JP2019516347A - 抗アンチトロンビン単一ドメイン抗体及びそれを含むポリペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。本発明者らは、アンチトロンビンに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)を生成した。本発明者らは、アミド分解アッセイで、sdAbによって、ヘパリンの存在においてトロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができないことを観察した。sdAbの異なる組み合わせによって、マウスにおいてトロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができた。このように、本発明者らは、トロンビン生成を促進し、このように血友病及び出血に関連付けられる他の状態を処置するために、アンチトロンビンの阻害機能を遮断するためのsdAbの異なる組み合せを使用することを提案する。したがって、本発明はまた、それを必要とする被験体において出血障害を防止又は処置する方法に関し、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。
Description
発明の分野
本発明は免疫療法の分野にある。特に、本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
本発明は免疫療法の分野にある。特に、本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
本発明はまた、アンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)及びそれを含むポリペプチド(例えば血液凝固因子など)、ならびに治療における(例えば止血障害の防止及び処置などにおける)その使用に関する。
発明の背景:
治療適用のためのポリペプチド(例えばタンパク質など)の使用が、主に、多くの疾患の根底にある分子生物学的原理の高度な知識ならびにヒトポリペプチドのための改善された組換え発現及び送達システムの利用可能性のために近年拡大している。ポリペプチド治療薬は、特定の天然ポリペプチドが、遺伝的な遺伝子欠損のために患者において欠陥又は喪失している疾患において主に利用されている。例えば、血友病は、特定の血漿タンパク質の欠損により起こされる疾患である。血友病患者は、血液の凝血カスケードのタンパク質成分の妨げられた機能により起こされる出血性の病的状態に苦しむ。罹患した凝固因子に応じて、2つの型の血友病を鑑別することができる。両者は共通して、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリン塊への変換阻害を有する。
治療適用のためのポリペプチド(例えばタンパク質など)の使用が、主に、多くの疾患の根底にある分子生物学的原理の高度な知識ならびにヒトポリペプチドのための改善された組換え発現及び送達システムの利用可能性のために近年拡大している。ポリペプチド治療薬は、特定の天然ポリペプチドが、遺伝的な遺伝子欠損のために患者において欠陥又は喪失している疾患において主に利用されている。例えば、血友病は、特定の血漿タンパク質の欠損により起こされる疾患である。血友病患者は、血液の凝血カスケードのタンパク質成分の妨げられた機能により起こされる出血性の病的状態に苦しむ。罹患した凝固因子に応じて、2つの型の血友病を鑑別することができる。両者は共通して、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリン塊への変換阻害を有する。
先行技術では、ポリペプチド治療薬の短い循環半減期は、ポリペプチドへのポリマーの共有結合により対処されてきた。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、又はヒドロキシエチルスターチ(HES)の結合によって、一部のポリペプチドの半減期のある程度の改善が示されている。しかし、多くの問題がポリマーの結合で観察されている。例えば、ポリマーの結合は、薬物活性の減少に導きうる。さらに、ポリマーをタンパク質に共役させるために使用される特定の試薬は反応性が不十分であり、従って、タンパク質の変性及び/又は不活性化が生じうる長い反応時間が要求される。また、不完全又は不均一な結合は、異なる特性を有する化合物の混合集団に導く。WO 2009/135888には、標的タンパク質及び少なくとも1つの結合分子を含む複合体が開示されており、それにおいて、結合分子は少なくとも1つの水溶性ポリマーに結合している。
治療用タンパク質の半減期を増加させて効率を増加させる、あるいは治療用タンパク質の量及び/又は患者に適用される注入の頻度を低下させる新たな産物を開発する必要性が依然としてある。これはまた、処置の費用を低下させうる。
発明の概要
本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。特に、本発明は請求項により定義する。
本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。特に、本発明は請求項により定義する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、アンチトロンビンに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)を生成した。本発明者らは、アミド分解アッセイで、sdAbによって、ヘパリンの存在においてトロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができないことを観察した。驚くべきことに、sdAbの異なる組み合わせによって、トロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができた。このように、本発明者らは、トロンビン生成を促進し、このように血友病及び出血に関連付けられる他の状態を処置するために、アンチトロンビンの阻害機能を遮断するためのsdAbの異なる組み合せを使用することを提案する。
本発明者らは、アンチトロンビンに対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)を生成した。本発明者らは、アミド分解アッセイで、sdAbによって、ヘパリンの存在においてトロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができないことを観察した。驚くべきことに、sdAbの異なる組み合わせによって、トロンビン及び第Xa因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができた。このように、本発明者らは、トロンビン生成を促進し、このように血友病及び出血に関連付けられる他の状態を処置するために、アンチトロンビンの阻害機能を遮断するためのsdAbの異なる組み合せを使用することを提案する。
出血状態に関するこれらの結果に加えて、本発明者らは、これらの異なる組み合わせが、治療用タンパク質の半減期(例えば血友病の処置のために使用される治療用タンパク質の半減期など)を増加させるために使用できうることを示している。
第一態様では、本発明は、アンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
「単離」により、それは、本発明に従った単一ドメイン抗体を指す場合、示した分子が、同じ型の他の生物学的な巨大分子の実質的な非存在において存在することを意味する。
