ES2343681T3 - Antagonistas de interaccion de factor viii con una proteina relacionada con el receptor de lipoproteinas de baja densidad. - Google Patents
Antagonistas de interaccion de factor viii con una proteina relacionada con el receptor de lipoproteinas de baja densidad. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un anticuerpo de unión a Factor VIII para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la degradación de Factor VIII y/o prolongar la vida media de Factor VIII en un fluido biológico, en el que el anticuerpo de unión a Factor VIII comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 17 y 19 de las cadenas pesada y ligera de KM41 o las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 21 y 23 de las cadenas pesada y ligera de KM33.
Description
Antagonistas de interacción de factor VIII con
una proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja
densidad.
La presente invención se refiere al uso de
anticuerpos generados contra el Factor VIII y la inhibición de la
interacción del factor VIII con LRP. Además, la presente invención
se refiere a un método para inhibir la interacción de LRP con el
Factor VIII, así como a un método para disminuir la degradación del
Factor VIII y/o prolongar la vida media del Factor VIII en un
fluido biológico y/o a un método para tratar pacientes que sufren
de un trastorno de la coagulación de la sangre, especialmente
Hemofilia A. La presente invención además se refiere a una
composición farmacéutica útil para disminuir la degradación del
Factor VIII en un fluido biológico, la inhibición de la interacción
del Factor VIII con LRP y/o la prolongación de la vida media del
Factor VIII en un fluido biológico para el tratamiento de un
trastorno de la coagulación de la sangre, especialmente Hemofilia
A.
La coagulación de la sangre implica una
combinación de diferentes rutas de reacción hemostáticas que
finalmente conllevan a la formación de un trombo. Los trombos son
coágulos de componentes de la sangre en la superficie de las
paredes de los vasos y principalmente consisten en plaquetas de la
sangre agregadas y fibrina reticulada insoluble. La formación de
fibrina se induce mediante la proteólisis limitada de fibrinógeno
mediante la enzima coagulante trombina. Esta enzima es el producto
final de una cascada de coagulación, que es una secuencia de
activaciones de zimógeno que tienen lugar en la superficie de las
plaquetas y leucocitos activados y una multitud de células
vasculares (ver, por ejemplo, K. G. Mann y otros, Blood, 1990, Vol.
76, páginas 1-16).
Una etapa clave en esta cascada de coagulación
es la activación del Factor X por un complejo de Factor IX activado
(Factor IXa) y Factor VIII activado (Factor VIIIa).
El Factor VIII de coagulación es, por lo tanto,
una proteína clave en la ruta intrínseca de la cascada de
coagulación. La función del FVIII es servir como un cofactor para la
enzima FIXa e incrementar la eficiencia catalítica de esta proteasa
de cinco a seis ordenes de magnitud (van Dieijen y otros. 1981. The
Journal of Biological Chemistry 256: 3433-3442). La
importancia del FVIII se demuestra mediante el trastorno de
sangramiento severo Hemofilia A, que se caracteriza por la ausencia
de FVIII activo (Kazazian y otros. 1995. The Metabolic and
Molecular Basis of Inherited Disease. En: Scriver, Beadet, Sly y
Valle, Ed. New York, McGraw-HiIII Inc. III:
3241-3267).
La Hemofilia A es un trastorno de la sangre
ligado al sexo que se caracteriza por una deficiencia del Factor
VIII. La enfermedad se presenta en aproximadamente 0,01% de la
población masculina. La hemofilia A puede tratarse administrando
plasma de sangre que contiene Factor VIII obtenido de donantes
sanos. Sin embargo, este tratamiento tiene varias desventajas. El
suministro del Factor VIII es limitado y muy caro; la concentración
del Factor VIII en la sangre es sólo aproximadamente de 100 ng/ml y
los rendimientos utilizando los métodos de fraccionamiento de
plasma actuales son bajos. Debido a que la procedencia de Factor
VIII es sangre de donantes mezclada, el recipiente corre un alto
riesgo de adquirir varias enfermedades infecciosas, incluyendo
aquellas causadas por los virus de la hepatitis No A, hepatitis no
B, hepatitis B o SIDA que pueden estar presentes en la sangre del
donante. Además, los beneficiarios pueden desarrollar anticuerpos
contra el factor VIII exógeno, algunos de los cuales puede reducir
grandemente su efectividad.
Tal como se ha descrito anteriormente, el Factor
VIII (FVIII) de coagulación sirve a su función en la ruta de
coagulación intrínseca como un cofactor para el Factor IX activado
(FIXa) en la activación proteolítica del Factor X (para revisiones,
ver Fay, P. J. (1999) Thromb. Haemostasis 82,
193-200; Lenting, P. J., van Mourik, J.A., y
Mertens, K. (1998) Blood 92, 3983-3996). El Factor
VIII es una glicoproteína de 300 kDa que comprende una estructura
de dominio discreta
(A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2)
(Lenting, P. J., van Mourik, J. A. y Mertens, K. (1998) Blood 92,
3983-3996; Vehar, G. A., Keyt, B., Eaton, D.,
Rodriguez, H., O'Brien, D. P., Rotblat, F., Opperman, H., Keck, R.,
Wood, W. I., Harkins, R. N., Tuddenham, E. G. D., Lawn, R. M., y
Capon, D. J. (1984) Nature 312, 337-342). Los
dominios A y C comparten un 30-40% de homología con
los dominios A y C de la proteína relacionada estructuralmente
Factor V, mientras que el dominio B y las regiones ácidas cortas
a1, a2 y a3 son únicas para el FVIII (Church,
W. R., Jernigan, R. L., Toole, J., Hewick, R. M., Knopf, J.,
Knutson, G. J., Nesheim, M. E., Mann, K. G. y Fass, D. N. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6934-6937).
En el plasma, el FVIII circula como un
heterodímero unido a un ión metálico, que consiste en una cadena
pesada de 90-220 kDa
(A1-a1-A2-a2-B)
y una cadena ligera de 80 kDa
(a3-A3-C1-C2)
(Rotblat, F., O'Brien, D. P., O'Brien, F. J., Goodall, A. H., y
Tuddenham, E. G. D. (1985) Biochemestry 24,
4294-4300; Kaufman, R. J., Wasly, L. C., y Dorner,
A. J. (1988) J. Biol. Chem. 263, 6352-6362). La
proteína inactiva esta estrechamente asociada con su proteína
portadora, el Factor von Willebrand (vWF) (Lollar, P.,
Hill-Eubanks, D. C. y Parker, C. G. (1988) J. Bio.
Chem. 263, 10451-10455). La proteólisis limitada por
el trombo o Factor Xa convierte el precursor de FVIII en su
derivado activado (Lollar, P., Knutson, G. J. y Fass, D. N. (1985)
Biochemestry 24, 8056-8064; Eaton, D., Rodriguez,
H. y Vehar G.A. (1986) Biochemestry 25, 505-512). El
dominio B y la región ácida está en el borde del dominio A3, a
continuación, se eliminan de la molécula (Fay, P. J., Haidaris, P.
J, y Smudzin, T. M. (1991) J. Biol. Chaem. 266,
8957-8962), que conlleva a la perdida de la alta
afinidad de unión a vWF (Lollar, P. y otros (1988) arriba). La
molécula de FVIII activado resultante (FVIIIa) consiste en un
heterodímero que comprende el dominio A2-a2 que
está asociado de formato no covalentemente con la fracción
A1-a1/A3-C1-C2 unida al ión
metálico (Fay, P. J. y otros (1991) arriba).
En la cadena pesada y la cadena ligera del
FVIII, se han identificado varias regiones como sitios interactivos
con FIXa (Fay P. J., Beattie, T., Huggings, C. F. y Regan, L. M.
(1994) J. Biol. Chem. 269, 20522-20527; Bajaj, S.
P., Schmidt, A. E., Mathur, A, Padmanabhan, K., Zhong, D., Mastri,
M., y Fay, P. J. (2001) J. Biol. Chem. 276,
16302-16309; Lenting, P. J., van de Loo, J. W. H.
P., Donath, M. J., S., H., van Mourik, J. A y Mertens, K (1996) J.
Biol. Chem. 271, 1935-1940). Los residuos del
dominio A2 Arg^{484}-Phe^{509},
Ser^{558}-Gln^{565} y
Arg^{698}-Asp^{712} contribuyen a la unión de la
cadena pesada a FIXa (Fay. P. J., (1994) arriba; Bajaj., (2001)
arriba; Fay, P. J., y Scandella, D. (1999) J. Biol. Chem. 274,
29826-29830). En la cadena ligera, la región del
dominio A3 Glu^{1811}-Lys^{1818} se ha
identificado como un sitio interactivo con FIXa (Lenting. P. J.,
(1996) arriba). Además, las regiones
Arg^{484}-Phe^{509} y
Lys^{1804}-Lys^{1818} también se han
identificado como epítopes dianas para anticuerpos que pueden
existir en pacientes con Hemofilia. Dichos anticuerpos inhiben la
actividad del FVIII interfiriendo con el ensamblaje del complejo del
FVIIIa y el FIX activado (Haeley, J. F., Lubin, L. M., Nakay. H.,
Saenko, E. L., Hoyer, L. W., Scandella, D., y Lollar, P. (1995) J.
Biol. Chem. 270, 14505-14509; Fijnvandraat, K.,
Celie, P. H. N., Turenhout, E. A. M., van Mourik, J. A., ten Cate,
J. W., Mertens, k., Peters, M., y Vooberg, J. (1998) Blood 91,
2347-2352; Zhong, D., Saenko, E. L., Shima, M.,
Flech, M., y Scandella, D. (1998) Blood 92,
136-142).
La vida media del Factor VIII puede prolongarse
influyendo en el mecanismo de degradación del Factor VIII
(eliminación), por ejemplo, mediante la reducción de la afinidad del
Factor VIII por los receptores que juegan un papel en su
eliminación, directamente o modificando el factor VIII en su sitio o
sitios de unión para el receptor o los receptores de eliminación
relevantes o, de manera indirecta, utilizando compuestos que
influyen en la unión entre el Factor VIII y sus receptores. Debido
a que los receptores celulares implicados en dicho proceso y los
sitios moleculares implicados en la interacción Factor
VIII-receptor no se conocían, la producción de
dichos agentes ha sido problemática.
La vida media de los heterodímeros del Factor
VIII no activado es dependiente de la existencia de Factor von
Willebrand, que tiene una afinidad pronunciada por el Factor VIII
(pero no por el Factor VIIIa) y que sirve como una proteína
portadora (Sadler, J. E. and Davie, E. W.: Hemofilia A, Hemofilia B
y von Willebrand's disease, en Stamatoyannopoulos, G y otros.
(Eds.), The Molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co.,
Philadelphia, 1987, pág 576-602). Se conoce que
pacientes que tienen la Enfermedad de von Willebrand tipo 3, que no
muestran ningún Factor de von Willebrand detectable en su sistema
circulatorio, también tienen una deficiencia secundaria del Factor
VIII. Además, la vida media del Factor VIII administrado por vía
intravenosa en estos pacientes es de 2 a 4 horas, que es claramente
menor que las 10 a 40 horas que se reportan para pacientes con
hemofilia A.
