGGKSITFNETYQDISEVVYGAKLQPLDFKGNAEQSRLTIN
QWISNKTEGRITDVIPPQAINEFTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKA
DGESCSVLMMYQESKFRYRRVAESTQVLELPFKGDDITMVLILPKLEKTLAKVE
QELTPDMLQEWLDELTETLLVVHMPRFRIEDSFSVKEQLQDMGLEDLFSPEKSR
LPGIVAEGRSDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTVISIAGRSLNSDRVTFKAN
RPILVLIREVALNTIIFMGRVANPCVD
SEQ ID NO：64(α-1-抗胰蛋白酶样蛋白GS55-MS)
MPSSISWGLLLLAGLSCLVAGSLAEDAQETGASKHDQEHPASHRIAPNLAEFALS
LYRVLAHESNTTNIFFSPVSIAMALASLSLGTKADTHTQIMEGLGFNLTETAESDI
HQGFQHLLQTLNKPNSQLQLTTGNGLFIDHNLKLLDKFLQDVKNLYHSEAFSTD
FTNTEEAKKQINTYVEKGTQGKIVDLVKDLNRDSVLALVNYIFFKGKWEKPPFEV
DHTKEEDFHVDQVTTVRVPMMNRMGMFEVHYCSTLASWVLQMDYLGNATAI
FLLPDEGKLQHLEDTITKEILAKFLKNRESSSVNLHFPKLNISGTMDLKPVLTRLG
ITNVFSYKADLSGITEDDPLRVSQALHKAVLTIDERGTEAAGATFLEMMPMSLPP
EVKFDKPFLVVIIEHSTKSPLFVGKVVNPTLH
SEQ ID NO：65(未命名的蛋白产物[智人(Homo sapiens)])
MLKKPLSAVTWLCIFIVAFVSHPAWLQKLSKHKTPAQPQLKAANCCEEVKELK
AQVANLSSLLSELNKKQERDWVSVVMQVMELESNSKRMESRLTDAESKYSEM
NNQIDIMQLQAAQTVTQTSADAIYDCSSLYQKNYRISGVYKLPPDDFLGSPELEV
FCDMETSGGGWTIIQRRKSGLVSFYRDWKQYKQGFGSIRGDFWLGNEHIHRLSR
QPTRLRVEMEDWEGNLRYAEYSHFVLGNELNSYRLFLGNYTGNVGNDALQYH
NNTAFSTKDKDNDNCLDKCAQLRKGGYWYNCCTDSNLNGVYYRLGEHNKHL
DGITWYGWHGSTYSLKRVEMKIRPEDFKP
SEQ ID NO：66(神经丝氨酸蛋白酶抑制剂[小鼠(Mus musculus)])
MTYLELLALLALQSVVTGATFPDETITEWSVNMYNHLRGTGEDENILFSPLSIAL
AMGMMELGAQGSTRKEIRHSMGYEGLKGGEEFSFLRDFSNMASAEENQYVMK
LANSLFVQNGFHVNEEFLQMLKMYFNAEVNHVDFSQNVAVANSINKWVENYT
NSLLKDLVSPEDFDGVTNLALINAVYFKGNWKSQFRPENTRTFSFTKDDESEVQI
PMMYQQGEFYYGEFSDGSNEAGGIYQVLEIPYEGDEISMMLALSRQEVPLATLE
PLLKAQLIEEWANSVKKQKVEVYLPRFTVEQEIDLKDILKALGVTEIFIKDANLT
AMSDKKELFLSKAVHKSCIEVNEEGSEAAAASGMIAISRMAVLYPQVIVDHPFL
YLIRNRKSGIILFMGRVMNPETMNTSGHDFEEL
SEQ ID NO：67(神经胶质-衍生的连接素)
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHG
IASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTV
ANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRD
MIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQ
VPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHIST
KTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITT
GSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPT
GAVLFMGQINKP
SEQ ID NO：68(神经胶质-衍生的连接素)
MNWHFPFFILTTVTLYSVHSQFNSLSLEELGSNTGIQVFNQIIKSRPHENVVVSPH
GIASILGMLQLGADGKTKKQLSTVMRYNVNGVGKVLKKINKAIVSKKNKDIVT
VANAVFLRNGFKMEVPFAVRNKDVFQCEVQNVNFQDPASASESINFWVKNETR
GMIDNLLSPNLIDGALTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPESTKKRTFVAGDGKSY
QVPMLAQLSVFRSGSTRTPNGLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHIT
TKTIDSWMNTMVPKRMQLVLPKFTAVAQTDLKEPLKALGITEMFEPSKANFTKI
TRSESLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFSIRHNP
TGAILFLGQVNKP
SEQ ID NO：69(神经丝氨酸蛋白酶抑制剂)
MAYLGLLSLVALQSLVTGAAFPDETIAEWSVNVYNHLRATGEDENILFSPLSIAL
AMGVMELGAQGSTLKEIRHSMGYESLKSGEEFSFLRDFSSMVSAEEGQYVMKI
ANSLFVQNGFHINEEFLQMMKMYFNAEVNHVDFSENVAVANYINKWVENYTN
SLLKDLVSPGDFDAVTHLALINAVYFKGNWKSQFRPENTRTFSFTKDDESEVQIP
MMYQQGEFYYGEFSDGSNEAGGIYQVLEIPYEGDEISMMLVLSRQEVPLATLEP
LLKPQLIEEWANSVKKQKVEVYLPRFTVEQEIDLKDILKALGVTEIFIKDANLTA
MSDKKELFLSKAVHKSFIEVNEEGSEAAVASGMIAISRMAVLFPQVIVDHPFLFLI
KNRKTGTILFMGRVMHPETMNTSGHDFEEL
SEQ ID NO：70(丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化枝C，成员1[智人])
MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICTAKPRDIPMNPMCIY
RSPEKKATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIF
LSPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYR
KANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAI
NKWVSNKTEGRITDVIPSEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYK
ADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKV
EKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKS
KLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFK
ANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK
SEQ ID NO：71(肝素辅因子II[非洲爪蟾(Xenopus laevis)])
MKLLHLATIFLLIHATLGGVKDLQEHFEDTSTGINPRGSQTQAVENLLDDTVTN
DLSTEGEDEEDYLDFDKIFGEDEDYIDIIDAAPEIKNSETQQGNIFELFHGKTRVQ
RLNIINANFGFNLYRAIKNNTDASENILLAPVGISTAMATISLGTKGQTLEQVLLT
LGFKDFLNASSKYEILTLHNVFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDIYVKRDFLIREPF
KNNLKNYYFAEAQTVDFGYKDFLTKANKRIQQLTKGLIEEALTNVDPALLMLL
VNCIYFKGTWENKFPVEYTQNMNFRLNEKELVKVPMMKTKGNFLVAADPELD
CAVLQLPYVGNISMLIVLPHKLSGMKLLEKQISPQVVERWQNIMTNRTREVFLP
RFKLEKSYDLQKVLSNMGATDLFTHGDFSGVSDKDINIGLFQHQGTITVNEEGT
EAAAVTVVGFMPLSTQARFVADRPFLFLIYEHRTNCLVFMGRVANPTKS
SEQ ID NO：72(肝素辅因子II[红原鸡(Gallus gallus)])
GTFCGIKDFSDHFESLKDAHTHENGTYNMPDLPLEFHRENTITNDLIPEEEEEED
YLDLDKILGEDDYSDIIDAAPHIVSEIQQGNILELFQGKTRIQRLNILNANFGFNLY
RSVADKANSSDNILMAPVGISTAMAMISLGLKGQTQQEVLSVLGFEDFINASAK
YELMTVHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYIRKDFSILNDFRNNMKTYYFA
DAQPADFSDPNFITKTNERILKLTKGLIKEALVNVNPTTLMMILNCLYFKGTWEN
KFPVEMTTKRSFRLNEKQTIKVPMMQTKGNFLAAA PELDCGVIQLPFVGNISM
LIVLPHKLSGMKALEKQITPQVVEKWQKSMTNRTREVVLPKFKLEKNYNLIGFL
RSMGIEELFSEKGNYCGVSEEKVSIDRFNHQGTITVNEEGTEAGAITNVGFMPLS
TQIRFIVDRPFLFLIYEHRTNCLLFMGRVVNPAKP
SEQ ID NO：73(肝素辅因子2)
MQHRPHLLLISLTIMSVCGGSNGLTDQLNNKNLTMPLLPIEFHKENTVTNDWIPE
GEEDDDYLDLEKLLSEDDDYIDIIDAVSPTDSEASAGNILQLFQGKSRIQRLNILN
AKFAFSLYRALKDQANAFDNIFIAPVGISTAMGMISLGLKGETHEQVHSVLHFR
DFVNASSKYEILTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYVQKQFPIREDFKAK
VREYYFAEAQAADFSDPAFISKANNHILKVTKGLIKEALENVDPATQMMILNCI
YFKGTWVNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELACDV
LQLEYVGGISMLIVVPHKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKF
KLEKNYNLVEALKSMGVTELFDKNGNMSGISDQGITMDLFKHQGTITVNEEGT
QAAAVTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGKVANPVRS
SEQ ID NO：74(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支D，成员1前体[小鼠])
MKHPLCTLLSLITFMCIGSKGLAEQLTNENLTTSFLPANFHKENTVTNDWIPEGE
EDEDYLDLEKLLGEDDDYIYIIDAVSPTDSESSAGNILQLFQGKSRIQRLNILNAK
FAFNLYRVLKDQATTSDNLFIAPVGISTAMGMISLGLRGETHEEVHSVLHFRDFV
NASSKYEVTTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNGLYIQKQFPIREDFKAAMRE
FYFAEAQEANFPDPAFISKANNHILKLTKGLIKEALENIDPATQMLILNCIYFKGT
WVNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDILQLEYV
GGISMLIVVPRKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNY
NLVEVLKSMGITKLFNKNGNMSGISDQRIAIDLFKHQSTITVNEEGTQAAAVTTV
GFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGKVTNPAKS
SEQ ID NO：75(肝素辅因子2)
MKHPAYTLLLSLIMSMCAGSKGLAEQLTKENLTVSLLPPNFHKENTVTNDWIPE
GEEDDDYLDLEKLLSEDDDYIYVVDAVSPTDSESSAGNILQLFQGKSRIQRLNIL
NAKFAFNLYRVLKDQATSSDNIFIAPVGISTAMGMISLGLRGETHEEVHSVLHFK
DFVNASSKYEVTTHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLQSVNDLYIQKQFPIREDFKAA
MREFYFAEAQEADFSDPAFISKANSHILKLTKGLIKEALENTDSATQMMILNCIY
FKGAWMNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDIL
QLEYVGGISMLIVIPRKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKL
EKNYNLVEVLKSMGITKLFNKNGNMSGISDQRIIIDLFKHQSTITVNEEGTQAAA
VTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGRVANPAKS
SEQ ID NO：76(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支D，(肝素辅因子)，成员1[斑马鱼(Danio rerio)])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESI
PLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFY
EPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPV
GISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRL
FRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKA
NQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRV
NEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRS
LEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKG
DFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFLFL
IYEHRTGCVVFMGRVVDPSQT
SEQ ID NO：77(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支D，(肝素辅因子)，成员1[斑马鱼])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESI
PLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFY
EPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPV
GISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRL
FRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKA
NQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRV
NEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRS
LEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKG
DFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFLFL
IYEHRTGCVVFMGRVVDPSQS
SEQ ID NO：78(丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化支D，(肝素辅因子)，成员1[合成构建体])
MWMLQRGVDQPGRLSLCSVFPPSFSSAKMKHSLNALLIFLIITSAWGGSKGPLD
QLEKGGETAQSADPQWEQLNNKNLSMPLLPADFHKENTVTNDWIPEGEEDDDY
LDLEKIFSEDDDYIDIVDSLSVSPTDSDVSAGNILQLFHGKSRIQRLNILNAKFAFN
LYRVLKDQVNTFDNIFIAPVGISTAMGMISLGLKGETHEQVHSILHFKDFVNASS
KYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYIQKQFPILLDFKTKVREYYFAE
AQIADFSDPAFISKTNNHIMKLTKGLIKDALENIDPATQMMILNCIYFKGSWVNK
FPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDILQLEYVGGISM
LIVVPHKMSGMKTLEAQLTPRVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNYNLVES
LKLMGIRMLFDKNGNMAGISDQRIAIDLFKHQGTITVNEEGTQATTVTTVGFMP
LSTQVRFTVDRPFLFLIYEHRTSCLLFMGRVANPSRS
SEQ ID NO：79(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支D，(肝素辅因子)，成员1[斑马鱼])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESI
PLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFY
EPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPV
GISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRL
FRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKA
NQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRV
NEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRS
LEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKG
DFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFPFL
IYEHRTGCVVFMGRVVDPSQT
SEQ ID NO：80(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAA
QMAQILSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRMANRLFGEKSCDFLSS
FRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINTWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTR
LVLVNAVYFRGNWDEQFDKENTEERLFKVSKNEEKPVQMMFKQSTFKKTYIGE
IFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEEV
EVSLPRFKLEESYDMESVLRNLGMTDAFELGKADFSGMSQTDLSLSKVVHKSFV
EVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHSKTNGILFCGRFSSP
SEQ ID NO：81(凝血酶抑制剂[智人])
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMS CALAMVYMGAKGNTAA
QMAQILSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRVANRLFGEKSCDFLSS
FRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINTWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTR
LVLVNAVYFRGNWDGQFDKENTEERLFKVSKNEEKPVQMMFKQSTFKKTYIGE
IFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEEV
EVSLPRFKLEESYDMESVLRNLGMTDAFELGKADFSGMSQTDLSLSKVVHKSFV
EVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHRKTNGILFCGRFSSP
SEQ ID NO：82(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAA
QMAQVLSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGEKSCDFLSS
FRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINSWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTR
LVLVNAVYFKGNWNEQFDKENTEERRFKVSKNEEKPVQMMFMQSTFRKTYIG
EIFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEK
VEVSLPRFKLEESYDMESVLCSLGMTDAFELGKADFSGMSKADLCLSKVVHKS
FVEVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHSKTNGVLFCGRF
SSP
SEQ ID NO：83(类似于胎盘凝血酶抑制剂(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)同种型2[狗(Canis familiaris)])
MDTLSEANGTFAISLLKKLGEDGSKNVFFSPMSISSALSMVFMGAKGNTAAQMS
QTLSLSKSGGGGDVHQGFQALLNEVNSAEARYLLRTANRLFGEKTCGFLSSFKD
SCRTFYQAEMEELDFLSACEQSREHITAGVTEGRKVKTRGKIVDLLSPGSVDPGT
NLILVNAFYFKGNWDKQFNKEQTTERPFKVSKNEKKPVQMMFKKSTF
QMTYIGEIFTKILVLPYVGRELNMIIMLPDENVSLETVETELTYEKFTEWTRPDM
LDEEEVEVFLPRFKLEEEYDMKAVLCSLGMTDAFEQSKADFSGMSSRGDLYLS
KVVHKSFVEVNEEGTEAAAASAAVMMLRCARIVPRFCADRPFLFFIQHSKSRSV
LFCGRFSSP
SEQ ID NO：84(类似于胎盘凝血酶抑制剂(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)同种型3[狗])
MDTLSEANGTFAISLLKKLGEDGSKNVFFSPMSISSALSMVFMGAKGNTAAQMS
QTLSLSKSGGGGDVHQGFQALLNEVNSAEARYLLRTANRLFGEKTCGFLSVSPL
SPARKIVDLLSPGSVDPGTNLILVNAIYFKGNWDKQFNKEQTTERPFKVSKNEK
KPVQMMFKKSTFQMTYIGEIFTKILVLPYVGRELNMIIMLPDENVSLETVETELT
YEKFTEWTRPDMLDEEEVEVFLPRFKLEEEYDMKAVLCSLGMTDAFEQSKADF
SGMSSRGDLYLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAASAAVMMLRCARIVPRFCADRP
FLFFIQHSKSRSVLFCGRFSSP
SEQ ID NO：85(类似于丝氨酸蛋白酶抑制剂B6(胎盘凝血酶抑制剂)(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)同种型1[Equus caballus])
MDTLSEANGTFALNLLKKLGEDNSKNVFFSPMSISSALAMVFMGAKGNTAAQM
SQVLSLSKSGGEVGDVHQGFQSLLSEINRPGTQYLLRTANRLFGEKSYDFLSSFK
DSCHKFYQAEMEQLDFISATEESRKHINTWVAKKTEGKITELLSSDSVDLLTKLI
LVNAIYFKGNWDDQFDKQQTKERPFKVSKNEEKPVQMMFKKSTFKRTYIGEIFT
QILMLPYVGEELNMIIMLPDENTDLKTVEKELTYEKFVEWTRPDMMDETEMEV
FLPRFKLEEDYDMEAVLRSLGMTDAFEQARADFSGMSSRADLFLSKVVHKSFV
EVNEEGTEAAAATAAVMMMRCVRIIPRFCADHPFLFFIQHSKTNSILFCGRFSSP
SEQ ID NO：86(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)
MDPLQEANGTFALNLLKILGEDSSKNVFLSPMSISSALAMVFMGAKGTTASQM
AQALALDKCSGNGGGDVHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGDKTCDLL
ASFKDSCLKFYEAELEELDFQGATEESRQHINTWVAKKTEDKIKEVLSPGTVNS
DTSLVLVNAIYFKGNWEKQFNKEHTREMPFKVSKNEEKPVQMMFKKSTFKMT
YIGEIFTKILLLPYVSSELNMIIMLPDEHVELSTVEKEVTYEKFIEWTRLDKMDEE
EVEVFLPKFKLEENYNMNDALYKLGMTDAFGGRADFSGMSSKQGLFLSKVVH
KAFVEVNEEGTEAAAATAGMMTVRCMRFTPRFCADHPFLFFIHHVKTNGILFCG
RFSSP
SEQ ID NO：87(类似于凝血酶抑制剂同种型2[黄牛(Bos taurus)])
MEELDFLSATEESRKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNAMTRLVLVNAIYFKG
NWDTQFNKEHTKERPFRVSKNMEKPVQMMFKKSTFKSTYIGEISTQILVLPYVG
KELNMVILLPSESTDLNTVEKALTYEKFVTWTKLDVMDEDEVEVFLPRFTLEES
YDMECVLRDLGVTDAFEAAQADFSGMSCQQDLHLSKIVHKSFVEVTEEGTEAA
AATVARITPRILRIVPRFCADHPFLFFIQHSRTGAILFCGRFCSP
SEQ ID NO：88(凝血酶抑制剂[黄牛])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGNSKNVFISPLSISSALAMVLLGAKGNTAAQMC
QTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLSEVNRRDTQYLLRTANRLFGEKTYDFLSSFK
DSCHKFYQAEMEELDFVSATEQSRKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNPMTRL
VLVNAIYFKGNWDTQFNKEHTEERPFRVSKNVEKPVQMMFKKSTCKITYIGEIS
TQILVLPYVGQELNMVILLPSESTDLNTVEKALTYEKFIAWTKPDVMDEEEVEV
FLPRFTLEESYDMEEFLQELGMTDAFEETRADFSGMSSGRGLHLSKVMHKSFVE
VTEEGTEAAAATGAVVMMRCLMVVPRFNANHPFLFFIQHSKTGAILFCGRFCSP
SEQ ID NO：89(类似于凝血酶抑制剂[灰色短尾负鼠(Monodelphis domestica)])
MVMNFPITFEPNILLSGSQVYKRWCVRMPALSEANNTFALNFFKKIGEEESEENV
FYSPLSLYYALTMVLEGATGETAEQIQQVLSLSKNTDVHQSFQSFLAEVNKTGA
PPLLRVANALFGEKTCGFLSPFKESCQKFYFSNVEELDFAHMPEAARKHINDWV
EEKTEGKISELLANDSVDVMTNLVLVNAIYFNGKWEKPFDKAKTAEKMFNISEK
KQKPVQMMYQRSTFSMTFIEDIPTQILVLPYAGGHMDMVILLPVENKHLKMLK
KRLTSENLVDWINPEMMNEIEVEVFLPKFILAEHLDVEVILQKLGMLDAFDKTK
ADFSKMSARNDLCLSKVIHKAYVEVNEEGTVAVSSTAAVMMTRSERMSLEFKA
DHPFIFYLIEKQTNKIVFIGEVTSP
SEQ ID NO：90(类似于胎盘凝血酶抑制剂(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)(丝氨酸蛋白酶抑制剂B6)[褐家鼠(Rattus norvegicus)])
METLNVRRQILTRSSPDDFGMLSIKITSGEMLKDLESLRLAFWDSKKVSILLSVS
DEIVQLTIMDPLLKANGNFAIKLFKVLGEDISKNVFFSLPSISSALSMILMGANGT
TASQICQAMSLDKCNSIGGGDVHQHFLSLLTKVNKTDTRCMLRKANSVFIEDSF
EILASFKDACHKLYEAEIEELDFKGAPEQSRQHINTWVAKKTEDIIRELLPPCTVN
SNTCLFLVNVIYFKGSLEKPFNKADTREMPFKVSMVTTVHLLNERKSVYMFYKI
STFKMTYVEEVSTKILLLLYVSIELTMIMLFSPRGWKHEIVGGCANCLDARDRN
KAQIEEWACALRHLPAASGVKWDSACPEVEIMDSFHMKFSSELHFGLDFSLLCG
WTESFVVLSKRYASEKQVSKPLFS
SEQ ID NO：91(类似于丝氨酸蛋白酶抑制剂B6(胎盘凝血酶抑制剂)(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)[猕猴(Macaca mulatta)])
MAAGKASGESEEASPSLTAEEREALGGLDRWRQDEGPTGQGKAAASRSADTVS
PAGAALAPGPAAGSALIVAADDGRGASGKLFPASALPPPTVNGRVSGAGPFLEP
GQHSVSLEAPETRRWGPELVKAKASGQGGVDPRVPPRLSQCSGPGTPPASPRVF
EVRGGSGVSTRRSTRSPPWVGKAGGASVCGGRGSGAGQRAAGPGTRVGQRRA
GTREPREWGVAARGCDPRRPSRAGARASVRLGFPSGASQLRRTATRPVGRAWP
RARPVTPLTRGPRAHRPSAHGRGGRRGMGAAQSLPGHRSAIMDVLAEANGTFA
LNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAAQMAQVLSFNKSG
GGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGEKSCDFLSSFRDSCQKFYQAE
MEELDFISAVEKSRKHINSWVAEKTEGENVLLSTRNSI
SEQ ID NO：92(类似于丝氨酸蛋白酶抑制剂B6(胎盘凝血酶抑制剂)(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6)(PI-6)[猕猴])
MAKAHYRFLTENSQAVAVFTRIEIGRFAHIRKSRGLRDPPRPPAQAPAGLTVMD
ALSEGNGTFALNLLKKLGENNSPNLKILFGNWQGPNKEKPVQMMFKKSTFQMT
YAKEILNKILVLSYVGKELNMLPDENTDLKMLMSVEKELSYERLIEWTKPDNM
HEREMEVFLPRFKLEETYNMEDVLRSMDMVDALEQDRADLKDLYLSKVMHKS
FVEVNEEGTEAAAATTEEIVLCCASYSLRFCADHPFLFFIQHNKTNGILFCCRFSS
P
SEQ ID NO：93(类似于凝血酶抑制剂[黄牛])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGNSKNVLIAPLSISSALAMVLLGARGNTAAQM
CQTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLCEVNRTDTRYLLRTANRLFGEKTYNFLSSF
KDSCRKFYQAEMEELDFVCATEESRKHINTWVAEKTEGKIRDLLSANSVYPMT
CLVLVNAIYFKGNWDKQFYKVHTKERPFQVSKVNKTVQMMFRKSTFKMTY
IAEICTQILVLPYVGQELNMVILLPRERTDLNTVEKALTYEKFVVWTKPDMLAEE
EVEVFLPRFTLEESYDMECVLRDLGMTDGFNMARADFIGLSCQPGLHLSKVVH
KPFVEVTEEGTEAVAASEARIRGLSLRTVPRFCANRPFLFFIQHSSTGAILFCGRF
CSP
SEQ ID NO：94(类似于凝血酶抑制剂[Bos taurus])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGSSKNVLIAPLSISSALAMVLLGARGNTAAQMC
QTLSLNKSSGGGEDVHQDFQNLLSEVNRTDTQYLLRTANRLFGEKPYDFLSSFK
NACHIFYQAEMEELDFVSATEEPTKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNPMTRL
VLVSAVYFKGNWAKPFLKGRTMEGIFNVCKNVQKRALMIYNWSTFKTACIAEI
CSQILVLPYVGQELNMVILLPFESTDLITVEKALTYEKFVTWTKPDVLAEVEVEV
FLPCFTLEESYDMECVLRDLGMTDAFNAARADFSGMSCQPGLHLSKVMHKSFL
EVTEEGTEAVAASEARIRRSLGVVHHFYANRPFLFFIQHSRTGAILFCGRFCSP
SEQ ID NO：95(α-1-抗胰蛋白酶1-2)
MTPSISWGLLLLAGLCCMVPSFLAEDVQETDTSQKDQSPASHEIATNLGDFAISL
YRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFAMLSLGSKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIH
KSFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQAEVFSVNF
AESEEAKKVINDFVEKGTQGKIVEAVKELDQDTVFALANYILFKGKWKKPFDPE
NTEEAEFHVDKSTTVKVPMMMLSGMLDVHHCSILSSWVLLMDYAGNASAVFL
LPEDGKMQHLEQTLNKELISKILLNRRRRLVQIHIPRLSISGDYNLKTLMSPLGIT
RIFNNGADLSGITEENAPLKLSKAVHKAVLTIDETGTEAAAATVFEAVPMSMPPI
LRFDHPFLFIIFEEHTQSPIFVGKVVDPTHK
SEQ ID NO：96(α-1-抗胰蛋白酶1-1)
MTPSISWGLLLLAGLCCLVPSFLAEDVQETDTSQKDQSPASHEIATNLGDFAISL
YRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFAMLSLGSKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIH
KSFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQAEVFSVNF
AESEEAKKVINDFVEKGTQGKIAEAVKKLDQDTVFALANYILFKGKWKKPFDPE
NTEEAEFHVDESTTVKVPMMTLSGMLHVHHCSTLSSWVLLMDYAGNATAVFL
