JP6042335B2 - 細胞取込みが低下した第viii因子変異体 - Google Patents
細胞取込みが低下した第viii因子変異体 Download PDFInfo
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Description
第VIII因子分子: FVIII/第VIII因子は、主に肝細胞により産生される大きく複雑な糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるいくつかの異なるドメインを含む。3個のAドメイン、1個だけのBドメイン、および2個のCドメインがある。ドメインの順序はNH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHと列挙することができる。FVIIIは血漿中でB-A3境界で分離された2つの鎖として循環する。この鎖は二価金属イオン結合によって接続される。A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と呼ばれるが、A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれる。
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本発明によるFVIII変異体の「固有の安定性」は、「安定性」、「物理的安定性」、「先天的安定性」、「構造安定性」、「化学的安定性」、「固有の安定性」、「in vitroでの安定性」、「熱力学的安定性」、「熱安定性」、「折畳み安定性」などと呼ばれることもあり、複雑な方法で環境条件に依存する。そのような用語の共通のテーマは、それらがポリペプチドのin vitroでの安定性を指すことであり、このin vitroでの安定性は折畳まれたコンフォメーションの比較的小さい集団を安定化するポリペプチド中の力の合計として見ることができる。FVIIIはin vivoでは多数のクリアランス機構にかけられるため、FVIIIのin vivoでの安定性とin vitroでの安定性との間には著しい差がある。かくして、in vitroでの安定性が改善されたFVIII変異体に関して延長されたin vivoでの循環半減期を得ることはとても不可能であった。本発明によるFVIII変異体のin vitroでの安定性は、例えば、安定化ジスルフィド架橋の挿入、分子内疎水性相互作用を形成することができるさらなる疎水性アミノ酸の挿入、静電相互作用を形成する正および負のアミノ酸の挿入などにより改善することができる。
KM33抗体がLRPへのFVIII結合を阻害する能力を有することは当業界で公知である(J Biol Chem 2003; 278: 9370〜9377およびWO 03/093313)。vWF欠損マウスへのKM33 scFvとFVIIIとの同時投与は、FVIIIのみを受ける対照マウスと比較して、投与の15および30分後により高レベルのFVIII活性をもたらした(WO 03/093313)。KM33はK2092〜S2094領域に結合するため(Blood 2009; 114: 3938〜3946およびISTH、2007で提示されたP-M-040の要約)、K2092はK2065をさらに含んでもよい1つの潜在的なLRP結合部位の一部を構成し得ることが示唆された(ISTH、2007で提示されたO-M-041の要約)。これらの単一の置換は両方とも、第IXa因子との相互作用ではなく、LRP結合に影響した(ISTH、2007のO-M-041の要約)。しかしながら、これらのアミノ酸残基の2個以上のみ(最大で約10個)のアラニンによる置換がLRP結合および/または細胞取込みを著しく低下させることは示唆されていない。
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F2093A(配列番号4)
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K2092A-F2093A(配列番号5)
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R2215A(配列番号6)
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K2065A-R2215A(配列番号7)
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R2090A-R2215A(配列番号8)
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K2092A-R2215A(配列番号9)
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(実施例1)
FVIII変異体の生成
cMycタグをコードする断片を、21アミノ酸のBドメインリンカーを含むFVIIIをコードする発現構築物中の重鎖のC末端中に挿入した(Haemophilia 2010; 16: 349〜48)。このFVIII-cMyc2の発現レベルおよび活性は、タグ付でないFVIIIと同様であった。FVIII-cMyc2を、変異体のための鋳型として、および実施例3〜5に記載のアッセイにおける対照として用いた。変異体間のドメインのスワッピングを容易にするために、さらなる制限部位をFVIII-cMyc2発現構築物に加えた。A1ドメインはSalIおよびPshAI/MfeIにフランキングし、A2はPshAI/MfeIおよびAvrII/NruIにフランキングし、A3はAgeI/MluIおよびBstZ17I/BstAPIにフランキングし、C1はBstZ17I/BstAPIおよびSwaI/SphIにフランキングし、C2はSwaI/SphIおよびSfiIにフランキングする。露出した塩基性アミノ酸(リジンまたはアルギニン)の部位特異的突然変異誘発を、Geneart AG(Regensburg、Germany)により行った。LRP1への親和性が低下した突然変異体は、特にC1およびC2ドメインのフットに局在化していた(図2ならびにtable 1および2(表1および表2)を参照されたい)。C1およびC2突然変異体の組合せを、C1突然変異体K2065A、R2090AおよびK2092Aに、R2215A、R2220Q、K2249AおよびR2320Qの520 bpのSphI/SfiI断片を導入することによりクローニングした(table 2(表2))。
FVIII突然変異体の発現
製造業者の推奨に従ってHKB11細胞(Cho M-Sら、J Biomed Sci 2002; 9: 631〜63)および293fectin(Invitrogen)を用いて、無血清トランスフェクションを実施した。50U/mLのペニシリンおよび50μg/mLのストレプトマイシンを添加した市販のFreestyle 293 Expression Medium(Invitrogen #12338-018)中で、HKB11懸濁細胞を増殖させた。細胞を、振とう器中で懸濁細胞として増殖させ、5%CO2および95%相対湿度の下、37℃でインキュベートした。細胞を3×105細胞/mLの密度で播種し、3〜4日毎に継代した。生細胞および総細胞濃度を、自動細胞計数のための画像分析ソフトウェアを用いるCedex(Innovatis)分析により評価した。生細胞を、乾燥トリパンブルーを排除するその能力により強調した。細胞をトランスフェクションの96時間後に収穫し、細胞ペレットを穏やかな遠心分離により単離した。その後、細胞ペレットを、0.5M NaClを含有するFreestyle 293 Expression Medium中に再懸濁した。穏やかな遠心分離後、FVIIIを含有する上清を収穫し、さらなる分析まで-80℃で保存した。
発色アッセイにおいて測定されたFVIII:C
