JPH07509691A - 安定なポリペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 なボリベプ　ド ｌ匪二分上 本発明は安定なポリペプチド組成物およびそのような安定なポリペプチド組成物 の調製方法に関する。

λ匪二ＸＪＩ。

ポリペプチドは、特に生物学的に活性なポリペプチドの貯蔵および供給の際の不 安定性を引き起こし得る、特殊な問題を呈する化学的および物理的特性を有する 。ポリペプチドは通常、凍結乾燥されて固体組成物を形成する。しばしば、安定 性を増すために、ポリペプチド製剤に添加剤が導入される。

そのような添加剤は、イオン性化合物の塩、ポリアルコールを包含するが、これ は、そのような添加剤および界面活性剤（非イオン性およびアニオン性の両方が ある）の濃度が比較的高い場合、特に経皮および鼻腔内投与に対してより有効で はない。タンパク質製剤の不安定性の問題の多くは、Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｐｈａ ｒＩｎ、Ｒｅｓ、（１９８９）　ｆｉ（１１）：９０３−９１８で議論されてい る。

欧州特許第３１１．９５０号、第２８６．８３０号、および第２８８．８９１号 、ならびに、米国特許第４．３６１．５１０号および第４．４７０．９６８号は 、１種または通常１種より多い種々の添加剤、例えば３−プロピオラクトン：種 々のトリス、へペス、グリシンまたはり工ン酸緩衝液；ポリオールまたはアルカ ノール：塩類（例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム 、クエン酸リチウム）を使用する、タンパク質の調製または精製における分離工 程について記載しているが、ｐＨは７から８ではないにしても、少なくとも５． ５以上であって、通常好ましくは６である。通常、タンパク質からこれらの添加 剤を除去し、そして好ましくは凍結乾燥される。

しかし、多くのポリペプチドは直接動物体内に注射されたとき最も有用である、 生物学的に活性な物質として役に立つ。

これは、アテローム性動脈硬化および動脈硬化によって発病する血小板関連虚血 性疾患の治療や予防のための治療作用物質として有用なポリペプチドについて事 実である。

これらの疾患が引き起こす生命に関わる症状の治療では、患者にできる限り迅速 に薬物濃縮液を注射すること（ポーラス治療（ｂｏｌｕｓ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ））、および／または、比較的低濃度の薬物で長期治療すること（輸注（ｉｎｆ ｕｓｉｏｎ））が必要であり得る。従って、薬物（ポリペプチドであり得る）は 、病院職員および準医療従事者がすぐに使用できるように、簡便に貯蔵されなけ ればならない。これは、長期間、室温であっても、貯蔵安定性であって、かう、 溶解しなければならない固体ではなく、すでに注射可能な液体製剤でなければな らないということである。

薬物が注射可能であるので、その薬物は、患者とできるだけ適合し、ほかのショ ック症状を誘発したり、患者に投与されている他の薬物と干渉しあわないように 、できるだけ単純に製剤されなければならない。理想的製剤は、通常安定化のた めに必要とされる他の添加剤を避けた、かつ、すぐに使用できる液体濃縮物であ ろう。

λ匪血１１ 本発明は、クエン酸緩衝液中の実質的に純粋なポリペプチドから本質的になる液 体溶液の形成を包含する、実質的に純粋なポリペプチドを安定化する方法に関し 、この溶液はｐＨ活性なポリペプチドであって、その安定化された組成物が結果 として治療に有効な溶液として使用され得る。

また、本発明は、クエン酸緩衝液の液体溶液中の、生物学的に有効な量の、実質 的に純粋なポリペプチドから本質的になる、注射可能で生物学的に活性な、実質 的に純粋なポリペプチドの、結果的に得られる有用な治療組成物を包含し、上記 溶液はｐＨが約５．０から約５．５である。そのような組成物は、非常に安定で 、例えば、約４℃で、注射までの７日、３４日または４９日間安定であり続ける ことができる。また、約５０’Ｃまで安定であり、そして約７０’Ｃでは５．５ より高いｐ）Ｉを有する組成物よりも安定性が高い。また、本発明の組成物は、 約−１５℃から約３０℃までの間で少なくとも９０日間、好ましくは少なくとも １日ケ月間、安定（かつ注射可能）であり、そしてより高温で改善された安定性 を有する。

得られる液体組成物は、無菌的に滅菌出荷バイアル、バッグ、またはボトルに導 入され、そして、皮下注射針または静脈注射管のような注射デバイスの付加によ る注射に備えて密封される。

口　の　ニー−ｔ１１ 本発明は、液体溶液中の実質的に純粋なポリペプチドを、約−１５°Ｃから約３ ０°Ｃで少なくとも９０日間、好ましくは少なくとも１日ケ月間、貯蔵上安定に する、または、より高温で改善された安定性を有するように安定化する方法を提 供する。このポリペプチドはクエン酸緩衝液に溶解して溶液にする。

「実質的に純粋な」とは、薬学的に受容可能な程度の純度に精製された、および 、好ましくは本質的に均一に精製されたという意味である。

水性媒体に可溶のポリペプチドは、当業者には周知であり、米国特許第４．５３ ２．２１２号に記載のものを包含し、そして、酵素などを包含する。薬学的に有 用なポリペプチドは、Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、旦（ＩＩ）：　９０３−９１８　（＋９８９）で議論されている ように当業者には周知である。

「生物学的に活性な」とは、生物学的システムに効果を有する任意のポリペプチ ドを意味する。そのようなポリペプチドには、インターフェロンのような薬学的 に活性なポリペプチド、殺虫性の堕旦■皿ユ鳳旦皿且胚且エントトキシンノヨう な殺虫的活性を持つポリペプチドなどを包含する。生物学的システムへの作用を 有する、非常に多様なポリペプチドが当該分計で公知であり、製剤学の場合、そ の作用は治療的である。その他の場合には殺虫作用、抗カビ作用などであり得る 。

「注射可能な」とは、ポリペプチドが患者に注射され得る、という意味であり、 そして、非常に多様なそのようなポリペプチドが当業者には公知である。

「生物学的に適合性のクエン酸緩衝液」とは、生物学的システムに望ましくない 、または不利な作用をそれら自体が持たない成分から調製されたクエン酸緩衝液 という意味である。

そのような緩衝液成分は、当該薬学分野の当業者には周知である。

「生物学的システム」とは、生きている実体を意味しており、例えば、植物、動 物、または、器官または細胞のようなそれらの生存部分を包含する。好ましい生 物学的システムは哺乳動物システム、特にヒトシステムである。

「安定性」または「改善された安定性」とは、本明細書中では、本発明の液体溶 液において、多量の（例えば、重量で）実質的に純粋なポリペプチドが、５０℃ 未満の温度、好ましくは、３０℃未満の温度にさらされた状態で、ある期間を経 過した後で、実質的に不変（ｉｎｔａｃｔ）、または、より不変であり続ける（ すなわち、物理的および化学的に安定で、そして、そのために初期に存在する生 物学的活性も安定化されている）ということ、ならびに、約７０°Ｃで、そして 光、酸素、および注射可能で生物学的に活性な、実質的に純粋なポリペプチドに 対して使用される貯蔵容器に対してさえも、改善された安定性を有するというこ とを意味する。この安定性は、ポリペプチドの純度、重量、または大きさに対し て適用可能な従来の分析方法によって評価し得る。これらの方法は、変色、透明 度および沈殿のような視覚的評価を包含するだけでなく、クロマトグラフィー（ 例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（ｌ（ＰＬＣ））のような、ポリペプチ ドをお互い同士および他の物質から分離するのに通常適用される測定法、および 紫外（ＵＶ）分析を包含し得る。従来の生物学的測定法は、ポリペプチドが生物 学的に活性なポリペプチドの場合に使用され得る。

「クエン酸ｍ衝液」とは、従来のクエン酸緩衝液を意味し、この緩衝液には、結 果的に水素イオン濃度麦化をほとんど変化させずに大量の強酸または強塩基が添 加され得る。このクエン酸緩衝液は、クエン酸溶液にｐ）Ｉ中性の強電解質また は強塩基を添加することによる、当該分野で公知の方法によって調製される。適 切な電解質は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸水素 ナトリウムなどを包含する。適切な強塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カルシ ウムなどを包含し、水酸化ナトリウムが好ましい。イオン強度、ポリペプチドの ｐｌ＋濃度の調整は、ｐＨ調整した等張溶液を作成する通常の方法で行われる。

本発明のクエン酸緩衝液および組成物を調製するための成分の添加は、どのよう な順序でも行えるが、好ましくは、ポリペプチドを注射可能なグレードの水に添 加し、それから緩衝液成分を添加する。または、特に、ポリペプチドをクエン酸 溶液に添加するときに緩衝液成分を添加する。ひとつの実施態様では、１．　Ｏ Ｍのクエン酸に１１当たり約２００！Ｉｇのポリペプチド濃度の溶液を作り、最 終容量の８５％まで水で希釈し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを５．０から５ ．５に調整し、それから、最終容量および濃度まで希釈する。

グリシンおよび他の塩のような、（薬学的な）調製物で従来用いられている付加 成分があり得るが、本発明の組成物では必須の成分ではない。

当該分野では、非常に多様な生物学的適合性のある緩衝液が公知であるが、通常 それらはｐＨ５，５を越え、そして通常ｐＨ７を越えるｐｌｌで、他の添加剤と ともに使用され、その後凍結乾燥で乾燥粉体にされる。しかし、今や、ｐｌｌが 約５．０から約５．５である（生物学的に活性な）ポリペプチドのクエン酸緩衝 液溶液が、他の成分を添加しなくても、または凍結乾燥のような他の処理を旅さ なくても、思いがけなく長時間にわたり非常に貯蔵安定性であることが見出され た。好ましい実施態様では、溶液のｐＨは約５．２５からである。

クエン酸緩衝液中の実質的に純粋なポリペプチドの濃度は、安定化有効量であり 、そして、特定のポリペプチド、ｐＨおよび特定の緩衝液を包含する稽々の因子 に依存して変化し得る。

本発明の安定化された組成物中のクエン酸緩衝液の安定化有効量およびポリペプ チド濃度は、タンパク質製剤分野の当業者によって容易に決定され得る。一般的 事項として、実質的に純粋なポリペプチドの濃度は、約０．Ｏｌから約２００ａ ＋ｇ／＋ｎｌ、通常は約０．Ｏｌから約１０ｉ＋ｇ／ｒ＋１である。注射可能な 、および／または生物学的に活性なポリペプチドについては、組成物中の濃度は 、目的の生物学的効果に対して有効な投薬量に対応するよう当業者によって容易 に決定され得るので、さらに調節され得る。例えば、ポリペプチドが、Ｍｐｒ− Ｌ−ホモアルギニン−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２・酢酸 塩、または、その環状形態である場合、濃度は通常約０．５から約５ｍｇ／ｍｌ の投薬量、好ましくは、約０．５から約２．０ｉｇ／ａ＋ｌに相当する。０．５ ｉｇ＃＋１の投薬形態は、直接輸注用プレミックス（ｐｒｅ−ｉｌｉｘ）である が、輸注前のポーラスである。このポーラスは約ＩＯから約５００、好ましくは 、約３０〜３００μｇ／Ｋｇ　（体重７０ｋｇの患者に対して約１〜４０ｆｆ１ ｇ、好ましくは、約２〜２０ｍｇ）、および、輸注は０．０２〜２μｇ／Ｋｇ／ 分であるが、おそらく、０．５〜１．０μｇ／Ｋｇ／分（体重７０Ｋｇの患者に 対して５０〜１００ａ＋ｇ／日）である。投与は、指示に依存して、７日までの 、好ましくは約１２時間から約３日間の、ポーラスからの注射によるものであり 得る。

好ましくは、このポリペプチドは、治療のために患者に注射され得る、生物学的 に活性で実質的に純粋な任意のポリペプチドであり、本発明の方法によって安定 化され得る。この実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸残 基をもつ直線状および環状のポリペプチドを包含し、そして、それ故に、単純な 直線状ジペプチドおよび大きなタンパク質分子を包含する。好ましくは、このポ リペプチドは合成または組換えポリペプチドである。

本発明の１つの好ましい実施態様では、ポリペプチドは、１０個までのアミノ酸 残基を有する。特に好ましいポリペプチドは、１ｌｐｒ−Ｌ−ホモアルギニン− ｃｔｙ−＾５ｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨｔ　・酢酸塩またはその環状形 態である。

実質的に純粋なポリペプチドは、ジスルフィド結合、イオン結合、グリコジル化 などのような通常のポリペプチド修飾を包含し得る。

本発明の１つの実施態様では、ポリペプチドは、次式を有する： Ｙ、−Ｘ、−（＾＾＋）−＋−Ｋ”−（Ｇ／５ａｒ）−Ｄ−（ＡＡｌ）、＊−（ Ａ人、）、、−（＾Ａ、）、、−Ｘ、−ｔ ここで、Ｋ’は、次式を有し、 Ｒ’、Ｎ（ＣＨｌ）、ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ−。

ここで、（Ｇ／５ａｒ）は、ＧまたはＳａｒであり：ここで、Ｒ１はそれぞれ独 立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、または、せイセイ１　個ノＲ’カＲ”−ｃ＝ ＮＲ”テアリ；ここで、Ｒ′は、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、または置換または 未置換のフェニルまたはベンジル残基、あるいは、ＮＲ’！（Ｒ’はそれぞれ独 立に、Ｈまたはアルキル（１〜６Ｃ））であり、および、Ｒ１はＨ，アルキル（ １〜６Ｃ）、フェニルまたはベンジル、あるいは、Ｒ’−Ｃ＝ＮＲ’　（以下か らなる群から選択されるラジカル）であり： ここで、ｍは２〜３の整数であり、そして、Ｒ′はそれぞれ独立に１１またはア ルキル（１〜６Ｃ）であり；そして、ここで、１個または２個の（ＣＬ）は、Ｏ またはＳで置換され得るが、前記０またはＳは別のへテロ原子に隣接しておらず ： 八＾１は、小さい中性の（極性または非極性の）アミノ酸であり、そして、Ｎｌ は０から３の整数であり：へＡ２は、中性の非極性の大きな（芳香族または非芳 香族）、または、極性芳香族アミノ酸であり、そして、Ｒ２は０から３の整数で あり： ＾＾１は、プロリン残基または修飾プロリン残基であり、そして、Ｒ３はＯから １の整数である； ＾＾４は、中性の小さいアミノ酸またはそのＮ−アルキル化形態で０４はＯから ３の整数であり： ＸＩおよびＸ！は、それぞれ独立に、ＸｌとＸｓとの間に結合を形成し得、図示 したような環式化合物を得る残基であり：および、 ＹｌおよびＹ、は、それぞれ独立に、非妨害性の置換基であるか、または、欠如 しており： ここで、１個またはそれ以上のペプチド結合は、必要に応じて、−Ｃ［１１Ｎ［ （−１−ＣＨ，Ｓ−１ＣＩｌ友ｃｕｔ−１−ＣＨ＝Ｃ［１−（シスおよびトラン ス）、−ＣＯＣＨｚ−１−Ｃ１ｌ（ＯＦＩ）ＣＨ，−１および−ＣｆｌｔＳＯ− からなる群から選択される結合によって置換され得る。