LPDDGKMQHLEQTLSKELISKFLLNRRRRLAQIHFPRLSISGEYNLKTLMSPLGIT
RIFNNGADLSGITEENAPLKLSQAVHKAVLTIDETGTEAAAVTVLQMVPMSMPP
ILRFDHPFLFIIFEEHTQSPIFLGKVVDPTHK
SEQ ID NO：97(α-1-抗蛋白酶)
MTPSISWGLLLLAGLFCLVPSFLAEDVQETDTSRRDSVPASHDTPYNLELSISLYR
ELGHKSTTSNIFFSQVSIATAFAMLSLGEKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIHKA
FQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGSLLNNDLKLVEKFLEEAKNNYHSEVFSVNFAE
SEEAKKVINDFVEKGTQGKIAEAVKDPDEDTVFALANYILFKGKWKKPFDPKHT
EEAEFHVDTVTTVKVPMMTLTGMLDVHHCSTLSSWVLLMDYLGNRTAVFLLP
DDGKMQHLEQTLNKELISKFLLNRHRRLAQVHLPRLSLSGNYTLNTLMSHLGIT
RIFNNGADLSGITEENAPLKLSKAADKAVLTMDETGTEAAAATVLQAVPMSMP
PILNFNKPFIFIIVEEHTQSPLFVGKVVDPTRK
SEQ ID NO：98(α-1-抗蛋白酶)
MTPSISWRLLLLAGLCCLVPSYLAEDVQETDTSQKDQSPASHEMATNLGDFAFS
LYRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFALLSLGSKGDTQTQILEGLQFNLTQTSEADIH
KVFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQSEVFSVNF
AKSEEARKMINDFVEKGTQGKIVDAVKDLDEDTVFALANYIFFQGKWKTPFDP
EHTTEADFHVNESTTVRVPMMNLMRMLDVHYCSTLSSWVLMMDYLGNATAV
FLLPDDGKMQHLEQTLNKELISKFLLNRHRSLAEIHFPRLSISGSYNLKALMAPL
GITRVFNNGADLSGITEENAPLRLSKAVHKAVLTIDERGTEAAATTIVEAVFMSL
PPILHFNHPFVFTIVETHTQTPLFVGKVVDPTRK
SEQ ID NO：99(α-1-抗蛋白酶)
MAPSISRGLLLLAALCCLAPSFLAEDAQETDTSQQDQSPTYRKISSNLADFAFSL
YRELVHQSNTSNIFFSPMSITTAFAMLSLGSKGDTRKQILEGLEFNLTQIPEADIH
KAFHHLLQTLNRPDSELQLNTGNGLFVNKNLKLVEKFLEEVKNNYHSEAFSVNF
ADSEEAKKVINDYVEKGTQGKIVDLMKQLDEDTVFALVNYIFFKGKWKRPFNP
EHTRDADFHVDKSTTVKVPMMNRLGMFDMHYCSTLSSWVLMMDYLGNATAI
FLLPDDGKMQHLEQTLTKDLISRFLLNRQTRSAILYFPKLSISGTYNLKTLLSSLGI
TRVFNNDADLSGITEDAPLKLSQAVHKAVLTLDERGTEAAGATVVEAVPMSLPP
QVKFDHPFIFMIVESETQSPLFVGKVIDPTR
SEQ ID NO：100(α-1-抗胰蛋白酶)
MKPSISWGILLLAGLCCLVPSFLAEDAQETDASKQDQEHQACCKIAPNLADFSFN
LYRELVHQSNTTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKGVTHTQILEGLGFNLTEIAEAEV
HKGFHNLLQTFNRPDNELQLTTGNGLFIHNNLKLVDKFLEEVKNDYHSEAFSVN
FTDSEEAKKVINGFVEKGTQGKIVDLVKDLDKDTVLALVNYIFFKGKWKKPFD
ADNTEEADFHVDKTTTVKVPMMSRLGMFDVHYVSTLSSWVLLMDYLGNATAI
FILPDDGKMQHLEQTLNKEIIGKFLKDRHTRSANVHFPKLSISGTYNLKTALDPL
GITQVFSNGADLSGITEDVPLKLGKAVHKAVLTIDERGTEAAGATFMEIIPMSVP
PEVNFNSPFIAIIYDRQTAKSPLFVGKVVDPTR
SEQ ID NO：101(α-1-抗胰蛋白酶)
HVEDPQGDAAQKTDTSHHDQEHSTFNKITPSLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFS
PVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLHTLNKPDSQ
LQLTTGNGLFLNKSVKVVDKFLEDVKKLYHSEAFSVNFEDTEEAKKQINNYVE
KGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVEATKEEDFHVDQATT
VKVPMMRRLGMFNIYHCEKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELT
HDIITKFLENENRRSANLHLPKLAITGTYDLKTVLGHLGITKVFSNGADLSGVTE
DAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQN
TKSPLFMGKVVNPTQK
SEQ ID NO：102(α-1-抗胰蛋白酶)
LLLAGLCCLLPGSLAEDPQGDAAQKTDTPPHDQNHPTLNKITPSLAEFAFSLYRQ
LAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLNFNLTEIPEAQVHEGF
QELLRTLNKPDSQLQLTTGNGLFLNKSLKVVDKFLEDVKNLYHSEAFSVNFEDT
EEAKKQINNYVEKGTQGKVVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVEAT
EEEDFHVDQATTVKVPMMRRLGMFNIYHCEKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPD
EGKLQHLENELTHDIITKFLENENRRSANLHLPKLAITGTYDLKTVLGHLGITKV
FSNGADLSGVTEDAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKF
NKPFVFLMIEQNTKSPLFIGKVVNPTQK
SEQ ID NO：103(α-1-抗胰蛋白酶)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNL
AEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLHFNLTEI
PEAQVHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLNESLKLVDKFLEDVKKLYHSD
AFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKW
ERPFEVKDTKEEDFHVDEVTTVKVPMMRRLGMFNIHYCEKLSSWVLLMKYLG
NATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENENRRSASLHLPKLSITGTYDLKRV
LGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAI
PMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFVGKVVNPTQK
SEQ ID NO：104(α-1-抗蛋白酶)
MALSITRGLLLLAALCCLAPISLAGVLQGHAVQETDDTSHQEAACHKIAPNLAN
FAFSIYHHLAHQSNTSNIFFSPVSIASAFAMLSLGAKGNTHTEILKGLGFNLTELA
EAEIHKGFQHLLHTLNQPNHQLQLTTGNGLFINESAKLVDTFLEDVKNLYHSEA
FSINFRDAEEAKKKINDYVEKGSHGKIVELVKVLDPNTVFALVNYISFKGKWEK
PFEMKHTTERDFHVDEQTTVKVPMMNRLGMFDLHYCDKLASWVLLLDYVGN
VTACFILPDLGKLQQLEDKLNNELLAKFLEKKYASSANLHLPKLSISETYDLKSV
LGDVGITEVFSDRADLSGITKEQPLKVSKALHKAALTIDEKGTEAVGSTFLEAIP
MSLPPDVEFNRPFLCILYDRNTKSPLFVGKVVNPTQA
SEQ ID NO：105(α-1-抗胰蛋白酶)
MASSSTWGLLLLAGLCCLVPISLAEGLQGHAVQETDVPRHDHEQHQEAACHRI
APNLADFAFSLYRQVARQSNTSNIFLSPVTIARAFAMLSLGTKGATHAEILEGLQ
FNLTEKAEAEIHEGFQHLLHTLNQPDNQLQLTTGNGLFIDEKAKLVPKFLEDVK
NLYHSEAFSINFRDTEEAKKCINDYVEKGSQGKIVDLVDELDKDTVFALVNYIFF
KGKWEKPFEVEQTTEEDFHVDEETTVKVPMMNRLGMFDLHHCDKLSSWVLLM
DYVATATAFFILPDQGKLHQLEDMLTKEIRAKFLEKRYPSSANLHLPKLTISGTY
DLKSLLGNLGITKVFSDEADLSGVTEEQPLKLSKALHRAVLTIDEKGTEATGATI
LEAIPMSIPPNVKFNKPFLFLIYDTKTKAVLFMGKVMNPTQK
SEQ ID NO：106(α-1-抗蛋白酶F)
MPPSVSRALLLLAGLGCLLPGFLADEAQETAVSSHEQDHPACHRIAPSLAEFALS
LYREVAHESNTTNIFFSPVSIALAFAMLSLGAKGDTHTQVLEGLKFNLTETAEAQ
IHDGFRHLLHTVNRPDSELQLAARNALVVHENLKLQHKFLEDAKNLYQSEAFL
VDFRDPEQAKTKINSHVEKGTRGKIVDLVQELDARTLLALVNYVFFKGKWEKP
FEPENTKEEDFHVNATTTVRVPMMSRLGRYDLFHCSTLASTVLRMDYKGNATA
LFLLPDEGKLQHLEDTLTTELITKFLAKSSLRSVTVHFPKLSISGTYDLKPLLGKL
GITQVFSDNADLSGITEQEPLKASQALHKAVLTIDERGTEAAGATYMEIIPMSLP
DSITLDRPFLFVIYSHEIKSPLFVGKVVDPTQH
SEQ ID NO：107(α-1-抗蛋白酶)
MMPSTLSLCLMLAGLCSLVTSHLTEEIQASNDTENEYSSTRRISPYMTDFSIDFYR
LLVSKSNTTNIFFSPISIYTAFTLLALGAKSATRDQILTGLRFNRTEISEEHIFEGFQ
QLLNTFNLPENELQLTTSNGLFIDKNLKLVAKFLEDSKRLYASDTFSTNFEDNMA
AKKQINDYVEKETQGKIVDLIQNLDSNVVFVLVNCIFFKGKWEKPFMTELTTEC
PFHVDSKTTVPVQTMRRLGMFNVFYDQDLSCWVLKMKYMGNATALFILPDTG
KIEKVENALNKMLFHKWTRNLKRRAISLYFPKVSISGNYDLKILRELGITDVFGS
NADLSGITEETNLKLSQAVHKAVVNIDEKGTEASGATFAEGIPMSIPPTVEFLRPF
IFIILEENTKSVLFMGKVMNPTGN
SEQ ID NO：108(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员5[智人])
MQLFLLLCLVLLSPQGASLHRHHPREMKKRVEDLHVGATVAPSSRRDFTFDLY
RALASAAPSQSIFFSPVSISMSLAMLSLGAGSSTKMQILEGLGLNLQKSSEKELHR
GFQQLLQELNQPRDGFQLSLGNALFTDLVVDLQDTFVSAMKTLYLADTFPTNFR
DSAGAMKQINDYVAKQTKGKIVDLLKNLDSNAVVIMVNYIFFKAKWETSFNHK
GTQEQDFYVTSETVVRVPMMSREDQYHYLLDRNLSCRVVGVPYQGNATALFIL