以下のようにCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いる発色FVIIIアッセイにおいて、rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を評価した: FVIII試料およびFVIII標準物(ヒト較正血漿、Chromogenix)を、Coatestアッセイバッファー(50mM Tris、150mM NaCl、1%BSA、pH 7.3、保存剤を含む)中に希釈した。100、400、1600および6400倍に予め希釈された50μLの試料(培養上清または精製されたFVIII変異体)、標準物ならびにバッファー陰性対照を2回、96穴Spectramaxマイクロタイタープレートに添加した。Coatest SPキットに由来する第IXa因子/第X因子試薬、リン脂質試薬およびCaCl2を、5:1:3(vol:vol:vol)で混合し、これの75μLをウェルに添加した。室温で15分間インキュベートした後、50μLの第Xa因子基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを添加し、反応物を室温で5分間インキュベートした後、25μLの1Mクエン酸、pH3を添加した。405nmでの吸光度をEnvisionプレートリーダー(PerkinElmer)上で測定し、620nmでの吸光度を参照波長として用いた。陰性対照の値を全試料から差引き、FVIII濃度に対してプロットされた標準物の吸光度値の線形回帰により較正曲線を調整した。試料の活性を、ELISAにより決定されたタンパク質濃度で除算することにより、比活性を算出した(実施例4)。FVIII変異体の比活性を、FVIII鋳型の比活性で除算することにより、FVIII-cMyc2鋳型と比較した活性を算出した。table 1(表1)のデータは、様々なFVIII変異体間のFVIII:C活性の大きな変動を示す。table 2(表2)のデータは、FVIII:C活性が選択されたFVIII変異体中で維持されたことを示す。
ELISAにおいて測定された総FVIII抗原
以下のようにAffinity Biologicals社製のELISA(#F8C-EIA)において、FVIII変異体の量を評価した:マイクロタイタープレート(Nunc)を、PBS(0.10Mリン酸ナトリウム; 0.145M NaCl、pH 7.2)中の100μL/ウェルの被覆抗体で被覆した。プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー(0.01Mリン酸ナトリウム、0.145M NaCl、0.05% Tween 20、pH 7.2)中で5回洗浄し、周囲温度で30分間、洗浄バッファー中で遮断した。試料をアッセイバッファー(0.1M Hepes; 0.1M NaCl; 10g/L BSA;0.1% Tween 20、pH 7.2)中で希釈し、10μLの希釈された試料(または較正/希釈対照)をそれぞれのウェルに移した。検出抗体(100μL)をプレートに添加し、振とう器上、周囲温度で1.5時間インキュベートした。プレートを洗浄し、100μLの基質(TMB一成分基質、Kem-en-Tec)を添加し、十分に発色するまで振とう器上でインキュベートした。100μLの停止バッファー(4M H3PO4)を添加することにより、反応を停止させた。450nmでの吸光度を、Envisionプレートリーダー(PerkinElmer)上で測定し、620nmでの吸光度を参照波長として用いた。
ELISAにおけるLRP結合
以下のようにLRPに結合する能力についてFVIII変異体をさらに評価した:全試料を、NaClを含まないバッファー(0.1M Hepes; 10g/L BSA; 0.1% Tween 20、pH 7.2)中で40倍および80倍に希釈した。標準物(FVIII-cMyc2)は3000; 1000; 333; 111; 37; 12.3; 4.12および0ng/mLに希釈した。マイクロタイタープレートをPBS(100μL/ウェル)中のLRP(1μg/mL、BioMac、Leipzig、Germany)で被覆し、密閉し、4℃で少なくとも72時間インキュベートした。NaClを含まないバッファー中でプレートを5回洗浄し、少なくとも15分間、該バッファー中で遮断した。標準物/希釈試料(50μL/ウェル)およびバッファー(150μL/ウェル)をプレートに添加し、ウェットチャンバー中、室温で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、100μL/ウェルの1μg/mLビオチン化抗FVIII A2抗体(標準的な技術を用いて社内で調製されたBDD-FVIII-1F5*ビオチン)を添加し、振とう器上、室温で1時間インキュベートした。プレートを5回洗浄し、バッファー中で1:20000に希釈された100μL/ウェルのストレプトアビジン*HRP(KPL、Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)を添加し、プレートを振とう器上、室温で1時間インキュベートした。プレートを5回洗浄し、100μL/ウェルのTMB一基質(Kem-en-Tec)を添加し、十分な色が得られるまで振とう器上でプレートをインキュベートした。反応を100μL/ウェルの4M H3PO4で停止させた後、Envisionプレートリーダー(PerkinElmer)上で450nmでの吸光度を測定し、620nmでの吸光度を参照波長として用いた。変異体のLRP結合を、ELISAにより決定されたタンパク質濃度で除算することにより、特異的LRP結合を算出した(実施例4)。変異体の特異的LRP結合を、FVIII-cMyc2鋳型の特異的LRP結合で除算することにより、FVIII-cMyc2鋳型と比較したLRP結合を算出した。Table 1(表1)は、表面に露出したリジンまたはアルギニン残基が突然変異したFVIII変異体の発現レベル、FVIII:C活性およびLRP結合を示す。いくつかのFVIII変異体については、発現レベルが低いため活性およびLRP結合を検出することができなかった。これらのものは表中では「低濃度」と示される。発現レベルがLRP結合の分析を可能にするのに十分に高いFVIII変異体の多くは、置換を含まないFVIII対照「FVIII鋳型」のものと近いLRP結合を示した。いくつかのFVIII変異体、例えば、K523AおよびK1972Qは、活性の低下と一致して、低いLRP結合を示した。しかしながら、C1およびC2ドメイン中に置換を含むFVIII変異体のいくつか、すなわち、K2065A、R2090A、K2092A、R2215A、R2220QおよびK2249AはLRP結合を低下させたが(FVIII対照に対して0.53未満)、活性は維持された(FVIII対照に対して0.78を超える)。これらの突然変異は全て、上記のC1フットおよびC2フット中に位置する。C1ドメインのこの領域内の突然変異をC2ドメインの突然変異と組み合わせた場合(table 2(表2))、R2215Aが含まれる二重突然変異についてLRP結合のさらなる低下が観察された。また、R2090A-K2249A二重突然変異体は、単一突然変異について見られるものよりも大きいLRP結合の低下を示した。発現レベルが約350ng/mlより低い突然変異のいくつかについては、記載のアッセイを用いてLRP結合を分析することができなかった。F2093Aと組み合わせたリジンおよびアルギニン置換を含む選択された精製FVIII変異体のLRP結合を、アッセイにおいて一定範囲の濃度(最大で18nM)を適用することによりさらに分析し、Prism version 5.01ソフトウェア中の1部位総結合のための式を用いる結合曲線の非線形回帰により、Kd値を算出した。Table 3(表3)は、突然変異が挿入されていないFVIIIと比較したKdの倍数増加を示す。Kdの倍数増加が高くなるほど、LRP結合はより低下する。このデータは、C1(K2065、R2090、K2092、F2093)およびC2フット(R2215、R2220およびK2249)中の2個以上、すなわち、最大4個のアミノ酸残基が置換された場合、LRP結合の実質的な低下が観察されたことを示す。