本発明の適切なペプチドは、以下のようなペプチドである：Ｙ、は、Ｈ、アシル 基、あるいは、ペプチド残基またはその誘導体であるかまたは欠如しており、お よびＹ！は、０口、Ｎ１（１またはペプチド残基またはその誘導体または欠如し ており、Ｙｔは、Ｎ［１，−＾−ＮＨｔまたは欠如であり、ＸＩおよびＬは、シ スティン（Ｃ）、メルカプトプロピオニル（Ｍｐｒ）およびペニシラミン（Ｐｅ ｎ）からなる群から選択され、Ａ島はＧであり、そしてｎｌは０または１であり 、＾＾２は、Ｗ、　Ｆ、　ＬＳＹおよびＶからなるグループから選択され、およ び、Ｋｏは、ＫＳＨａｒ、アセトイミジル（１ｃｅｔｉｒＩｉｄＹ１）−Ｌｙｓ またはフェニルイミジル−Ｌｙｓである。１つの実施態様では、このポリペプチ ドは、上記の式を有し、ここで、Ｒ３が０のとき、以下のいずれかである： １）Ｒ２と０４の和が少なくとも２でなければならない：または、 ２）ＫｏはＨａｒまたはに以外でなければならない：または、３）ＸＩおよびＸ ！の少なくとも１つはＣｙｓ（Ｃ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、または２−アミ ノ−３，３−シクロペンタンメチレン−３−メルカプトプロピオン酸（＾Ｐｎｐ ）以外でなければならない；また４）Ｙ、またはＹ２は少なくとも１つのアミノ 酸残基を含有しなければならない：または、 ５）１個またはそれ以上の結合が前記代替結合で置換される。

適切なペプチドの例は以下を包含する；Ｍｐｒ　−Ｋ−Ｇ　−Ｄ　−Ｗ　（心ｖ ：（Ｖ）　−Ｐ　−Ｃ−ＮＨ２Ｍｖｌ−Ｋ　−Ｇ　−Ｄ　−Ｗ　−Ｐ　−Ｃ−Ｎ ）（２Ｍｐｒ−に−Ｇ−１）−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ２Ｍｐｒ−（Ｍａｒｌ　− Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２Ｍｐｒ−（Ｈａｒｌ　−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ− ＮＨ２Ｍｐｒ（７’ｅ）ｒミジ’ｔＬ−−Ｌ　ＹＳｌ　−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ− ＮＨ２Ｍｐｒ（ア”！）　イ；ｇ’、ｐ−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ− ＮＨ２Ｍｐｒ（７ｒ＝ｔＶイＳ、ジ′ルーＬｙｓｌ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ 。

Ｍｐｒ（７！　；ｎ、−イ；Ｑ’ルーＬＹＳ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ ２Ｍｐｒ　−Ａｈａ　−（Ｈａｒ　）　−Ｇ　−Ｄ　−Ｗ−Ｐ　−Ｃ−Ｎ’Ｈ２ ＭＰｒ−Ｌ−；ＦＣ−ｉニア’ｔｖｒ二’、−−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２Ｍ ｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２またはこれらの環状形態。

このようなペプチドは、１９９０年２月２０日出願の、同時係属中のＵＳＳへ０ ７／４８３．２２９、および、ＷＯ９０／１５６２０として公開されたＰＣＴ／ ＵＳ９０１０３４１７に記述されている。それぞれ、本明細書中で参考として援 用し、および、後続の３５頁および実施例４〜１４でさらに詳細に述べる。

「アルキル」は慣用的に、表示数の炭素を持つ、例えばメチル、エチル、イソプ ロピル、Ｎ−ヘキシル、２−メチルブチル、シクロヘキシルなどのような、直線 状または分枝状または環状炭化水素残基と定義される。

Ｒ１で表されるベンジル、フェニル残基は、未置換であるか、または、非妨害性 の置換基で置換され得る。好ましい置換パターンは１個の置換基のみが芳香族核 に、好ましくは４位で結合しているパターンである。好ましい置換基はアルキル （１〜６Ｃ）、とくにエチルまたはメチル、またはフェニルのような電子供与性 置換基である。

Ｋｏの好ましい実施態様は、リシン、ホモアルギニン、ホルミルホモアルギニン 、オルニチン、アセトイミジルリシン、ＮＧＮＧエチレン−ホモアルギニン、お よびフェニルイミジルリシンの残基を包含する。フェニルイミジルリシル残基は 、例えば、次式を有する： Ｐｈ−Ｃ（＝ＮＩ（）−ＮＨ（ＣＨ，）、Ｃ）Ｉ（ＮＨ−）Ｃｏ−０結合の優先 的抑制の本質的特徴は、ＲＧＤＸのＲのに°による置換に存するように見えるの で、本発明の組成物に使用するペプチドまたはペプチド関連化合物の１つのクラ スは、結合配列にＲＧＤＸを通常含有する天然に存在する血小板凝集抑制物質（ ＦＡＩ）を含有し、それによって、これら抑制物質の形態がこの配列中のＲをに ゛で置換することによって改変される。包含されるのは、この置換を有する天然 ペプチド、および、ＧＰ　ｌ１ｂ−Ｉｌｌａへの接着タンパク質の結合を選択的 に抑制するのに効力のある充分な長さのある、それらペプチドのフラグメント、 または、この活性を破壊しないペプチド部位での無関係な置換を有するフラグメ ントまたは完全な長さのペプチドである。

通常は、これらのフラグメントは、もし立体配座が、例えば環化によって制御さ れると、少なくとも７個のアミノ酸のペプチド鎖の長さに相当する残基を有し、 そして、このような立体配座制御がなければ、フラグメントはもっと長くなる。

一般に、必要なに’ＧＤＸ配列は別として、ペプチドのに’ＧＤＸ以外の部分で は、１〜１０個、好ましくは１〜４個の、および好ましくは、１〜３個のアミノ 酸置換がある。

さらに、ＲＧＤＸまたはにＧＤＸのＧは、サルコシン残基によって置換され得る 。

加えて、１個またはそれ以上のペプチド結合は、必要に応じて、還元または脱離 によって得られる結合のような代替結合によって置換され得る。このように、１ 個またはそれ以上（７）−ＣＯＮ）１−ペプチド結合は、−Ｃ１ｌ、Ｎ）Ｉ−１ −Ｃ１１，Ｓ−１ＣＨ−ＣＨｙ−１−ＣＨ＝ＣＨ−（シスオＪ：びトランス）、 −ＣＯＣＨ、−１−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ宜および−Ｃ）１１ＳＯ−のような他のタ イプの結合で、当該分野で公知の方法によって置換され得る。次の参考文献には 、このような代替結合部分を包含するペプチドアナログの調製について説明があ る （以下余白） Ｍｏｄｉｆｉｃａ’ｅｉｏｎｓ″（ｊ、ｆｌ　ｉ　ｌ；　５ｐａｃｏｌａ、　Ａ 、Ｆ、　ｉ二”Ｃｈａｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｒｙ　ｏｆ 　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ、Ｐｅｐｅ：ｄｅｓ　ａｎｄら　６　＋１９７９１… ：１７７４８５　ｆ−ＣＨ２ＮＭ−。

ＣＨ２ＣＨ２−）；　Ｓｐａセｏｌａ、　Ａ、Ｆ、ｔ；、、　−包」ム［１９８ ６１ｌ：１２４３−１２４９　ｆ−ＣＨ２−Ｓｌ；　Ｈａｎｎ、　Ｍ、Ｍ、　’ 　Ｔ（λ９Ｂ２）　３０７−３１４　＋−ＣＨ−ＣＨ−１’ｙｌ　ｊｉＪｕ−１ ’＞’／、Ｊｌ；　Ａｌｍｑｕｉｓｃ、Ｒ，Ｇ、。

ζ　、　ｕ　＋１９８０１　ｕ：　１３９２−１３９８１−ＣＯＣＨ２）：Ｊｅ ｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ、　Ｃ，３、＋１９Ｂ２）　２１：２５３３＋−ＣＯ ＣＨ２−）　；　５ｚｅｌｋｅ、　Ｍ、、ｔ；　、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ａｐｐ ｌｎ、　ＥＰ　４５６６５（１９８２１ＣＡ：　１７：３９４０５　＋１９Ｂ２ １　［−ＣＨ［０Ｉ（）ＣＨ２−１；　Ｈｏ１ｌａｄａｙ、　Ｍ、Ｗ。

５　、　ｎ　＋１９８３）　２＋ｉ：４４０１−４４０４　＋−ＣｆＯ）（ｌｃ Ｈ２−１；ろ、よ４ｋ”Ｈｒｕｂｙ、Ｖ、Ｊ、ＬムＬ二ｊＬ−５≦−：　（１９ Ｂ２）　２≦１＝１８９−１９９　（−ＣＨ２−５−）。

特に好ましいのは−Ｃ）Ｉ　ｒ　ＮＨ−である。

天然に存在するヘビ毒ＦＡＩのフラグメントおよび／または改変形態は、以下の 配列の［ＥＩａ、Ｌ４１．（＠“］パルボウリン（２８−７および以下の配列の ［に２′］エリスチコフイン（４−５１）を包含する。

この表示法では、フラグメントの大きさは、フラグメントに含有されているアミ ノ酸の数で、名前の後ろの丸括弧の中に表記される。そして、かぎ括弧した接頭 文字および数字は、天然の完全長ペプチドの数字の位置でのアミノ酸置換を示す 。

このように、上記のパルポウリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）フラグメントについて は、フラグメントの長さは、天然配列に含まれる残基２Ｂ−７３であり、そして 、番号付き天然配列の位置２８．４１．６４に元来あったアミノ酸はＧＬｕ（Ｅ ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＣｙｓ（Ｃ）でそれぞれ１換されている。

追加例として、トリグラミン（ｔｒｉｇｒａｉｉｎ）、ニレガンチン（ｅｌｅｇ ａｎｔｉｎ）、アルポラプリン（ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）、クロタトキシン（ｃ ｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、フラボピリジン（ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｎ）、エキ スタチン（ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）、ビチスタチン（ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）、 ピリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ）、モロシン（ｒ＋ｏｌｏｓｓｉｎ）、ルトシン（ｌ ｕｔｏｓｉｎ）、バシリシン（ｂａｓｉｌｉｃｉｎ）、アプラギン（ａｐｐｌａ ｇｉｎ）、バリシン（ｈａｌｙｓｉｎ）、ホリンン′（ｈｏｒｒｉｄｉｎ）、テ ルゲミニン（ｔｅｒｇｅｆｆｌｉｎｉｎ）、ラケシン（ｌａｃｈｅｓｉｓｎ）、 コチアリン（ｃｏｔｉａｒｉｎ）、セレベリン（ｃｅｒｅｂｅｒｉｎ）、シャラ ラシン（ｊａｒａｒａｃｉｎ）、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）、エリスチコフ ィン（ｅｒｉｓｔｉｃｏｐｈｉｎ）、ビタンーａ　（ｂｉｔａｎ−ａ）およびル ベリン（ｒｕｂｅｒｉｎ）／オレガニン（ｏｒｅｇａｎｉｎ）にあるＲＧＤ配列 のアルギニンは、Ｋ°残基で置換され得、ＧＰ　１ｌｂ−１１１ａに対して優先 的な親和性を有する、特異的に活性なＦＡＩを与える。さらに、少なくとも２０ 個の、好ましくは少なくとも３０個の、さらに好ましくは少なくとも４０個のア ミノ酸を含有する、これらのペプチドの短縮形態は、天然ペプチドから、または この修飾形態で調製され得る。さらに、または、そのかわりに、１−１ｏ個の、 好ましくは１〜４個の、ＲＧＤ／に″ＧＤ配列に無関係なアミノ酸は、好ましく は保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換で置換または改変され得 る。保存的なアミノ酸置換とは、例えば、酸性アミノ酸残基を酸性アミノ酸残基 で、中性残基を中性残基で、塩基性残基を塩基性残基で、など、本明細書中以下 に述べるような置換を意味する。

さらに、追加の例の群は、ＲＧＤまたはにＧＤのグリシル残基が、活性を維持す るサルコシル残基で置換され得ることを包含する。このように、上述とは異なる 他の方法で分離および／または改変される活性ＦＡＩは、この置換でさらに改変 され得る。

ヘビ毒のフラグメントおよび／または改変されたＦＡＩは、ＲＧＤをＫ”ＣＤで 置換することによって、Ｆｇ／ｖＷＦ／ＧＰ　ｌ１ｂ−１１ａ結合性特異的化合 物のなかに包含され得るが、追加の実施態様では、特異的に活性なペプチドは、 Ｋ’ＧＤ配列自体の適合的拡張型（ＣｏｌｌＩｐａｔｉｂｌｅ　ｅｘｔｅｎｓｉ ｏｎ）に基づく。

Ｙ、およびＹ２は、０〜２５個のアミノ酸残基のペプチド拡張型および誘導型で あり得る。Ｙ、のＮ末端拡張型は、例えば、アセチル化またはそうでなければア シル化され得る：ＹＩのＣ末端拡張型はＮｉ１．、あるいは弐Ｒ−Ｎｌｈまたは 式Ｒ１−ＮＨの１級または２級アミン（ここで、Ｒはそれぞれ独立に、メチル、 ｎ−ブチル、またはｔ−ブチルのような１〜４Ｃの低級アルキルである）でアミ デート化し得る。Ｙｌは、また（Ｒ）またはアシル（１〜４Ｃ）であり得る：Ｙ ｔは、（ＯＨ）、ＮＨ！または上記のようなアミンであり得る。式（Ｌ）の化合 物が単に環状ペプチドである場合は、ＹｌおよびＹｌは無い。

ＸＩおよびＸ！は代表的には、例えばそして最も好ましくは、ジスルフィド環を 形成できるシスティン残基のような、環化可能なアミノ酸残基である。しかし、 ジスルフィドまたは他の結合を形成可能な他の残基も使用され得る・・例えば、 Ｐｌｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒら（上述）によって述べられている、Ｐｅｎ（ペニ シラミン）残基、またはＭｐｒ（メルカプトプロピオニル）またはＭｖｌ（メル カプトバレリル）残基である。目的の環化のための他のタイプの共有結合は、ペ プチド結合、例えばリシル残基の側鎖アミノ基とグルタミル残基の側鎖カルボキ シル基との間に形成されるアミド、および、スレオニン残基の側鎖アルコールと アスパルチル残基の側鎖カルボキシル基との間で形成するようなエステル結合を 包含する。このペプチド鎖の残部（または上記のような、改変されたペプチド結 合）とペプチド結合を形成でき、かつ、共有結合を形成して環化を行い得る適合 性の任意の残基が使用され得る。これは、例えば、単に、Ｎ末端のＮ１１ｌとＣ 末端のＣ０ＯＨ間でペプチド結合を直接形成する環状ペプチドを包含する。