Estos descubrimientos implican que el Factor
VIII tiende a ser eliminado del sistema circulatorio rápidamente y
que este proceso se inhibe en cierta medida por la formación de un
complejo con el portador natural, el Factor von Willebrand.
Recientemente, El Factor VIII activado por la
trombina se ha involucrado en la unión a la Proteína Receptora de
Lipoproteínas de Baja Densidad (en lo adelante referida como
"LRP") (Yakhyaev, A. y otros, Blood vol. 90 (Suppl. 1), 1997,
126-I). El resumen de este documento describe el
consumo y degradación de los fragmentos de Factor VIII activados
con trombina y reporta que el dominio A2, no las otras dos
subunidades del heterodímero de Factor VIIIa, interactúan con el
LRP celular. Los autores proponen que el dominio A2 que se une al
LRP desestabiliza además la interacción entre el dominio A2 en el
heterodímero de Factor VIIIa y la actividad del Factor VIIIa se
regula a la baja de esta manera.
También se ha demostrado que el FVIII no
activado interactúa con el receptor endocítico multifuncional
proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja
densidad (LRP) (Lenting, P.J., Neels, J. G., van den Berg, B. M.
M., Clisjsters, P. P. F. M., Meijerman, D. W. E., Pannekoek, H., van
Mourik, J. A, Mertens, K. y van Zonneveld, A., J. (1999) J. Biol.
Chem. 274, 23734-23739; WO 00/28021; Saenko, E. L.,
Yakhyaev, A. V., Mikhailenko, I., Strickland, D. K. y Sarafanov, A.
G. (1999) J. Biol. Chem. 274, 37685-37692). Se
sugiere que el receptor juega un papel en la eliminación del FVIII
de la circulación (Saenko, E. L. y otros, arriba; Schwarz, H. P.,
Lenting, P. J., Binder, B., Mihaly, J., Denis, C., Dorner, F., y
Turecek, P. L. (2000) Blood 95, 1703-1708).
El LRP es un miembro de la familia de los
receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL) que además
incluye el receptor LDL, el receptor de lipoproteínas de muy baja
densidad, un receptor 2 de lipoproteína E y megalina (para
revisiones, ver Neels J. G., Hom, I. R., van den Berg, B. M. M.,
Pannekoek, H., y van Zonneveld, A. J. (1998) Fibrinolysis
Proteolysis 12, 219-240; Herz, J. y Strickland, D.
K. (2001) J. Clin. Invest. 108, 779-784). Se
expresa en una variedad de tejidos, incluyendo hígado, pulmón,
placenta y cerebro (Moestrup, S. K., Gliemann, J. y Pallesen, G.
(1992) Cell Tissue Res. 269, 375-382). El receptor
consiste en una cadena \alpha de 515 kDa extracelular, que se une
de manera no covalente a una cadena \beta de 85 kDa transmembranal
(Herz, J., Kowal, R. C., Goldstein, J. L. y Brown, M. S. (1990)
EMBO J. 9, 1769-1776). La cadena \alpha contiene
cuatro bloques de un número variable de repeticiones de tipo de
complemento que median la unión de muchos ligandos no relacionados
estructuralmente y funcionalmente (Moestrup, S. K., Hotlet, T. L.,
Etzerodt, M.,Thoersen, H. C., Nykjaer, A., Andreasen, P. A.,
Rasmussen, H. H., Sottrup-Jensen, L., y Gliemann, J.
(1993) J. Biol. Chem. 268, 13691-13696; Willnow, T.
E., Orth, K. y Herz, J. (1994) J. Biol. Chem. 269,
15827-15832; Neels, J. G., van den Berg, B. M. M.,
Lookene, A., Olivercrona, G., Pannekoek, H., y van Zonneveld, A. J.
(1999) J. Biol. Chem. 274, 31305-31311).
La cadena \beta comprende un dominio
transmembranal y una cola citoplasmática corta que es esencial para
la endocitosis. La cadena alfa funciona como un ectodominio grande y
comprende tres tipos de repeticiones: dominios tipo factor de
crecimiento epidérmico, secuencias
Tyr-Trp-Thr-Asp y
dominios clase A de receptor LDL. Estos dominios clase A, que se
han implicado en la unión del ligando, están presentes en cuatro
bloques separados que se denominan Bloque I (2 dominios), Bloque II
(8 dominios), Bloque III (10 dominios) y Bloque IV (11
dominios).
El LRP también se expresa en tipos de células
como células de riñón de mono (COS) o células de ovario de hámster
chino (CHO) (Fitzgerald, D. J., y otros., J Cell Biol. Vol. 129,
1995, páginas 1533-1541) que son aquellos
frecuentemente utilizadas para la expresión de proteínas de
mamíferos, incluyendo el Factor VIII (Kaufman, R. J. y otros.,
Blood, Coag. Fibrinol, vol. 8 (Supl. 2), 1997, páginas
3-14).
El LRP juega un papel en la eliminación de una
multitud de ligandos, que incluyen proteasas inhibidores del tipo
Kunitz, complejos serpina-proteasa, lipasas y
lipoproteínas, lo que implica que el LRP juega un papel importante
en varios procesos de eliminación fisiológicos y patofisiológicos
(Narita y otros., Blood, vol. 2, páginas 555-560,
1998; Orth y otros., Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 89, páginas
7422-7426, 1992; Kounnas y otros., J. Biol. Chem.,
vol. 271, páginas 6523-6529, 1996).
El LRP también se une al cofactor no enzimático
activado Factor VIIIa (Yakhyaev, A. y otros., Blood, vol. 90,
(Suppl. 1), 1997, 126-I). Mientras que esta
divulgación implica al LRP en la regulación del Factor VIIIa, no
hay indicios de un papel para el LRP en la regulación del Factor
VIII heterodímero no activado.
Se ha demostrado que la cadena ligera del FVIII
interactúa con los bloques II y IV de LRP recombinante, mientras
que no se observó unión a los bloques I y III de LRP (Neels, J. G.,
y otros (1999) arriba).
Se han realizado varios intentos de modificar
varias regiones del polipéptido de Factor VIII para mejorar el
perfil farmacocinético del Factor VIII:
- El documento WO 87/07144 describe varias modificaciones de los sitios de escisión proteolítica, que comprende residuos de arginina y licina para reducir la labilidad de la molécula para una escición catalizada por proteasas específicas, por ejemplo el sitio de escición de factor Xa entre Arg^{1721} y Ala^{1722}.
- Los documentos WO 95/18827, WO 95/18828 y WO 95/18829 describen derivados del Factor VIII con modificaciones en las regiones A2 de la cadena pesada.
- El documento WO 97/03193 da a conocer análogos del polipéptido del Factor VIII, en los que las modificaciones alteran las características de unión a metal de la molécula.
- En el documento WO 97/03195, se describen análogos de polipéptidos de Factor VIII:C, en el que se dan a conocer las modificaciones en uno o más residuos de aminoácidos adyacentes a un residuo Arg.
- El documento EP 808 901 describe la construcción de variantes de Factor VIII con, como mínimo, una mutación en, como mínimo, una región inmunodominante del Factor VIII y el uso de esta variante del Factor VIII para el tratamiento de pacientes con inhibidores de Factor VIII. Estas modificaciones no conllevan a una vida media prolongada o una estabilidad incrementada de la variante del Factor VIII in vivo o in vitro.
Además, el documento WO 00/28021 da a conocer un
polipéptido de Factor VIII con una actividad de Factor VIII:C que
tiene modificaciones en el dominio A3 y/o C1 o C2 de la cadena
ligera y que se caracteriza porque la modificación influye en la
afinidad de unión a la proteína receptora de lipoproteínas de baja
densidad (LRP).
Se ha reportado la clonación molecular del ADNc
de Factor VIII obtenido a partir de ARNm humano y la producción
posterior de proteínas con actividad de Factor VIII en células de
mamíferos, levaduras y bacterias (ver los documentos WO 85/01961,
EP 160 457, EP 150 735 y EP 253 455). En la patente EP 253 455 se da
a conocer un método para producir proteínas con actividad de Factor
VIII utilizando microorganismos transformados. Las solicitudes de
Patente europea EP 150 735 y EP 123 945 y Brikhous y otros (1985)
dan a conocer actividad de Factor VIII en productos de escisión
proteolítica de Factor VIII. Un complejo de dos productos de
eescisión proteolítica de Factor VIII, un polipéptido de 92 kDa y
un polipéptido de 80 kDa muestran una actividad de Factor VII
mejorada. (Fay y otros. Biochem. Biophys. Acta (1986)
871:268-278: Faton y otros, Biochemestry (1986)
25:505-512).
Por lo tanto, los presentes inventores proponen
hacer preparaciones de Factor VIII disponible que aumenten la
estabilidad y la vida media del Factor VIII in vitro e in
vivo.
Sorprendentemente, los presentes inventores han
descubierto que péptidos específicos que comprenden secuencias de
aminoácidos parciales de Factor VIII, así como anticuerpos dirigidos
contra epítopes específicos dentro de esos péptidos, son capaces de
mejorar significativamente la estabilidad del Factor VIII in
vitro e in vivo.
Por lo tanto, la presente invención de manera
general se refiere al uso de un anticuerpo de unión al Factor VIII
para preparar una composición farmacéutica para disminuir la
degradación del Factor VIII y/o prolongar la vida media del Factor
VIII en un fluido biológico, en el que el anticuerpo de unión al
Factor VIII comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nº. 17 y
19 de las cadenas pesada y ligera de KM41 o las secuencias de
aminoácidos SEQ ID Nº. 21 y Nº. 23 de las cadenas ligera y pesada de
KM33.
- 2.
- Preferentemente, dicho anticuerpo consiste en secuencias de aminoácidos según la SEQ ID Nº. 26 (KM33) o según la la SEQ ID Nº. 25 (KM41).
- 3.
- La presente invención además se refiere a una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre y/o discapacidad temporal de los sistemas trombolítico o fibrolítico, en la que la composición comprende los anticuerpos según la presente invención.
Preferentemente, dicho trastorno de coagulación
de la sangre es Hemofília A o enfermedad de von Willebrand y la
discapacidad temporal se produce durante o antes de un proceso
quirúrgico.
Figura 1. Unión de los fragmentos de cadena
ligera de Factor VIII a LRP inmovilizado. El LRP inmovilizado en un
chip sensor CM5 a 16 fmol/mm^{2} se incubó con: A, cadena ligera
de FVIII (150 nM) (línea sólida) y la cadena ligera de Factor Xa
escindida (150 nM) (línea de puntos). B, fragmento
a3-A3-C1 (línea sólida) y el
dominio C2 aislado (750 nM) (línea de puntos). Las incubaciones se
realizaron en 150 mM de NaCl, 2mM de CaCl_{2}, 0,005% (v/v) de
Tween® 20 y 20 mM de Hepes (pH 7,4) a un caudal de 20 \mul/min
durante 2 min a 25ºC. La disociación se inició con el
remplazamiento de la solución del ligando por la solución tampón.
La respuesta se indica como unidades de resonancia (RU) y se corrige
para uniones no específicas, que fueron menos del 5% relativo a los
canales recubiertos con fragmentos de LRP.