表面プラズモン共鳴(SPR)分析によるLRP結合試験
BIAcore(商標)3000バイオセンサシステム(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を用いて、SPR分析を実施した。完全長LRP(BioMac、Leipzig、Germany)を、供給業者により処方されたアミンカップリングキットを用いて、一級アミノ基による活性化CM5-センサチップのデキストラン表面に共有結合によってカップリングさせた(10fmol/mm2)。FVIII誘導体FVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093AおよびFVIII-YFP-K2092A-F2093Aを構築し、抗FVIII抗体CLB-CAg 117を、記載のような(Br J Haematol 2008; 142: 644〜652)完全長IgGモノクローナル抗体VK34中で構築された一本鎖抗体断片VK34(Blood 2000; 96: 540〜545)により置換した以外は記載のように(Blood 2009; 114: 3938〜3945)発現させた。FVIIIを、50mMイミダゾール(pH 6.7)、50mM CaCl2、0.8M NaCl中のVK34 Sepharoseカラム上に充填した。充填後、続いてカラムを50mMイミダゾール(pH 6.7)、50mM CaCl2、0.8M NaClおよび50mMイミダゾール(pH 6.4)、40mM CaCl2、5%(v/v)エチレングリコールバッファーで洗浄した。次に、FVIIIを、50mMイミダゾール(pH 6.4)、40mM CaCl2、55%(v/v)エチレングリコール中でVK34 Sepharoseカラムから溶出させた。FVIIIを含有する画分を50mM Tris(pH 8.0)、100mM NaCl、5mM CaCl2、10%(v/v)グリセロール中に希釈し、Q Sepharose FF(Amersham Biosciences、Belgium)上に吸収させた。続いて、Q Sepharoseカラムを50mM Tris(pH 8.0)、100mM NaCl、5mM CaCl2、10%(v/v)グリセロールで洗浄した。FVIIIを、50mM Tris(pH 7.4)、5mM CaCl2、0.8M NaCl、50%(v/v)グリセロール中でQ Sepharoseカラムから溶出させ、-20℃で保存した。精製されたFVIII変異体は、活性(FVIII Coatest法、Chromogenix、Milan、Italy)と抗原(FVIII ELISA、Blood 2009; 114: 3938〜3945を参照されたい)との間の0.92〜1.03の比により評価されたように、完全な活性を維持した。FVIII誘導体(60nM)を、固定されたLRP上に通過させ、非特異的結合について補正された、共鳴単位(RU)での結合応答を、360秒の結合にわたって記録した。Table 4(表4)は、FVIII-K2092AのLRP結合が、置換を含まないFVIII-YFPと比較して約100 RU低下したが、FVIII-F2093Aの結合はわずかだけ低下した(17 RU)ことを示す。しかしながら、C1フット中で2つの置換を組み合わせた場合、LRP結合の実質的な低下(約200 RU)が観察された。
FVIII軽鎖変異体のLRP結合
製造業者により指示されるように好適なプライマーを用いるQuick Change mutagenesis(商標)(Stratagene、La Jolla、CA、USA)により、FVIII軽鎖中にK2065R、K2065A、K2092RおよびK2092A点突然変異ならびにK2065R-K2092RおよびK2065A-K2092A二重突然変異を導入した。製造業者の推奨に従ってFreeStyle(商標)293-F細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA、#R790-07)および293fectin(Invitrogen)を用いて、FVIII軽鎖変異体の無血清トランスフェクションを実施した。FreeStyle(商標)293-F細胞懸濁液細胞を、市販のFreestyle 293 Expression Medium(Invitrogen、#12338-018)中で増殖させた。細胞を振とう器中で懸濁細胞として増殖させ、8%CO2および95%相対湿度下、37℃でインキュベートした。細胞を3×105細胞/mLの密度で播種し、3〜4日毎に継代した。トランスフェクションの120時間後に細胞を収穫し、細胞ペレットを穏やかな遠心分離により単離した。その後、細胞ペレットを、0.55M NaClを含有するFreestyle 293 Expression medium中に再懸濁した。穏やかな遠心分離後、FVIII軽鎖を含有する上清を収穫し、さらなる分析まで-20℃で保存した。LRPクラスターIIをベビーハムスター腎臓(BHK)細胞中で発現させ、記載のように精製した(J Biol Chem. 2003; 278:9370〜9377)。FVIII軽鎖変異体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092RおよびK2065R-K2092RへのLRPクラスターIIの結合および解離を、BIAcore 3000バイオセンサ(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を用いるSPR分析により評価した。抗C2抗体CLB-EL14 IgG4(Br J Haematol 2008; 142: 644〜652)を、製造業者の説明書に従うアミンカップリング法を用いて、27fmol/mm2の密度でCM5センサチップ上に固定した。結果として、FVIII軽鎖変異体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092RおよびK2065R-K2092Rは、17fmol/mm2の密度で抗C2抗体に結合した。変化する濃度(0.2〜200nM)のLRPクラスターIIを、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005%(v/v)Tween 20および20mM Hepes(pH 7.4)を含有するバッファー中、20μL/minの流量で25℃でFVIII軽鎖変異体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092RおよびK2065R-K2092R上に通過させた。センサチップ表面を、1M NaClを含有する同じバッファーを用いてLRPクラスターIIのそれぞれの濃度の後3回再生した。FVIII軽鎖変異体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092RおよびK2065R-K2092Rへの結合を、240秒の結合の間に記録し、非特異的結合について補正した。結合期の間の結合データを、単相指数関係モデル(one-phase exponential association model)において適合させた。平衡での応答を、LRPクラスターII濃度の関数としてプロットした。平衡での応答を、KD値を得るための標準的な双曲線を用いる非線形回帰により適合させた(GraphPad Prism 4ソフトウェア、San Diego、CA、USA)。Table 5(表5)は、位置K2065およびK2092でC1ドメイン中に2個のリジン置換を担持するFVIII軽鎖変異体へのLRPクラスターII結合は、位置K2065またはK2092でC1ドメイン中に1個のリジン置換を担持するFVIII軽鎖変異体よりも低いことを示す。
FVIIIの細胞取込み