上記のように、１個またはそれ以上の指示されたペプチド結合ハ、−ＣＦｌｔＮ Ｈ−１−ＣｔｌｔＳ−１ＣＬＣＬ−１−ＣＢ＝Ｃ）ｌ−（シスおよびトランス） 、−ＣＯＣＨ，−１−ＣＩ（（ＯＨ）ＣＢ、−および−ＣＩＩＩＳＯ−ノような 置換結合によって置換され得る。

上記のアミノ残基＾＾１〜ＡＡ、の指定では、次の分類法に基づいて説明を行っ た。すなわち、アミノ酸残基は一般に４つの主要なサブクラスに分類し得る。こ の分類はまた、以下に示す。

酸性：　残基は、生理的ｐｌ（でＨイオンを失うことにより、負電荷を有し、そ して、この残基は水溶液に親和し、ペプチドが生理的ｐ８で水性媒体中にあると きに、それが含まれるペプチドの立体構造中で表面位置を探す。

塩基性：　残基は、生理的ｐ［（でＨイオンと結合すること１こより、正電荷を 有し、そして、この残基は水溶液に親和し、ペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中 にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造中で表面位置を探す。

中性／非極性：　残基は生理的ｐＨで荷電せず、そして水溶液による反発を受け 、ペプチドが水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造中で 内側の位置を探す。

また、これらの残基は本明細書中で「疎水性」と表記される。

中性／極性：　残基は生理的ｐＨで荷電しないが、水溶液に親和し、ペプチドが 水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造中で外側の位置を 探す。

個々の残基分子の統計的集合体では、荷電している分子もあるが、非荷電分子も あり、そして、多かれ少なかれ水性媒体への親和性または反発性があるというこ とは、当然、理解される。「荷電した」という言葉の定義に合うには、生理的ｐ Ｈで、個々の分子がかなりの割合で（少なくとも約２５％）荷電している。極性 または非極性の分類に必要な親和力または反発力の程度は、任意であり、そして それゆえに、特定して企図されたアミノ酸は、特定してどれかに分類された。特 定に命名されていないアミノ酸はほとんど、既知の挙動に基づいて分類され得る 。

アミノ酸残基は、さらに、環状または非環状、および芳香族または非芳香族、残 基の側鎖の置換基に関する自明な分類、および、小さいまたは大きい、として下 位分類され得る。残基が、カルボキシル炭素を含めて、全部で４個またはそれよ り少数の炭素原子を含有している場合は、小さい残基と見なされる。小さい残基 は当然いつも非芳香族である。

天然に存在するタンパク質アミノ酸については、前記の図式に従った下位分類は 、以下のとおりである（以下の図式を参照）。

■　アスパラギン酸およびグルタミン酸：１五伎Ａ匪ユ咽、　アルギニン、リシ ン。

（ＬＡＺユぷ　ヒスチジン。

主／極−／′））さい゛　グリシン、セリンおよびシスティン。

しゝ　−：　スレオニン、 アスパラギン、グルタミン； い／　：　チロシン； ／１１さい：　アラニン； ／　い／　：　バリン、 イソロイシン、ロイシン、メチオニン；い／−：　フェニルアラニン およびトリプトファン。

遺伝子にコードされたアミノ酸プロリンは、技術的には中性／非極性／大きい／ 環状および非芳香族の群に入るが、その公知の、ペプチド鎖の２次立体構造上へ の効果により特殊な場合であって、従って、この定義群には包含されず、別個に 分類される。八Ａ、は、プロリン残基または「改変プロリン残基」と指定される 。

プロリンは、理解されているように、２位にカルボキシル基を持つ窒素へテロ５ 員環である。修飾プロリン残基はすべて、窒素に対してα位にカルボキシル基を 持つ窒素５員環または６員環である、その他のへテロ環原子もまた環のなかに包 含され得る。このように、修飾プロリン残基は、ピペコリン酸（２−カルボキシ ピペリジン、Ｐｉｐと略す）およびチアゾリジン（Ｔｈｚ）を包含する。したが って、プロリン、または修飾プロリン残基は、次の式で表される：ここで、１個 または２個のメチレン基はＮＲ，Ｓまたは０によって置換され得、および、任意 の環窒素が、必要に応じて、アルキル（１〜６Ｃ）のような非妨害性の置換基で あるＲで置換され得る。

特定のありふれたアミノ酸は、遺伝コードによってコードされないが、例えば、 ベーターアラニン（β−ａｌａ）、または、３−アミノプロピオン酸、４−アミ ン酪酸などのような他のω−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸（＾ｉｂ）、サルコ シン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモアルギニ ン（Ｏａｒ）、ｔ−ブチルアラ＝　ン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ −ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、フェニルグリシン（ Ｐｈｇ）、およびシクロへキシルアニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、 システィン酸（Ｃｙａ）　；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、チアゾリジン（Ｔｈｚ） 、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ ）を包含する。これらはまた、都合よく特定のカテゴリーに入る。

上記の定義に基づいて、 Ｓａｒおよびβ−ａｌａは中性／非極性／小さい。

ｔ−Ｂｕａ、　ｔ−ＢｕＧ、　Ｎ−Ｍｅｌｌｅ、　ＮｌｅおよびＣｈａは、中性 ／非極性／大きい／非芳香族： Ｃｙａは酸性。

Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大きい／非芳香族： ２−Ｎａ１およびＰｈｇは、中性／非極性／大きい／芳香族：および、Ｐｉｐお よびＴｈｚは、修飾プロリン残基である。

前記アミノ酸は、図式で次のように示し得る：（以下余白） ｒｙ’５　／ｌ’士　冨　ＣユＵ　（冨）、＾ＪＰ　１））Ｊ　システィン６） １すＣｈａ 種々のω−アミノ酸は、サイズによって中性／非極性／′小さい（β−ａｌａ、 すなわち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または、大きい（その他 すべて）に分類される。

また、遺伝子内でコードされたアミノ酸についての他のアミノ酸置換もまた本発 明の範囲内のペプチド化合物に包含され、この一般図式内で分類され得る。

本発明の選択された特定の実施態様を示す式では、アミンおよびカルボキシル末 端基は、特定して示されないことがしばしばあるが、他に特定されないかぎり、 生理的ｐＨ値でとると考えられる形態であるとする。従って、必ずしも特定そし て示す必要がないと考えられ、特定の例または一般式のいずれにおいても生理的 ｐｏでＮ末端Ｈ）およびＣ末端０−が存在すると理解される。当然、非生理的ｐ Ｈ値で形成される酸および塩基付加塩を含む酸および塩基付加塩もまた包含され る。他に注記がないかぎり、これら残基はＬ体であるニ一般式では、特定される 残基はＬ体か０体のいずれかであり得る。一般に、発明のポリペプチドは、０個 、１個または２個のＤ型残基を有するが、好ましくは０個または１個、もっとも 好ましくは０個である。示したポリペプチドでは、各々のコードされた残基をア ミノ酸の通称に従って、適切な場合には１文字表記するが、以下の慣用一覧表に 従う： 遺伝子によってコードされないアミノ酸は、前記の表記のように略称する。

本願に示した特定のペプチドでは、特に明白な上付き刻印（１）の表示がない限 り、光学異性体を有するアミノ酸残基はどれもＬ体を意味する。ペプチドの残基 は通常天然のし光学異性体であるが、１個または２個の、好ましくは１個のアミ ノ酸が光学異性体り体で置換され得る。

カルボキシ末端またはアミノ末端にあるものを包含する遊離官能基も同様にアミ ド化、アシル化または他の置換反応で修飾され得る。これらの修飾は、例えば、 化合物の活性に影響を及ぼすことな（化合物の溶解度を変化させ得る。

本発明のアミド化ペプチドの形成において、例えば、ＢＯＣ−ＡＡｘ−ｐＭＢＨ 八−樹脂またはＢｏｃ−ＡＡｘ−Ｂ）Ｉ＾−樹脂の使用により、類似化合物を直 接合成し得る。ここで、＾＾Ｘは以下さらに詳細に述べるように、所望のペプチ ドの選択されたカルボキシ末端アミノ酸である。あるいは、また、これらのペプ チドは、当該分計で周知の方法を用いるペプチド合成に続いて、化学的または酵 素的にアミド化し得、または、標準的な液相ペプチド合成プロトコルを使って調 製され得る。

本発明の新規（ｄｅ　ｎｏｖｏ）ペプチドの特定の実施態様が好ましい。Ｋ”（ Ｇ／５ａｒ）Ｄ配列では、Ｇ／Ｓａｒは好ましくはＧである。＾＾１および＾＾ ４は、好ましくはＧｌｙ、＾ｌａまたはＳｅｒである；ｎｌは好ましくは０−２ であり、ｎ４は好ましくは１−２である。＾＾２について好ましいのは、中性／ 非極性／芳香族アミノ酸で、特に、トリプトファンおよびフェニルアラニン、最 も好ましくはトリプトファンであり、ｎ２は好ましくは１である。ｘｌおよびＸ Ｉは好ましくは、Ｃｙｓ、　Ｍｐｒ、またはＰｅｎ　（ペニシラミン）残基であ る。Ｙ、は好ましくは、Ｈ、アセチル、またはＧｌｙである；Ｙ２は、好ましく は−ＮＨｔまたは一＾−ＮＨ２である。また、一般に好ましいのは、Ｙ意のＣ末 端アミド体である。

従って、Ｐへ■類似物の好ましい実施態様は、下記の式のペプチドを包含する。

これらはすべてジスルフィド結合の形成によって環状形態をとり得、これらの結 合は明確には示されていない；他の環状形態は「シクロ」と表記する。

（以下余白） Ｌ虹い旦痣ズ」 ＰＡユ　フｓ　Ｃ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｃ−Ａ−Ｒ五２；？Ａ！９ｓ　時ｒ４−シ ＤＪ＊ｎ−％ （以下余白） ＰＡ！　１０１　Ｃ−に−Ｇ−Ｄ−賢−ｐ−ｃ−面ｘア入工　Ｌ２ｔ　Ｃ−ＩＣ −Ｇ−Ｄ−τ−Ｆ−Ｃ−ｕｎｉ２Ｐｊ□１３ｔ　Ｃ４−Ｇ−Ｄ−Ｆ−シーＣ−頗 ２ＦＡ！！４ｔ　Ｃ−Ｘ−Ｇ−Ｄ−レｐ−ｃ−ｍ２？Ａ１１５ｔ　Ｃ４−Ｔ：ｔ −Ｄ−Ｖ−７４１区２ＰＡ！　１１ｉｔ　Ｃ−寒−Ｇ−Ｄ−！（ロー）−Ｐ−Ｃ −ド五２Ｐ入工　１７菖　Ｃ−寒−Ｇ−Ｄ−（２−Ｍａｌドアーａ、！Ｏ！２Ｐ ＭＩＩＩＣ−ｘ−Ｇ−シ（−）−Ｐ−ｃ−顛２ＰＪｕＬ９ｔ　Ｍｇｘ−メーシ昏 、ｗ、ｐ−ｃ−）□ア入工　２０＋　）ｌｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｔｍν−（、Ｗ！ ｔ。

７２ｋｌ　ｍｉｓ　沖：一トシｏ−ｒ−ｖ−ｃ−皿２アλユ　２２！　五ｐｒ− メーＧ−Ｄ−Ｌ−アーＣ−町ア入工　２３ｔ　Ｍｇｘ４−Ｇ−Ｄ−Ｖ−Ｐ−Ｃ− ＮＨ２ＰＪＬｆ２４ｓ　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｙ（ＯＭＩ−Ｆ−Ｃ−ＨＩＨ２ア λ工　２５ｓ　Ｍｐｒ一本−Ｇ−Ｄ−（２−Ｈａ工）、ｐ、Ｃ−）ｉｌ（２ＰＪ Ｕ　２６ｔ　Ｍｇｘ４−Ｇ−Ｄ−（Ｃｈａ）−Ｐ−Ｃ−圏２アλユ　スフ菖　シ フ０（Ｇ・Ｘ、Ｇ−Ｄ−賢−ア）ＰＡ！　２１ｔ　＞１０　（Ａ−Ｘ−シロ−賀 −シ］Ｐ人工　２９＋　、、）ｏ（Ｄ−人工蟲−Ｘ−Ｇ−Ｄ−賀−？）ＰＡ！　 ３０ｔ　シフｏ（Ｆ−に−（ｒ−Ｄ−１１４）ＰＡｘ　コＸＩ　ン’）（：ＪＣ ｐ　−人ユａ−Ｘ−Ｇ−Ｄ−賢−Ｐ）１Ｍ３２ｔ７７ｐ（″ｉ−−珈−に一シシ ｗ−ｐ）ν入；　コ３雪　、ン７ｏ（λ−寒−シｐ−賛−町アＡＸ　コ４＊　ｃ −ｘ−ｃ−ｏ−ｗ−Ｇ−ｃ−ドＨ。

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ＰＡｊ５　ｔ　ｃ−ａ−ｘ−Ｇ−ｏ−ｗ−ｐ（−ＮＩＪ２１ＰＪＪ９ｓ　Ｑｘ− ４−Ｇ−シＰ＠ｎ−１０！、ｊ　ｉ、ＪぴＰＡｊ　！Ｏｔ　Ｃ−に−（ｒ−Ｄ− Ｗ−Ｐへ”圏２１人Ｘ　１２＋　Ｃ−に−Ｇ轡Ｄ−Ｙ−Ｐ拳Ｃ−％Ｐ人１　！！ ＋　Ｃ−に−Ｇ−Ｄ−Ｆ−Ｐ−Ｃ−ＫＨ２Ｐ入工　人工＋　Ｍｐｒ−Ｘ−Ｇ−Ｄ −Ｗ−Ｐ−Ｃ−）［。

１）Ｊ　２５＋　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−（２−）Ｌａｌ）−Ｐ−Ｃ−ＸＦＥ２Ｐ Ｍ３４ｓ　Ｃ−＊−Ｃｒ−Ｄ−’ｄ−Ｇ−Ｃ−聞２ＰＡＩ　コ９ｒ　Ｃ−に−Ｇ −Ｄ−Ｗ−（ＳｊＬｒ）　−Ｃ−ＮＦ４Ｆ）Ｊ４２ｔ　Ｃ−７：−Ｇ−Ｄ−（４ −ＣニーＰｈ＠）−Ｐ−ｎ２ＰＪＪ　４コ！　Ｃ−に−（Ｓａｒ）−Ｄ−賀−Ｐ −Ｃ−ＮＨ２ア）Ｊ　４４ｔ　Ｃ−に−Ｇ−Ｄ−（４−Ｎｏ、−ＰＭ）−Ｐ−Ｃ −ｎ２Ｐ入工　４フｔ　アセ＝ｔｖ＜−ｘ−ａ−ｏ−賀−シーＣ−）Ｑｒ２Ｐ、 人工　４ｉｔ＋　ｘｐｒ−寒−Ｇ−Ｄ−貿（＄＋レミＩＶ）−Ｐ−Ｃ−ＮＩＪ（ ２ＰＡ！４１９！　Ｍｙニーｘ−ｃ−ｏ−ｗ−ｐ−ｃ−ｍｔ。