PSEGKMQQVENGLSEKTLRKWLKMFKKRQLELYLPKFSIEGSYQLEKVLPSLGI
SNVFTSHADLSGISNHSNIQVSEMVHKAVVEVDESGTRAAAATGTIFTFRSARLN
SQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP
SEQ ID NO：109(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支A，成员5[小鼠])
MRFFPILCLVLFISHGVASRRHSHSKKKKAKESSVGAVGPPSSKDFAFRLYRALV
SESPGQNVFFSPLSVSMSLGMLSLGAGLKTKTQILDGLGLSLQQGQEDKLHKGF
QQLLQRFRQPSDGLQLSLGSALFKDPAVHIRDDFLSAMKTLYMSDTFSTNFGNP
EIAKKQINNYVAKQTKGKIVDFIKDLDSTHVMIVVNYIFFRAKWQTAFSETNTH
KMDFHVTPKRTTQVPMMNREDGYSYYLDQNISCTVVGIPYQGNAIALFILPSEG
KMKQVEDGLDERTLRNWLKMFTKRRLDLYLPKFSIEATYKLENVLPKLGIQDV
FTTHADLSGITDHTNIKLSEMVHKSMMEVEESGTTAAAITGAIFTFRSARPSSLKI
EFTRPFLLTLMEDSHILFVGKVTRP
SEQ ID NO：110(丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化支C(抗凝血酶)，成员1[褐家鼠])
MYSPGIGSAVAGERKLCLLSLLLIGALGCAVCHGNPVDDICIAKPRDIPVNPMCI
YRSPAKKATEEDVLEQKVPEATNRRVWELSKANSRFATNFYQHLADSKNDND
NIFLSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRL
YRKANKSSNLVSANRLFGDKSLTFNESYQDVSEIVYGAKLQPLDFKENPEQSRV
TINNWVANKTEGRIKDVIPQGAIDELTALVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKEPF
HKVDGQSCLVPMMYQEGKFKYRRVGEGTQVLEMPFKGDDITMVLILPKPEKSL
AKVEQELTPELLQEWLDELSEVMLVVHVPRFRIEDSFSLKEQLQDMGLVDLFSP
EKSQLPGIIAEGRDDLFVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTSVVITGRSLNPSRVTF
KANRPFLVLIREVALNTIIFMGRVSNPCVN
SEQ ID NO：111(抗凝血酶-III)
MYSPGAGSGAAGERKLCLLSLLLIGALGCAICHGNPVDDICIAKPRDIPVNPLCIY
RSPGKKATEEDGSEQKVPEATNRRVWELSKANSRFATNFYQHLADSKNDNDNI
FLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYR
KANKSSDLVSANRLFGDKSLTFNESYQDVSEVVYGAKLQPLDFKENPEQSRVTI
NNWVANKTEGRIKDVIPQGAINELTALVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKEPFY
KVDGQSCPVPMMYQEGKFKYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLA
KVEQELTPELLQEWLDELSETMLVVHMPRFRTEDGFSLKEQLQDMGLIDLFSPE
KSQLPGIVAGGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTSVVITGRSLNPNRVT
FKANRPFLVLIREVALNTIIFMGRVANPCVN
SEQ ID NO：112(抗凝血酶-III)
MYSNVIGTITSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICIAKPRDIPMNPMCIYR
SPEKKATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFL
SPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRK
ANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAIN
KWVSNKTEGRITDVIPPEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKA
DGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVE
KELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKS
KLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFK
ANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK
SEQ ID NO：113(抗凝血酶-III)
MISNGIGTVTTGKRSMCLFPLLLIGLWGCVTCHRSPVEDICTAKPRDIPVNPMCIY
RSPEKKATEGEGSEQKIPGATNRRVWELSKANSHFATAFYQHLADSKNNNDNIF
LSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYR
KANKSSELVSANRLFGDKSITFNETYQDISEVVYGAKLQPLDFKGNAEQSRLTIN
QWISNKTEGRITDVIPPQAIDEFTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTKKELFYKA
DGESCSVPMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKLEKPLAKVE
RELTPDMLQEWLDELTETLLVVHMPHFRIEDSFSVKEQLQDMGLEDLFSPEKSR
LPGIVAEGRNDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTVISLAGRSLNLNRVTFQAN
RPFLVLIREVALNTIIFMGRVANPCVN
SEQ ID NO：114(凝血酶抑制剂infestin前体[骚扰锥蝽(Triatoma infestans)])
LEENDCACPRVLHRVCGSDGNTYSNPCTLDCAKHEGKPDLVQVHEGPCDPNDH
DFEDPCECDNKFEPVCGTDHITYSNLCHLECAAFTTSPGVEVKYEGECHAEIME
QHQILKSCICTKMYKPVCGTDGHTYPNLCVLKCRISSKPGLKLAHVGKCGIGLL
AVETKEVRNPCACFRNYVPVCGSDGKTYGNPCMLNCAAQTKVPGLKLVHEGR
CQRSNVEQF
SEQ ID NO：115(brasiliensin前体[Triatoma brasiliensis])
MRYLLLLGLAAFSAVSAEEKDPPCACPLIWKPVCGNDGQTYPNECLLNCIKYVL
KKDIEVAYQGICKHFVHAAAEAEELVESKPPCACPLIWKPVCGNDGQTYPNEC
MLNCMKYILKKDIEVAYQGMCKHFVHAAAEAEELVESKNPCECPRALHRVCGS
DGNTYSNPCTLNCAKHEGKPDLVQVHEGPCSPDEHDFEDPCECDNKFDPVCGT
DKVTYRNLCXLECAMFTTSPGVEVDYEGECLAETVLLEENHCACPRVLHRVCG
SDGNTYSNPCTLDCAKHEGKPDLVQVHEGPCDPNDHDFEDPCECDNKFEPVCG
TDHITYSNLCHLECAAFTTSPGVEVKYEGECHAEIMEQHQILKSCICTKIYSPVCG
TDGHTYPNLCILECHISFNPGLKLAHVGKCGTDLQDIETKQVRNPCACFRNYLPV
CGSDGKTYGNPCMLNCAAHTKVPGLKLAHKGRCQRSDVEQF
SEQ ID NO：116(丝氨酸蛋白酶抑制剂dipetalogastin)
LIKELVNMVIQHAEEEEVKELKNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNPCMLNCAKH
EGNPDLVQVHKGPCDEHDHDFEDPCKCDNKFEPVCGDDQITYLNLCHLECATF
TTSPGVEVAYEGECHAETTNAMEVLFQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNPCM
LTCAKHEGNPDLVQVHEGPCDEHDHDFEDTCQCDDTFQPVCGDDEITYRNLCH
LECATFTTSPGVEVKHEGECHPETKVNQLILKSCMCPKIYKPVCGTDGRTYPNIC
VLKCHISSNPGLGLAHLGECKVAVLAKETGEVRNPCNCFRNFNPVCGTDGKTY
GNLCMLGCAAETKVPGLKLLHNGRCLPKEQL
SEQ ID NO：117(凝血酶抑制剂蛋白[长红锥蝽(Rhodnius prolixus)])
RLLLLLGLAALVAAEGGEPCACPHALHRVCGSDGETYSNPCTLNCAKFNGKPEL
VKVHDGPCEPDEDEDVCQECDGDEYKPVCGSDDITYDNNCRLECASISSSPGVE
LKHEGPCRTEEKKILKRSDEFEMYRCACPKIYYPVCGTDGETYPNLCVLECHMR
MNPGLQLHHYGHCQHHHHHHPPPHHHHHHHPHHTTEKPVEPCACPHALHRVC
GSDGETYSNPCTLNCAKHNGKPGLVKVHDGPCEPDEDEDVCQECDDVDYEPVC
GTDDKTYDNNCRLECASISSSPGVELKHEGICRKEEKKLPKRSVGLEHTCVCPY
NYFPVCGTDGETYPNLCALQCRMREVPGLELKHTGKCLPHLDFPDPV
SEQ ID NO：118(凝血酶抑制剂蛋白[长红锥蝽])
MKRLLLLLGLAALVAAEGGEPCACPHALHRVCGSDGETYSNPCTLNCAKFNGK
PELVKVHDGPCEPDEDEDVCQECDGDEYKPVCGSDGITYDNNCRLECASISSSP
GVELKHEGICRKEEKKLPKRSVGLEHTCVCPYNYFPVCGTDGETYPNLCALQCR
MREVPGLELKHTGKCLPHLDFPDPV
SEQ ID NO：119(凝血酶抑制剂haemalin[长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)])
MKLFVFLALFGAAFAQRNGFCRLPAEPGICRAFMPRYYFDVEKGQCEQFIYGGC
KGNENNFETLKECQDACGEPERASDFEKADFETGCKAAPETGLCKASFERWFFN
AASGECEEFIYGGCGGNDNNYENKEECEFACKY
SEQ ID NO：120(boophilin[微小牛蜱(Boophilus microplus)])
MKCIILLAVLGTAFAQRNGFCRLPADEGICKALIPRFYFNTETGKCTMFSYGGCG
GNENNFETIEECQKACGAPERVNDFESADFKTGCEPAADSGSCAGQLERWFYN
VQSGECETFVYGGCGGNDNNYESEEECELVCKNM
SEQ ID NO：121(boophilin[微小牛蜱(Boophilus microplus)])
MKYLILLAVLGTAFAQRNGFCRLPADEGICKALIPRFYFNTETGKCTMFSYGGC
GGNENNFETIEDCQKACGAPERVSDFEGADFKTGCEPAADSGSCAGQLERWFY
NVRSGECETFVYGGCGGNDNNYESEEECELVCKNM
SEQ ID NO：122(Ornithodorin)
LNVLCNNPHTADCNNDAQVDRYFREGTTCLMSPACTSEGYASQHECQQACFV
GGEDHSSEMHSSCLGDPPTSCAEGTDITYYDSDSKTCKVLAASCPSGENTFESEV
ECQVACGAPIEG
SEQ ID NO：123(凝血酶抑制剂[非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)])