本明細書中で使用するように、用語「単一ドメイン抗体」(sdAb)は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然では軽鎖を欠いているラクダ科の哺乳動物において見出すことができる型の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体はVHH又は「ナノボディー(登録商標)」とも呼ばれる。(単一)ドメイン抗体の一般的な記載については、上で引用する先行技術、ならびにEP 0 368 684、Wardら(Nature 1989 OcT1/2; 341 (6242): 544-6)、Holt et al, Trends Biotechnol, 2003, 21(11):484-490;及びWO 06/030220、WO 06/003388も参照する。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、4つのフレームワーク領域又は「FR」で構成されると考えることができ、それらは、当技術分野及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域1」又は「FR1」として;「フレームワーク領域2」又は「FR2」として;「フレームワーク領域3」又は「FR3」として;及び「フレームワーク領域4」又は「FR4」として言及し;それらのフレームワーク領域は、3つの相補性決定領域又は「CDR」により中断されており、それらは、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域1」又は「CDR1」として;「相補性決定領域2」又は「CDR2」として;及び「相補性決定領域3」又は「CDR3」として言及する。したがって、単一ドメイン抗体は、一般的な構造:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を伴うアミノ酸配列として定義することができ、それにおいてFR1からFR4はそれぞれフレームワーク領域1〜4を指し、及びそれにおいてCDR1からCDR3は相補性決定領域1〜3を指す。本発明の文脈では、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、International ImMunoGeneTics情報システムアミノ酸ナンバリング(http://imgt.cines.fr/)により与えられるVHドメインについての一般的なナンバリングに従って番号付けする。
アンチトロンビン(AT)は血液の凝血を防止する抗凝固因子である。それは、凝血経路において機能するトロンビン、FXa、及び他のセリンプロテアーゼを阻害する。それは432のアミノ酸からなり、肝臓の肝細胞により産生され、2.5日の長い血漿中半減期を有する(Collen, Schetz et al. 1977)。ATのアミノ酸配列はよく保存されており、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、及びヒトの間での相同性は84%〜89%である(Olson and Bjork 1994)。ATの主要な生理学的標的はトロンビン及びFXaであるが、ATはFIXa、FXla、FXIlaならびにFVIIaもより少ない程度で阻害する。ATは、その阻害をヘパリンと一緒に発揮する。ヘパリンの存在において、ATによるトロンビン及びFXaの阻害率は、7−11×103/M/秒から1.5−4×107/M/秒まで、及び2.5×103/M/秒から1.25−2.5×107/M/秒まで3〜4桁増加する(Olson, Swanson et al. 2004)。それぞれ開始段階及び増幅段階のみで凝血を阻害するTFPI及びAPCとは異なり、ATは開始段階及び増幅段階の両方で凝血に対する阻害を発揮する。従って、ATを遮断することは、TFPI又はAPCのいずれかを単独で遮断するよりも強力な凝血促進効果を有しうる。
特に、本発明は、配列番号1として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号2として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、 及び配列番号3として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
本発明に従い、第2のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有する第1のアミノ酸配列は、第1のアミノ酸配列が、第2のアミノ酸配列と50%;51%;52%;53%;54%;55%;56%;57%;58%;59%;60%;61%;62%;63%;64%;65%;66%;67%;68%;69%;70%;71%;72%;73%;74%;75%;76%;77%;78%;79%;80%;81%;82%;83%;84%;85%;86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%又は100%の同一性を有することを意味する。配列同一性は、パーセンテージ同一性(又は類似性もしくは相同性)に関してしばしば測定する;パーセンテージが高いほど、2つの配列がより類似している。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981;Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970;Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988;Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988;Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989;Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988;Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992;及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994において記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994には、配列アライメント方法及び相同性計算の詳細な考察を提示している。例えば、アライメントツールALIGN(Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989)又はLFASTA(Pearson and Lipman, 1988)を使用して配列比較を実施してもよい(Internet Program(登録商標) 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63、発売日1996年12月)。ALIGNでは配列全体を互いに比較し、LFASTAでは局所的類似性の領域を比較する。これらのアライメントツールとそれぞれのチュートリアルは、例えばインターネット上のNCSAウェブサイトで入手可能である。あるいは、約30アミノ酸を上回るアミノ酸配列の比較のために、Blast 2配列機能を、デフォルトパラメーターにデフォルトBLASTUM62マトリックスを使用して用いることができる(ギャップ存在コスト11、及び残基当たりギャップコスト1)。短いペプチド(約30アミノ酸未満)を整列させる場合、アラインメントは、デフォルトパラメーターにPAM30マトリックスセットを用いて(オープンギャップ9、エクステンションギャップ1ペナルティー)、Blast2配列機能を使用して実施すべきである。BLAST配列比較システムは、例えばNCBIウェブサイトから入手可能である;また、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990;Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993;Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996;Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997;及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997を参照のこと。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号1として示す配列を有するCDR1、配列番号2として示す配列を有するCDR2、及び配列番号3として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号4として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−001を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
本発明に従い、第2のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する第1のアミノ酸配列は、第1のアミノ酸配列が、第2のアミノ酸配列と70%;71%;72%;73%;74%;75%;76%;77%;78%;79%;80%;81%;82%;83%;84%;85%;86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%、又は100%の同一性を有することを意味する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号4として示す配列を有するKB−AT−001を含む。