ＦＪＵ５１ｔ　Ｍｐｒ４−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐａｎ−４０１２？入！　りＩ　Ｍ ｐｒ４−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｆ−（Ｄ−Ｐｅｎ）−）Ｑｒ２ＰＡＹ　５５１　Ｍｐｒ− に−Ｇ−シ賢−（７１ｇ）＜−）Ｑｆ２ＦＡ−１５６ｔ　岑ｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｈ （２−４−Ｄ）ｒＰ）−Ｐ−Ｃ−皿２Ｐ入Ｘ　５７！　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−（ ２−Ｈａユ）−Ｐ−１’ａｎ−ＮＨ２１入１５日＋　Ｍ　ｖｌ−Ｘ−Ｇ−Ｄ−Ｗ −Ｐ−Ｐａｎ−Ｋと２Ｐ入ヱ　５９Ｉ　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｍ−（Ｐｉｐ）− ＰＭｒｔ−１７１゜ＰＡｊ　６２ｔ　ｑｒ−Ｋ　−Ｇ−Ｄ−Ｗ−シーＰ＠ｎ−Ｎ Ｉ！。

？Ａｌ１１３ｘ　Ｍｐｒ−（シぼ）４→−Ｗ−Ｐ−Ｐａｎ−）Ｑ１２ＦＪＬＸ　 ６４ｔ　鵬キー（了勾イ５゛ジ°ルーＬｙ寥）−一〇−％ｉ−７−シ１Σ２Ｐλ １　ｇｉｌｌ　ｑｒ−Ｈａｒ−５ａｑ−Ｄ−賀−Ｐ−Ｃ−１０！。

ＦＡ！ｇ！ｌ＋　Ｍｐｒ−（蝋争有：、’、し、）ｙｌ）−シＤ−賀−Ｐ−Ｐｅ ｎ−１０らＰ入工　フＯ：　Ｍｐｒ−（７ｘ＝＋レイ汁′’＋　し　−Ｌｙｍ） 　−Ｇ−Ｄ−ＭＰ−Ｃ−％Ｐｍ　フｌＩ　Ｑｒ−Ｍａｒ−５直ｘ−Ｄ−Ｗ”Ｐ− ＰＭ　−２？Ａ！７２：　Ｍｐｒ−Ｃ７ｚ：ＩＮ／／ｒ！嶺し’−Ｌ？”）４− シ賢−Ｐ−Ｐ＠！’ＬＮＩＨ。

ア、入エ　フ３１　、ｑｒ−ｕ訂−ｔｚ−ｏ−ｗ−（３，４−−ｒ”ｔ＝ｇ’ｏ −ｐｘｖ）−ｃ−ｗｍ２日のペプ　゛の　８ム 本発明の範囲内にあるポリペプチドは、当該分野で周知の方法、例えば、固相ペ プチド合成、を使って化学的に合成され得る。この合成は、αアミノが保護され たアミノ酸を用いて、ペプチドのカルボキシ末端から開始される。ｔ−ブチロキ シカルボニル（Ｂｏｃ）保護基は、フルオレニルメチロキシカルボニル基（Ｆｌ ［１ｏｃ）のような他の保護基が適切であったとしても、すべてのアミン基の保 護に使われ得る。例えば、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏｆｔ、Ｂｏｃ−＾１ａ、　０ＨＳ Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）−ＯＨ，（すなわち、選択されたカルボキシ末端ア ミノ酸）は、クロロメチル化ポリスチレン樹脂支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）、ｐ− メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨ＾）樹脂またはＰＡＭ樹脂とエステル結 合され得る。ポリスチレン樹脂担体は、好ましくは、スチレンと、架橋剤として の、約０．５〜２％のジビニルベンゼンとの共重合ポリマーでアルポリスチレン ポリマーは特定の有機溶媒に完全に不溶となる。

５ｔｅｖａｒｔら、　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅ ｓｉｓ　（１９６９）　１．日、　Ｆｒｅｅｉａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏおよびＭｅｒｒｉｆｉｅＬｄ　Ｊ　ＡＴＩＣｈｅｎ　Ｓｏｃ　（１ ９６３）　８５：２１４９−２１５４を参照。これらおよび他のペプチド合成法 はまた、米国特許第３．８６２．９２５号、第３．８４２．０６７号、第３、９ ７２．８５９号、および第４．１０５．６０２号によって例示されている。

これらの合成には、手動による合成技術の使用、または、自動的に、例えばＡｐ ｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｉｓ　４３０＾または４３１＾Ｐｅｐｔｉｄｅ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ） の、製造者によって提供された操作手引き書の指示に従った使用も可能である。

ペプチドの樹脂からの開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）は、Ｌｕ、　Ｇ、−３，ら、Ｉ ｎｔ上Ｐｅ　ｔｉｄｅ　＆　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ　（１９８７）　２９：５ ４５−５５７ニ説明されているように、［ロー−ハイ（ｌｏｗ−ｈｉｇｈ）Ｊフ ッ化水素脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）プロトコルを用いて実施され得る 。ヘビ毒Ｐ＾Ｉ類似体の再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）は、エキスフチンの合成に ついて記載しているＧａｒｓｋｙ、　Ｖ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳ＾（１９８９）８６　：４０２２−４０２６に概説されている手順を 用いて実施し得る。

ジスルフィド結合のない本発明の環状ペプチドは、Ｎｕｔｔの米国特許第４．６ １２．３６６号で概説されているように、固相合成法と一般的な方法を用いる溶 液中での環状環構造形成とを組み合わせて、簡便に調製され得る。二のように、 標準的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂上で調製される直線状ペプチドは、ヒドラジ ンで樹脂から開裂され得、続いて、対応するアジドの環化によって環状ペプチド を生成する。

本発明のアナログ化合物の合成過程中に、この開示に従ってｔｌｌ！２される中 間体は、それら自体新規かつ有益な化合物であり、かつ、それゆえに本発明の範 囲内であることは、ペプチド合成分野の当業者によって容易に認識される。

紘汰人主１ 別の方法では、本発明の選択されたペプチドは、周知の方法に従って調製された 組換えＤＮＡ構築物の発現によって生産され得る。このような生産は、このよう な化合物を大量またはその他の実施態様を提供するために望ましいものであり得 る。

ペプチド配列は比較的短いので、岨換え生産は容易である：しかじ、組換え法に よる生産は、少なくとも８個のアミノ酸残基のあるペプチドについての一般的な 固相合成よりも、とくに好ましい。

ＰＡＩのような配列が決定されているポリペプチドをコードするＤＮＡは、好ま しくは市販の核酸合成法を用いて調製され得る。

また、組換え宿主におけるＦＡＩの生産のための発現システムを構築する方法も 当該分野では一般に公知である。

発現は、原核または真核宿主のいずれかで、もたらされ得る。原核生物は、最も 頻繁にはＥ、ｃｏｌｉの種々の細胞株で代表される。しかし、バチルス！Ａ（例 えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ、多様な種のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 、または他の細菌細胞株）のような他の微生物細胞株も使用され得る。このよう な原核細胞系では、複製部位および宿主と適合性を有する種に由来する制御配列 を含むプラスミドベクターが使用される。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉに対するワーク ホース（ｖｏｒｋｈｏｒｓｅ）ベクターはｐＢＲ３２２およびその誘導体である 。一般に使用される原核細胞の制御配列は、リポソーム結合部位配列の他に、あ る場合にはオペレーター遺伝子を伴って転写開始のためのプロモーター遺伝子を 含有する配列であり、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトー ス（１ａｃ）プロモーター遺伝子システムのような一般に使用されるプロモータ ー遺伝子、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター遺伝子システム、ならびにラ ムダ由来のＰＬプロモーター遺伝子およびＮ−遺伝子リポソーム結合部位を含有 する。

しかし、原核生物と適合性の、利用可能なプロモーター遺伝子システムであれば いずれも使用し得る。真核宿主において有用な発現システムは適切な真核遺伝子 から誘導されたプロモーターを含有する。酵母において有用な一群のプロモータ ー遺伝子は、例えば、解糖系酵素合成のためのプロモーター遺伝子、例えば、３ −ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーターを含有する。他の酵母プロ モーター遺伝子は、エノラーゼ遺伝子からのプロモーターまたはＹＥｐ１３から 得られたＬｅｕ２遺伝子を包含する。

適切な哺乳動物プロモーターは、ＳＶ４０の初期および後期のプロモーター遺伝 子、または、他のウィルス性プロモーター遺伝子、例えば、ポリオーマ、アデノ ウィルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウィルス、またはトリ肉層ウィルスを包含する。適切 なウィルス性および哺乳動物のエンハンサ−は上記に列記される。

植物細胞が発現システムとして使用される場合は、例えばツバリン（ｎｏｐａｌ ｉｎｅ）合成プロモーターが適切である。

これらの発現システムは周知の制限および結合技術を用いて構築され、そして、 適切な宿主に形質転換される。

形質転換はそのような細胞に適した標準的な技術を用いて行われる。発現システ ムを含有する細胞は、ポリペプチド、例えばＦＡＩ生産に適した条件下で培養さ れ、そして次いでポリペプチド、例えばＦＡＩ、は回収され、精製される。

仄盗 本発明の精製ポリペプチド、例えばＰＡＩ、を用いることによって、これらの活 性ペプチドと特異的に免疫反応性である抗体の生産もまた可能となる。

例えば、ヘビ毒から単離された精製ＦＡＩ、または、その他の合成された精製Ｆ ＡＩを含有する組成物は、Ｐ＾１ペプチドと免疫反応する抗体の生産を刺激する のに利用され得る。ウサギ、ラット、マウス、ヒツジおよびニワトリのような種 々のを椎動物へのＦＡＩの投与を含む、標準的な免疫化プロトコルは、精製ペプ チドと免疫反応する抗血清を生成させることになる。

ポリペプチド、例えばＦＡＩ、は、適切な抗原的に中性のキャリア（例えば適切 な血清アルブミンまたはキーホールリンペツトヘモシアニン、に都合良く複合（ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）され得、免疫抗原性を高める。さらに、遊離ペプチドは、 複合化の代替物としてのメチル化されたＢＳＡとともに注射され得る。さらに、 免疫化した哺乳動物の抗体分泌細胞は、モノクローナル抗体パネルを生成するよ うに不滅化され得、後にＦＡＩのようなポリペプチドとの反応性についてスクリ ーニングされ得る。得られたポリクロナールまたはモノクローナル抗体のｉｌｌ ！は、標準的な免疫学的検定法を用いる生物学的試料において、対応するポリペ プチド、例えばＦＡＩ、の水準についての分析に有、用である。

１１１げ二よｌ ヘビ毒出発原料（活性ＦＡＩを含有し、そして、そのＰ＾■は既知の特異性を有 する）の同定は、Ｐ＾１アッセイによって可能となる。ＦＡＩアッセイは、イン ビトロでＧＰ　ｌ１ｂ−１１１ａ複合体に対するフィブリノーゲンの結合を抑制 する化合物は、インビボでもまた、トロンビンまたはＡＤＰで誘導されるヒト血 小板の凝集、および、血小板血栓の形成を抑制し得るという観察に基づいている 。この観察は、試験物質がフィブリノーゲン−ＧＰｆｉｂ−１１１ａ間の相互作 用を分断する能力を評価することによって有効なＰｈ３を得ることへの基礎を与 える。

このアッセイでは、例えば本明細書中で参考として援用するＦｉｔｚｇｅｒａｌ ｄ、Ｌ、＾、ら、＾ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８５）　１５１：１６９− １７７に記載されているように、ＧＰ　１ｌｂ−１１１ａを精製形懸で調製して 、ビーズ、試験管、またはマイクロタイタブレートのような固体支持体上にコー トする。次に、コートされた担体をフィブリノーゲンと、そして試験物質と接触 させ、そして充分な時間インキュベートして、固定化ＣＰ　ｆｌｂ−１１１ａに 対してフィブリノーゲンを最大限結合させる。フィブリノーゲンは、代表的には 約５〜５０ｎｌｉの濃度で与え、そして所望された場合には、試験材料を一連の 希釈物で添加し得る。代表的インキュベーションは３５℃で２〜４時間であるが 、時間および温度は相互に依存する。

インキュベーションの後、フィブリノーゲンと試験物質を含有する溶液を取り出 し、ＧＰ　ｌ１ｂ−１１１ａに結合したフィブリノーゲンを定量することによっ てフィブリノーゲンの結合のレベルを測定する。任意の適切な検出手段はいずれ も使用し得るが、例えば放射性、蛍光性またはビオチン化標識を用いて、標識フ ィブリノーゲンを使用するのが便利である。このような方法は周知であり、ここ で入念に説明する必要はない。

結果の評価は、試料物質が欠如している以外は試験試料と通常同一である、コン トロール試料を使用することによって促進される。この場合、抑制百分率は次の 式すなわち、５こ基づいて計算され得る。

また、ＩＣ＠ａのような他の抑制有効性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）の尺度 も利用され得る。

さらに、ＦＡＩアッセイシステムは、Ｆｇを他の接着タンパク質に、および、Ｇ Ｐ　ｌ１ｂ−１１１ａを他のレセプターに置換する以外は上記の分析法と同一で ある結合阻害分析による、ＦＡＩ特異性の特性付けを包含する。特に、ビトロネ クチンのビトロネクチンレセプターへの結合の抑制：フィブロネクチンのフィブ ロネクチンレセプターへの結合の抑制：フィブロネクチンのＧＰｆｉｂ−１１１ ａへの結合の抑制、およびフィブロネクチンおよび／またはｖＷＦのＧＰ　１ｌ ｂ−１＋１ａへの結合の抑制が評価され得る。これらの分析のための接着性タン パク質およびレセプターは、当該分野で入手可能である。

その　の　・セイ 上記のプレートアッセイに加えて、血小板凝集抑制活性および関連活性に対する 他のアッセイもまた、上記のように、利用可能である。要約すると、一般に用い られるアッセイは次の通りである。