LNVLSNNPHTADCNNDAQVDRYFREGTTCLMSPACTSEGYASQHECLRPALLA
GKTTAVKCTAHALVTRPLPARKARTSPTTILIAKHVRY
SEQ ID NO：124(savignin[Ornithodoros savignyi])
MLFYVVITLVAGTVSGLNVRCNNPHTANCENGAKLESYFREGETCVGSPACPGE
GYATKEDCQKACFPGGGDHSTNVDSSCFGQPPTSCETGAEVTYYDSGSRTCKV
LQHGCPSSENAFDSEIECQVACGVSME
SEQ ID NO：125(凝血酶抑制剂[Amblyomma hebraeum])
MGFLVASAVLVCVTSQRVPGYCKKKPAVGPCKALIEKWYFDYSTQSCKTFYYG
GCGGNGNKFSSRKKCREACLPKRPSVPVCKQMPDPGFCRAYMPHWFFNSKSGY
CEGFVYGGCQGNDNRFKSCWQCMKKCRTAREANRLCWKLTKEFNKKFLRNVP
TAKPLPPK
SEQ ID NO：126(凝血酶抑制剂[Amblyomma americanum])
MRPQAFIGAFVFTLVLRQAAGIKWSRCFRPKAVGNCQNKVPAWYYDFWSFRC
KGFLYSGCGGNSNRFPTEEECQKSCLRKSKRKEVCSLKPKTGKCKAAIPLWYYD
PELDECRGLIYGGCKGNANRFETCLKCMKRCSGNNNARKICKKQTKKFLEENN
LGSNRHHKKPSWPQLSIRIPFIEK
SEQ ID NO：127(凝血酶抑制剂[黑脚硬蜱])
MHQEGDFKMGHCSDLKVSALEIPYKGNKMSMVILLPEDVEGLSDLEEHLTAPK
LLALLGGMYVTSDVNLHFPKFKLEQSMGLKDVLMAMGVKDFFTFLADLSGISA
TGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAILMDCIPQVVNFFVDHPFMFLICSH
DPDAVLFMGSIREL
SEQ ID NO：128(凝血酶抑制剂[黑脚硬蜱])
MHQKGDFKMGHCSDLKVTALEIPYKGNKMSMIILLPEDVEGLSVLEEHLTAPKL
SALLGGMYVTPDVNLRLPKFKLEQSIGLKDVLMAMGVKDFFTSLADLSGISAAG
NLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAIPMMLMCARFPQVVNFFVDHPFMFLIH
SHDPDVVLFMGSIREL
SEQ ID NO：129(凝血酶抑制剂[黑脚硬蜱])
MASDFSNSLISFSVDLYKKLKSESDGASNFICSPFSIAAALSMTLAGAKHDTAKQI
SNALHMQDTTVHENFAYFFSKLPGYAPDVILHVANRLYAEETYNTLDEFTHLLE
KSYSTTVEKVDFKRNAEKTRLQVNTWVEEVTQSKIKDLLAEGTIDDFTSLIIINA
VYFKGLWHDQFDPKRTSQQEFHLTADRTKMVDMMHHKQRFRMCRHPNFKVS
ALEIPYKGQKMSMVILLPEEIDGLADLEETLTSSKIREIIQELSYQGDIELSLPRFKL
EHTVGLKNVLAAMGIEDMFDALKCDLSGISPDNALVVSDVVHKAFIEVNEEGTE
AAAATAMVMLCCMSFPTRFTVDHPFLFLIRCHDPDVILFIGSVAQI
SEQ ID NO：130(tsetse凝血酶抑制剂前体[Glossina morsitans morsitans])
MKFFTVLFFLLSIIYLIVAAPGEPGAPIDYDEYGDSSEEVGGTPLHEIPGIRL
SEQ ID NO：131(凝血酶抑制剂madanin 2[长角血蜱])
MKHFVILILAVVASAVVMAYPERDSAKDGNQEKERALLVKVQERYQGNQGDY
DEYDQDETTPPPDPTAQTARPRLRQNQD
SEQ ID NO：132(凝血酶抑制剂madanin 1[长角血蜱])
MKHFAILILAVVASAVVMAYPERDSAKEGNQEQERALHVKVQKRTDGDADYD
EYEEDGTTPTPDPTAPTAKPRLRGNKP
SEQ ID NO：133(抗凝血酶-III)
MHLFIGVSLRPLGHGIPAPYAVEDICTAKPRDIPVNPICIYRNPEKKPQERRGAGA
GEGQDPGVHKPPASGSCPGPTRAFGRRSFLQAPGPTPRTMRRTSSCRPS
SEQ ID NO：134(凝血酶抑制剂[Amblyomma hebraeum])
MGFLVASAVLVCVTSQRVPGYCKKKPAVGPCKALIEKWYFDYSTQSCKTFYYG
GCGGNGNKFSSRKKCREACLPKRPSVPVCKQMPDPGFCRAYMPHWFFNSKSGY
CEGFVYGGCQGNDNRFKSCWQCMKKCRTAREANRLCWKLTKEFNKKFLRNVP
TAKPLPPK
SEQ ID NO：135(凝血酶抑制剂[Amblyomma americanum])
MRPQAFIGAFVFTLVLRQAAGIKWSRCFRPKAVGNCQNKVPAWYYDFWSFRC
KGFLYSGCGGNSNRFPTEEECQKSCLRKSKRKEVCSLKPKTGKCKAAIPLWYYD
PELDECRGLIYGGCKGNANRFETCLKCMKRCSGNNNARKICKKQTKKFLEENN
LGSNRHHKKPSWPQLSIRIPFIEK
SEQ ID NO：136(凝血酶抑制剂，TTI＝抗血栓肽[Glossina morsitans])
GEPGAPIDYDEYGDSSEEIG
SEQ ID NO：137(凝血酶抑制剂[Amblyomma americanum])
MEIKRCVHVLLTLATVYGTSVSISSICSLPQVKGNCRGIFEMWHYNSTKDTCSLF
TYGGCGGNENRFENCTQCMESCSTNENRTEICQLLEKEADEDYYSGWDDNTGG
DGYTAPPREAYDEDYDEE
SEQ ID NO：138(Theromin)
ECENTECPRACPGEYEFDEDGCNTCVCKGCDDAQCRCSSDANGCESFCTCNTR
CSAADECNPRCTCK
SEQ ID NO：139(monobin[Argas monolakensis])
MRLLALFAFAVAVVSAQRNQMCQQPRTQGSCDASNQITKFFYTGSGCTSAPVC
SDTDGGYGTEDECIQACTVQGGHHNEGAGEEGCSGDPPRGDCGGQVEERYYFD
STTRTCQTFEYRGCSSGNPDNSYETEIECEIACPSASS
SEQ ID NO：140(类似于凝血酶抑制剂[大乳头水螅(Hydra magnipapillata)])
MCLRCRPCEPDLCPPRPLCNGGYVKGICGCCDTCAKVDGEECGGLWNMYGKC
DVGFVCAQVKRHTKGVCVSVKKKSNNKENTCALKPETGPCRAAIKAWYYDYK
TDTCKRFVYGGCGGNSNRFREKKMCQKTCYA
SEQ ID NO：141(凝血酶抑制剂亚基1)
EKFPAVNQKPQAAXL
SEQ ID NO：142(类似于凝血酶抑制剂[黄牛(Bos taurus)])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGSSKNVFISPLSISSALAMVLMGARGNTAAQMC
QTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLSEVNRTDPRLLAQNRQRGFSGDKTYDFLSSF
KDSCRXILPSRDGRAGLYQRYGAVQEAHKHLGS
SEQ ID NO：143(胰蛋白酶抑制剂1)
MATTMAKLITLVVLAILAFVEVSVSGYKTSISTITIEDNGRCTKSIPPICFPDGRP
SEQ ID NO：144(磷脂酰乙醇胺结合蛋白1)
MPVDLGKWSGPLSLQEVEERPQHALHVKYTGTEVDELGKVLTPTQVKNRPTSI
AWDGLDPGKLYTLVLTDPDAPSRKDPKYREWHHFLVVNMKGNDISSGTVLSD
YVGSGPPKGTGLHRYVWLVYEQSGPLKCDEPILSNRSGDHRGKFKVASFRKKY
ELGPPVAGTCYQAEWDDYVPKLCEQLSGK
SEQ ID NO：145(bothrojaracin＝凝血酶诱导的血小板聚集抑制剂15kda多肽{N-末端}[Bothrops jararaca])
DCPSDWSPYGQGCYXF
SEQ ID NO：146(thrombostasin[Haematobia irritans])
NINIMKHFVVIGILALSAVCQAQNVLSGRRQHGAQGLSGYSGDNDWGYYGEAG
APGSDYSGSSGQWAPLDFDYNSLPGLSGYNHEQQDYEEDSYRHVRSAGPITLQL
DDDDDDDSGIPIFEMDDEDEDSNDNQKFPLSFERFPENEKNQVGLRARFNKFMA
KFTSLFGRRRGVNVPNAA
SEQ ID NO：147(hemadin[森林山蛭(Haemadipsa sylvestris)])
CDCGEKICLYGQSCNDGQCSGDPKPSSEFEEFEIDEEEK
SEQ ID NO：148([冈比利亚按蚊(Anopheles gambiae str.PEST)])
MASKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTYDEEDFDEESLKPHSSSSSDDG
EEEFDPSLLEEHADAPTARDPGRNPEFLRNSNTDEQASAPAASSSESDE
SEQ ID NO：149(anophelin-like funestolin[不吉按蚊(Anopheles funestus)])
MATKLIVIAFLCAALIAVVQSAPQYAQGEEPTYDEDDDEPVKPHSSADPDASYE
EFDPSQLTEYANTAQDPGRRPHFLEQANSNNGDQLPSQSDSSSESTEH
SEQ ID NO：150(唾液抗凝血酶anophelin[史帝芬塞疟蚊(Anopheles stephensi)])
MASKVIVIALLCIALAAFVQGAPQYTHGEEPEYDEDDGADEPVQPHSSSNHADT
EDDFDLSLLDKPYANAPENADPGRRPEFLKQHNNENQSDSSSGSTEN
SEQ ID NO：151(唾液抗凝血酶肽anophelin[Anopheles darlingi])
MANKLFLISLLCVALVAKIAQAAPQYAPGEEPSYDEDTDDKLIENDTSITDEDYA
EIEASLSQAFGTAADPGRRLGEGKKP
SEQ ID NO：152(唾液抗凝血酶肽anophelin[白魔按蚊(Anopheles albimanus)])
MANKLVLISLLCVVLVAKITQAAPQYAPGDEPSYDEDTDDSDKLVENDTSITDE
DYAAIEASLSETFNTAADPGRRLGEGSKP
SEQ ID NO：153(蛭素，*Y是硫酸化的)
VYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDG
DFEEIPEEY*LQ
SEQ ID NO：154(合成肽)
FEEIPEEYL
SEQ ID NO：155(合成肽)
YEPIPEEA
SEQ ID NO：156(合成肽)
NGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：157(合成肽)
APPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：158(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：159(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：160(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：161(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：162(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：163(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：164(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：165(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTANGDFEEIPEEYL
SEQID NO：166(修饰的蛭素类似物)
FPRMHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：167(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：168(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：169(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：170(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：171(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：172(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：173(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：174(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：175(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：176(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：177(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：178(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：179(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：180(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：181(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQID NO：182(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQID NO：183(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTANGDFEEIPEEYL
SEQID NO：184(修饰的蛭素类似物)
FPRXHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：185(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：186(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：187(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：188(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：189(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：190(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：191(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：192(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：193(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：194(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：195(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：196(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：197(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：198(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：199(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：200(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：201(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：202(修饰的蛭素类似物)
FPRMHXTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQID NO：203(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：204(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：205(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：206(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：207(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：208(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：209(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：210(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：211(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHXTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：212(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：213(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：214(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：215(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：216(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：217(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：218(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：219(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：220(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：221(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：222(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：223(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：224(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：225(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：226(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：227(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：228(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：229(修饰的蛭素类似物)
FPRMHRTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：230(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：231(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：232(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：233(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：234(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：235(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：236(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：237(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：238(修饰的蛭素类似物)
FDPRMHRTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：239(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：240(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：241(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：242(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：243(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：244(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：245(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：246(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：247(修饰的蛭素类似物)
FDPRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：248(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：249(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：250(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：252(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：253(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：254(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：255(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：256(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：257(修饰的蛭素类似物)
FPKMHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：258(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQID NO：259(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：260(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：261(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：262(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：263(修饰的蛭素类似物)