特に、本発明は、配列番号5として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号6として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号7として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号5として示す配列を有するCDR1、配列番号6として示す配列を有するCDR2、及び配列番号7として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号8として示す配列と少なくとも70%の同一性を有する配列KB−AT−002を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号8として示す配列を有するKB−AT−002を含む。
特に、本発明は、配列番号9として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号10として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号11として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号9として示す配列を有するCDR1、配列番号10として示す配列を有するCDR2、及び配列番号11として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号12として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−003を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号12として示す配列を有するKB−AT−003を含む。
特に、本発明は、配列番号13として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号14として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号15として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号13として示す配列を有するCDR1、配列番号14として示す配列を有するCDR2、及び配列番号15として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号16として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−004を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号16として示す配列を有するKB−AT−004を含む。
特に、本発明は、配列番号17として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号18として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号19として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号17として示す配列を有するCDR1、配列番号18として示す配列を有するCDR2、及び配列番号19として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号20として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−005を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号20として示す配列を有するKB−AT−005を含む。
特に、本発明は、配列番号21として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号22として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号23として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号21として示す配列を有するCDR1、配列番号22として示す配列を有するCDR2、及び配列番号23として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号24として示す配列と少なくとも70%を有する配列KB−AT−006を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号24として示す配列を有するKB−AT−006を含む。
特に、本発明は、配列番号25として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR1、配列番号26として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR2、及び配列番号27として示す配列と少なくとも50%の配列同一性を有するCDR3を含む単離単一ドメイン抗体(sdAb)に関する。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号25として示す配列を有するCDR1、配列番号26として示す配列を有するCDR2、及び配列番号27として示す配列を有するCDR3を含む。
一部の実施形態では、配列番号28として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−007を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号28として示す配列を有するKB−AT−007を含む。
sdAb KB−AT−007は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるサル及びマウスATと交差反応することにさらに注意すべきである。
一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は「ヒト化」単一ドメイン抗体である。本明細書中で使用するように、用語「ヒト化」は、天然に生じるVHHドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列が「ヒト化」されている、即ち、前記の天然に生じるVHH配列のアミノ酸配列中(及び、特にフレームワーク配列中)の1つ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の鎖抗体からのVHドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の1つ以上により置換することによる、本発明の単一ドメイン抗体を指す。単一ドメイン抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知である。典型的には、ヒト化置換は、結果として得られるヒト化単一ドメイン抗体が、本発明の単一ドメイン抗体の好ましい特性を依然として保持するように選ぶべきである。当業者は、適切なヒト化置換又はヒト化置換の適切な組み合わせを決定及び選択することができる。
第2の態様において、本発明は、異種部分に連結された、本発明の単離単一ドメイン抗体を含む薬物コンジュゲートに関する。
一部の実施形態では、異種部分は、アプタマー、核酸、ポリペプチド、別の単一ドメイン抗体、又は治療用ポリペプチドである。