１　前段落に記載の、特定のレセプターを利用するプレートアッセイ。

２　血小板凝集に直接適用される標準アッセイ、例えば、上記引用し、本明細書 中で参考として援用するＧａｎｎ、　Ｚ、’−Ｒ，ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ 　（＋９８８）　２６３：１９８２７−１９８３２；　）Ｉｕａｎｇ、Ｔ、Ｆ、 ら、　ＬＢｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（＋９８７）　２６２：１６１５７−１６１６３ ；　肛匹匡肚射ユ（１９８９）２８　：　６６１−６６６に記載されているよう なアッセイ；３、Ｆｏｌｔｓ、　Ｊ、Ｄ、ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　（１９ ７６）　５４：３６５によって記載されているような、イヌのインビボでの血栓 モデル；４、以下の実施例１０に記載したような、Ｓ３５メチオニン標識細胞を 用いる細胞接着への効果 ハ追目’ＬＩＬ肱月 本発明のＦＡＩは、治療上、血栓形成の予防に有用である。このような処置に対 して適切な適応症は、制限なしで、アテローム硬化症および動脈硬化症、急性心 筋梗塞症、慢性不安定性アンギナ（ｕｎｓｔａｂｌｅ　ａｎｇｉｎａ）　、一過 性脳虚血発作および卒中、抹消血管疾病、動脈血栓、子痛前症、塞栓症、血管形 成後の再狭窄および／または血栓、頚動脈血管内膜切除、血管移植の吻合および 慢性心臓血管デバイス（例えば、留置（ｉｎ−ｄｖｅｌｌｉｎｇ）カテーテルま たはバイパス（ｓｈｕｎｔ）　ｒ体外循環デバイス」）を包含する。これらの症 候群は、血管壁上の血小板活性化によって開始すると考えられる種々の狭窄性お よび閉塞性血管障害を代表する。

これらのＦＡＩは、不安定アンギナおよび動脈塞栓症または血栓症において、動 脈血栓形成の予防または中断（ａｂｏｒｔｉｏｎ）のために、および、心筋梗塞 （Ｍ＋）およびＭｒ後の壁在血栓症の治療または予防のために使用し得る。脳関 連障害については、一過性脳虚血発作の治療または予防、および血栓性脈拍また は脈拍の亢進（ｓｔｒｏｋｅ−ｉｎ−ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の治療が包含される 。

これらのＦＡＩはまた、腎臓透析、心肺バイパス、血液環流、および血漿交換の 改善を含む、体外循環での血小板の凝集、塞栓形成、または消費を予防するため にも使用され得る。

これらのＰ＾１は、血管内デバイスに関連した、血小板の凝集、塞栓形成または 消費を予防し、そして、その投与は、大動脈内バルーンポンプ、心室補助装置、 および動脈カテーテルの効用の改善につながる。

これらのＰ＾１は、また、深部静脈血栓症、ＩＶｃ、腎静脈または門静脈血栓症 、および肺静脈血栓症のような静脈血栓症の治療または予防にも有用である。

血栓性血小板減少性紫斑病のような血小板凝集を含む種々の障害もまた、治療可 能である さらに、本発明のＦＡＩは、血小板凝集の抑制が望まれる、非常に多くの治療的 でない応用に使用され得る。例えば、血小板および全血液の貯蔵の改善は、充分 量のペプチドを添加することによって得られ、このペプチド量は、予定貯蔵時間 の長さ、貯蔵条件、貯蔵物質の最終用途などによって変化する。

ＦＡＩ投薬量は、期待される効果および治療背景に依存して広範囲にわたり得る 。代表的には、投薬量は０．５１１ｇ＃＋１投薬形態であり得、これは直接輸注 プレミックスであり、輸注後のポーラスである。このポーラスは約１０〜約５０ ０、好ましくは、約３０〜３００μｇ／Ｋｇ　（約ｌ〜４０ｍｇ、好ましくは、 体重７０ｋｇの患者に対して約２〜２０ｉｇ）、そして、輸注は０．０２〜２μ ｇ／Ｋｇ／分であるが、おそらく、０．５〜１．０μｇ／に８１分（体重７０に ｇに患者に対して５０〜１０（ｌａ＋ｇ７日）である。投与は、毎日の、好まし くは、静脈内のような、非経口であり、例えば１週間、または、１ケ月または２ ケ月またはそれ以上までの間（これらの期間は、ペプチドの大きさによって変化 する）、行われる。ペプチドが、充分小さい、（例えば、約８〜１０個のアミノ 酸残基より少ない）場合、鼻腔内、舌下などのような、投与の別経路が利用でき る。

注射可能物は、液体溶液または懸濁液、注射前の溶液または液体懸濁物に適する 固体形態として、あるいは、エマルジョンとしていずれかの従来形態でｍ製され 得る。

本発明はまた、クエン酸緩衝液中の液体溶液として注射可能で生物活性な、実質 的に純粋なポリペプチドから本質的にる新規治療組成物を含み、この溶液は、ｐ Ｈが約５．０〜約５．５までである。この組成物は、約４℃で非常に安定であり 、約５０℃でも安定で、約５．５より大きいｐＨを有する組成物と比較すると、 注射に先立って、前７．３４．４９日間、約７０”Ｃで改善された安定性を有す る。また、本発明の組成物は、約−１５℃〜約３０℃で少なくとも１８ケ月安定 で、かつ、注射可能である。

この治療用組成物は、上記で議論したような、任意の注射可能で生物学的に活性 な、実質的に純粋なポリペプチドを含有する。好ましくは、この実質的に純粋な ポリペプチドは、血栓形成抑制、血液の体外循環中の血小板損失防止、または、 血小板関連虚血性症候群があるとの疑いのある患者の治療に対して生物学的に活 性である。１つの好ましい実施態様では、このポリペプチドは、１０個までのア ミノ酸残基を含む、環状ポリペプチドで、好ましくは、少なくとも１個のジスル フィドを含有し、例えば、以下のようなペプチドである：　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ −ｆ（本ルミル）−Ｐ−Ｃ−Ｎ）Ｉｚ、　Ｍｖｌ−に−Ｇ−ＤＪ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ ｚ、　Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−Ｎ［ｌｔ、Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）− Ｇ−ＤＪ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ！、　Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）−Ｇ−ＤＪ−Ｐ−Ｐｅｎ−Ｎ Ｈｔ、１ｌｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−ｆ−Ｐ−Ｃ−ＮＨｙ、Ｍ ｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−１１−Ｐ−Ｐｅｎ−Ｎ）ｌｔ、Ｍｐ ｒ（フェニルイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−ｆ−Ｐ−Ｃ−Ｎ）Ｉｔ、Ｍｐｒ（フ ェニルイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−ｆ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨｘ、Ｍｐｒ−＾１ａ −（ｔ（ａｒ）−Ｇ−Ｄ−ｆ−Ｐ−Ｃ−ＮＨｚ、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモアルギ＝　ン −Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ，、Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＬ、また は、これらの環状形態。好ましくは、このポリペプチドは、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモア ルギニン−ｃｉｙ−＾５ｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨｘ　・酢酸塩、また はこれらの環状形態である。

別の局面では、本発明は、ＦＡＩと同定された単離形態の新規ＦＡＩであり、そ して本発明の方法に従って、単離された形態の活性ヘビ毒であり得る。特に、本 発明は、以下から単離され得る単離形態にあるＦＡＩに関する。

（以下余白） Ｌ尾は２山Ｕ議、シー氾ユα−−１匹じ西紅埠田ユ；バー江Ｃニー１゜ニー劇式 ユ；凪瓜−！凶」■２匡；比旦二２冨葛ル圭躯ｌ、Ｌコ匡■鄭≧。

！Ｌ　シエｕｌ四シ瓜、ｍ、　シー戯！二り、Ｌ　血は■は、Ｌ　ｍＩ史１．！ ｌ。

ｍムΣにヒは、Ｌ以１出江、Ｌシはユ良ａ工；Ω■ふ扼−１λ口エス、Ｌｚｈｅ ｕよｅｍ、Ｗ　ｈ　７１　！　ｈ　Ｍ＋好ましいのは、以下から調製される単離 形態のＦＡＩ、または以下から得られたアミノ酸配列を有するＦＡＩである：皿 亀３ＩルＬ旦　Ｉｔ−）ス今ソ）；　；１は猛しムＬぷ旦シΣｘｍ龜−■四、（ イｌユリレソに≦；１．　≦１１Ｌ；；］、＝Ｌシコー」シ、　≦１ふと；−ニ ー≦」ミニ１１ミ　（７”／　、’／　’／　）　ｒ　≦＝、、　よ＊　ｌkこ とｘ−＝＝Ｌ≦コＭ （オ・す：ｚ”’／　ｌ　：　ΩｚΣＪニーｘ　ｒｎ、−ｍＱＬムΣ■一旦　１ モ（）　Ｓ／　’／ｌ　；　’、、　Ｌ８鵠１；猛ぬ旦ｘ　ＩｔしＲン’／　ｌ 　；　Ω口Σｉａ遍旦ｄ旦よ■バＪｙ旦　（Ｉしトレ’ｚｌ；Ｑ。

ｖ＝　ｚは１山１　（ヒバワレ”’／ｌ；　！　ｈ　Ｗ　Ｉ才’ｐ−＃’二’／ 　ｌ　；α又２記謹ムーＬ１ｎｒ−二一りは１ニは（うケレン）；ムＥ二仄匡廊 ■１ユ記四１シ匡ユ虹−ｍ刊　（ｆＩｖｋ７”；ニンｌ；Ｂ、Ｊゼ≦−ユムゑΩ 月社と１≦によ≧；と−ｆｉ　＋１１’ルイヅ″′＞Ｉル′）参特に好ましいの は、クロタトキシン（ｃｒｏｔａｔｒｏｘｉｎ）、セラスチン（ｃｅｒａｓｔｉ ｎ）、デュリシン（ｄｕｒｉｓｓｉｎ）、ホリジン（ｈｏｒｒｉｄｉｎ）、ルベ リン（ｒｕｂｅｒｉｎ）、ラヶシン（ｌａｃｈｅｓｉｎ）、ルトシン（ｌｕｔｏ ｓｉｎ）、モロシン（ｅｏｌｏｓｓｉｎ）、オレガニン（ｏｒｅｇａｎｉｎ）、 ピリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ）、テルゲミニン（ｔｅｒｇｅ＋ｏｉｎｉｎ）および パルボウリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）である。

本発明はまた、天然に存在するペプチドの切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態およ び／または改変形態であり、および／または、１個またはそれ以上の−ＣＩ（！ ＮＨ−または−ＣＨ−ＣＨｘ−のような代替結合で置換されたペプチド結合を有 する、上記で説明したようなアミノ酸配列のペプチドを包含する。

他の局面では、本発明は、本発明の方法によって同定された活性ヘビ毒から調製 され得、そして、ＧＰ　Ｉ［ｂ−１１１ａに対するフィブリノーゲン（Ｆｇ）お よび／またはｖｏｎ　ｆｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖｆＦ）の結合、特異的に阻 害することが示され得た、単離形態のＦＡＩ、ならびに、これらの切形形態およ び／または改変形態をに関する。

また他の局面では、本発明は、ここで、単離形態のヘビ毒のＰＡＩに関し、接着 タンパク質レセプターへの結合に関与する配列は配列ＫＧＤを含有する。

他の局面では、本発明は、一般に、１群のペプチドまたはペプチド関連化合物に 関し、これらは、ビトロネクチンのビトロネクチンレセプターへの結合またはフ ィブロネクチンのフィブロネクチンレセプターへの結合を抑制する能力よりも実 質的に高い能力で、ＦｇまたはｖｆＦのＧＰ　ｌ１ｂ−［１１ａへの結合を抑制 し得る血小板凝集インヒビターである。これらのペプチドは、他のＦＡＩタンパ ク質でみられるＲＧＤＸ結合性配列のかわりに、結合性配列Ｋ”ＧＤＸを有する ことにょつて特性付けられる。

Ｋ”ｌｔ、式Ｒ’　、Ｎ（ＣＯり、ＣＨ（Ｎｌ（）Ｃｏ−（７）、！　換＊　ｆ ニー　ｉｔ　非１換リシル誘導残基であり、ここで、Ｒ１は、それぞれ独立して 、Ｈｌ　または、隣接窒素の塩基性を壊さない程度に十分に電子供与性である置 換基であり、そして、以下に述べるように、１個または２個のメチレン残基が必 要に応じて０またはＳで置換され得る。Ｓ、　ｎ１ｌａｒｕｓ　ｂａｒｂｏｕｒ ｉから単離されたパルボウリンＰＡ＋は、この系列のペプチドの１例である。し かし、このペプチドのさらに短い形態がまた、ならびに、ペプチド鎖の他の場所 に１〜１０個のアミノ酸残基改変および／または代替結合によるペプチド結合の 置換をまた含有する類似配列が使用され得る。他の例示となる実施態様は、Ｋ” ＧＤＸで置換される、負のＲＧＤＸ配列を有する単離されたＰ＾■ペプチドを包 含する。パルボウリンの場合のように、これらの単離されたＦＡＩは、別に天然 形態、または切形され得、および／または１個〜１０個のアミノ酸残基置換また は欠失を含有し得、および／またはペプチド結合を置換した非ペプチド結合を有 し得る。

本発明の範囲内にある別の群の化合物は、記載されたような前記の化合物であり 、ただし、ＲＧＤまたはに″ＣＤ配列中のグリシル残基がサルコシル残基によっ て置換される。このクラスの化合物は、ペプチドを含有する関連ＲＧＤまたはに ’ＣＤの能力および特異性を保持する。

本発明の血小板凝集インヒビター（ＰＡＩ）は、以下に述べるように、「活性」 と同定された（すなわち、本明細書中以下に記載する本発明の方法を用いてＰＡ Ｉを含有することが見出された）ヘビ毒から単離形態で調製され得る、低分子量 ペプチドを含有する。

本発明の方法は、他のインテグリン（例えばビトロネクチンレセプターおよびフ ィブロネクチンレセプター）とは反対に、選択的にＣＰ　Ｉ！ｂ−１１１ａへの 結合を抑制する、ヘビ毒中の有効なＦＡＩの存在の迅速同定および特徴付けを可 能にする。このような同定、および、必要に応じてかつ最適には、特徴付けに際 して、本明細書中で例示され、そして当該分野で開示された種々の標準的手法を 用いて、ＦＡＩは単離かっ精製され得る。

例えば、分子量に基づく分離（代表的には１０ｋｄより小さい物質の回収）、イ オンクロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣが組み合わされて使用され得る。

他の手法もまた使用され得るが、任意の活性ヘビ毒からのＦＡＩに適用し得る実 行可能な手順は、以下のとおりである。

約１０〜ｌ０００ｍ　ｇの毒を希酢酸に溶解し、セファデックスＧ−５０のよう なサイジングカラムに移し、そして同一溶媒で溶出する。画分を本発明のＦｇ／ ＧＰ　［Ｉｂ−１１１ａ結合アッセイ、標準血小板凝集アッセイ（Ｐ＾＾）また は任意のＧＰ　ｌ１ｂ−１１１ａの接着タンパク質結合活性に依存する同様のア ッセイを用いて、活性をアッセイする。あるいは、毒の画分のうち１０ｋｄより 小さい画分は、限外濾過を用いて回収し得、そして同様にアッセイし得る。