様々な細胞がLRPおよび関連する細胞内受容体を発現している。これらのものとしては、高レベルのLRPを発現することが当業界で公知であるヒトグリア芽腫細胞系U87 MG細胞(Cancer Res 2000; 60: 2300〜2303)が挙げられる。これらの細胞は、FVIIIなどのLRP結合リガンドのLRP媒介性細胞取込みを研究するのに特に有用である。U87 MG細胞はATCCから得られたものである(HTB-14)。10%熱不活化FCSを添加したEMEM上、37℃、5%CO2中で48時間、24穴プレート中で細胞を増殖させた。細胞を10mM HEPES(pH 7.4)、135mM NaCl、10mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4を含有するバッファーで洗浄し、40nMのFVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093AおよびFVIII-YFP-K2092A-F2093A(実施例6に記載のように調製された変異体)と共に、37℃で15分間インキュベートした。続いて、細胞をそれぞれ同じHEPESバッファーおよびTBS(20mM Tris-HCl、150mM NaCl)で洗浄した。トリプシンを用いて細胞を回収し、10%熱不活化FCSを添加したEMEMで中和し、TBSで洗浄し、TBS + 0.5%(w/v)BSA中に再懸濁した。FVIIIの取込みを、フローサイトメトリー分析により決定した。細胞結合試験のために、細胞を、10mM HEPES(pH 7.4)、135mM NaCl、10mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4と共に4℃で15分間インキュベートした。次に、細胞を、40nMのFVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093AおよびFVIII-YFP-K2092A-F2093Aと共に4℃で45分間インキュベートした。続いて、細胞を氷冷TBSで洗浄した後、0.5%(w/v)BSAを含有する氷冷TBSで洗浄した。細胞を擦り取り、TBS + 0.5%(w/v)BSA中に再懸濁した。蛍光活性化細胞選別装置(Becton Dickinson LSR IIフローサイトメーター)を用いて、FVIII結合および取込みを測定した。U87MG細胞に特徴的なものとは異なる前方散乱値および側方散乱値を有する事象を排除することにより、分析の間のノイズを減少させた。フローサイトメトリーのデータを、FacsDiva version 5.0.3(Becton Dickinson)を用いて収集し、分析のためにFlowJoプログラムにダウンロードした。Table 6(表6)は、4℃(細胞結合)および37℃(細胞取込み)でのFVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093AおよびFVIII-YFP-K2092A-F2093Aの存在下でのU87 MG細胞の平均蛍光強度を示す。このデータは、LRP発現細胞によるFVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093AおよびFVIII-YFP-K2092A-F2093Aの細胞結合および取込みが、突然変異を含まないFVIII-YFPと比較して低下したことを示す。
FVIII C1二重および三重変異体の維持された比活性
FVIII変異体FVIII-R2090A、FVIII-K2092A-F2093AおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを、実施例6に記載のように調製した。FVIII活性を、実施例6に記載のような発色FVIIIアッセイにおいて測定した。タンパク質濃度を、Bradford法(Anal Biochem 1976; 72: 248〜254)を用いて測定した。精製されたタンパク質の特性を、Table 7(表7)に列挙する。活性を、タンパク質濃度または抗原で除算することにより、比活性を算出した。K2092A-F2093AおよびR2090A-K2092A-F2093A突然変異を有するFVIIIは活性を維持した。
FVIII C1二重および三重変異体の細胞取込み
YFP(黄色蛍光タンパク質)融合パートナーを含まないFVIII-K2092A-F2093AおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093A突然変異体のエンドサイトーシスを、U87MG細胞中で分析した(実施例8を参照されたい)。細胞を、10mM HEPES(pH 7.4)、135mM NaCl、10mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4と共に、37℃で15分間インキュベートした。次に、細胞を、様々な量の野生型FVIII、FVIII-K2092A-F2093AまたはFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aと共に45分間インキュベートした。続いて、細胞を氷冷TBS(50mM Tris-HCl pH 7.6、150mM NaCl)で洗浄し、擦り取り、氷冷TBS中に再懸濁し、氷冷TBSで1回洗浄した。続いて、細胞を1%の溶解したばかりの超高純度メタノール非含有パラホルムアルデヒド(Polysciences、Eppelheim、Germany)で固定し、0.5% HSAを含有するTBS中の0.05%サポニンの存在下でFITCコンジュゲートモノクローナル抗FVIII抗体CLB-CAg117と共にインキュベートした。LSRII(BD Biosciences、Uppsala、Sweden)を用いるフローサイトメトリーにより、平均蛍光強度を決定した。その結果をTable 8(表8)にまとめる。FVIIIはU87MG細胞によって用量依存的様式でエンドサイトーシスされた。FVIII-K2092A-F2093Aの取込みは大幅に低下した。FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aの取込みの評価は、この変異体の取込みがFVIII-K2092A-F2093Aのものと比較した場合、さらにより低下することを示していた。これらの結果は、R2090、K2092およびF2093の置換が、LRP発現細胞中での取込みが低下したFVIII分子をもたらしたことを示している。
FVIII C1およびC2二重変異体の細胞取込み
コラーゲン被覆24穴プレート(Blood 2002; 99: 457〜462)に、10%熱不活化FCSを添加したDMEM-F12中、37℃で5%CO2中でU87MG細胞を播種した。細胞を集密まで増殖させ、10mM HEPES(pH 7.4)、135mM NaCl、10mM KCl、5mM CaCl2、2mM MgSO4を含有するバッファーで洗浄し、40nMのFVIII-K2065A、FVIII-K2249A、FVIII-K2065A-K2249A、FVIII-K2092A、FVIII-R2215A、またはFVIII-K2092A-R2215Aと共に37℃で30分間インキュベートした(実施例1および2を参照されたい)。0.5%BSAを添加したTBS(20mM Tris-HCl、150mM NaCl)中に擦り取ることにより、細胞を収集した。細胞を再懸濁し、0.4%超高純度メタノール非含有パラホルムアルデヒド(Polysciences、Eppelheim、Germany)中、室温で15分間固定した。固定された細胞を、TBS、1%BSA、0.3%サポニン中で500倍に希釈したマウス抗cMyc抗体9E10(Sigma、M4439)と共に室温で60分間インキュベートした。細胞をTBS、0.5%BSAで洗浄した後、TBS、1%BSA、0.3%サポニン中で200倍に希釈した二次抗体Alexa Flour 488ヤギ抗マウス抗体(Invitrogen、A-11001)と共に室温で45分間インキュベートした。細胞をTBS、0.5%BSA中で洗浄および再懸濁し、実施例8に記載のように蛍光活性化細胞選別装置(Becton Dickinson LSR IIフローサイトメーター)を用いて分析した。Table 9(表9)は、細胞の平均蛍光強度を示す。単一の置換は、WT FVIIIと比較して取込みの低下を示す。しかしながら、細胞取込みの最も強い欠陥が、C1およびC2ドメインの両方における置換を担持する変異体について観察される。