一部の実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、異種部分にコンジュゲートされる。本明細書中で使用するように、用語「コンジュゲーション」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、化学的コンジュゲーションを意味する。異種部分をポリペプチドにコンジュゲートするための技術は、当技術分野において周知である(例、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985);Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery(Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987);Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications(Pinchera et al. eds., 1985);“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。また、PCT公開WO 89/12624.を参照のこと)。典型的には、核酸分子は、Nヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基をそれぞれ通じて、抗体上のリジン又はシステインに共有結合される。操作されたシステインを使用したコンジュゲーション又は非天然アミノ酸の取り込みの方法が、コンジュゲートの均一性を改善することが報告されている(Axup,J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.;Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al.(2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.)。Junutulaら(2008)は、従来のコンジュゲーション方法と比較し、改善された治療指数を呈することが要求される「THIOMAB」(TDC)と呼ばれるシステインベースの部位特異的コンジュゲーションを開発した。特に、当業者はまた、ポリペプチド操作(例、ポリペプチド上でのアミノ酸欠失、挿入、置換、又は変異を介して)により反応性に作製されたアシルドナーグルタミン含有タグ(例、Gin含有ペプチドタグ又はQタグ)又は内因性グルタミンを用いて操作されたポリペプチドも予想することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミンドナー薬剤(例、反応性アミンを含む、又はそれに結合された小分子)を用いて、共有結合的に架橋し、操作されたFc含有ポリペプチドコンジュゲートの安定で均一な集団を形成することができ、アミンドナー薬剤は、アシルドナーグルタミン含有タグ又は接近可能な/曝露された/反応性の内因性グルタミンを通じてFc含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされている(WO 2012059882)。用語「トランスグルタミナーゼ」は「TGase」又は「TG」と互換的に使用され、ペプチド結合グルタミンのγカルボキサミド基とリジン又は構造的に関連する第一級アミンのεアミノ基、例えばアミノペンチル基など(例、ペプチド結合リジン)の間でのアシル転移反応を通じてタンパク質を架橋し、ε(γグルタミル)リジンイソペプチド結合をもたらすことが可能な酵素を指す。TGアーゼには、とりわけ、細菌トランスグルタミナーゼ(BTG)、例えばECリファレンスEC 2.3.2.13(タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ)を有する酵素などが含まれる。一部の実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、リンカー分子により異種部分にコンジュゲートされる。本明細書中で使用するように、用語「リンカー分子」は、本発明の単一ドメイン抗体に結合された任意の分子を指す。結合は典型的には共有結合的である。一部の実施形態では、リンカー分子は可動性であり、本発明の単一ドメイン抗体の結合と干渉しない。
一部の実施形態では、異種部分が異種ポリペプチドである場合、本発明の単一ドメイン抗体は異種ポリペプチドに融合されて融合タンパク質を形成する。
「融合」又は「キメラ」タンパク質又はポリペプチドは、天然において天然には連結されていない第2のアミノ酸配列に連結された第1のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質中に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチド中に一緒にすることができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、又はポリペプチド領域が所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを作製及び翻訳することにより作製する。
本発明に従い、融合タンパク質は、そのC末端で異種ポリペプチドのN末端に、もしくはそのN末端で異種ポリペプチドのC末端に直接的に又はスペーサーを介して融合されている、本発明に従った少なくとも1つの単離単一ドメイン抗体(sbAb)を含む。本明細書中で使用するように、用語「直接的に」は、単一ドメイン抗体の末端(N末端又はC末端)の(最初又は最後の)アミノ酸が、異種ポリペプチドの末端(N末端又はC末端)で(最初又は最後の)アミノ酸に融合されている。換言すれば、本実施形態では、前記sdAbのC末端の最後のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのN末端の最初のアミノ酸に共有結合により直接的に連結している、又は前記sdAbのN末端の最初のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのC末端の最後のアミノ酸に共有結合により直接的に連結している。本明細書中で使用するように、用語「スペーサー」は、「リンカー」とも呼ばれ、本発明のsdAbを異種ポリペプチドに連結する少なくとも1つのアミノ酸の配列を指す。そのようなスペーサーは、立体障害を防止するために有用でありうる。本発明で開示するリンカーの例は、以下の配列(Gly3−Ser)4、(Gly3−Ser)、Ser−Gly、又は(Ala−Ala−Ala)を有する。
一部の実施形態では、異種部分は、本発明の別の単一ドメイン抗体である。したがって、本発明に従い、薬物コンジュゲートは、このように、本明細書で「一価」薬物コンジュゲートとして言及される唯一の単一ドメイン抗体を含むことができる。本発明に従った2つ以上の単一ドメイン抗体を含むか、又は本質的にそれらからなる薬物コンジュゲートは、本明細書では「多価」ポリペプチドとして言及される。典型的には、多価ポリペプチドは、二重パラトープ抗体、三価抗体、又は四価抗体でありうる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は二重パラトープポリペプチドである。本明細書中で使用するように、用語「二重パラトープ」ポリペプチドは、本明細書中で定義する単一ドメイン抗体及び第2の単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを意味し、これらの2つの単一ドメイン抗体は、1つの抗原の2つの異なるエピトープ(例、アンチトロンビン)に結合することが可能であり、このエピトープは、通常、1つの単一特異性免疫グロブリン(例えば従来の抗体又は単一ドメイン抗体など)により同時に結合されない。二重パラトープポリペプチドは二価抗体とも呼ばれる。
一部の実施形態では、本発明の二重パラトープポリペプチドの2つの単一ドメイン抗体は、直接的に(即ち、リンカーを使用せずに)又はリンカーを介して互いに連結することができる。リンカーは、典型的には、リンカーペプチドであり、本発明に従い、アンチトロンビンのそれらの少なくとも2つの異なるエピトープのへの2つの単一ドメイン抗体の結合を可能にするように選択される。適切なリンカーは、とりわけ、エピトープ及び、具体的には、単一ドメイン抗体が結合するアンチトロンビン上のエピトープ間の距離に依存し、任意に、特定の限定された程度の日常的実験後に、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかになる。また、アンチトロンビンに結合する2つの単一ドメイン抗体は、第3の単一ドメイン抗体を介して互いに連結されうる(2つの単一ドメイン抗体が第3のドメイン抗体に直接的に又は適切なリンカーを介して連結されうる)。そのような第3の単一ドメイン抗体は、例えば、増加した半減期を提供する単一ドメイン抗体でありうる。例えば、後者の単一ドメイン抗体は、(ヒト)血清タンパク質、例えば(ヒト)血清アルブミン又は(ヒト)トランスフェリンなどに結合することが可能である単一ドメイン抗体であってもよい。一部の実施形態では、アンチトロンビンに結合する2つ以上の単一ドメイン抗体は、(直接的に、又は適切なリンカーを介して)直列で連結されており、第3の(単一)単一ドメイン抗体(上に記載するように、半減期が増加しうる)は、これらの2つ以上の前述の単一ドメイン抗体のうちの1つに直接的に、又はリンカーを介して結合される。