いずれかの方法で単離された低分子量画分を、次に、ｆａｔｅｒｓ社から入手可 能な、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）７８％アセトニトリルで予備平衡化 したＣ−１８Ｄｅｌｔａ　Ｐａｋ逆相ＨＰＬＣカラムのような調製用Ｃ−１８Ｈ ＰＬＣカラムにロードする。吸収されたＦＡＩをその後０．１ＸＴＦＡ中で８％ 〜６０％アセトニトリルの濃度勾配を用いて溶離する。勾配の傾きおよび流速は 日常的手順を用いて最適化する。活性画分をＰＡ＾または開示されたレセプター 結合法によって決定する。次に、活性画分をプールし、濃縮し、そして分析ＨＰ ＬＣまたは５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて均一性について試験する。さらに、回収さ れたＦＡＩが均一になるまで逆相ＨＰＬＣの濃度勾配精製を適用する。

配列決定された単離ＰＡＩは、インビトロで合成されるとき、活性を壊さない配 列変化によりて改変され得ることが理解される。一般に、これらの改変形態は、 １〜１０個の、好ましくは１〜４個のアミン置換によって天然型と異なるが、ま たは、切形形態であり得る。さらに、１個またはそれ以上のペプチド結合が、本 明細書中で記載されるような代替結合で置換され得る。特に好ましい置換は、Ｋ ″ＣＤにょるＲＧＤの置換であり、本明細書中で記載されるようなＧＰ　ｌ１ｂ −１１１ａの特異性を付与する。

５ｉｓｔｒｕｒｕｓ　ｍ、　ｂａｒｂｏｕｒｉのＰＡＩは、均一にまで精製され て、配列決定され、「パルボウリン」と命名された。これまでに同定されたＧＰ 　ｌ１ｂ−１１１ａに対する接着タンパク質およびＧＰＩＩｂ−１１１ａの機能 をブロックする、ヘビ毒からのペプチドとは違って、パルボウリンは、当該分野 で公知の接着タンパク質の標準的＾ｒｇ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ配列を含有しない。パ ルボウリンの見かけの結合配列は、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−（Ｔｒｐ）である 。このペプチドの見かけの結合配列領域にＫＧＤ配列が存在することは、ＲＤＧ Ｘ配列をベースとする小さな合成ペプチドで、Ｌｙｓを＾ｒｇで置換すると、こ れらのペプチドのインテグリンレセブターへの結合能力が大きく低下するという 観察から見ると、特に驚くべきことである（　ｐｉｅｒｓ（ｈｂａｃｈｅｒら、 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９８４）旦１＋５９８ ５−５９８８；　ｆｉｌｌｉａＩｏｓら、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｒｅｓ　（１９８７） 　４Ｊ４：４５７−４７１；ＨｕａｎｇらのＪ、　Ｒｉｏｔ　Ｃｈｅｍ　（１９ ８７）　２６２：１６１５７−１６１６３）。この置換は、例えば、ビトロネク チンのビトロネクチンレセプターへの結合阻害とは逆に、パルポウリンペプチド がＦｇおよびｖＹＦのＣＰ　ｌ１ｂ−１１１ａへの結合を抑制する特異性に部分 的に関与していると考えられる。

夾五更 本発明は以下の実施例で例証されるが、これらの実施例は本発明をいかようにも 限定するものではない。

１　−　だ　の クエン酸緩衝溶液を、定容フラスコで、最終クエン酸濃度が２５ａ＋Ｍになるよ うにナノ純水（ｎａｎｏｐｕｒｅ　ｗａｔｅｒ）とクエン酸を混合し、ＮａＯＨ を加えてｐｉｆを調整して、調製する。

上記のクエン酸緩衝液に９５％より高い純度の環状形態の１ｌｐｒ−Ｌ−ホモア ルギニン−ｃｔｙ−＾５ｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨｚ　・酢酸塩ポリペ プチド（１）２００ｎｇを加えて、所望のｐｌ（のｙ４整して、２　ｃｇ／ｍｌ の溶液濃度になるようにした。

支ヱ１立］ユ 上記のポリペプチドのクエン酸緩衝溶液１１１を滅菌条件下でホウ素ケイ酸ガラ スアンプルに封入し、定温で貯蔵した。

試験試料アンプルを各ｐＨおよび温度４℃、５０”Ｃおよび７０”Ｃから定期的 に採り、視覚的に検査し、次に水にアセトニトリル（ＭｅＣＮ）および０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する移動相を用いて）ＩＰＬＣで別々にアッ セイした。この安定性は、純度、重量またはポリペプチドの大きさについて適用 可能な従来アッセイで評価した。これらのアッセイには、変色、透過度および沈 殿のような視覚的アッセイを包含するのみならず、逆相高速液体クラマドグラフ ィー（ＨＰＬＣ）による、ポリペプチドをお互いおよび他の物質から分離するた めに通常適用されるアッセイが包含された。

これらの実験の結果を、表１に示す。この表では、安定性は、Ｉ（ＰＬＣでアッ セイされた試料中の、もともとのポリペプチドのメインビークに対する百分率で 表している。また、この組成物は、視覚的評価では正常であるとわかった。

（以下余白） これらの実験結果は、９Ｈが５．２５のクエン酸緩衝液中の本発明のポリペプチ ド液体溶液が、約−１５℃から約３０℃まで非常１こ安定であったことを示した 。また、この組成物は、視覚的評価によって正常であることがわかった。

３の 上記の実施例１および２の記載と同様の手順に従って、Ｍｐｒ−＾１ａ−（ｔｌ ａｒ）−Ｇ−Ｄ−ｆ−Ｐ−Ｃ−ＮＯｘをｐｕｓ、　２５で約１ｉＩｇ／ＩＩＬの 濃度で２５１Ｍのクエン酸緩衝液に溶解し、そして試験試料ノくイアル中で５℃ 、３０℃および４５℃で９０日間まで貯蔵した。各温度条件からの試験試料バイ アルを定期的に採り、実施例１に記載したように、ＨＰＬＣおよび視覚的検査に よって安定性についてアッセイした。これらの実験結果を以下の表３に示す。

２９　９Ｂ、１９７．３　９５．４ ６０　９Ｂ、３　９７．３　９２．６ ９０　９７．３　９６．５　９０．に れらの実験結果は、ｐＨが５．２５である本発明のポリペプチドの液体溶液が約 ５℃から約４５℃まで非常に安定であったことを示した。また、この組成物は、 視覚的評価でも正常であった。

犬１■ま 口　＃　ｌ　の゛　電 ｕ！＠ｃ４１ｃ４４　バルボ　１ン２８−７３：Ｅ−Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｇ−Ｌ−Ｃ− Ｃ−Ｄ−−Ｃ−Ｒ−Ｆ−Ｌ−に−に−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ａ−に−Ｇ−Ｄ −Ｗ−Ｎ−Ｄ−Ｄ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−−３−Ｃ−Ｄ−Ｃ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｌ− Ｙ−Ｇｏ、　５ｍｆｆ１ｏｌのＰ＾１ｆ−Ｇ１ｙ樹脂（０，６ｍｅｑ／ｇ、＾ｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）を手順へに従って処理し、必要なアミノ酸を 順次導入した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、次の側鎖が保護されていた。＾ｒｇ（Ｔ ｏｓ）、＾５ｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅ ｘ）、Ｌｙｓ　（Ｃ１−Ｚ）、丁ｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＩＩＯ）および Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。完成した保護ペプチド−樹脂鎖の作成に続いて、アミノ末 端のＢａＯ基をＴＦＡで除去し、そして樹脂を乾燥してＴＦＡ塩の形態とした。

この樹脂（１，３ｇ）を「ロー−ハイ（１０冒−ｈｉｇｈ）Ｊ　ＨＦ脱保護手順 に従って処理し、次に、「真空でＪ　ＨＦを除去する。乾燥させたペプチド−樹 脂混合物をエチルエーテルを用いて格子状（ｆｒｅｔｔｅｄ）漏斗（（（＋ａｒ ｓｅ）に移し、エーテルおよびクロロホルムで交互に数回洗浄して、有機保護基 と脱保護に使われたスカベンンヤーのほとんどを除去した。

このペプチド混合物を２Ｌの０．４％酢酸に移し、そして濃ＮＨ。

ＯＨを用いてｐＨを７゜９９に調整した。樹脂をこの溶液から濾過し、そして２ ０時間、４°Ｃで撹拌しないで放置した。次に、この溶液を室温まで暖め、再び ３日間、撹拌しないで貯蔵した。

沈殿した物質を濾過によって除去し、上澄のｐＨを酢酸で３．０に調整し、そし て凍結乾燥した。

組物質を８．０ａ＋１の０．５Ｍ酢酸に溶解し、０．５Ｍ酢酸で平衡させたセフ ァデックスＧ−５０フアインカラム（２，５ｘ　１００ｃｍ）上にロードした。

このカラムを２０１１／ｈｒで流し、そして画分（４ｉｆ）をポリプロピレン試 験管に集めた。画分のアリコー）　（ａｌｉｑｕｏｔ）を乾燥し、水に再分散さ せ、そして前記のように、血小板凝集阻害活性について試験した。活性画分（７ １−９０）をプールし、そして凍結乾燥した。

乾燥した物質（６６のｇ）を２．０＋ｎｌの０．１Ｍ酢酸に再溶解し、０．１％ のＴＦＡを含有する８％のアセトニトリルで平衡化させたＷａｔｅｒｓ　Ｐｒｅ ｐａｒａｔｉｖｅ　Ｃ−１８カラムにロードした。１０分間でアセトニトリル８ ％から２０％までの勾配をかけた後、４０分で３０％アセトニトリルまでのゆる い勾配をかけた。このカラムを１８ｍ１／分で溶離させ、画分（１２秒）をポリ プロピレン試験管に集めた。画分を５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ濃縮器で１．ＯＩＩ＋１ の容量まで濃縮し、そのｌＯμｌのアリコートを血小板凝集のアッセイに使用し た。

活性画分（２９−３２）は、個々に凍結乾燥し、そして８〜３０％アセトニトリ ル勾配を用いて分析用Ｃ−１８ＨＰＬｃカラムでアッセイした。画分２９および ３０をプールし、１．０Ｔｒｌｌの０．５％ＴＦ＾でアッセイカラムにロードし た。主ピークを手で集め、そして凍結乾燥して１．６ｆｆ１ｇの純粋ペプチドを 得た。

この物質のアミノ酸アッセイによって、ペプチドの同一性が確認された。フィブ リノーゲンがＧＰ　１ｌｂ−１１１ａおよびビトロネクチンに結合するのを阻害 する能力について、この物質をアッセイした結果、濃度１μ鼠までは、このアナ ログはＧＰＩ［ｂ−Ｉ　Ｉ　Ｉａに対して親和性が高いこと、および、ＶｎＲに 対しては親和性が欠如していることを示した。

火五五五 Ｇ　−Ｄ−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−３−Ｃ−Ｄ−Ｃ−Ｐ−Ｒ−Ｎ −Ｐ−１−Ｎ−Ｇｏ、　５ｉ＋ｍｏｌのＰ＾Ｍ−ＧＩＹ樹脂（０，６ｍｅｑ／ｇ 、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎｓ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、Ｃ＾）を（順次導入される）必要なアミノ酸を用いて 、手順へに従って処理した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、次の側鎖保護を有していた ：＾ｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｇｌ ｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｌｙｓ　（Ｃ１−Ｚ）、５ｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢ ｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）および７ｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。このペプチドの開裂、再 生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）および精製は、前例と同一であった。このアナログに ついてのレセプター結合データはＴｏ　９０／１５６２０の図２６および図２８ に示されている。

Ｋ１医１ ０　＃　３の　： Ｇ−Ｃ−Ｇ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−＾−Ｎｌ（。

０、５ｎｏ＋＋ｏｌのｐＭＢＩｌ＾樹脂（０，７２ｍｅｑ／ｇ、＾ｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）を手順へに従っ て処理し、必要なアミノ酸を順次導入した。Ｂｏｃ保護アミノ酸は、次の側鎖保 護を有していた：＾５ｐ（０−ｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）および１ ｙｓ（Ｃ１−ｚ）。保護ペプチド−樹脂の作成の完成に続いて、アミノ末端Ｂｏ ｃ基をＴＦ＾で除去し、樹脂をＴＦ＾塩の形態として乾燥した。この樹脂（１， ５４ｇ）を、１０％のアニソール、２％の硫化エチルメチルを含有する無水フッ 化水素（）ＩＦ）を用いて、−１０℃で３０分間処理し、次いで０℃で３０分間 処理した。ＨＦは、真空中で除去し、このペプチド／樹脂組成物をジエチルエー テルに分散させ、次にクロロホルムとエーテルで３回交互に洗浄した。最後のエ ーテル洗浄後、２．０Ｍの酢酸で樹脂からペプチドを抽出し、蒸留水で希釈し、 そして凍結乾燥した。

この粗ペプチド（３７０＋ｏｇ）を、脱酸素した１０！ＩＭのＮＨａＯＡｃ−ｐ Ｈ８、に溶解して０．５＋ｎｇ／ｎｌにし、そしてわずかに過剰の０．０１Ｍフ ェリシアン化カリウム（ＫｓＦｅ（ＣＮ）＠）溶液を滴下して加えて酸化させ、 さらに２０分撹拌し、そして酢酸でｐＨを５に調整した。このペプチド溶液をＤ ＯｆＥＸ　ＡＧ３ｘ４アニオン交換樹脂で撹拌しながら１５分間処理し、そして 樹脂を濾過し、Ｈ！Ｏで希釈し、その後凍結乾燥して、粗層状化ペプチドを得た 。この粗層状化ペプチド（３９２ｍｇ）を、セファデックスＧ−２５Ｆで脱塩し て、０．５Ｍの酢酸で溶離し、その後、Ｃトセファロース（Ｐｈａｒｉ＋ａｃｉ ａ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにかけた。溶出は、ｌＯａ＋１１の ＮＨ，０胱、ｐＨ４，５、の溶液に１ｏＯａ＋ｌｉのＮｌ（、ＯＡｃを添加する ことによって生じる濃度勾配を使用した。）ＩＰＬＣアッセイにより、９０％の 最低純度を有する両分を、プールし、数回水から凍結乾燥して１７５ｍｇを得た 。精製ペプチドを得るために、Ｗａｔｅｒ　Ｃ−１８逆相カラム上を用いる調製 用１（ＰＬＣで、アセトニトリル／水／ＴＦ＾勾配を用いて、最終精製を行なっ た。このアナログにつも）でのレセプター結合データは、Ｔｏ　９０／１５６２ ０の図２６、図２９および図３０に示されている。