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SEQ ID NO：264(修饰的蛭素类似物)
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SEQ ID NO：265(修饰的蛭素类似物)
FDPKMHKTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：266(修饰的蛭素类似物)
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SEQ ID NO：267(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：268(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：269(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：270(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：271(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：272(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：273(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTAGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：274(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTANGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：275(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHKTAGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：276(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHXGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：277(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHXGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：278(修饰的蛭素类似物)
FDPKXHXGGGGNGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：279(修饰的蛭素类似物)
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SEQ ID NO：770(修饰的肝素辅因子Ii)
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SEQ ID NO：771(共有序列)
(N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)
SEQ ID NO：772(合成肽)
FEEIPEEYL
SEQ ID NO：773(合成肽)
YEPIPEEA
SEQ ID NO：774(合成肽)
NGDFEEIPEEYL
SEQ ID NO：775(合成肽)
APPFDFEAIPEEYL
SEQ ID NO：776(BPTI-牛胰腺胰蛋白酶抑制剂)
MKMSRLCLSVALLVLLGTLAASTPGCDTSNQAKAQRPDFCLEPPYTGPCKARII
RYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNDFKSAEDCMRTCGGAIGPWENL
Claims (50)
1.产生修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，所述修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制，所述方法包括：修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP的结合使所述靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括：将能够使所述靶SP的催化三元组的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基导入SPI。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法产生修饰的SPI，其显示出延长的抑制持续时间。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的一个或多个导入的氨基酸残基是通过置换或插入导入的。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述的能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。
6.权利要求5的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸序列。
7.权利要求6的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。
8.权利要求7的方法，其中所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个残基包括催化性丝氨酸残基。
10.权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法进一步包括修饰SPI使其能被中和的步骤，包括：将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。
11.权利要求10的方法，其中将所述导入的离子电荷区域导向SPI的羧基末端。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述导入的离子电荷区域是阴离子电荷区域。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中所述导入的离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。
14.权利要求13的方法，其中所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述中和试剂是硫酸精蛋白。
16.根据权利要求1-15任一项的修饰SPI的方法，其中所述SPI是凝血酶抑制剂。
17.根据权利要求16的修饰SPI的方法，其中所述SPI选自由SEQ IDNO：14和17-153中的任一项组成的组。
18.通过前述权利要求任一项的方法可获得的或获得的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。
19.根据权利要求18任一项的修饰的SPI，其中所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。
20.权利要求19的修饰的SPI，其包含下列共有序列：N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO：771)。
21.根据权利要求19或权利要求20的修饰的SPI或其片段或功能等同物，其包含选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列或由选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列组成。
22.编码根据权利要求18-21任一项的修饰的SPI的核酸分子，或在高度严格杂交条件下与编码权利要求18-21任一项的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。
23.包含权利要求22的核酸序列的载体。
24.包含权利要求23的载体或权利要求22的核酸分子的宿主细胞。
25.抑制靶SP的方法，包括向受试者施用权利要求18-21任一项的修饰的SPI。
26.治疗患有凝血病的受试者或预防受试者患上凝血病的方法，包括施用权利要求19的修饰的凝血酶抑制剂。
27.在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括：
a)施用根据权利要求19的修饰的凝血酶抑制剂；和
b)然后向受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
28.显示出靶SPI的增强的抑制的修饰的SPI，其中SPI与其靶SP的结合使所述靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位。
29.权利要求28的修饰的SPI，其包括能够使所述靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基。
30.权利要求29的修饰的SPI，其中所述SPI显示出延长的抑制持续时间。
31.权利要求29的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子移位的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。
32.权利要求29的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸序列。
33.权利要求32的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。
34.权利要求33的修饰的SPI，其中所述能够使靶SP的催化三联体的一个或多个残基移位的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。
35.权利要求28-34任一项的修饰的SPI，其中所述靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个氨基酸残基包括催化性丝氨酸残基。
36.权利要求28-34任一项的修饰的SPI，其进一步包括离子电荷区域，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。
37.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域向SPI的羧基末端放置。
38.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域是阴离子电荷区域。
39.权利要求36的修饰的SPI，其中所述离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。
40.权利要求39的修饰的SPI，其中所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。
41.权利要求36-40任一项的修饰的SPI，其中所述中和试剂是硫酸精蛋白。
42.权利要求28-41任一项的修饰的SPI，其中所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。
43.权利要求42的修饰的SPI，其含有下列共有序列：
N-末端肽)-X1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽)(SEQ ID NO：771)。
44.修饰的SPI或其片段或功能等同物，其包含选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列或由选自SEQ ID NO：158-770任一项的序列组成。
45.编码根据权利要求28-44任一项的修饰的SPI的核酸分子，或在高度严格杂交条件下与编码根据权利要求28-44任一项的修饰的SPI的核酸分子杂交的反义核酸分子。
46.包含权利要求45的核酸序列的载体。
47.包含权利要求46的载体或权利要求45的核酸分子的宿主细胞。
48.抑制靶SP的方法，包括施用权利要求28-44的修饰的SPI。
49.治疗患有凝血病的受试者或预防受试者患上凝血病的方法，包括施用权利要求42的修饰的凝血酶抑制剂。
50.在受试者中中和凝血酶抑制的方法，包括：
a)施用根据权利要求42的修饰的凝血酶抑制剂；和
b)然后向受试者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
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