適切なリンカーを、本発明の特定のポリペプチドに関連して本明細書に記載しており、例えば、限定しないが、アミノ酸配列(このアミノ酸配列は、好ましくは9又はそれ以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも17のアミノ酸、例えば約20〜40のアミノ酸などの長さを有する)を含みうる。しかし、その上限は重要ではないが、例えばそのようなポリペプチドの生物医薬的生産に関する利便性の理由で選択される。リンカー配列は天然配列又は非天然配列であってもよい。治療的な目的のために使用される場合、リンカーは、好ましくは、本発明の抗アンチトロンビンポリペプチドが投与される被験体において非免疫原性である。リンカー配列の1つの有用な群は、WO 96/34103及びWO 94/04678に記載される重鎖抗体のヒンジ領域から由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列(例えばAla−Ala−Alaなど)である。リンカー配列のさらに好ましい例は、(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3、ならびに(gly3ser2)4、(gly3ser)4及びSer−Glyを含む、異なる長さのGly/Serリンカーである。
一部の実施形態では、異種部分は、本発明に従った単一ドメイン抗体である。したがって、融合タンパク質は、上に記載する少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質は二重パラトープ抗体である。典型的には、融合タンパク質は2つの単一ドメイン抗体を含む。例えば、第1の単一ドメイン抗体は、リンカーを介して自然では天然には連結していない別の単一ドメイン抗体に直接的に連結されている。
一部の実施形態では、配列番号29として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−002及びKB−AT−003を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号29として示す配列を有するKB−AT−002/003を含む。
特定の実施形態では、本発明は、上に記載するような単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む二相性抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号30として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−001及びKB−AT−002を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号30として示す配列を有するKB−AT−001/002を含む。
特定の実施形態では、本発明は、上に記載する単離単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む二重パラトープ抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号31として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−001及びKB−AT−003を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号31として示す配列を有するKB−AT−001/003を含む。
特定の実施形態では、本発明は、上に記載する単離単一ドメイン抗体KB−AT−005に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む二重パラトープ抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号32として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列KB−AT−001及びKB−AT−005を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号32として示す配列を有するKB−AT−001/005を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質は三価抗体である。典型的には、融合タンパク質は、2つのリンカーを介して連結された2つの単一ドメイン抗体を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された、本発明に従った2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む三価抗体である。この三価抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号33として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する2つの配列KB−AT−001及び1つのKB−AT−002配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号33として示す配列を有するKB−AT−112を含む。
特定の実施形態では、本発明は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された、本発明に従った2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む三価抗体に関する。この3価抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号34として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する2つの配列KB−AT−001及び1つのKB−AT−003配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号34として示す配列を有するKB−AT−113を含む。
特定の実施形態では、本発明は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体KB−AT−005に連結された、本発明に従った2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む三価抗体に関する。この三価抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号35として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する2つの配列KB−AT−001及び1つのKB−AT−005配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号35として示す配列を有するKB−AT−115を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質は四価抗体である。典型的には、融合タンパク質は、3つのリンカーを介して互いに連結された4つの単一ドメイン抗体を含む。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一ドメイン抗体KB−AT−003に結合された、本発明に従った単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された、本発明に従った2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む四価抗体である。この四価抗体は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号36として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する2つの配列KB−AT−001、1つのKB−AT−002配列、及び1つのKB−AT−003配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号36として示す配列を有するKB−AT−1123を含む。