Ｋ胤五ヱ その　のアナ口　の 以下のアナログを合成した；はとんどの場合、実施例６に示したのと同様の方法 で合成した。しかし、以下に示すアナログ６０は、Ｍａｊｕｓｚ、Ｓ、らのＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔｓ　（１９８０）　Ｌｌｌ：８５−８７のｅｈ方法を用いて、ア ナログ＃１９のリシン残基の側鎖をグアニジン化することによって溶液中で調製 した。

ｌｆｆ１ｇのアナログ３１９を、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥ人）の存 在下で、１引１の無水（ａｂｓｏｌｕｔｅ）エタノール中で１ｍｇの硝酸ｌ−ア ミジノ−３，５−ジメチルピラゾール（＾１ｄｒｉｃｈ）と、室温で４日間反応 させた。生成物であるアナログ６０を、０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセト ニトリル勾配を用いるＣ−１８カラムでの逆相）ＩＰＬＣによって、過剰の試薬 および出発原料から精製した。

この物質９００μｇを精製形態で単離した。

叉ｔ８ ペプ　゛のＰ＾■ 上記の標準的凝集阻害アッセイで試験されたとき、アナログ＃３〜５は、＾ＤＰ 誘導ヒト血小板凝集を阻害する能力について、＋Ｃａ。値は５μＭであった。し かし、アナログ＃６のＩＣ８，値は２００μ賛より大きく、ならびにアナログ＃ ７は１００μＭである。このアッセイにおける本発明のアナログのＩＣ，、値は 以下の通りである： 塞ｍ旦 ペプ　ドに　る′　ベプ　゛の プレートアッセイ（ｐｌａｔｅ　ａｓｓａｙ）でＧＰ　ｌ１ｂ−１＋１ａに対す るフィブリノーゲンの結合阻害を試験したとき、線状ＲＧＤ？−ＮＨ叩と環状Ｇ ＣＧＲＧＤＷＰＣ＾−ＮＬとの活性はに非常に良く似ていた。対照的に、線状Ｋ 　ＧＤｆ−ＮＯＲは、環状ＧＣＧＫＧＤＴＰＣＡ−ＮＨ＋より効力がずっと弱か った。ＲＧＤＷ化合物ではなく、ＫＧ囲化合物については、環状化によって、ペ プチドがＧＰ　１ｌｂ−１１１ａへのフィブリノーゲンの結合を阻害する能力は 著しく増大した。

火」■１上」− ム　ペプチドのプレート　ムア・・セイ結また、実施例８で合成されたペプチド は、さらに、直接血小板凝集を阻害する能力についての評価に加えて、上記のプ レートアッセイで試験され、そして以下の結果を示した。すなわち、これらのア ナログは、ビトロネクチンレセプターへのビトロネクチンの結合と比較したとき 、特異的に、種々の程度で、ＧＰ　１ｌｂ−１１１ａへのフィブリノーゲンの結 合を阻害することが可能である。アナログ＃４は、この群の中では、もっとも特 異性が高いようである。一方、アナログ＃７および＃５は、同様に非常に特異的 であり、かっ、優れた血小板４集阻害活性を有する。

火」【例−Ｌユ 胞　への　ぺ　３の １１２１メラノーマ細胞を１８３−メチオニンで標識し、次いで、所定の濃度の 精製ヘビ毒ペプチドの存在下で、ビトロネクチンで被覆したプレートに加えた。

細胞接着は、前記の培養および洗浄の後、残っている細胞の可溶化して測定した 。パルボウリンおよびペプチド１（切形形態のパルボウリン）は、いずれも有効 な血小板凝集阻害剤であるが、ビトロネクチンへの細胞接着には大きな効果はも っていなかった。対照的に、コチアリン、これはビトロネクチンレセプターに結 合するビトロネクチンの有効な阻害剤であるが、ビトロネクチンへの細胞接着の 阻害に非常に有効であった。同様の実験で、ペプチド＃３、ＫをＲで置換しタヘ プチド＃３（ＧＣＧＲＧＤＹＰＣ＾−Ｎｔｌ＊）オよびＲＧＤＳを用いて、Ｍ２ １細胞のビトロネクチンへの細胞接着を調べた。

ＲＧＤＳおよびＧＣＧＲＧＤＷＰＣ＾−ＮＨ２は有効な細胞接着阻害剤であるが 、ＧＣＧＫＧＤＷＰＣＡ−ＮＨｚハ、６ｏμｉｔまでは効力が無かった。

去１０乳１」− ア　ロ　６０お　び１９の比 上記のアナログ６０および１９は、配列にＧＤＸを含有し、かつ、に°という実 施態様以外は同一である。アナログ６ｏは、次式を有する。

Ｍｐｒ−（ｌｌａｒ）−Ｇ−ＤＪ−Ｐ−Ｃ−ＮＨｚ　；アナログ１９は、次式で ある。

Ｍｐｒ−に−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−Ｎｉ１．。

これらのアナログを標準血小板凝集阻害アッセイおよび上記の実施例１１の細胞 接着アッセイを用いて試験した。アナログ＃６０は、ごく低濃度で血小板凝集の 阻害に効果があり、そしてビトロネクチンへの細胞接着防止には効果が低かった 。アナログ＃１９は、良好な血小板凝集抑制活性および特異性を有していた：し かじ、アナログ＃１９は、血小板凝集阻害アッセイにおいては、アナログ＃６０ よりも活性が低かった。アナログ＋１６０は、血小板凝集では約Ｃ１１５ｎＭの ＩＣａｏ値を有していた。アナログ＃１９の１Ｃａｏ値は、約１ｎＭであった。

去１目江上」− パルボウ「ンベプ　゛の　べ　−の ［Ｌ”］パルポウリンペプチド（１−７３）の全長をコードする遺伝子を、ｔｏ 　９０／１５６２０の図３８に記載されている方法で、オリゴヌクレオチドから 組み立てた。これらのオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、アニーリングし、 そして標準の手順を用いてＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌで消化したＭ【釦ｐ１８ に結合した。細菌のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子（ｐｈｏ＾）のシグナル配 列（ｆａｔｓｏｎ。

Ｍ、Ｅ、Ｅ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８４） １２：５１４５）を、パルボウリン構築物に付加したが、その方法は、Ｔｏ　９ ０／＋５６２０の図３９に示されているように、［Ｌ”］パルポウリン（１−７ ３）構築物のＥｃｏＲＩ／Ｎｃｏ１部位に合成オリゴヌクレオチドを結合するこ とによった。すべての構築物ヌクレオチド配列をＳａｎｇｅｒジデオキシチェー ンターミネーション法で確認した。

また、このペプチドの切形形態のバージョンを、全長分子のアミノ酸配列２８− ７３のみをコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。ＱｌからＥｌ およびＡｌ１から０６４の２ツノ変更を、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　 ｍｏｌ　（１９８７珪旦：３６７の記載に従って、部位特異的突然変異誘発を用 いて導入した。Ｐｈｏ＾シグナル配列を上記（ｔｏ　９０／１５６２９の図４０ ）の切形形態上山熱安定性エンテロトキシンｌ　Ｉ　（Ｐ　１ｃｋｅｎ、　Ｒ， ＬらのＩｎｆｅｃｔ　１ｍｎｕｎ　（１９８３）　４２：２６９）を、ＥｃｏＲ ＩおよびＮｃｏｌ互換性末端を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、切形バ ージョンに加えた。すべての細菌分泌物構築物を、ＥｃｏＲＩおよび）Ｉｉｎｄ ｌｌ＋制限エンドヌクレアーゼを用いて、ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂ、　Ｉｎｃ、 から商業的に入手可能な細菌の発現ベクターｐＰＲＯＫ−１（Ｂｒｏｓｉｕｓ、 　Ｊ、、江ｎｅ　（１９８４）　２７：１５１．　同：１６１）＋：ｌ：サブク ローンした。

所望のペプチドのタンデム反復をコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）を用いて調製し、Ｌ４１およびＣ６４を含有する完全な長さのパルボウ リンペプチド１−７３からマルチマーユニットを形成した。

ｔｏ　９０／１５６２０の図４１に、このＰＣＲ合成に用いたオリゴヌクレオチ ドを示す。このＰＣＲ反応は、５ａｋｉ、　Ｒ，Ｋ、らの５ｃｉｅｎｃｅ（１９ ８８）　２３９：４８７の方法に従って行なった。得られたポリマー接合部（ｊ ｕｎｃｔｉｏｎ）は７０９０／１５６２０の図４２に示されているように、配列 の末端のいずれかにメチオニンを含有しそして構築物に所望の制限部位を与える 。

このタンデム反復は、個々のマルチマーを形成する成分から形成されるが、例え ば、ＥｃｏＲＩ　／　Ｂａｎ旧フラグメントを、ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ１１１で 切断し、Ｍ１釦９１８ベクターのＢｇｌｌｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントに結 合してダイマーを形成させることによって形成される。得られたダイマーを、Ｅ ｃｏＲｌおよびＢａＩＤＨ＋を用いて切断し、Ｂｇｌｌｌ／　Ｈｉｎｄｌｌ！フ ラグメントに再結合してトリマーを形成させ、そして、所望のサイズが得られる までこれを繰り返す。この構築過程は７０９０／１５６２０の図４３に示されて いる。

次に、このマルチマーを、Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈから入手可能なＬμ壮１ベクター ｐＫＫ２３３−２＋、：、結合した（八ｇ＋ａｎｎ、　Ｅ、らのＧｅｎｅ　（１ ９８５）４０：１８３）。その方法は、このベクターをＮｃｏｌ／　）Ｉｉｎｄ ｌｌｌで消化し、そして、Ｎｃｏｌ／Ｂａｉ旧のモノマーサブフラグメントおよ びＢｇｌｌｌ／　Ｈｉｎｄｌｌｌのマルティマーサブフラグメントを結合させる ことによった。

融合タンパク質として発現させるために、上記の消化されたベクターを、ＮＣ０ Ｉ／εｃｏＲ［サブフラグメントおよびマルティマー構築物のＥｃｏＲｌ−Ｈｉ ｎｄｌｌｌサブフラグメントとともに使用した。このＮｃｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲ Ｉサブフラグメントは、アミン末端部分くアミノ酸１−７２）が少し修飾された クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ， Ｎ、、らのＧｅｎｅ（＋９８７）　５５：１８９）を有しティる。

１１璽上１ ′　え遣云　の 上記の組換えプラスミドすべてからのタンパク質発現は、適切なＬ並且宿主菌株 に形質導入した後、Ｋａｎａｔｎａｒｉら、１匣（１９８Ｂ）　６６：２９５に 従って誘発される。生成物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル 電気泳動およびこれらの生成物の、血小板に富むプラズマでのＡＤＰ誘発血小板 凝集阻害能力によって特徴付けた。精製に続いて、マルティマータンパク質をシ アノーゲンブロマイドで開裂してモノマー単位に変え、そして生成物を上記のよ うにアッセイする。

犬五■±１ ′　の　ナロ　の− 以下のアナログを実施例６に記載の方法と同様の方法で合成し、本明細書中上記 のアッセイ方法でＦＡＩ活性について試験した。

（以下余白） （ＬＩＸＴ−偕λ） １６の １．０Ｍのクエン酸に９５％より高純度の環状１１ｐｒ−Ｌ−ホモアルギニン− Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｎｕｔ　・酢酸塩ポリペプチド（１ ）を、１ｉ１あたり２００ｍｇまでの濃度で含有する溶液を作成した。この溶液 を以下のように希釈し、所望の最終ペプチド濃度にした：まず、この溶液を水で 希釈し、最終容量の約８５％にした。

この溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて５．０〜５．５に調整した。次に 、この溶液を水で希釈し、最終容量にした。（１）の濃度が０．５ｍｇ／ｉｌお よび５．０＋ｎｇ／Ｉ＋＋１である組成物を作成し、そして実施例１に記載した ように、ＨＰＬＣＳＬＩＶおよび視覚的検査によって安定性について評価した。

また、この組成物を、上述したアッセイ法を用いて、血小板凝集阻害能力につい て評価した。これらの実験結果を以下の表４および５に示す。

４５　３２　ＣＣ５，４６９Ｂ、９　０．５０　０．５０　１９９３０　３２　 ＣＣ５，４４９Ｅ１．４　０．５０　０．５０　１７４４５　３２　ＣＣ５，４ ４９７，１０，５００，５０２０２わ χ〈　５ Ｓ　２９　ＣＣ５，４Ｑ９８．３　５．３５　ＮＴ　ＮＴＳ　６０　ＣＣＳ、４ ０９Ｂ、３　４．７１　ＮＴ　ＮＴ５　９０　ＣＣＳ、３８９７．９　４．９７ 　ＮＴ　ＮＴ３０　２９　ＣＣ５，４１９Ｂ、４　４．７６　ＮＴ’　ＮＴ３０ 　６０　ＣＣＳ、４０９７．４　４．６４　ＮＴ　ＮＴ３０　９０　ＣＣ５，３ ９９６，９４，８７ＮＴ　ＮＴ４５　２９　ＣＣ５，４１９６，４４，６５ＮＴ 　ＮＴ４５　６９　ＣＣＳ、４１９３．９　４．２２　ＮＴ　ｆｒ４５　９０　 ＣｖＰＹ　５．３９８９．８　４．１４　ＮＴ　ＮＴ前記表・１および５に記載 しｊこ実験結果Ｃま、本発明のポリペプチドの液体溶液のｐＨ５，０〜５．５を 有して（Ｓるもの（ま、約−１５℃から約４５°Ｃまで非常（こ安定であ−）？ こことを示しｊこ。組成物（ま視覚的検査でも正常であツｊこ。