Figura 2. Unión de cadena ligera de FVIII con
fragmentos de LRP recombinante. La cadena ligera de FVIII (LCh) (25
nM) se incubó con bloque IV de LRP inmovilizado (1 pmol/pocillo) en
un volumen de 50 \mul en NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, HSA 1%
(peso/volumen), 0,1% de Tween® 20 y Tris 50 mM (pH 7,4) en presencia
o ausencia de varias concentraciones de bloque II de LRP
recombinante (0-600 nM) durante 2 h a 37ºC. Después
de lavar con la misma solución tampón, la cadena ligera de FVIII
unida se cuantificó mediante incubación con anticuerpo contra FVIII
conjugado con peroxidasa CLB-CAg 12 durante 15 min a
37ºC. La unión residual se expresa como porcentaje de la unión en
ausencia de competidor y se corrige para la unión no específica
(menos de 5% en relación con la unión a los pocillos de bloque II
de LRP inmovilizado). En el recuadro, diluciones seriadas de la
cadena ligera del FVIII se incubaron con bloques II de LRP
inmovilizado (1 pmol/pocillo) en un volumen de 50 \mul en NaCl
150 mM, CaCl_{2} 5 mM, HSA 1% (peso/volumen), Tween® 20 0,1% y
Tris 50 mM (pH 7,4) durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar con la
misma solución tampón, se cuantificó la cadena ligera de FVIII
unida tal como se describió anteriormente. Los datos representan la
media \pm D.E. de tres experimentos.
Figura 3 Unión del bloque II de LRP a la cadena
ligera de FVa inmovilizada. El bloque II de LRP (100 nM) se incubó
con cadena ligera de FVIII inmovilizada (71 fmol/mm^{2}) (I) o
cadena ligera de Fva (76 fmol/mm^{2}) (II) en NaCl 150 mM,
CaCl_{2} 2 mM, Tween® 20 0,005% (v/v) y Hepes 20 mM (pH 7,4) a un
caudal de 20 \mul/min durante 2 minutos a 25ºC. La respuesta se
indica como unidades de resonancia (RU) y se corrige para uniones
no específicas, que fueron menos de un 5% en relación con los
canales recubiertos.
Figura 4. Efecto de los fragmentos de anticuerpo
scFv en la interacción entre la cadena ligera de FVIII y LRP. A,
cadena ligera de FVIII (LCh) (25 nM) se incubó con bloque II de LRP
inmovilizado (1 pmol/pocillo) en un volumen de 50 \mul en NaCl
150 mM, CaCl_{2} 5 mM, HSA 1% (Peso/volumen) Tween® 20 0,1% y Tris
50 mM (pH 7,4) en presencia de varias concentraciones
(0-100 nM) de scFV KM41 (círculos negros) o scFv
KM36 (círculos blancos) durante 2 h a 37ºC. Después de lavar con la
misma solución tampón, la cadena ligera de FVIII unida, se
cuantificó mediante incubación con anticuerpo contra FVIII conjugado
con peroxidasa CLB-CAg 12 durante 15 minutos a
37ºC. La unión residual se expresa como porcentaje de unión en
ausencia de competidor y se corrige para unión no específica (menos
del 5% en relación con los pocillos con bloque II de LRP
inmovilizado). Los datos representan la media \pm D.E. de tres
experimentos. B, se incubó la cadena ligera de FVIII (50 nM) con
LRP inmovilizado (16 fmol/mm^{2}), tal como se describe en la
leyenda de la figura 1. La unión se evaluó en ausencia (curvas) o
en presencia de concentraciones incrementadas de scFv KM41 (20, 60,
300, 500 nM curvas 2-5 respectivamente). Se dejó
formar los complejos durante 30 min antes del análisis SRP.
Figura 5. Efecto del ScFv KM33 en la interacción
entre la cadena ligera de FVIII y LRP. La cadena ligera de FVIII
(LCh) (25 nM) se incubó con bloque II de LRP inmovilizado (1
pmol/pocillo) en un volumen de 50 \mul en NaCl 150 mM, CaCl_{2}
5 mM, HSA 1% (Peso/volumen) Tween® 20 0,1% y Tris 50 mM (pH 7,4) en
presencia de varias concentraciones (0-30 nM) de
scFV KM36 (círculos blancos) o scFv KM33 (círculos negros) durante 2
h a 37ºC. Después de lavar con la misma solución Tampón, la cadena
ligera de FVIII unida se cuantificó mediante incubación con
anticuerpo contra FVIII conjugado con peroxidasa
CLB-CAg 12 durante 15 minutos a 37ºC. La unión
residual se expresa como porcentaje de unión en ausencia de
competidor y se corrige para unión no específica (menos del 5% en
relación con los pocillos recubiertos con bloque II de LRP
inmovilizado). Los datos representan la media \pm D.E. de tres
experimentos.
Figura 6. Unión del bloque II de LRP a la
quimera de la cadena ligera de
FVIII/FV^{1811-1818}. Se incubó ScFv EL 14 en un
chip sensor CM5 (67 fmol/mm^{2}) con cadena ligera de FVIII no
modificada recombinante o quimera de
FVIII/FV^{1811-1818} recombinante hasta una
densidad de 20 fmol/mm^{2}, en Nacl 150mM, Tris 50mM (pH 7,4). El
bloque II de LRP (25-125 nM) se pasó por dos canales
separados con quimera de FVIII/FV^{1811-1818}
inmovilizada (círculos blancos) o cadena ligera de FVIII intacta
(círculos negros), respectivamente, y un canal de control
(recubierto con scFV EL 14) en NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, Tween®
20 0,005% (v/v) y Hepes 20 mM (pH 7,4) durante 2 min a un caudal de
20 \mul/min a 25ºC. El bloque II de LRP unido se expresa como la
cantidad asociada después de 2 min.
Figura 7. Unión de scFV KM41 a la quimera de la
cadena ligera FVIII/FV^{1811-1818}. Se incubó
scFv El 14 en un chip sensor CM5 (67 fmol/mm^{2}) con cadena
ligera de FVIII no modificada recombinante o quimera de
FVIII/FV^{1811-1818} recombinante hasta una
densidad de 20 fmol/mm^{2}, en NaCl 150 mM, Tris 50 mM (pH 7,4).
Se pasó ScFv KM41 (40 nM) por dos canales separados con cadena
ligera de FVIII intacto inmovilizado (I) o quimera de
FVIII/FV^{1811-1818} (II), respectivamente. La
respuesta se indica como unidades de resonancia (RU) y se corrige
para la unión no específica.
Figura 8. Según el ejemplo II se inyectaron
ratones con FVIII humano, FVIII humano solo, en presencia de un
fragmento de scFv de control (KM38) y con FVIII humano en presencia
de un fragmento de scFv (KM33) interfiriendo específicamente con la
interacción de FVIII-LRP putativa.
Un aspecto de la divulgación se refiere al uso
de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como
se define en cualquiera de las SEQ ID números 1, 2, 3 ó 4 derivadas
del Factor VIII pero que no tienen ninguna actividad de Factor VIII
sustancial para inhibir la interacción de Factor VIII con LRP.
El término "péptido" se refiere a una
molécula que está comprendida por una secuencia de aminoácidos
unidos por enlaces peptídicos. Preferentemente, los péptidos útiles
para la presente invención están comprendidos por aquellos 20
aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas (ver, por
ejemplo, el bien conocido libro de texto "Biochemistry" por A.
Lehninger, 2^{da} Ed., Worth Publishers, NY, NY (1975).
Los péptidos útiles para la presente divulgación
pueden fabricarse completos o en parte mediante técnicas de
síntesis de péptidos estándares o mediante técnicas de ADN
recombinante.
Un péptido en particular útil para la
divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
(Gly^{1811}-Lys^{1818}).
Otros péptidos particulares útiles para la
divulgación comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:
2 (Lys^{1804}-Lys^{1818}) o SEQ ID NO: 3
(Tyr^{1815}-Ala^{1834}). Por lo tanto, otro
péptido útil para la divulgación comprende las secuencias de
aminoácidos Lys^{1804}-Ala^{1834} (SEQ ID NO:
4).
Preferentemente, un péptido útil para la
presente divulgación tiene menos del 5,0% de actividad de Factor
VIII, más preferentemente menos del 1,0% de actividad de Factor VIII
y lo más preferente esencialmente sin actividad, comparado con la
actividad de Factor VIII correspondiente de la molécula de Factor
VIII de origen natural a partir de la que se deriva dicho péptido
de la presente invención, tal como se ha medido en uno de los
ensayos mencionados anteriormente para la actividad del Factor
VIII.
La evaluación de la actividad de Factor VIII
puede llevarse a cabo mediante un ensayo adecuado, en particular
con cualquier ensayo que se realiza típicamente para determinar la
actividad del Factor VIII en muestras, tales como el ensayo de
coágulo de una sola etapa, tal como se describe en Mikaelsson y
Oswaldson, Scan. J. Hematol. Suppl. 33, 79-86,
1984, por ejemplo o por un ensayo cromatogénico tal como Factor VIII
IMMUNOCHROM (Baxter).
La actividad del Factor VIII puede realizarse
también mediante la medición de la capacidad del Factor VIII de
actuar como cofactor del Factor IXa en la conversión del Factor X a
Factor Xa, en el cual se utiliza un sustrato cromogénico para el
Factor Xa (Coatest Factor VIII, Chomogenix, Moelndal, Suecia).
Otro aspecto de la presente divulgación se
refiere al uso de un anticuerpo, que específicamente se une a uno o
más epítopes en un péptido que comprende una secuencia de
aminoácidos, tal como se define en la SEQ ID Números 1, 2, 3 ó 4
derivadas de Factor VIII, pero que no tienen ninguna actividad
sustancial de Factor VIII para inhibir la interacción del Factor
VIII con LRP.
El término "anticuerpo", tal como se
utiliza en el presente documento, se pretende que incluya un
anticuerpo policlonal o monoclonal, preferentemente un anticuerpo
monoclonal y fragmentos o regiones de los mismos, así como
derivados de los mismos que son capaces de unirse específicamente a
uno o más epítopes en el Factor VIII o a un péptido útil para la
presente invención y que interfiere con la interacción entre una
molécula de Factor VIII y una proteína relacionada con un receptor
de lipoproteínas de baja densidad (LRP).
El término "epítope", tal como se utiliza
en el presente documento, se refiere a toda o a una parte de un
péptido útil para la presente invención que imita la estructura 1º,
2º y/o 3º de todo o de parte de los aminoácidos correspondientes
encontrados en el Factor VIII y que es capaz de ser reconocido
específicamente por un anticuerpo que inhibe la interacción entre
el Factor VIII y LRP. Un epítope puede comprender la secuencia de
péptido en sí misma, es decir la estructura 1º del péptido, el
péptido en varias conformaciones tridimensionales, es decir, las
estructuras 2º o 3º de la secuencia de péptidos y/o modificaciones
de los aminoácidos de dichos péptidos, tales como la adición de
moléculas de azúcares, por ejemplo péptidos glicosilados. Sin estar
ligados a ninguna teoría en particular o mecanismo biológico de
acción, es posible que los péptidos útiles para llevar a la
práctica la presente invención comprendan, como mínimo, dos epítopes
diferentes. Un epítope parece ser una secuencia primaria de
aminoácidos localizada en la SEQ ID NO: 1
(Gly^{1811}-Lys^{1818}). El otro epítope puede
comprender una combinación de secuencias de aminoácidos localizadas
adyacentes al epítope primario anterior; es decir, el otro epítope
puede formarse de la SEQ ID NO: 2
(Lys^{1804}-Lys^{1818}) y/o SEQ ID NO: 3
(Tyr^{1815}-Ala^{1834}). Este epítope puede ser
también un epítope de estructura secundaria o terciaria y puede
comprender ambas secuencias de aminoácidos
Lys^{1804}-Lys^{1818} y
Tyr^{1815}-Ala^{1834}.
Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por
ejemplo, fragmentos de Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv y scFv.
Estos fragmentos pueden prepararse a partir de anticuerpos intactos
utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica, por
ejemplo mediante escición proteolítica con enzimas, tales como
papaína, para producir fragmentos de Fab, o pepsina para producir
fragmentos de F(ab')_{2}.
El anticuerpo útil para llevar a la práctica la
presente invención es un fragmento de anticuerpo scFv y comprende
la secuencia de aminoácidos tal como se describe en los ejemplos
como KM33 (ver SEQ ID NO:20 para la secuencia de aminoácidos de
cadena pesada de KM33, SEQ ID NO: 22 para la secuencia de
aminoácidos de cadena ligera de KM33 y SEQ ID NO: 26 para una
proteína de fusión que comprende las cadenas ligera y pesada de KM33
unidas por un péptido de unión) y/o tal como el dado a conocer por
GenBank Número de Acceso AF235247 (VHKM33) o el anticuerpo tal como
se describe en los ejemplos como KM41 (ver SEQ ID NO: 16 para la
secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de KM41, SEQ ID NO: 18
para la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de KM41 y SEQ
ID No:25 para una proteína de fusión que comprende las cadenas
ligera y pesada de KM41 unidas por un péptido de unión) y/o tal
como el dado a conocer por GenBank Número de Acceso AF234258
(VLKM41).
Éstos y otros scFv pueden producirse tal como se
describe en van der Brink, E. N. y otros, Blood 97(4),
966-972(2001).
Preferentemente, un anticuerpo útil para la
presente invención es capaz de inhibir la interacción con el Factor
VIII y la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de
baja densidad (LRP) de manera que se reduzca esta interacción, como
mínimo, al 20%, más preferentemente, como mínimo, al 50%, todavía
mas preferentemente, como mínimo, al 90% ó 95% o más, comparada con
la interacción, por ejemplo, entre el Factor VIII y LRP derivado de
la fuente dada.
La interacción entre el Factor VIII y LRP puede
determinarse utilizando la Resonancia de Plasmon de Superficie o el
ensayo de unión en fase sólida, tal como se describe en el presente
documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "Proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de
baja densidad" abreviado como "LRP" y se han utilizado estos
términos de manera intercambiada para referirse a la glicoproteína
de membrana que es un miembro de la familia de proteínas receptoras
de lipoproteínas de baja densidad (LDP) (ver Gliemann, J. Biol.
Chem. 379, 951-964 (1998; incorporado como
referencia). El LRP humano contiene 31 dominios repetidos ricos en
cisteína clase A (conocidos como LDLRA) que se distribuyen en la
molécula de LRP en 4 bloques conocidos como I, II, III y IV. El
bloque II comprende un dominio conocido como
CL-II-1/2 que abarca el amino
terminal que flanquea la repetición E4 del Factor de crecimiento
epidérmico y los dominios C3-C7 de LDLRA. Este
dominio CL-II-1/2 interactúa con el
factor VIII (ver Neels, J.G y otros, arriba).
La presente invención se refiere además a una
composición farmacéutica que comprende un anticuerpo útil para la
presente invención y un excipiente fisiológicamente aceptable,
portador, diluyente y/o estabilizador.
Las composiciones farmacéuticas según la
presente invención pueden comprender uno o más anticuerpos útiles
para la presente invención. Las composiciones farmacéuticas según la
presente invención también pueden comprender uno o más ingredientes
activos terapéuticos o profilácticos. En una realización, la
composición farmacéutica comprende uno o más péptidos útiles para
la presente invención. En otra realización, la composición
farmacéutica comprende uno o más anticuerpos útiles para la
presente invención dirigidos contra dichos péptidos. Cuando la
composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos útiles para
la presente invención, dichas composiciones farmacéuticas pueden
contener, además, Factor VIII. El Factor VIII en dicha composición
farmacéutica puede derivarse de cualquier fuente natural, sintética
o recombinante.
Un anticuerpo útil para la presente invención
puede formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo
liofilizado asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable
tales como uno o más excipientes, portadores, diluyentes y
estabilizadores. Portadores adecuados incluyen, sin contribuir
limitación, diluyentes o rellenos, medios acuosos estériles y
varios disolventes orgánicos no tóxicos. Ejemplos de dichos
vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, soluciones
de dextrosa y soluciones de albúmina de suero humano. Pueden
utilizarse también liposomas y vehículos no acuosos, tales como,
aceites fijos. El vehículo o liofilizado puede contener aditivos
que mantengan la isotonicidad, por ejemplo, NaCl, sacarosa, manitol
y la estabilidad, por ejemplo, tampones y/o preservantes. Vehículos
aceptables farmacéuticamente adecuados se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences por A. Osol, un libro de texto estándar en
este sector. Las composiciones pueden formularse en forma de
tabletas, cápsulas, polvos, suspensiones acuosas o soluciones,
soluciones inyectables y similares.
Preferentemente, la composición farmacéutica
según la presente invención está liofilizada.
La administración de la composición farmacéutica
según el método de la presente invención debe llevarse a cabo,
preferentemente, empleando un régimen de dosis que asegure una
respuesta terapéutica máxima hasta obtener mejoría. En general, la
dosis dependerá del tamaño molecular del péptido utilizado. Para un
péptido de aproximadamente 15 aminoácidos, la dosis para la
administración intravenosa puede variar entre aproximadamente 0,1 y
1000 mg/kg, preferentemente entre 1 y 500 mg/kg y lo más preferente
entre 10 y 100 mg/kg. Para péptidos mayores, la dosis puede
incrementarse en consecuencia. Para la administración oral, la dosis
debe ser sustancialmente mayor, teniendo en cuenta, por supuesto,
que la dosis apropiada debe también depender de la salud general
del paciente, edad y otros factores que pueden influir en la
respuesta del medicamento. El medicamento puede administrarse
mediante infusión continua o a intervalos regulares de
aproximadamente 4 a 50 horas para mantener el efecto terapéutico en
el nivel deseado.
La composición farmacéutica según la presente
invención puede estar en forma de preparación de un componente
único o puede existir en combinación con uno o más de otros
componentes en un kit.
La composición farmacéutica según la presente
invención se destina para la administración a mamíferos,
preferentemente humanos. Cuando el anticuerpo útil para la presente
invención se destina para la administración a un mamífero en
concreto, por ejemplo un humano, entonces es preferente que dicho
anticuerpo sea generado utilizando un epítope derivado de ese
mamífero en concreto. Además, es preferente que un anticuerpo útil
para la presente invención que se destina para la administración a
un humano sea un anticuerpo humano o humanizado.
Un anticuerpo útil para la presente invención,
así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos
anticuerpos se pueden administrar a un individuo mediante cualquier
medio que permita que dicho péptido, anticuerpo o derivados de los
mismos lleguen al sitio de acción en el cuerpo. Preferentemente,
dichos anticuerpos y composiciones farmacéuticas que comprenden
dichos anticuerpos según la presente invención se administran por
vía parenteral, es decir, por vía intravenosa, subcutánea o
intramuscular.
La preparación farmacéutica según la presente
invención se puede utilizar para tratar cualquier individuo que
necesite la administración de un agente que inhibe la interacción de
Factor VIII con LRP, disminuye la degradación del Factor VIII o
prolonga la vida media del Factor VIII, en particular para la
prevención o tratamiento de pacientes que tienen un trastorno de la
coagulación de la sangre. Dicho trastorno de la coagulación de la
sangre puede ser provocado, como mínimo en parte, por un
deficiencia, por ejemplo una deficiencia genética o congénita o una
deficiencia adquirida, de Factor VIII. Dicho trastorno de la
coagulación de la sangre puede también ser provocado, como mínimo
en parte, por un deficiencia, por ejemplo una deficiencia genética o
congénita o una deficiencia adquirida, de cualquier otra proteína
que participa en la ruta de coagulación, entre las que incluyen
Factor IX, Factor V, Factor X o Factor von Willebrand.
Preferentemente, dicho trastorno de la coagulación de la sangre es
Hemofilia A o la enfermedad de von Willebrand.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
además al uso de un anticuerpo útil en el contexto de la presente
invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento
de un trastorno de la coagulación de la sangre.
En una realización preferente, el trastorno de
la coagulación de la sangre es Hemofilia A o la enfermedad de von
Willebrand.
La preparación farmacéutica según la presente
invención también puede ser utilizada para la prevención o
tratamiento de pacientes que tienen pérdida temporal de sus
sistemas trombolíticos o fibrinolíticos, por ejemplo, para
pacientes directamente antes, durante o después de una operación o
procedimiento quirúrgico.
La presente invención también se refiere al uso
de un anticuerpo útil en el contexto de la presente invención que
se une de manera específica a uno o más epítopes en dichas
secuencias de aminoácidos para disminuir la degradación de Factor
VIII en un fluido biológico.
Un "fluido biológico", tal como se utiliza
en el presente documento, incluye un fluido aislado de un mamífero,
tal como sangre, o una fracción de la misma, tal como plasma o
suero, así como el medio o fracciones del mismo obtenidos del
cultivo de células eucariotas o procariotas, líneas celulares o
tejidos.
Preferentemente, se añade una cantidad de dicho
anticuerpo que es suficiente para disminuir la degradación de
Factor VIII, como mínimo, un 10%, más preferentemente, como mínimo,
un 20%, aún más preferentemente, como mínimo, un 50% y lo más
preferente, esencialmente un 100%.
La presente invención también se refiere al uso
de un anticuerpo útil en el contexto de la presente invención que
se une de manera específica a uno o más epítopes en dichas
secuencias de aminoácidos para prolongar la vida media del Factor
VIII en un fluido biológico.
Preferentemente, se añade una cantidad de dicho
anticuerpo que es suficiente para prolongar la vida media del
Factor VIII en un fluido biológico, como mínimo, 2 veces, más
preferentemente, como mínimo, 5 veces y lo más preferente, como
mínimo, 10 veces.
La presente memoria se refiere además al uso de
un anticuerpo que se une de manera específica a uno o más epítopes
en dichas secuencias de aminoácidos para inhibir la interacción de
Factor VIII con LRP en un fluido biológico. Preferentemente, se
añade una cantidad de dicho anticuerpo que es suficiente para lograr
un grado de inhibición de Factor VIII para con LRP, como mínimo, un
10%, preferentemente, como mínimo, un 20% y lo más preferente, como
mínimo, un 50%.
La presente invención se ilustra en los Ejemplos
descritos a continuación, sin que se tenga la intención de que la
presente invención esté limitada a los mismos.