一部の実施形態では、異種部分はポリペプチドである。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体又は多価抗体は、ポリペプチド、例えばアルブミン、アルブミン結合ペプチド、VWFもしくはその断片、又はC4BP由来ポリペプチドなどに連結される。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、VWF A1ドメインに連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、VWF A1ドメイン配列に連結されたKB−AT−002/003である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号37として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、KB−AT−002の1つの配列、KB−AT−003の1つの配列、及びヒトVWF A1ドメインの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号37として示す配列を有するVWF−A1/KB−AT−002/003を含む。
特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、C4BPから由来するポリペプチドである。
本明細書中で使用するように、用語「C4BP」は、阻害剤として作用する補体系に関与するタンパク質であるC4b結合タンパク質を指す。C4BPは、中心の茎及び7つの分枝α鎖を伴うタコ様構造を有する。ヒト血液中のC4BPの主な形態は、7つの同一のアルファ鎖及び1つの特有のベータ鎖で構成され、それは次に抗凝固剤であるビタミンK依存性プロテインSと結合する。C4BPは、肝臓中で主に合成される、推定血漿濃度200マイクログラム/mLを伴う大きな糖タンパク質(500kDa)である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、C4BP配列と融合された、本発明に従った単離単一ドメイン抗体を含む。典型的には、単一ドメイン抗体KB−AT−002はC4BPに連結される。そのようなタンパク質は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号38として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する1つのKB−AT−002及びヒトC4BPの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号38として示す配列を有するKB−AT−002−C4BPを含む。
一部の実施形態では、配列番号39として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する1つのKB−AT−003及びヒトC4BPの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号39として示す配列を有するKB−AT−003/C4BPを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、マウスFVII変異体に連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、マウスFVII変異体配列に連結されたKB−AT−002/003である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号40として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する1つのKB−AT−002配列、1つのKB−AT−003配列、及びマウスFVIIの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号40として示す配列を有するmFVII−AT−0203を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、FVIII変異体に連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、FVIII変異体配列に連結されたKB−AT−002/003である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する:
一部の実施形態では、配列番号41として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、KB−AT−002の1つの配列、KB−AT−003の1つの配列、及びヒトFVIIIの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号42として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する2つの配列KB−AT−001及び1つのKB−AT−004配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号43として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する1つの配列KB−AT−006及び2つのKB−AT−004配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号44として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する1つの配列KB−AT−002及び2つのKB−AT−004配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号45として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−004の2つの配列及びKB−AT−003の1つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号46として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−002の1つの配列及びKB−AT−004の1つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、配列番号47として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−004の2つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号47として示す配列を有するKB−AT−004004を含む。
一部の実施形態では、配列番号48として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−002の1つの配列及びKB−AT−006の1つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号48として示す配列を有するKB−AT−002006を含む。
一部の実施形態では、配列番号49として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−001の2つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号49として示す配列を有するKB−AT−001001を含む。
一部の実施形態では、配列番号50として示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有するKB−AT−006の2つの配列、KB−AT−002の1つの配列、及びKB−AT−003の1つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号50として示す配列を有するKB−AT−6623を含む。
一部の実施形態では、異種部分は循環タンパク質である。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体又は多価抗体は、循環タンパク質に連結される。
「循環タンパク質」により、身体器官の細胞により合成され、血流内で輸送されるタンパク質を意味する。循環タンパク質の例は、血液の凝血因子、タンパク質、及びホルモンである。
一部の実施形態では、循環タンパク質は治療用タンパク質、即ち、被験体の処置のために使用することができるタンパク質である。このように、一部の実施形態では、異種部分は、特に短い半減期を有し、それを必要とする患者に反復投与をもたらす治療用ポリペプチドである。そのような治療用ポリペプチドは、例えば、インスリン、グルカゴン、オステオプロテゲリン(OPG)、アンジオポエチン2(ANGPT2)、フリン、成長因子、又は他のペプチドホルモンでありうる。