、、−ｍ−ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３９３３フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　５１０８３ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１００ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　ＺＮＡ　Ｃ９２８２−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ 、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　Ｍ Ｌ、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、 　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、 ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　デュ　ミー、チャールズ　ピー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４４０４゜フォスター　シティ、コーラル 　レーン（７２）発明者　ランドルフ、アン　イー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０１０゜バーリングアム　ドレイク　ア ベニュー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋なポリペプチドを貯蔵安定化する方法であって、該ポリペプチ ドをクエン酸緩衝液に溶解し、ｐＨが約５．０から約５．５である貯蔵安定性溶 液を形成することによる、方法。 ２．実質的に純粋なポリペプチドを貯蔵安定化する方法であって、該ポリペプチ ドをクェン酸緩衝液に溶解し、該溶液中の該ポリペプチドを貯蔵安定化すること によって、本質的に実質的に純粋なポリペプチドからなる液体溶液を形成するこ とを包含する方法であり、該溶液は、約５．０から約５．５のｐＨを有し、およ び、該ポリペプチドは、以下の式を有する：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｋ＋は、以下の式を有し、 Ｒ１２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ−；ここで、（Ｇ／Ｓａｒ）は、Ｃまた はＳａｒであり；ここで、Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、 または、多くともひとつのＲ１がＲ２−Ｃ＝ＮＲ３であり；ここで、Ｒ２はＨ， アルキル（１〜６Ｃ）、または置換または未置換のフェニルまたはベンジル残基 、あるいは、ＮＲ４２であり；ここでＲ４はそれぞれ独立に、Ｈまたはアルキル （１〜６Ｃ）であり；および Ｒ３は、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、フェニルまたはベンジルであり、あるいは Ｒ２−Ｃ＝ＮＲ３は、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼からな る群から選択されるラジカルであり；ここで、ｍは２から３の整数であり、そし てＲ５はそれぞれ独立に、Ｈまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり、そして、ここ で、１個または２個の（ＣＨ２）は、０またはＳによって置換され得るが、該Ｏ またはＳは別のヘテロ原子に隣接しておらず； ＡＡ１は、小さい、中性の（極性または非極性の）アミノ酸であり、そして、ｎ １は０から３の整数であり；ＡＡ２は、中性の、非極性の大きな（芳香族または 非芳香族）アミノ酸、または、極性の芳香族アミノ酸であり、そして、ｎ２は、 ０から３の整数であり； ＡＡ３は、プロリン残基または修飾されたプロリン残基であり、そしてｎ３は０ から１の整数であり； ＡＡ４は、中性の、小さなアミノ酸またはそれらのＮ−アルキル化形態であり、 そして、Ｎ４は０から３の整数であり；Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｘ１ とＸ２の間で結合を形成して、図示したような環式化合物を形成し得る残基であ り；および、 Ｙ１およびＹ２はそれぞれ独立に、非妨害性の置換基であるか、または欠如して おり； ここで、一つまたはそれ以上のペプチド結合は、必要に応じて、−ＣＨ２ＮＨ− 、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、 −ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群か ら選択される結合によって置換され得る。 ３．請求項２に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドＹ１は、Ｈ、ア シル、あるいはペプチド残基またはその誘導体であるか、または、欠如しており 、および、Ｙ２はＯＨ、ＮＨ２あるいはペプチド残基またはその誘導体であるか 、または、欠如しており、Ｙ２はＮＨ２−Ａ−ＮＨ２または欠如しており、Ｘ１ およびＸ２は、システイン（Ｃ）、メルカプトプロピオニル（Ｍｐｒ）およびペ ニシラミン（Ｐｅｎ）からなる群から選択され；ＡＡ１はＧであり、そして、ｎ １は、０または１であり、ＡＡ２は、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＶからなる群から 選択され、そして、Ｋ＋は、Ｋ、Ｈａｒ、アセトイミジル−Ｌｙｓまたはフェニ ルイミジル−ＬｙＳである。 ４．請求項３に記載の方法であって、ポリペプチドが以下のポリペプチドまたは これらの環状形態から選択される方法【配列があります】 ５．前記ポリペプチドがＭｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ（ホルミル）−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２ 、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 ６．前記ポリペプチドが、Ｍｖｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはそ の環状形態である、請求項２に記載の方法。 ７．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、また はその環状形態である、請求項２に記載の方法。 ８．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、 またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 ９．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １０．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ− Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １１．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ− Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １２．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（フェニルイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ −Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １３．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ａｌａ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ −ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １４．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモアルギエン−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ −ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２に記載の方法。 １５．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、または その環状形態である、請求項２に記載の方法。 １６．前記貯蔵安定性が約７０℃またはそれより低い温度で、少なくとも４９日 間該貯蔵安定である、請求項２に記載の方法。 １７．注射可能な、生物学的に活性な、実質的に純粋なポリペプチドを貯蔵安定 性にする方法であって、クエン酸緩衝液に該ポリペプチドを溶解することに記載 、生物学的に活性な、本質的に実質的に純粋なポリペプチドからなる液体溶液を 形成することを包含し、該溶液が約５．０から約５．５のｐＨを有し、該溶液中 の該ポリペプチドを貯蔵安定化する、方法。 １８．前記ポリペプチドが、合成または組換えポリペプチドである、請求項１７ に記載の方法。 １９．前記ポリペプチドが、血栓の形成の阻害、体外血液循環中の血小板損失の 防止、または血小板関連虚血性症候群である疑いのある患者の治療のための、生 物学的に活性であるポリペプチドである、請求項１８に記載の方法；２０．前記 ポリペプチドが以下の式を有する、請求項３に記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｋ＋は以下の式を有し、 Ｒ１２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ−；ここで、（Ｇ／Ｓａｒ）は、Ｇまた はＳａｒであり；ここで、Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、 または、多くともひとつのＲ１がＲ２−Ｃ＝ＮＲ３であり；ここで、Ｒ２はそれ ぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、または、未置換のフェニルまたはベン ジル残基、あるいはＮＲ４２であり； ここで、Ｒ４はそれぞれ独立に、Ｈまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり；および Ｒ２はＨ、アルキル（１〜６Ｃ）、フェニルまたはベンジルであり、あるいは Ｒ２−Ｃ＝ＮＲ３は、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼からな る群から選択されるラジカルであり；ここで、ｍは２から３の整数であり、そし てＲ６はそれぞれＨまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり；そして、ここで、１個 または２個の（ＣＨ２）は、ＯまたはＳで置換され得るが、該ＯまたはＳは別の ヘテロ原子に隣接しておらず； ＡＡ１は、小さい、中性の（極性または非極性）アミノ酸であり、そしてｎ１は ０から３の整数であり；ＡＡ２は、中性の、非極性の大きな（芳香族または非芳 香族）、または、極性芳香族アミノ酸であり、そしてｎ２は０から３の整数であ り； ＡＡ２は、プロリン残基または修飾プロリン残基であり、そしてｎ３は０から１ の整数であり； ＡＡ４は、中性の、小さいアミノ酸またはそのＮ−アルキル化形態であり、そし てｎ４は０から３の整数であり；Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｘ１とＸ２ との間で待合して、図示したような環式化合物を形成し得る残基であり；および 、Ｙ１およびＹ２はそれぞれ独立に、非妨害性の置換基であるか、または欠如し ており； ここで、１個またはそれ以上のペプチド結合は、必要に応じて、−ＣＨ２ＮＨ− 、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、 −ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から 選択される結合によって置換され得る。 ２１．前記ポリペプチドが１０個までのアミノ酸残基を含有する環状ポリペプチ ドである、請求項１９に記載の方法。 ２２．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモァルギニン−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔ ｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２・酢酸塩、またはその環状形態である、請求項２ １に記載の方法。 ２３．前記ｐＨが約５．２５である、請求項１７に記載の方法。 ２４．前記安定性が約−１５℃から約３０℃である、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記安定性が約５℃から約３０℃である、請求項２２に記載の方法。 ２６．前記ポリペプチドが１０個までのアミノ酸残基を含有する環状ポリペプチ ドであり、かつ、ｐＨが約５．２５であって、クエン酸緩衝溶液が水酸化ナトリ ウムを含有する、溶液中で安定化される、請求項１７に記載の方法。 ２７．クエン酸緩衝液に溶解された、実質的に純粋なポリペプチドを本質的に含 有し、該溶液が約５．０から約５．５のｐＨを有する、貯蔵安定性組成物。 ２８．クエン酸緩衝液に溶解された、本質的に有効な量の実質的に純粋なポリペ プチドからなり、該溶液が約５．０から約５．５のｐＨを有し、ポリペプチドが 以下の式を有する、貯蔵安定性組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｋ＋は以下の式を有し、 Ｒ１２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ−；ここで、（Ｇ／Ｓａｒ）は、Ｇまた はＳａｒであり；ここで、Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、 または、多くともひとつのＲ１がＲ２−Ｃ＝ＮＲ３であり；ここで、Ｒ２はそれ ぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、または、置換または未置換のフェニル またはベンジル残基、あるいは、ＮＲ４２であり； ここで、Ｒ４はそれぞれ独立にＨまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり；および Ｒ３はＨ、アルキル（１〜６Ｃ）、フェニルまたはベンジルであり、あるいは、 Ｒ２−Ｃ＝ＮＲ３は、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼からな る群から選択されるラジカルであり；ここで、ｍは２から３の整数であり、およ びＲ５はそれぞれ独立に、Ｈまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり；そして、ここ で、１個または２個の（ＣＨ２）は、ＯまたはＳで置換され得るが、該０または Ｓは別のヘテロ原子に隣接しておらず； ＡＡ１は、小さい、中性の（極性または非極性の）アミノ酸であり、そしてｎ１ は０から３の整数であり；ＡＡ２は、中性の、非極性の大きな（芳香族または非 芳香族）、または、極性芳香族アミノ酸であり、そしてｎ２は０から３の整数で あり； ＡＡ３は、プロリン残基または修飾プロリン残基であり、そしてｎ３は０から１ の整数であり； ＡＡ４は、中性の、小さいアミノ酸またはそのＮ−アルキル化形態であり、そし てｎ４は０から３の整数であり；Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｘ１とＸ２ との間で結合して、図示したような環式化合物を形成し得る残基であり；および 、Ｙ１およびＹ２はそれぞれ独立に、非妨害性の置換基であるか、または、欠如 しており； ここで、１個またはそれ以上のペプチド結合は、必要に応じて、−ＣＨ２ＮＨ− 、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、 −ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から 選択される結合によって置換され得る。 ２９．請求項２８に記載の組成物であって、ここで、前記ポリペプチドＹ１は、 Ｈ、アシル、または、ペプチド残基またはその誘導体、あるいは欠如しており、 および、Ｙ２はＯＨ、ＮＨ２またはペプチド残基またはその誘導体、あるいは欠 如しており、Ｙ２はＮＨ２−Ａ−ＮＨ２または欠如しており、Ｘ１およびＸ２は 、システイン（Ｃ）、メルカプトプロピオニル（Ｍｐｒ）およびペニシラミン（ Ｐｅｎ）からなる群から選択され、ＡＡ１はＧであり、そして、ｎ１は０または １であり、ＡＡ２は、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、およびＶからなる群から選択され、およ び、Ｋ＋は、Ｋ、Ｈａｒ、アセトイミジル−Ｌｙｓまたはフェニルイミジル−Ｌ ｙｓである。 ３０．前記ポリペプチドが以下のポリペプチドまたはこれの環状形態から選択さ れる、請求項２８に記載の組成物；【配列があります】 ３１．前記ポリペプチドがＭｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ（ホルミル）−Ｐ−Ｃ−ＮＨ ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３２．前記ポリペプチドがＭｖｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはそ の環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３３．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、ま たはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３４．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２ 、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３５．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｐｅｎ−Ｎ Ｈ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３６．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ− Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３７．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（アセトイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ− Ｐ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３８．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ（フェニルイミジル−Ｌｙｓ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ −Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ３９．前記ポリペプチドがＭｐｒ−Ａｌａ−（Ｈａｒ）−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ− ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ４０．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモアルギニン−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ −ＮＨ２、またはその環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ４１．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｗ−Ｐ−Ｃ−ＮＨ２、または その環状形態である、請求項２８に記載の組成物。 ４２．約７０℃またはそれより低い温度で、少なくとも４９日間安定化される、 請求項２８に記載の組成物。 ４３．本質的にクエン酸緩衝液の液体溶液に溶解された、注射可能な、生物学的 に有効な量の、実質的に純粋なポリペプチドからなり、約５．０から約５．５の ｐＨを有する、貯蔵安定な治療用液体組成物。 ４４．前記ポリペプチドが、合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドである 、請求項４３に記載の液体組成物。 ４５．前記ポリペプチドが、血栓形成の阻害、体外血液循環中の血小板損失の防 止、または、血小板関連虚血性症候群であるとの疑いのある患者の治療のための 、生物学的に活性なポリペプチドである、請求項４４に記載の液体組成物。 ４６．前記ポリペプチドが以下の式を有する、請求項４５に記載の液体組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｋ＋は以下の式を有し、 Ｒ１２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ−；ここで、（Ｇ／Ｓａｒ）は、Ｇまた はＳａｒであり；ここで、Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、アルキル（１〜６Ｃ）、 または、多くともひとつのＲ１がＲ２−Ｃ＝ＮＲ３であり；ここで、Ｒ２はＨ、 アルキル（１〜６Ｃ）、あるいは、置換または未置換のフェニルまたはベンジル 残基、あるいは、ＮＲ４２であり、Ｒ４はそれぞれ独立にＨまたはアルキル（１ 〜６Ｃ）であり；および Ｒ２はＨ、アルキル（１〜６Ｃ）、フェニルまたはベンジルであり、あるいは Ｒ２−Ｃ＝ＮＲ３は、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼からな る群から選択されるラジカルであり；ここで、ｍは２から３の整数であり、そし てＲ５はそれぞれ独立に、Ｈまたはアルキル（１〜６Ｃ）であり；そして、ここ で、１個または２個の（ＣＨ２）は、ＯまたはＳで置換され得るが、該Ｏまたは Ｓは別のヘテロ原子に隣接おらず；ＡＡ１は、小さい、中性の（極性または非極 性）アミノ酸であり、そしてｎ１は０から３の整数であり；ＡＡ２は、中性の、 非極性の大きな（芳香族または非芳香族）、または、極性の芳香族アミノ酸であ り、そしてｎ２は０から３の整数であり； ＡＡ３は、プロリン残基、または修飾プロリン残基であり、そしてｎ３は０から １の整数であり； ＡＡ４は、中性の、小さいアミノ酸、またはそのＮ−アルキル化形態であり、そ してｎ４は０から３の登数であり；Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、Ｘ１とＸ ２との間で結合して、図示したような環式化合物を形成し得る残基であり；およ び、Ｙ１およびＹ２はそれぞれ独立に、非妨害性の置換基であるか、または、欠 如しており； ここで、１つまたはそれ以上のペプチド結合が、必要に応じて、−ＣＨ２ＮＨ− 、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、 −ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から 選択される結合によって置換され得る。 ４７．前記ポリペプチドが、１０個までのアミノ酸残基を含有する１０個までの アミノ酸の環状ポリペプチドである、請求項４４に記載の液体組成物。 ４８．前記ポリペプチドが、Ｍｐｒ−Ｌ−ホモアルギニン−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔ ｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２・酢酸塩、またはその環状形態である、請求項４ ７に記載の液体組成物。 ４９．前記ｐＨが約５．２５である、請求項４３に記載の組成物。 ５０．前記ポリペプチドが１０個までのアミノ酸残基を含有する環状ポリペプチ ドであり、そして、ｐＨが約５．２５であり、その中のクエン酸緩衝溶液が水酸 化ナトリウムを含有する溶液中で安定化される、請求項４３に記載の液体組成物 。 ５１．実質的に純粋なポリペプチドおよび安定化する有効な量のクエン酸緩衝液 を含有し、約５．０から約５．５のｐＨを有する、組成物。 ５２．注射可能な形の、請求項４３に記載の液体組成を充填した、滅菌デリバリ ーバイァル、バッグ、またはボトルを包含する、製造物。