樹状細胞によるFVIIIの細胞取込み
樹状細胞は、免疫系への提示の前にFVIIIの取込みを媒介し、潜在的に免疫応答を惹起する(Blood 2007; 109: 610〜612、J Thromb Haemost 2009; 7: 1816〜1823)。樹状細胞はLRPならびに他の細胞内受容体を発現する。FVIII変異体の細胞取込みを、ヒト単球由来樹状細胞、ヒト単球由来マクロファージおよびマウス骨髄由来樹状細胞を用いてさらに調査した。以前に記載された(Vaccine 2007; 25: 7145〜52)、CD14マイクロビーズ、磁気細胞分離機およびElutra(商標)細胞分離システムを用いるアフェレーシス試料に由来する末梢血単核細胞から、単球を単離した。100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1000U/mlヒト組換えGM-CSFおよび800U/mlヒト組換えIL-4を添加したCellGro DC培地中で、単球を樹状細胞に分化させた。細胞培養の4〜6日後、細胞表面マーカーCD14、CD80、CD83およびCD86を決定することにより、未熟な表現型の細胞を評価した。フローサイトメトリーによるFVIII変異体の取込みをモニターするために、約2×105個の未熟なDCをまず無血清培地で1回洗浄し、120μlの無血清CellGro DC培地中、37℃で30分間、FVIIIと共にインキュベートした。FVIIIの取込み後、細胞を氷冷TBSで洗浄し、1%の調製したばかりのパラホルムアルデヒドで固定し、0.5%ヒト血清アルブミンを含有するTBS中の0.05%のサポニンの存在下または非存在下でFITCコンジュゲートモノクローナル抗FVIII抗体CLB-CAg117と共にインキュベートした。平均蛍光強度および陽性細胞の割合を、LSRII(BD Biosciences、Uppsala、Sweden)を用いるフローサイトメトリーにより決定した。精製された野生型FVIII、FVIII-K2092A-F2093AおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを用いる取込み実験の結果を、Table 10(表10)に示す。その結果は、ヒト樹状細胞による野生型FVIIIの用量依存的取込みを示す。変異体FVIII-K2092A-F2093Aは、樹状細胞による強く低下した取込みを示すが、FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aは、樹状細胞によるその取込みのさらにより明白な低下を示す。これらの結果は、R2090、K2092およびF2093の置換が、樹状細胞によるFVIIIの取込みを強く低下させることを示す。
マクロファージにおけるFVIIIの細胞取込み
マクロファージも、肝臓および脾臓においてFVIIIを取込み、免疫系に対してFVIIIを提示することができ(Blood 2008; 112: 1704〜1712、J Thromb Haemost 2009; 7: 1816〜1823)、従って、FVIII変異体の取込みを、ヒト単球由来マクロファージを用いてさらに評価した。単球を実施例10に記載のように単離し、10%FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび50ng/ml組換えヒトM-CSFを添加したRPMI 1640培地中で5日間インキュベートすることにより、マクロファージに分化させた。フローサイトメトリーによりFVIII変異体の取込みをモニターするために、約2×105個のマクロファージをまず無血清培地で1回洗浄し、120μlの無血清CellGro DC培地中、37℃で30分間、15nMのFVIIIと共にインキュベートした。FVIII取込みの後、細胞を氷冷TBSで洗浄し、1%の調製したばかりのパラホルムアルデヒドで固定し、0.5%ヒト血清アルブミンを含有するTBS中の0.05%のサポニンの存在下または非存在下でFITCコンジュゲートモノクローナル抗FVIII抗体CLB-CAg117と共にインキュベートした。平均蛍光強度および陽性細胞の割合を、LSRII(BD Biosciences、Uppsala、Sweden)を用いるフローサイトメトリーにより決定した。野生型FVIII、FVIII-R2090A、FVIII-K2092A-F2093AおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを用いる取込み実験の結果を、Table 11(表11)に示す。その結果は、FVIII-R2090Aの取込みがわずかに低下するが、FVIII-K2092A-F2093Aについては取込みの強い低下が観察されることを示している。FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aについては取込みのさらにより強い低下が観察される。これらの結果は、R2090、K2092およびF2093の置換がマクロファージによるFVIIIの取込みも低下させることを示す。
マウス骨髄由来樹状細胞によるFVIIIの細胞取込み
続いて、マウス骨髄由来樹状細胞を用いて、FVIII変異体の取込みに取り組んだ。2%FCSを添加したPBSを用いて血友病のE17 KOマウスから大腿骨を洗い流すことにより、骨髄細胞を単離した。骨髄懸濁液を、Tris-NH4Cl中、室温で2分間インキュベートして、赤血球を溶解させた。最後に、20ng/mlのマウス組換えGM-CSFを含有する細胞を1×106細胞/mlで再懸濁し、2.5mM HEPES、55mM 2-メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5mMグルタミンおよび10%FCSを添加したRPMI 1640培地中で7〜9日間培養した。CD11c、CD11b、CD80、CD86およびGr-1の発現を、7〜9日目に測定した。ヒト単球由来樹状細胞およびマクロファージについて上記のようにFVIIIの取込みを試験した。FVIII取込み実験の結果をTable 12(表12)に提示する。その結果は、FVIII-R2090Aが野生型FVIIIと比較してわずかに低下したレベルでエンドサイトーシスされるが、FVIII-K2092A-F2093Aのエンドサイトーシスはより大幅に低下することを示している。FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aのエンドサイトーシスは、FVIII-K2092A-F2093Aと比較した場合、より大幅に低下する。これらの結果は、R2090、K2092およびF2093の置換は、マウス骨髄由来樹状細胞によるFVIIIの取込みも低下させることを示している。
FVIII細胞取込みを遮断する抗FVIII C1およびC2抗体