Materiales- CNBr-Sepharosa 4B se
obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech. Las placas de microtitulación
(Maxisorp), los frascos para el cultivo de tejidos, el medio
Optimem I, suero fetal bovino (FCS), penicilina y estreptomicina se
obtuvieron de Life Technologies (Life Technologies Inc., Breda,
Países Bajos). El medio de Insectos de Grace
(TNM-FH) y medio Insect-XPRESS se
obtuvieron de BioWhittaker (Alkmaar, Países Bajos).
Proteínas- La cadena ligera de FVIII derivado de
plasma y su Factor Xa adherido derivado se prepararon tal como se
describió anteriormente (Lenting, P.J., Donath, M.J.S.H., van
Mourik, J.A. y Mertens, K. (1994) J. Biol. Chem. 269,
7150-7155; Donath, M.J.S.H., Lenting, P.J., van
Mourik, J.A. y Mertens, K. (1995) J. Biol. Chem. 270,
3648-3655). Los anticuerpos monoclonales contra el
FVIII CLB-CAg A, CLB-CAg 117 y
CLB-CAg 12 han sido descritos anteriormente
(Lenting, P.J. y otros (1994), arriba; Leyte, A., Mertens, K.,
Distel, B., Evers, R.F., de Keyzer-Nellen, M.J.,
Groenen-van Dooren, M.M., de Bruin, J., Pannekoek,
H., van Mourik, J.A. y Verbeet, M.P. (1989) Biochem. J. 263,
187-194). El anticuerpo monoclonal contra la cadena
ligera de Factor Va CLB-FV se obtuvo mediante
técnicas de hibridoma estándares.
Los fragmentos de anticuerpos de dominio
variable de cadena simple (scFV) dirigidos contra la cadena ligera
de FVIII se expresaron en la cepa TG1 de Escherichia coli y
se purificaron por cromatografía de quelatos metálicos (Qiagen,
Hilden, Alemania), tal como se describió anteriormente
(32-34), con la excepción que los scFV KM36, KM41 y
KM33 se fluyeron en 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 100 mM de
Imidazol y 20 mM de Hepes (pH 7,4).
Los péptidos sintéticos que abarcan las regiones
de FVIII humano Trp^{1707}-Arg^{1721}
(WDYGMSSPHVLRNR)(SEQ ID NO: 5),
Lys^{1804}-Lys^{1818} (KNFVKPNETKTYFWK) (SEQ ID
NO: 2), Tyr^{1815}-Ala^{1834}
(YFWKVQHHMAPTKDE-
FDCKA) (SEQ ID NO: 3), His^{1822}-Ala^{1834} (HMAPTKDEFDCKA) (SEQ ID NO: 6), Thr^{1892}-Ala^{1901} (TENMERNCRA) (SEQ ID NO: 7), Glu^{1908}-His^{1919} (EDPTFKENYRFH) (SEQ ID NO: 8), Thr^{1964}-Lys^{1972} (TVRKKEEYK) (SEQ ID NO: 9), Lys^{2049}-Gly^{2057} (KLARLHYS) (SEQ ID NO: 10) y Asp^{2108}-Gly^{2117} (DGKKWQTYRG) (SEQ ID NO: 11) se sintetizaron mediante química de Fmoc (N-(9-fluorenil)metoxicarbonilo) según el método "T-bag" manual (Houghton, R.A. (1985) PNAS U.S.A. 82, 5131-5135; WO96/41816), o empleando un instrumento 430A de Applied Biosystems (Pharmacia LKB Biotechnology, Roosendaal, Países Bajos; Medprobe AS, Oslo, Noruega).
FDCKA) (SEQ ID NO: 3), His^{1822}-Ala^{1834} (HMAPTKDEFDCKA) (SEQ ID NO: 6), Thr^{1892}-Ala^{1901} (TENMERNCRA) (SEQ ID NO: 7), Glu^{1908}-His^{1919} (EDPTFKENYRFH) (SEQ ID NO: 8), Thr^{1964}-Lys^{1972} (TVRKKEEYK) (SEQ ID NO: 9), Lys^{2049}-Gly^{2057} (KLARLHYS) (SEQ ID NO: 10) y Asp^{2108}-Gly^{2117} (DGKKWQTYRG) (SEQ ID NO: 11) se sintetizaron mediante química de Fmoc (N-(9-fluorenil)metoxicarbonilo) según el método "T-bag" manual (Houghton, R.A. (1985) PNAS U.S.A. 82, 5131-5135; WO96/41816), o empleando un instrumento 430A de Applied Biosystems (Pharmacia LKB Biotechnology, Roosendaal, Países Bajos; Medprobe AS, Oslo, Noruega).
Los péptidos estaban más del 95% puros, tal como
se determinó mediante análisis por cromatografía líquida de alta
presión (HPLC) y sus identidades se confirmaron mediante
espectrometría de masa. LRP derivado de placenta purificado se
obtuvo tal como se ha descrito (Moestrup, S.K. y Gliemann, J. (1991)
J. Biol. Chem. 266, 14011-14017; incorporado en el
presente documento como referencia). La proteína asociada a receptor
de fusión glutatión S-transferasa
(GST-RAP) se expresó en la cepa DH5\alpha de
Escherichia coli y se purificó empleando
glutatión-sepharosa tal como se ha descrito (Herz,
J., Goldstein, J.L., Strickland, D.K., Ho, Y.K. y Brown, M.S.
(1991) J. Biol. Chem. 266, 21232-21238). Las células
de riñón de bebé de hámster (BHK) que expresan el ligando LRP
recombinante que se une a los bloques II y IV han sido descritas con
anterioridad (Neels, J.G. y otros (1999) arriba). La albúmina de
suero humano (HSA) se obtuvo de la División de Productos de CLB
(Ámsterdam, Países Bajos). La proteína se cuantificó mediante el
método de Bradford (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72,
248-254), utilizando HSA como estándar.
Proteínas recombinantes- El plásmido
pCLB-BPVdB695 que codifica la variante por supresión
del dominio B de FVIII, FVIII-del
(868-1562) ha sido descrita con anterioridad
(Mertens, K., Donath, M.J.S.H., van Leen, R.W., de
Keyzer-Nellen, M.J.M., Verbeet, M.P., Klaase Bos,
J.M., Leyte, A. y van Mourik, J.A: (1993) Br. J. Haematol. 85,
133-142) y se utilizó como plantilla para construir
el plásmido que codifica para la quimera
FVIII/FV^{1811-1818}. Los iniciadores de
oligonucleótidos derivados de la secuencia de la cadena ligera de
FVIII que contienen los reemplazos de codones de FVIII/FV (tabla II
más adelante) se emplearon para construir los plásmidos utilizando
el método de mutagénesis de Reacción en Cadena PCR (Tao, B.Y. y Lee,
K.C.P. (1994) PCR Technology Current Innovations (Griffin, H.G. y
Griffin, A.M., eds), 71-72, CRC Press, Boca Ratón,
Florida). El análisis de secuencia se llevó a cabo para verificar
la presencia de las mutaciones en el plásmido. La transfección de
los plásmidos que codifican FVIII en células de fibroblastos
murinas (C127) se realizó tal como se describió anteriormente
(Mertens, K. y otros, (1993), arriba). Las líneas celulares estables
que expresan FBI no modificado o quimera
FVIII/FV^{1811-1818} se mantuvieron en fábricas de
células ("cell factories") de 1 litro en medio RPMI 1640,
suplementado con FCS al 5%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 1 \mug/ml de anfotericina B y 0,8 \mug/ml de
desoxicolato. El medio que contiene FVIII se recogió tres veces a la
semana. Posteriormente, el medio se filtró para eliminar los restos
de células y se concentró aproximadamente 10 veces utilizando un
cartucho de fibra hueca (Hemoflow F5, Fresenius, Bad Homburg,
Alemania). Se añadió benzamidina hasta una concentración final de
10 mM y los concentrados se almacenaron a -20ºC. El FVIII se
purificó a partir del medio concentrado mediante cromatografía de
inmunoafinidad utilizando el anticuerpo CLB-CAg 117
y cromatografía de Q-Sepharosa según un
procedimiento establecido (Mertens, K. y otros, (1993), arriba). Se
prepararon las cadenas ligeras de FVIII incubando la quimera
FVIII/FV^{1811-1818} y el FVIII no modificado en
un tampón que contiene 40 mM de EDTA, 100 mM de NaCl y 50 mM de
Tris (pH 7,4) durante 4 horas a 25ºC. Posteriormente, se
purificaron la quimera de FVIII/FV^{1811-1818} y
la cadena ligera del FVIII no modificado utilizando cromatografía
de Q-Sepharosa. Las proteínas recombinantes se
eluyeron en un tampón que contiene 1M de NaCl y 50 mM de Tris (pH
7,4), se dializaron contra 150 mM de NaCl y 50 mM de Tris (pH 7,4) y
se almacenaron a 4ºC. La construcción del plásmido que codifica el
dominio C2 recombinante (es decir, residuos
Ser^{2173}-Tyr^{2332}) ha sido descrita con
anterioridad (Fijnvandraat, K. y otros (1998) arriba). El plásmido
pACgp67b-His-a3-A3-C1, que
codifica el fragmento a3-A3-C1 de
FVIII (es decir, residuos Glu^{1649}-Asn^{2172})
se construyó mediante reacción en cadena de la polimerasa empleando
los iniciadores de oligonucleótidos,
5'-TTACTCGAGGAAATAACTCGTACTAACT-3'
(sentido) (SEQ ID NO: 13) y
5'-AATGCGGCCGCTTCAATTTAAATCACAGCCCAT-3'
(anti-sentido) (SEQ ID NO: 14), utilizando
pCLB-BPVdB695 como plantilla (Mertens, K. y otros,
(1993), arriba). Se purificó el fragmento de ADN amplificado, se
digirió con XhoI y NotI y se ligó en pBluescript. La
construcción resultante se verificó mediante secuenciación.
Posteriormente, se digirió
pBluescript-a3-A3-CI
con EspI y NotI y el fragmento obtenido se purificó y
se ligó en el plásmido pACgp67b-80K digerido con
EspI/NotI (Fijnvandraat, K., Turenhout, E.A.M., van den
Brink, E.N. ten Cate, J.W., van Mourik, J.A., Peters, M. y Voorberg,
J. (1997) Blood 89, 4371-4377). Un fragmento de ADN
que codifica una cola poli-His
(5'-ATTGGATCCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAGCCCCCGCAGCTTTC
AAAGCCCGGGGCCATGGGA-3')(SEQ ID NO: 15) se digirió
con BamHI y NcoI y se clonó en el plásmido
pACgp67b-a3-A3-C1
digerido con BamHI/NcoI. Utilizando el sistema de expresión
de baculovirus, se obtuvieron los fragmentos recombinantes
a3-A3-C1 y C2 mediante la infección
de células de insecto tal como se ha descrito (Fijnvandraat, K. y
otros (1998) arriba). El fragmento
a3-A3-C1 se purificó a partir del
medio Insect-XPRESS empleando cromatografía de
afinidad, utilizando el anticuerpo contra el dominio A3
CLB-CAg A acoplado a CNBr-Sepharosa
4B como matriz de afinidad. Se incubó CLB-CAg
A-Sepharosa con medio que contiene el fragmento
a3-A3-C1 durante 16 horas a 4ºC.