本明細書中で使用するように、用語「半減期」は、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、被験体に投与される量の半分が動物における循環及び/又は他の組織から除去されるために要求される時間により表してもよい。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、曲線は通常、迅速なα相及びより長いβ相を伴う二相性である。
特定の実施形態では、循環タンパク質は凝固因子(血液の凝血因子とも呼ばれる)である。
本明細書中で使用するように、用語「凝固因子」は、被験体における出血エピソードの持続を防止又は減少させる、天然に生じる又は組み換え産生された分子又はその類似体を指す。換言すれば、それは、凝固促進活性を有する、即ち、促進する分子が、フィブリノゲンを不溶性フィブリンの網目に変換し、血液を凝血又は凝固させることに関与することを意味する。凝固因子には、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)、第VIII因子、ビタミンK依存性凝血タンパク質(第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、及びプロトロンビンを含む)、及び凝固因子Vが含まれる。本発明の凝固因子は、野生型凝固因子の変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的又は非保存的な挿入、欠失、及び置換を含み、そこでは、そのような変化によって、それぞれの凝固因子の生物学的活性を付与する活性部位又は活性ドメインは実質的に変化しない。好ましくは、凝固因子は、VWF、FVII、FVIII、及びFXからなる群より選択する。
第3の態様では、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含むベクターに関する。
典型的には、単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートは、ベクターに関連して送達されうる。本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートは、適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなどに含まれる。そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含むベクターに関する。典型的には、ベクターはウイルスベクターであり、それはアデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、又は感染性ウイルスである。一部の実施形態では、ベクターはAAVベクターである。本明細書中で使用するように、用語「AAVベクター」は、アデノ随伴ウイルス血清型から由来するベクターを意味し、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、及びそれらの変異形態を含むが、これらに限定しない。AAVベクターは、全部又は一部が欠失したAAV野生型遺伝子の1つ以上、好ましくはrep遺伝子及び/又はcap遺伝子を有するが、機能的な隣接ITR配列を保持することができる。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組み込み、多量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種及び細胞型に感染させ、特別な細胞系においてパッケージするそれらの能力のために、遺伝子送達ベクターとして選ばれうる。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入して、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、gag遺伝子、pol遺伝子、及び/又はenv遺伝子を含むが、LTR及び/又はパッケージング成分を伴わないパッケージング細胞系を構築する。レトロウイルスLTR及びパッケージング配列と一緒にcDNAを含む組換えプラスミドを(例えば、リン酸カルシウム沈殿によって)この細胞株に導入する場合、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子中にパッケージングされ、次に培養培地中に分泌される。組換えレトロウイルスを含む培地を次に収集し、任意に濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは広範囲の細胞型に感染することができる。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol、及びenvに加えて、調節機能又は構造機能を伴う他の遺伝子を含む。より高い複雑性によって、潜伏感染の経過などのように、ウイルスがそのライフサイクルを調節することが可能になる。レンチウイルスの一部の例には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV1、HIV2)及びシミアン免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。レンチウイルスベクターは、HIV毒性遺伝子を複数回弱毒化することにより生成されており、例えば遺伝子env、vif、vpr、vpu、及びnefが欠失されており、ベクターを生物学的に安全にする。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第6,013,516号及び第5,994,136号を参照のこと。これらの両方を、参照により本明細書中に組み入れる。一般的に、ベクターはプラスミドベース又はウイルスベースであり、宿主細胞中への核酸の選択及び移入のために、外来核酸を組み入れるための必須配列を保持するように設定される。目的のベクターのgag遺伝子、pol遺伝子、及びenv遺伝子も当技術分野で公知である。このように、関連遺伝子を選択されたベクター中にクローニングし、次に目的の標的細胞を形質転換するために使用する。適切な宿主細胞が、パッケージング機能、即ち、gag、pol、及びenv、ならびにrev及びtatを保有する2つ以上のベクターでトランスフェクトされた非分裂細胞に感染することが可能である組換えレンチウイルスが、米国特許第5,994,136号に記載されており、参照により本明細書中に組み入れる。これは、ウイルスgag遺伝子及びpol遺伝子をコードする核酸を提供することができる第1のベクター、ならびにパッケージング細胞を産生するためにウイルスenvをコードする核酸を提供することができる別のベクターを記載する。そのパッケージング細胞中に異種遺伝子を提供するベクターを導入することによって、目的の外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出する産生細胞がもたらされる。envは、好ましくは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。典型的には、本発明の核酸分子又はベクターは、「制御配列」を含み、これは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位(「IRES」))、エンハンサーなどを集合的に指し、これらは、レシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適当な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳されることが可能である限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。別の核酸配列は、本明細書において、その通常の意味において、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために使用される「プロモーター」配列であり、調節配列は、RNAポリメラーゼに結合して、下流(3’方向)コード配列の転写を開始することが可能である遺伝子から由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」(プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される)、「抑制性プロモーター」(プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される)、及び「構成的プロモーター」が含まれる。