FVIII細胞取込みに寄与する残基を定義する別の手法として、FVIIIの全てのドメイン内のエピトープを有する一団の抗体を、U87MG細胞(実施例8を参照されたい)、一次ラット肝細胞およびヒト単球由来マクロファージを用いるFVIII細胞結合試験において適用した。抗体ESH-2、ESH-4、ESH-5およびESH-8(Thromb Haemost 1986; 55: 40〜46)は、American Diagnosticaから市販されている。KM33はJ Biol Chem 2003; 278: 9370〜9377およびWO 03/093313に記載されている。CLB-CAg117はBlood 1998; 91: 2347〜2352に記載されている。残りの抗体は、モノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いてFVIIIでマウスを免疫した後に社内で調製した。社内で調製されたか、またはBiopredic International(Rennes、France)から購入した単離したばかりの一次ラット肝細胞を用いた。簡単に述べると、麻酔したSprague Dawleyラットを開腹し、大静脈を結びながら門脈にカニューレを挿入した後、Hepesバッファー(25mM hepes、0.38mM Na2HPO4、0.35mM KH2PO4、5.36mM KCl、0.11M NaCl、22mMグルコース、pH 7.4)を用いるかん流の開始後、クリップで留めた。hepesバッファー中の120mgのコラゲナーゼ(Sigma C-5138)で組織を消化した後、Hepesバッファー中の5mM CaCl2で洗い流した。肝臓の周囲の被膜組織を剥がして洗浄バッファー(1%BSAおよび0.1mMヒドロコルチゾンヘミスクシネート(Sigma)および1nMインスリン(Sigma)を添加したL-グルタミンおよび15mM hepes(Gibco)を含むD-MEM/F12)中に細胞を遊離させた。細胞を50×gで遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、2mM L-グルタミン、100UI/mLインスリン、100μg/mLストレプトマイシンおよび5μMヒドロコルチゾンヘミスクシネートを添加したWilliam's E培地(Biopredic International、Rennes、France)中に再懸濁した。肝細胞を、合計48時間にわたって2.5×105細胞/ウェルの密度で24穴組織培養プレート中に播種した。製造業者の説明書に従って磁気抗CD14ビーズ(Miltenyi)およびMACSカラム(Miltenyi)を用いて、磁気分離により単球を単離した。単球(0.5×106細胞/ml)を、T-75組織培養フラスコ中に播種し、3.3ng/mlのM-CSF(R&D Systems)を添加した。3日間の細胞培養後、さらに3.3ng/mlのM-CSFを添加した。6日後、マクロファージをPBSで洗浄し、5%FCSを含むPBS中の2.5mM EDTAを用いて4℃で10〜20分間インキュベートした。細胞を3.5×105細胞/ウェルの密度で48穴組織培養プレート中に播種し、一晩インキュベートした。U87細胞およびマクロファージをバッファーA(100mM HEPES、150mM NaCl、4 KCl、11mMグルコース、pH 7.4)で注意深く洗浄し、バッファーB(5mM CaCl2および1mg/ml BSAを添加したバッファーA)と共に15分間インキュベートした。抗FVIII抗体(最終濃度10μg/ml)を125I-FVIII(最終濃度1nM)に添加し、10分間インキュベートした後、細胞に添加し、4℃で一晩インキュベートした。続いて、細胞を氷冷バッファーBで2回洗浄し、200mM NaOH、1%SDS、10mM EDTAを用いて溶解した。一次ラット肝細胞のために、バッファーの代わりに培地を用いた以外は同様のプロトコルを用いた。溶解物中の125Iをγ-カウンター(Cobra)中で計数した。抗FVIII抗体の非存在下での結合した125Iを100%に設定した。Table 13(表13)は、U87MG細胞、マクロファージおよび肝細胞への125I-FVIIIの結合に対する抗FVIII抗体の効果を示す。このデータは、細胞へのFVIII結合を阻害するのは、抗C1抗体KM33および4F30およびいくつかの抗C2抗体、すなわち、ESH-4、4F161 およびCLB-CAg117のみであることを示している。注目すべきことに、一団の抗体は、分析した3つの細胞型の全部に対して同様の効果を有し、それは細胞型とは無関係に細胞取込みに関与するFVIII上の同じエピトープであることを示唆している。
抗FVIII C1およびC2抗体はin vivoでのFVIIIの半減期を延長させる
記載のように(Haemophilia 2010、16; 349〜359)調製されたFVIIIを、表面プラズモン共鳴実験に由来するKd値を用いてin vivoでのFVIIIの98%以上の初期飽和を確保し、in vivoでの試験物質の20倍希釈液とする量の抗C1および/または抗C2抗体のscFvまたはfab断片と混合した。この20倍希釈液は、単独で投与された場合にFVIIIについて得られた70ml/kgの分布量、28.6gのマウスの見積もり体重および0.1mlの試験物質の容量に基づくものであった。FVIIIのみ(280IU/kg)または抗体と混合したFVIIIを、VWF欠損マウス(n=6/群)に静脈内投与した。t = 0.08; 1、2、3、4および5hで眼窩神経叢から血液を採取した。それぞれのマウスから3つの試料を採取し、3つの試料をそれぞれの時点で収集した。クエン酸ナトリウムを用いて血液をすぐに安定化させ、4倍量のバッファー(50mM Tris、150mM NaCl、1%BSA、pH 7.3、保存剤を含む)中に希釈した後、4000×gで5分間遠心分離した。血漿をドライアイス上で凍結させ、-80℃で保持した後、FVIII抗原を分析した。非コンパートメント手法(Phoenix WinNonlin Pro 6.1)を用いて、薬物動態パラメータの評価のために平均値を用いた。得られるPK値をTable 14(表14)に示す。FVIII単独ではVWF欠損マウスにおける比較的速いクリアランスを有するが、C1またはC2の遮断はクリアランスの低下ならびに半減期(T1/2)および平均滞留時間の延長をもたらした。C1中のエピトープとC2中のエピトープを同時に遮断したところ、1つの抗体のみの添加と比較してクリアランスのさらなる低下ならびにT1/2および平均滞留時間の延長が得られた。これは、抗体KM33および4F161が、細胞取込みに関与するFVIIIのエピトープを保護し、それによってFVIIIの半減期を延長することを示す。
細胞取込みを遮断し、in vivoでのクリアランスを延長するFVIII C1およびC2抗体のエピトープ
実施例13に記載の細胞取込みを遮断する抗体のエピトープを、水素交換質量分析(HX-MS)によりマッピングした。HX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HX)を質量分析(MS)により容易に追跡することができることを活用するものである。水素を含有する水性溶媒を、重水素を含有する水性溶媒で置換することにより、タンパク質中の所与の部位での重水素原子の取込みは1Daの質量の増加を生じる。この質量増加を、交換反応のクエンチした試料における質量分析により時間の関数としてモニターすることができる。重水素標識情報を、クエンチ条件下でのペプシン消化によりタンパク質中の領域にサブ局在化させ、得られるペプチドの質量増加を追跡することができる。HX-MSの1つの用途は、タンパク質間複合体形成の際の水素交換が減少した領域を同定することにより分子相互作用に関与する部位を探査することである。通常は、溶媒の立体排除に起因する水素交換の顕著な減少により結合界面を示すことができる。時間の関数として対応する結合パートナーの存在下および非存在下でのいずれかのタンパク質メンバーに組込まれた重水素の総量を簡単に測定することによってHX-MSによりタンパク質間複合体形成を検出することができる。HX-MS技術は、天然の成分、すなわち、タンパク質および抗体またはFab断片を使用し、溶液中で実施される。かくして、HX-MSはin vivo条件を模倣するための可能性を提供する(Mass Spectrom. Rev. 25, 158 (2006))。FVIII(Haemophilia 2010, 16; 349〜359)ならびに抗体KM33および4F30(実施例14を参照されたい)を、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaCl、pH 7.3中にバッファー交換した後、分析した。重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステム上への注入および消化時間制御を実施する、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)により操作されるLeapロボット(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)により、HX実験を自動化した。