Después de la unión, se colectó la matriz de inmunoafinidad y se
lavó con un tampón que contiene 1 M de NaCl y 50 mM de Tris (pH
7,4) y se eluyó con 150 mM de NaCl, 55% (v/v) de etilen glicol y 50
mM de lisina (pH 11). Las fracciones de la elusión se neutralizaron
inmediatamente con 1 M de imidazole (pH 6,0), se dializaron contra
150 mM de NaCl, 50% (v/v) de glicerol y 50 mM de Tris (pH 7,4) y se
almacenaron a -20ºC. El dominio C2 recombinante se purificó
empleando la misma técnica de cromatografía de afinidad, excepto que
se utilizó el anticuerpo contra el dominio C2
CLB-CAg 117 en lugar de CLB-CAg
A.
Purificación de la Cadena Ligera de Factor Va-
El Factor V Humano (FV) se obtuvo a partir de plasma humano
proporcionado por nuestro instituto (CLB, Países Bajos). El FV de
tamaño completo se purificó empleando cromatografía de afinidad. La
cadena ligera de Fva se preparó incubando FV (10 \muM) con
trombina (2 \muM) en un tampón que contiene 100 mM de NaCl, 5 mM
de CaCl_{2} y 50 mM de Tris (pH 7,4) durante 2 horas a 37ºC. La
trombina se inactivó con Huridina (Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO) y la cadena ligera de Fva se purificó empleando
cromatografía de afinidad, utilizando
CNBr-Sepharosa 4B acoplada con el anticuerpo
monoclonal contra la cadena ligera de Factor V
CLB-FV 5 (5 mg/ml). La matriz de inmunoafinidad se
lavó con 100 mM de NaCl, 25 mM de EDTA y 50 mM de Tris (pH 7,4) y
se eluyó con 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 55% (v/v) de etilen
glicol y 50 mM de Tris (pH 7,4). La cadena ligera de Fva purificada
se dializó contra 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 50% (v/v) de
glicerol y 50 mM de Tris (pH 7,4) y se almacenó a -20ºC.
Expresión y purificación de fragmentos de LRP
recombinantes- Los bloques II y IV de LRP recombinantes se
expresaron en células BHK, utilizando medio Optimem I suplementado
con 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina
(Neels, J.G. y otros (1999) arriba). Después de colectar el medio,
se añadió CaCl_{2} hasta una concentración final de 10 mM. La
purificación de los bloques II y IV de LRP a partir del medio
acondicionado se llevó a cabo mediante una etapa de purificación
única, utilizando GST-RAP acoplado a
CNBr-Sepharosa 4B como matriz de afinidad. La
matriz se colectó en una columna, se lavó con un tampón que
contiene150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 50 mM de Hepes (pH
7,4) y se eluyó con 150 mM de NaCl, 20 mM de EDTA y 50 mM de Hepes
(pH 7,4). Posteriormente, las preparaciones de bloques de LRP
purificados se concentraron empleando concentradores Centricon 10
(Millipore, Bedford, MA) mediante rondas sucesivas de centrifugación
durante 1 hora a 4000 x g a 4ºC. Finalmente, las preparaciones se
dializaron contra 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl_{2}, 0,005% (v/v)
de Tween® 20 y 20 mM de Hepes (pH 7,4) y se almacenaron a -20ºC.
Ensayos de unión en fase sólida- Los bloques II
y IV de LRP recombinantes (1 pmol/pocillo) se absorbieron en
pocillos de microtitulación en 50 mM de NaHCO_{3} (pH 9,8) en un
volumen de 50 \mul durante 16 horas a 4ºC. Los pocillos se
bloquearon con 2% (p/v) de HSA, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y
50 mM de Tris (pH 7,4) en un volumen de 200 \mul durante 1 hora a
37ºC. Después de tres lavados rápidos (menos de 5 segundos cada
uno) con 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 0,1% (v/v) de Tween® 20
y 50 mM de Tris (pH 7,4), la cadena ligera de FVIII o sus derivados
se incubaron a varias concentraciones en un volumen de 50 \mul en
un tampón que contiene 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 1% (p/v)
de HSA, 0,1% (v/v) de Tween® 20 y 50 mM de Tris (pH 7,4) durante 2
horas a 37ºC. El ligando unido se detectó mediante incubación con
anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa
CLB-CAg 12 en el mismo tampón durante 15 minutos a
37ºC. El anticuerpo CLB-CAg 12 no interfiere con la
unión de fragmentos de FVIII a LRP o bloques de LRP (datos no
mostrados). En experimentos de competición, la cadena ligera de
FVIII (25 nM) se incubó con pocillos que contenían bloques de LRP
inmovilizados, tanto en presencia como en ausencia de diluciones
seriadas de competidor en un volumen de 50 \mul durante 2 horas a
37ºC. La unión de FVIII residual se detectó tal como se describió
anteriormente. Los datos se corrigieron por la unión de pocillos de
microtitulación vacíos, que fue menos del 5% en relación con la
unión a pocillos que contienen bloques de LRP inmovilizados.
Resonancia de Plasmón de Superficie- Las
cinéticas de las interacciones de la proteínas se determinaron
mediante análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR),
utilizando un sistema biosensor BIAcore^{TM}2000 (Biacore AB,
Uppsala, Suecia). Se acoplaron covalentemente LRP (16
fmol/mm^{2}), cadena ligera de FVIII (71 fmol/mm^{2}),
fragmento a3-A3-C1 (67
fmol/mm^{2}), cadena ligera de FVa (76 fmol/mm^{2}) o scFv EL
14 (67 fmol/mm^{2}) a la superficie de dextrana de un chip sensor
CM5 activado a través de aminoácidos primarios, utilizando el kit
de acoplamiento de aminas tal como recomienda el fabricante. Se
activó de forma rutinaria un canal de flujo de control y se bloqueó
en ausencia de proteína. Se evaluó la asociación del analito en 150
mM de NaCl, 2 mM de CaCl_{2}, 0,005% (v/v) de Tween® 20 y 20 mM de
Hepes (pH 7,4) durante 2 minutos a una velocidad de flujo de 20
\mul/min a 25ºC. Se dejó disociar durante 2 min en el mismo flujo
de tampón. Los chips sensores se regeneraron utilizando varios
pulsos de 100 mM de H3PO4 o 20 mM de EDTA, 1 M de NaCl y 50 mM de
Hepes (pH 7,4) a una velocidad de flujo de 20 \mul/min. Las
constantes de velocidad de asociación (k_{on}) y
disociación (k_{off}) se determinaron utilizando el
programa BIAevaluation 3.1 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Los datos
fueron corregidos para cambios del índice de refracción en masa y se
ajustaron mediante análisis de regresión no lineal según un modelo
de unión de dos sitios. Las constantes de disociación de equilibrio
(k_{d}) se calcularon a partir de la relación
k_{off}/k_{on}. El valor de k_{d} para
interacciones de baja afinidad se estimó utilizando un análisis de
afinidad en estado estacionario utilizando el programa
BIAevaluation. En experimentos de competición, se incubó la cadena
ligera de FVIII (50 nM) con LRP inmovilizado (16 fmol/mm^{2}) en
presencia o ausencia de diluciones seriadas de competidor durante 2
minutos, a una velocidad de flujo de 20 \mul/min a 25ºC.
Unión de la quimera FVIII/cadena ligera de
FV^{1811-1818} al bloque II de LRP- La quimera
recombinante FVIII/cadena ligera de
FV^{1811-1818} o la cadena ligera de FVIII no
modificado se acoplaron a scFv EL 14 inmovilizado hasta una
densidad de 20 fmol/mm^{2}, en un tampón que contiene 150 mM de
NaCl y 50 mM de Tris (pH 7,4). Se hizo pasar el bloque II de LRP
(25.125 nM) por canales separados con la quimera recombinante
FVIII/cadena ligera de FV^{1811-1818} o la cadena
ligera de FVIII no modificado, respectivamente, y un canal de
control (recubierto con scFv EL 14) en 150 mM de NaCl, 2 mM de
CaCl_{2}, 0,005% (v/v) de Tween® 20 y 20 mM de Hepes (pH 7,4)
durante 2 minutos a una velocidad de flujo de 20 \mul/min a
25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Interacción entre LRP y fragmentos de cadena
ligera de FVIII- El dominio C2 de FVIII aislado (es decir, residuos
Ser^{2173}-Tyr^{2232}) se asocia con LRP de
forma menos eficaz que la cadena ligera de FVIII intacta (Lenting,
P.J. y otros (1999) arriba; WO00/28021 arriba). En este estudio, fue
explorada la posibilidad que otros sitios en la cadena ligera de
FVIII contribuyan a la unión a LRP. Para ello, se monitorizó la
interacción de cuatro derivados de la cadena ligera de FVIII, la
fracción a3-A3-C1 (es decir,
residuos Glu^{1649}-Asn^{2172}), el dominio C2
del C terminal y un fragmento de la cadena ligera de FVIII que
carece de la región ácida N-terminal empleando la
escisión en la posición Arg^{1721} de Factor Xa (es decir,
residuos Ala^{1722}-Tyr^{2332}).
Tal como se muestra en la figura 1, todos los
fragmentos de FVIII mostraron asociación dependiente del tiempo con
LRP inmovilizado seguido de disociación, que parece ser dependiente
de la dosis, ya que la mayor respuesta se observó a la mayor
densidad de LRP (datos no mostrados). Se requirió de un modelo de
unión a dos sitios para describir de forma adecuada los datos
obtenidos de la cadena ligera de FVIII, cadena ligera escindida de
Factor Xa y el fragmento a3-A3-C1.
Las constantes de velocidad de asociación (k_{on}) y las
constantes de velocidad de disociación (k_{off}) que se
derivan de este modelo estaban en el mismo orden o magnitud para
estos fragmentos (tabla I más adelante). Esto conlleva a valores de
K_{d} comparables que describen una interacción de afinidad
ligeramente baja con LRP inmovilizado, a saber 18 nM y 59 nM para la
cadena ligera de FVIII, 22 nM y 60 nM para la cadena ligera
escindida de Factor Xa y 26 nM y 74 nM para el derivado
a3-A3-C1 (tabla I más adelante).
Por el contrario, el dominio C2 aislado mostró una velocidad
disociación muy rápida que es descrita con exactitud por cualquiera
de los modelos de unión. La afinidad (K_{d}) de este fragmento
(3,4 \muM), por lo tanto, fue estimada por extrapolación,
empleando cálculos de afinidad de estado estacionario. De forma
colectiva, estos resultados muestran que existe una alta afinidad
por el sitio de unión a LRP en la región A3-C1 (es
decir, residuos Ala^{1722}-Asn^{2172}) y una
baja afinidad al sitio en el dominio C2.
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de la cadena ligera de FVIII a los bloques
II y IV de LRP inmovilizado- Un estudio previo ha demostrado que
los bloques II y IV de unión al ligando LRP median en la interacción
con la cadena ligera de FVIII (Neels, J.G. y otros (1999), arriba).