Leapロボットは、それぞれ、バッファー保存およびHX反応のために20℃で維持され、タンパク質およびクエンチ溶液の保存のために2℃で維持された2つの温度制御されたスタックを備えていた。Leapロボットはさらに、ペプシンカラム、プレカラムおよび分析カラム、ならびにLCチューブおよびスイッチングバルブを1℃に保持する冷却されたTrio VSユニット(Leap Technologies Inc.)を含んでいた。スイッチングバルブは、HPLCからMicrobore UHPLCスイッチバルブ(Cheminert、VICI AG)にアップグレードした。インラインペプシン消化のために、0.15pmolのFVIIIを含有する100μLのクエンチした試料をロードし、200μL/minのイソクラチック流量(0.1%ギ酸: CH3OH 95:5)を用いてPoroszyme(登録商標)Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm、Applied Biosystems)上に通過させた。得られたペプチドを捕捉し、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm、Waters Inc.)上で脱塩した。続いて、バルブのスイッチを入れてプレカラムを分析カラムであるUPLC-BEH C18 1.7μm(2.1×100mm、Waters Inc.)と直列に置き、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から150μL/minで送達される15〜40%のBの9分の勾配を用いてペプチドを分離した。移動相はA: 0.1%ギ酸およびB: CH3CN中の0.1%ギ酸からなっていた。ESI MSデータ、および高エネルギー(MSE)実験を、Q-Tof Premier MS(Waters Inc.)を用いて陽イオンモードで獲得した。ロックマスとしてロイシン-エンケフェリンを用い(m/z 556.2771での[M+H]+イオン)、データを連続モードで収集した。消化ペプチドを、MSE方法(Waters Inc.)を用いて別々の実験において同定した。MSEデータをBiopharmaLynx 1.2(version 017)を用いて処理した。HX-MS生データファイルを連続ロックマス補正にかけた。データ分析、すなわち、重水素化ペプチドの重心決定および交換曲線のプロッティングを、HX-Express(Version Beta; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006; 17: 1700)を用いて実施した。
FVIII-R2159N中のグリカンの導入はFVIII細胞取込みおよびin vivoでの半減期を延長させる抗C1ドメイン抗体(KM33)への結合を遮断する
C1ドメイン領域2157-SIRST-2161中のアスパラギンによるR2159の置換は、KM33のエピトープ中に含まれる位置2159にN-結合グリコシル化のコンセンサス配列(すなわち、N-X-S/T、p.22を参照されたい)を導入する(実施例17を参照されたい)。鋳型としてwt FVIIIのDNAを用いるQuickChange突然変異誘発を用いて、FVIII-R2159Nを構築した(Blood 2009; 133: 3102〜3109)。FVIII-R2159Nおよびwt FVIIIを記載のように発現させた(Plos One 2011; 6(8): e24163. doi:10.137/journal.pone.0024163)。FVIII軽鎖中へのさらなるN-結合グリカンの導入をSDS-PAGEにより確認したところ、FVIII軽鎖の移動の低下が観察された。実施例3に記載のFVIII活性を発色FVIIIアッセイにおいて測定した。FVIII抗原を、捕捉抗体としてのCLB-EL14 IgG4(Br J Haematol 2008; 142: 644〜652)、検出抗体としてのペルオキシダーゼ標識CLB-CAg69(Biochem J 1989; 263: 187〜94)、および標準物としての40人のドナーからのヒトプール血漿を用いるELISAにおいて測定した。wt FVIIIおよびFVIII-R2159Nへの抗体KM33の結合(実施例15を参照されたい)を、BIAcore 3000バイオセンサ(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を用いるSPR分析により評価した。抗C2抗体CLB-EL14 IgG4を、製造業者の説明書に従ってアミンカップリング法を用いて33fmol/mm2の密度でCM5センサチップ上に固定した。続いて、FVIII-R2159Nまたはwt FVIIIを、3fmol/mm2の密度でEL14 IgG4に結合させた。KM33(100nM)を、20μL/minの流量を用いて25℃で150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005%(v/v)Tween 20および20mM Hepes(pH 7.4)を含有するバッファー中のFVIII-R2159Nまたはwt FVIII上に通過させた。結合応答を、結合の240秒の間に記録し、非特異的結合について補正した。Table 15(表15)は、結合の235秒後の結合応答ならびにwt FVIIIおよびFVIII-R2159Nの活性および抗原濃度を示す。その結果は、グリカンの導入はFVIIIのKM33への結合を完全に破壊するが、FVIIIの活性はグリカンの導入によっては低下しないことを示す。FVIIIへのKM33の結合は細胞取込みを低下させ、in vivoでの半減期を延長するため、KM33結合の破壊を示すFVIII-R2159Nも細胞取込みの低下およびin vivoでの半減期の延長を示す可能性がある。
FVIII K2062A-F2093Aの肝臓クリアランスの延長
FVIII-K2092A-F2093Fの肝臓クリアランスを、かん流肝臓モデル(Thromb Haemost 2010; 104, 243〜251)において評価した。簡単に述べると、麻酔したSprague Dawleyラットの肝臓に、門脈および大静脈を介してカニューレを挿入し、25ml/minでKrebs-Henseleit重炭酸バッファー(115mM NaCl、25mM NaHCO3、5.9mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、2.5mM CaCl2)を用いてかん流した。肝臓に入る前に、かん流液は、酸素:二酸化炭素混合物(95:5)で飽和させたファイバーダイアライザ(Gambro(登録商標)Scandidact Hemophan(登録商標)Fiber Dialyzer 100HG、Secon、Dransfeld、Germany)を流動する。FVIII(Haemophillia 2010、16; 349〜359)またはFVIII-K2092A-F2093Aをバッファーに添加し、混合した後、0〜80分の時点で再循環するかん流液から試料を採取した。かん流液中のFVIII:Cを、実施例3に記載の発色アッセイにより分析した。FVIII-K2092A-F2093AのT1/2は、野生型FVIIIのものと比較して延長され(Table 16(表16))、これは、C1置換を含まないFVIIIと比較してFVIII-K2092A-F2093Aの肝臓クリアランスが低下したことを示す。
FVIII-K2092A-F2093Aのin vivoでの半減期の延長