En el presente estudio se utilizó un ensayo de unión en fase sólida
para abordar la cuestión de si los bloques II y IV de LRP pueden o
no competir por la unión a la cadena ligera de FVIII. Tal como se
demuestra en el recuadro de la figura 2, la cadena ligera de FVIII
fue capaz de unirse al bloque II de LRP inmovilizado en una forma
dependiente de la dosis. Esta observación está acorde con los
descubrimientos anteriores, en los que se utilizó análisis de SPR
para monitorizar la interacción entre el bloque II de LRP y la
cadena ligera de FVIII inmovilizada (Neels, J.G. y otros (1999),
arriba). Los estudios de competición revelaron que los bloques II y
IV de LRP compiten por la unión a la cadena ligera de FVIII (figura
2). El bloque II de LRP mostró una inhibición dependiente de la
dosis de la unión a la cadena ligera de FVIII al bloque IV de LRP
inmovilizado. Estos datos dan a entender que los bloques II y IV de
LRP comparten una región de unión similar en la cadena ligera de
FVIII.
Unión del bloque II de LRP a la cadena ligera de
FVa inmovilizada- En vista de la conocida homología entre FVIII y
FV (Church, W.R. y otros (1984) arriba), puede surgir la cuestión de
si las cadenas ligeras de FVIII y FV activado comparten o no las
propiedades de unión al bloque II de LRP. Con este fin, se incubaron
diluciones seriadas de bloque II de LRP con la cadena ligera de
FVIII y la cadena ligera de FVa. Tal como se muestra en la figura
3, las cadenas ligeras de FVIII y FVa mostraron ser diferentes en
que solamente FVIII mostró una alta afinidad de unión al bloque II
de LRP. Estas observaciones indican que los dominios
a3-A3-C1 de la cadena ligera de
FVIII contienen una región interactiva de LRP de alta afinidad que
no está conservada en la cadena ligera de FVa.
Efecto de los péptidos sintéticos sobre la unión
de la cadena ligera de FVIII al bloque II de LRP- Se construyó un
panel de péptidos sintéticos que imitan los bucles superficiales de
los dominios a3-A3-C1 (WO 96/41816,
arriba). La observación de que la cadena ligera de FVa no se asocia
de forma eficiente con el bloque II de LRP se utilizó como criterio
de selección para la construcción de péptidos sintéticos que son
únicos para FVIII. La accesibilidad al disolvente de estos bucles
se verificó empleando análisis de hidropatía (Lenting, P.J. y otros
(1996), arriba) y estudiando el modelo tridimensional del
heterodímero de FVIII intacto (Stoilova-McPhie, S.,
Villoutreix, B.O., Mertens, K., Kemball-Cook, G. y
Holzenburg, A. (2002) Blood 99, 1215-1223). Los
péptidos sintéticos comprenden residuos
Trp^{1707}-Arg^{1721},
Lys^{1804}-Lys^{1818},
Tyr^{1815}-Ala^{1834},
His^{1822}-Ala^{1834},
Thr^{1892}-Ala^{1901},
Glu^{1908}-His^{1919},
Thr^{1964}-Lys^{1972},
Lys^{2049}-Gly^{2057} y
Asp^{2108}-Gly^{2117} (tabla II).
Posteriormente, estos péptidos se ensayaron para
determinar su capacidad para interferir en la interacción entre la
cadena ligera de FVIII y el bloque II de LRP inmovilizado. Tal como
se muestra en la tabla II, los péptidos sintéticos
Lys^{1804}-Lys^{1818} (SEQ ID No: 2) y
Tyr^{1815}-Ala^{1834} (SEQ ID No: 3) inhibieron
de manera eficiente la interacción entre la cadena ligera de FVIII y
el bloque II de LRP inmovilizado. La inhibición máxima promedio
(IC_{50}) se alcanzó a concentraciones de péptidos de
aproximadamente 1,9 a 16,8 \muM, respectivamente. Los otros
péptidos sintéticos no mostraron dicho efecto inhibitorio. Estas
observaciones sugieren que la secuencia
Lys^{1804}-Ala^{1834} en el dominio A3 de FVIII
contiene residuos importantes involucrados en la interacción con
LRP.
Efecto de fragmentos de anticuerpo scFv sobre la
unión de la cadena ligera de FVIII a LRP y su bloque II- De forma
previa, se empleó la expresión en fago para aislar fragmentos de
anticuerpo scFv recombinantes a partir de un paciente con
anticuerpos inhibitorios dirigidos contra residuos en la región
Gln^{1778}-Asp^{1840} (van den Brink, E.N.,
Turenhout, E.A.M., Bovenschen, N., Heijnen, B.G., mertens, K.,
Peters, M. y Voorberg, J. (2001), Blood 97,
966-972; Voorberg J. y otros, Método de diagnóstico
y tratamiento de pacientes con hemofilia A con un inhibidor
("Method for diagnosis and treatment of haemophilia A patients
with an inhibitor") Solicitud de Patente Internacional WO
99/58680). Estos scFv se evaluaron para determinar su capacidad de
interferir en la unión de la cadena ligera de FVIII y LRP o bloque
II. El primer scFv, referido como scFv KM36, está dirigido contra
una región en Glu^{1778}-Asp^{1840}, pero no
requiere los residuos Arg^{1803}-Lys^{1818}
para la unión a FVIII (van den Brink y otros (2001), arriba; WO
99/58680, arriba). El segundo scFv, designado como scFv KM41, está
dirigido contra una región en
Arg^{1803}-Lys^{1818} e inhibe la actividad
procoagulante de FVIII (van den Brink y otros (2001), arriba; WO
99/58680, arriba). La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada
de scFv KM41, así como su correspondiente secuencia de ADN se
muestra en la SEQ ID No: 16. La secuencia de aminoácidos de la
cadena ligera de scFv KM41, así como su correspondiente secuencia de
ADN se muestra en la SEQ ID No: 18. La cadena pesada y la cadena
ligera de KM41 se pueden unir mediante un péptido enlazador (SEQ ID
No: 24) y pueden tener una cola de histidina en el
C-terminal. La secuencia de aminoácidos de la
proteína scFv KM41 expresada se describe en la SEQ ID No: 25. El
tercer scFv, designado como scFv KM33, es similar a scFv KM41,
excepto en que no requiere la región 1778-1818 del
dominio A3 para su interacción con la cadena ligera de FVIII (van
den Brink y otros (2001), arriba; WO 99/58680, arriba). La secuencia
de aminoácidos de la cadena pesada de scFv KM33, así como su
correspondiente secuencia de ADN se muestra en la SEQ ID No: 20. La
secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de scFv KM33, así como
su correspondiente secuencia de ADN se muestra en la SEQ ID No: 22.
La cadena pesada y la cadena ligera de KM33 se pueden unir mediante
un péptido enlazador (SEQ ID No: 24) y pueden tener una cola de
histidina en el C-terminal. La secuencia de
aminoácidos de la proteína scFv KM33 expresada se describe en la
SEQ ID No: 26. Tal como se muestra en la figura 4A, scFv KM36 no
afecta la interacción entre la cadena ligera de FVIII y el bloque II
de LRP inmovilizado. Por el contrario, la presencia de scFv KM41
inhibe la unión de la cadena ligera de FVIII y el bloque II de LRP
(figura 4A). El efecto de scFv KM41 sobre la interacción entre la
cadena ligera de FVIII y LRP fue estudiado además empleando
análisis SPR. Tal como se muestra en la figura 4B, la asociación de
la cadena ligera de FVIII y LRP inmovilizado se inhibió en
presencia de scFv KM41. Como se demuestra en la figura 5, scFv KM33
inhibió de manera eficaz la unión de la cadena ligera de FVIII el
bloque II de LRP inmovilizado de una forma dependiente de la dosis.
La constante de inhibición aparente fue de aproximadamente 5 nM, que
es similar al valor de K_{d} para la unión de la cadena ligera de
FVIII al mismo scFv (van den Brink y otros (2001), arriba; WO
99/58680, arriba). Estos datos sugieren fuertemente que scFv KM33,
scFv KM41 y LRP comparten sitios de unión que se solapan en la
cadena ligera de FVIII.
La secuencia
Glu^{1811}-Lys^{1818} de la cadena ligera de
FVIII contiene un sitio de unión a LRP- Los péptidos sintéticos
Lys^{1804}-Lys^{1818} y
Tyr^{1815}-Ala^{1834} son eficaces inhibidores
de la actividad procoagulante de FVIII interfiriendo en el
ensamblaje del complejo FVIIIa-FIXa (Lenting, P.J. y
otros (1996) arriba; WO 96/41816, arriba), mientras que los scFv
KM33 y KM41 son eficaces inhibidores de la actividad procoagulante
de FVIII interfiriendo con el ensamblaje del complejo
FVIIIa-FIXa (Lenting, P.J. y otros (1996), arriba;
van den Brink y otros (2001), arriba; WO 99/58680, arriba). Como
los residuos Glu^{1811}-Lys^{1818} contribuyen
a la interacción con FIXa (Lenting, P.J. y otros (1996), arriba; WO
96/41816, arriba), esta región de la cadena ligera de FVIII en
particular fue investigada respecto a su papel en la interacción con
LRP. Ya que la cadena ligera de FVa no interactúa con el bloque II
de LRP, se construyó una quimera en la que los residuos
Glu^{1811}-Lys^{1818} se remplazaron por los
residuos correspondientes de FV (es decir, los residuos
^{1704}SSYTYVWH^{1711} (SEQ ID No: 12)). La quimera aislada
(FVIII/FV^{1811-1818}) se comparó con la cadena
ligera de FVIII recombinante no modificada en términos de
asociación con el bloque II de LRP, empleando análisis SPR. Tal como
se muestra en la figura 6, el bloque II de LRP mostró una
asociación reducida de 2 a 3 veces con
FVIII/FV^{1811-1818} comparado con la cadena
ligera de FVIII no modificada.
La quimera aislada
(FVIII/FV^{1811-1818}) se evaluó a continuación
para determinar su capacidad para interactuar con scFv KM41,
empleando análisis SPR. Tal como se muestra en la figura 7, scFv
KM41 no reconoció la quimera FVIII/FV^{1811-1818}
inmovilizada, mientras que reaccionó fácilmente con la cadena ligera
de FVIII recombinante no modificada inmovilizada. Estas
observaciones indican que la región
Glu^{1811}-Lys^{1818} del dominio A3 de FVIII
contiene residuos críticos para la unión a scFv KM41. Estos datos
demuestran que la región Glu^{1811}-Lys^{1818}
de la cadena ligera de FVIII juega un papel importante en el
ensamblaje del complejo LRP-cadena ligera de
FVIII.
En el presente estudio, se demostró que la
región Glu^{1811}-Lys^{1818} del dominio A3 de
la cadena ligera de FVIII contribuye a la interacción de alta
afinidad con LRP. Varias líneas de evidencias soportan esta
conclusión. En primer lugar, los péptidos sintéticos derivados del
dominio A3 Lys^{1804}-Lys^{1818} y
Tyr^{1815}-Ala^{1834} afectaron la interacción
entre la cadena ligera de FVIII y el bloque II de LRP (tabla II). En
segundo lugar, una quimera de la cadena ligera de FVIII, en la que
la región Glu^{1811}-Lys^{1818} se remplaza por
los residuos correspondientes de FV, mostró una reducción en la
asociación del bloque II de LRP comparado con la cadena ligera de
FVIII no modificada (figura 6). En tercer lugar, un fragmento de
anticuerpo scFv recombinante, dirigido contra la región
Glu^{1811}-Lys^{1818}, inhibió la unión de la
cadena ligera de FVIII a LRP o su fragmento del bloque II (figura
4).