K2093A-F2093A突然変異体のin vivoでの薬物動態を、VWF欠損マウスにおいてさらに評価した。野生型FVIII(Haemophilia 2010, 16; 349〜359)およびFVIII-K2092A-F2093Aを、WO09108806に記載のようなBドメイン中のO-結合グリカンに特異的な40K-PEG化した。wt FVIII、K2092-F2093AおよびPEG化FVIII(40K-PEG-FVIII)および突然変異体(40K-PEG-K2092A-F2093A)を、実施例16に記載のように280IU/kg(n = 3〜6匹/群)の用量でVWF欠損マウスに投与した。それぞれのマウスから3つの時点で、すなわち、FVIIIおよびK2092-F2093Aについては投与後t=0.5、1.25および2hで、ならびにPEG化タンパク質については投与後4、7および24hで、血液試料を採取し、実施例3に記載のようにFVIII:Cについて分析した。C1突然変異K2092A-F2093Aは、PEG化ならびに非PEG化FVIIIタンパク質の両方についてT1/2のおよそ2倍の倍加をもたらし(Table 17(表17))、かくしてFVIIIにおけるK2092-F2093の置換がin vivoでの半減期の延長をもたらしたことを確認した。
FVIII-R2090A-K2092A-F2093AのT細胞応答の低下
FVIIIと抗原提示細胞との相互作用は、続いてFVIIIに対する抗体の産生を刺激するFVIII特異的CD4+ T細胞の形成における重要な段階を提供することがよく知られている。野生型FVIII(wt FVIII)およびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを注射したマウスからの脾臓細胞のCD4+ T細胞応答を以下のように分析した: FVIIIの毎週の注射後に回収された脾臓を群内にプールした。赤血球を除去し、抗マウスCD8抗体Lyt 1.2(eBioscience)で被覆されたビーズを用いる磁気ビーズ分離により、CD8+細胞を枯渇させた。残りのCD8-細胞を、抗原特異的T細胞増殖を生成させるための増加するFVIII濃度(0、0.1、0.5または1μg/ml)または非特異的増殖を生成させるためのコンカナバリンA(1μg/ml)の存在下、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン(全てBioWhittaker; Walkersville、Marylandから)および55μM β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich、Irvine、UK)を添加したX-VIVO 15培地中で72または96時間、丸底96穴プレート中で培養した。最後の18〜20時間に1μCi/ウェルの[3H]チミジン(ICN Pharmaceuticals、Irvine、CA)の添加により増殖をアッセイした。Table 18(表18)に示される結果は、カウント毎分(CPM)値(平均±SD)で、または刺激指数(SI:抗原と共にインキュベートした細胞のCPMを培地のみでインキュベートした細胞のCPMで除算したもの)として表される。マウスへのFVIII-R2090-K2092A-F2093Aの注射は、wt FVIIIと比較した場合、FVIIIによるin vitroでの再刺激の際に脾臓CD4+ T細胞の著しく低下した増殖をもたらしたが、抗原提示細胞におけるFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aの取込みの低下がマウスにおけるCD4+ T細胞応答の低下になることを示している。
FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを受容するマウスにおける抗体レベルの低下
FVIII変異体の免疫原性に対する抗原提示細胞によるこれらのI変異体の取込みの低下の結果を、血友病Aにおける阻害因子形成のためのマウスモデルにおいてさらに評価した。野生型FVIIIおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aを滅菌PBS中で10μg/mlに希釈し、100μlの用量(1μg)を週に5回、オスのFVIIIエクソン17 KOマウス(n = 8)に静脈内(i.v.)投与した。最後の注射の1週間後、動物を犠牲にし、血液試料を採取した。治療されたFVIII-KOマウスからの血漿試料中の抗FVIII抗体の存在を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびFVIII活性を阻害するマウス血漿の能力を測定するBethesdaアッセイにより決定した。ELISAについて、50mM NaHCO3 pH 9.8を含有するバッファー中の血漿由来FVIII(5μg/ml)をマイクロタイターウェル中に固定した。プレートをPBS中の2%ゼラチンで遮断した。50mM Tris、150mM NaCl、2%BSA、pH 7.4中でマウス血漿希釈液を調製した。マウスモノクローナル抗FVIII抗体CLB-CAg9を標準物として用いた。抗FVIII抗体を、ヤギ抗マウスIgG-HRPを用いて検出した。マウス血漿中の抗FVIII抗体の濃度を任意の単位(AU)で示し、1AUは1μgのCLB-CAg9により得られるシグナルに対応する。本質的には記載のように(Thromb Diath Haemorrh 1975; 34: 612)Bethesdaアッセイを実施した。データをノンパラメトリックMann-Whitney U検定を用いて分析した。FVIIIおよびFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aの5回の毎週の注射後にマウス血漿中で観察された抗体力価をTable 19(表19)に示す。その結果は、FVIIIの点滴がFVIIIに対する抗体の形成をもたらすことを示している。FVIII-R2090A-K2092A-F2093Aで治療されたマウスにおいては、抗体力価の有意な低下が観察される(p<0.05)。また、中和抗FVIII抗体の存在を反映するBethesda力価も有意に低下した(p<0.05)。これらの知見は、抗原提示細胞中のFVIII-R2090A-K2092A-F2093Aの取込みの低下およびT細胞応答の低下が、血友病Aにおける阻害因子の発生に関するマウスモデルにおける阻害因子力価の低下になることを示す。同時に、これらの結果は、抗原提示細胞によるそのエンドサイトーシスの低下をもたらすFVIIIの特異的改変がin vivoでのFVIIIの免疫原性を低下させるための有効な方法であることを示す。従って、本発明者らの結果は、細胞取込みの低下を示すFVIII変異体が血友病Aを有する患者における阻害因子発生の危険性の低下を担持することを示唆する。
Claims (9)
- FVIII活性を有する組換えFVIII変異体であって、前記変異体が、FVIIIのC1フットおよびC2フット中に表面に接近可能な正荷電アミノ酸残基の2〜4個の置換を含み、前記表面に接近可能な荷電アミノ酸残基がアラニンまたはグルタミンで置換され、前記置換が前記FVIII変異体の細胞取込みの低下をもたらし、前記変異体が、K2092Aの置換およびR2215Aの置換を含む、組換えFVIII変異体。
- K2249、R2090およびK2065から選択される置換を1つまたは2つ含む、請求項1に記載のFVIII変異体。
- 低下したLRP結合を有する、請求項1または2に記載の組換えFVIII変異体。
- 低下した免疫原性を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えFVIII変異体。
- 半減期延長部分にコンジュゲートしている、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えFVIII変異体。
- F2093A突然変異をさらに含む、請求項1に記載の組換えFVIII変異体。
- F2093A置換を更に含み、半減期延長部分(PEG)にコンジュゲートしている、請求項1に記載の組換えFVIII変異体。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のFVIII変異体を含む医薬組成物。
- 血友病の治療のための、請求項1から7のいずれか一項に記載のFVIII変異体を含む医薬組成物または請求項8に記載の医薬組成物。
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