Para varios ligandos de LRP, incluyendo RAP,
lipoproteína lipasa y \alpha_{2}-macroglobulina,
se ha establecido que los residuos cargados positivamente en la
superficie del ligando están involucrados en la interacción con LRP
(Merman, L., Cao, Z.F., Rennke, S., Paz Marzolo, M., Wardell, M.R. y
Bu, G. (2001) J. Biol. Chem. 276, 29338-29346;
Chappell, D.A., Fry, G.L., Waknitz, M.A., Muhonen, L.E., Pladet,
M.W., Iverius, P.H. y Strickland, D.K. (1993) J. Biol. Chem. 268,
14168-14175; Howard, G.C., Yamaguchi, Y., Misra
U.K., Gawdi, G., Nelsen, A., DeCamp, D.L. y Pizzo, S.V. (1996) J.
Biol. Chem. 271, 14105-14111; Nielsen, K.L., Holtet,
T.L., Etzerodt, M., Gliemann, J., Sottrup-Jensen,
L. y Thorgersen, H.C. (1996) J. Biol. Chem. 271,
12909-12912). De forma interesante, también la
región Glu^{1811}-Lys^{1818} del dominio A3 de
FVIII (es decir, los residuos ^{1811}ETKTYFWK^{1818} (SEQ ID
No: 1) contiene dos residuos de lisina cargados positivamente
expuestos en las posiciones 1813 y 1818. Comparado con la parte
homóloga del dominio A3 de FV (es decir, los residuos
^{1704}SSYTYVWH^{1711}), estos residuos de lisina pareces ser
únicos del dominio A3 de FVIII (Church, W.R. y otros (1984),
arriba). El reemplazo de los residuos
Glu^{1811}-Lys^{1818} de FVIII por los residuos
correspondientes de FV resultó en una unión deficiente al bloque II
de LRP (figura 6). Estos resultados sugieren que los residuos
cargados positivamente en la región
Glu^{1811}-Lys^{1818} median una interacción
electrostática con LRP.
Hasta la fecha, se han identificado dos regiones
de aminoácidos en la cadena ligera de FVIII que contribuyen al
ensamblaje del complejo LRP-cadena ligera de FVIII.
Además del papel para la región
Glu^{1811}-Lys^{1818} del dominio A3 encontrado
en este estudio, también es conocido que el dominio C2
carboxiterminal contribuye a la interacción con LRP (Lenting, P.J.,
Neels, J.G., van den Berg, B.M.M., Clijsters, P.P.F.M., Meijerman,
D.W.E., Pannekoek, H., van Mourik, J.A., Mertens, K. y van
Zonneveld, A.J. (1999) J. Biol. Chem. 274,
23734-23739; Lenting, P.J. y otros. Un polipéptido
de factor VIII con actividad de factor VIILC ("A factor VIII
polipeptide with factor VIILC-activity").
Solicitud de Patente Internacional WO 00/28021). El sitio
interactivo LRP en el dominio A3 parece más predominante que el del
dominio C2, ya que el dominio C2 aislado mostró una interacción de
baja afinidad con LPR (K_{d} = 3,4 \muM)(tabla I). Esto coincide
con un estudio previo en el que el dominio C2 aislado mostró sólo
una asociación modesta con LRP (Lenting, P.J. y otros, (1999),
arriba; WO 00/28021, arriba). Además, la afinidad de la unión de la
cadena ligera de FVIII a LRP no se ve afectada cuando se suprime el
dominio C2 (tabla I). Sin embargo, se ha demostrado que un
anticuerpo monoclonal contra el dominio C2 (ESH4) inhibe
completamente la interacción entre la cadena ligera de FVIII y LRP
(Lenting, P.J. y otros, (1999), arriba; WO 00/28021, arriba). El
mecanismo por el cuál el anticuerpo ESH4 inhibe la unión a LRP no se
ha dilucidado aún. Debido a que el anticuerpo contra C2 no requiere
la región Glu^{1811}-Lys^{1818} para su
interacción con la cadena ligera de FVIII (Scandella, D., Gilbert,
G.E., Shima, M., Nakai, H., Eagleson, C., Felch, M., Prescott, R.,
Rajalakshmi, K.J., Hoyer, L.W. y Saenko, E. (1995) Blood 86,
1811-1819), es poco probable que ESH4 compita con
LRP para la unión al mismo sitio en el domino A3. Por lo tanto, uno
de los mecanismos que podrían contribuir a la inhibición incluye la
interferencia estérica.
Por el contrario, scFv KM41 solamente inhibe
parcialmente la interacción entre la cadena ligera de FVIII y LRP
(figura 4). Esto puede ser debido al relativo pequeño tamaño de un
fragmento de anticuerpo scFv (\approx30 kDa) comparado con un
anticuerpo completo (\approx150 kDa). Estas observaciones sugieren
que, además de la región Glu^{1811}-Lys^{1818},
otros elementos estructurales superficiales expuestos en los
dominios A3-C1 (es decir, residuos
Ala^{1722}-Asn^{2172}) contribuyen al ensamblaje
del complejo LRP-cadena ligera de FVIII. Esto está
en consonancia con la observación de que la quimera FVIII/ cadena
ligera de FV^{1811-1818} demostró unión residual
al bloque II de LRP (figura 6). En este contexto se podría mencionar
que la región Glu^{1811}-Lys^{1818} en el
dominio A3 de la cadena ligera de FVIII es parte de un segmento más
grande que está expuesto en la superficie de la proteína (es decir,
residuos Glu^{1804}-Lys^{1818} (Lenting, P.J. y
otros, (1996), arriba. Además de los residuos de lisina en las
posiciones Lys^{1813} y Lys^{1818}, esta región contiene dos
residuos de lisina únicos de FVIII adicionales en las posiciones
Lys^{1804} y Lys^{1808}, que pueden jugar un papel en la
interacción con LRP.
Procedimiento experimental: Se trataron ratones
"knockout" (Factor VIII endógeno disminuido, 20% de Factor
VIII comparado con animales saludables) con Factor VIII humano
recombinante (Recombinate^{TM}; 200 U/kg) y scFv (KM33)
recombinante en exceso (30 nM contra 3 nM de Factor VIII en plasma).
En experimentos de control, se utilizaron en las mismas
concentraciones Factor VIII y un fragmento scFv de control (KM38)
que se une a un dominio diferente que el sitio de unión a LRP
propuesto en la molécula de Factor VIII. Se usó infusión de FVIII
recombinante sin ninguna adición para monitorizar la eliminación de
FVIII en este sistema modelo.
En momentos puntuales definidos (15, 30, 60, 120
y 240 minutos) después de la inyección, se colectó sangre mediante
punción cardiaca, posteriormente se aisló el plasma, se congeló
rápidamente y se analizó para determinar actividad de FVIII. Se
utilizaron 10 ratones en cada momento puntual, el plasma se diluyó
hasta 3 concentraciones (1:20, 1:60 y 1:100) y se analizó por
duplicado. Los niveles de FVIII se cuantificaron realizando un ELISA
cuantitativo.
Resultados: Los datos del grupo de control de
Factor VIII mostraron actividades de Factor VIII de 0,35 U/ml a los
15 minutos, que se corresponden con un recobrado del 14%. A los 30
minutos la actividad de Factor VIII disminuyó hasta aproximadamente
0,2 u/mL, que es la actividad de Factor VIII de fondo de estos
ratones (que corresponde con un recobrado del 8%). No se detectó
otra alteración de la concentración de Factor VIII en los puntos
siguientes. Los datos indican que en este sistema de ratón, el
Factor VIII se elimina de la circulación del animal en los primeros
30 minutos.
El análisis de las muestras de plasma derivado
de los ratones tratados con FVIII y el fragmento scFv (KM33) de
bloqueo de LRP demostró que 15 minutos después de la aplicación se
pudo detectar aproximadamente 0,8 U/mL de Factor VIII. Esto se
traduce en un recobrado de 30,4%. Los niveles de actividad de Factor
VIII disminuyó durante los siguientes 15 minutos hasta 0,5 U/mL
(20% de recobrado) y alcanzó las 0,35 U/mL (14% de recobrado)
después de 60 minutos. Cuatro horas después de la inyección, los
niveles de actividad de FVIII alcanzaron la actividad de fondo de
Factor VIII de ratón. Esta alta cantidad de actividad de FVIII en la
circulación después de 15 y 30 minutos, comparado con el grupo de
control, indica un protección extremadamente buena de la
eliminación de FVIII.
Un segundo grupo de control de animales
recibieron FVIII humano co-inyectado con un
fragmento scFv (KM38) que se une a Factor VIII en un sitio
diferente que LRP. Con estos animales, se obtuvieron los mismos
resultados que con el grupo de control de Factor VIII (figura
8).
Empleando un fragmento de anticuerpo que
interfiere con la interacción FVIII-LRP, fue posible
aumentar de forma significativa la vida media de Recombinate^{TM}
en ratones "knock-out" de vWF. Además, se
podría demostrar claramente que el recobrado de FVIII humano en
sistema "knock-out" de vWF podría ser más del
doble.
<110> Baxter Healthcare SA
\hskip1cmMertens, Koenraad
\hskip1cmBovenschen, Arend Niels
\hskip1cmVoorberg, Jan
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antagonistas de proteína relacionada
con receptor de lipoproteína de baja densidad de Factor VIII y usos
de las mismas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 11111
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo en sentido para
Glu1649-Asn2172 de factor VIII humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttactcgagg aaataactcg tactactc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN1
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(233)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo antisentido iniciador para
Glu1649-Asn2172 de factor VIII humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgcggccg cttcaattta aatcacagcc cat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cola de poli (His)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> codifica cola de poli (His)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(378)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada de KM41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(324)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena ligera de KM41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(360)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada de KM33
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena ligera de KM33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido enlazador que conecta las
cadenas ligera y pesada de KM33 y KM41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(273)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadenas ligera y pesada de KM41 con
enlazador y cola de histidina en el C-terminal
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(266)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadenas ligera y pesada de KM33 con
enlazador y cola de histidina en el C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (4)
1. Uso de un anticuerpo de unión a Factor VIII
para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir
la degradación de Factor VIII y/o prolongar la vida media de Factor
VIII en un fluido biológico, en el que el anticuerpo de unión a
Factor VIII comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No: 17 y
19 de las cadenas pesada y ligera de KM41 o las secuencias de
aminoácidos SEQ ID No: 21 y 23 de las cadenas pesada y ligera de
KM33.
2. Uso, según la reivindicación 1, en el que
dicho anticuerpo consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID
No: 26 (KM33) o según la SEQ ID No: 25 (KM41).
3. Uso, según la reivindicación 1 ó 2, en el que
la composición farmacéutica se utiliza para la prevención o
tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre y/o
pérdida temporal de los sistemas trombolíticos o
fibrinolíticos.
4. Uso, según la reivindicación 3, en el que
dicho trastorno de la coagulación de la sangre es hemofilia A o
enfermedad de von Willebrand y en el que la pérdida temporal tiene
lugar durante o después de un procedimiento quirúrgico.
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