第4の態様では、本発明は、治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法に関し、前記治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、アンチトロンビン又は、本発明に従ったベクターに挿入されたもしくは挿入されていない薬物コンジュゲートに対する少なくとも1つのsdAbを加える工程を含む。
典型的には、本発明の単一ドメイン抗体又は多価抗体は、循環タンパク質の半減期を延長又は増加させるために適切である。
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体をフォン・ヴィレブランド(VWF)因子に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をVWF−A1ドメインに融合させる。そのような構築物は、上に記載するVWF−A1/KB−AT−002/003に対応する。
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体を第VII因子(FVII)に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をFVIIに融合させる。そのような構築物は、上に記載するFVII−AT−0203に対応する。
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体を第VIII因子(FVIII)に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をFVIIIに融合させる。このような構築物は、上に記載するFVIII−AT−0203に対応する。
特定の実施形態では、薬物コンジュゲートは、ATに対して向けられ、被験体に投与される前記sdAbに連結されていない対応するポリペプチドと比較して、低下したクリアランス速度、このように、被験体に投与された場合の延長された半減期を示す。
特定の実施形態では、本発明は、ベクターに挿入された又は挿入されていない本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの半減期を延長又は延長させる方法に関する。
さらなる実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体の半減期は、C4BPにより延ばすことができる。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体をC4BPに融合させる。そのような構築物を上に記載している(融合タンパク質KB−AT−002/C4BP及びKB−AT−003/C4BPを参照のこと)。
第5の態様では、本発明は、それを必要とする被検体の出血障害を防止又は処置する方法に関し、ベクターに挿入された又は挿入されていない本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。
本明細書中で使用するように、用語「処置する」又は「処置」は、疾患に罹患するリスクがある、又は疾患に罹患している疑いのある被験者、ならびに病気である、又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいると診断された被験体の処置を含む、予防的又は防止的処置ならびに治癒又は疾患修飾処置の両方を指し、及び臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害又は再発性障害の1つ以上の症状を防止、治癒、その発症の遅延、重症度の低下、もしくは寛解させるために、又はそのような処置の非存在下で予想される生存を超えて被験体の生存を延長させるために、医学的障害を有する、又は最終的に障害を獲得しうる被験体に投与してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば治療の間に使用される投薬パターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「誘導レジメン」又は「誘導期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に高レベルの薬物を被験体に提供することである。誘導レジメンは、「負荷レジメン」を(一部又は全部で)使用してもよく、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持療法レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での患者の維持のために、例えば、被験体を長期間(月又は年)にわたり緩解に保つために使用される治療レジメン(又は治療レジメンの部分)を指す。維持レジメンは、連続治療(例、例えば毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与する)又は間欠的治療(例、断続的処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の予め定められた基準[例、疼痛、疾患の徴候など]の達成時での処置)を用いうる。
本明細書中で使用するように、用語「被験体」は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などを指す。特に、本発明において、被験体は、出血性障害に罹患しているか、又は罹患しやすいヒトである。
本発明の融合タンパク質の投与により処置されうる出血障害は、血友病ならびにフィブリノゲン、プロトロンビン、第V因子、第VII因子、FIX、又は第X因子の欠損又は構造異常を含むが、これらに限定しない。
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質の投与により処置されうる出血障害は、血友病A又は血友病Bである。
「治療的に効果的な量」とは、任意の医療処置に適用可能な合理的な利益/リスク比での出血障害の処置のための方法における使用のための、防止するために十分な量のポリペプチド(又はポリペプチドを含むベクター)を意味する。本発明の化合物及び組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療的に効果的な用量レベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康、性別、及び食事;用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度;処置の持続期間;用いられる特定のポリペプチドと組み合わせで又はそれと同時に使用される薬物;及び医学的技術分野において周知の同様の因子を含む種々の因子に依存する。例えば、所望の治療的効果を達成するために、及び所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために要求されるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始することは、当業者の技術内で周知である。しかし、産物の1日投与量は、0.01〜1,000mg/成人/日の広範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される患者への投与量の症候性調整のために、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250、及び500mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約0.01mg〜約500mgの活性成分を、好ましくは1mg〜約100mgの活性成分を含む。効果的な量の薬物は、普通は、0.0002mg/kg〜約100mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてヘパリン誘導性出血を防止又は処置するための方法に関し、本発明に従った単一ドメイン抗体、薬物コンジュゲート、又は単一ドメイン抗体もしくは薬物コンジュゲートを含むベクターの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。
ヘパリンは広く使用されている注射可能な血液溶剤である。これは、深部静脈血栓症及び肺塞栓症を処置及び防止するために使用される。ヘパリンは変動する鎖サイズのポリマーである。医薬品としての未分画ヘパリン(UFH)は、低分子量を伴う分子の画分を隔離するために分画されていないヘパリンである。対照的に、低分子量ヘパリン(LMWH)は、その薬力学をより予測可能にする目的のための分画を経ている。用語「ヘパリン誘導性出血」は、治療的に投与された場合でのヘパリンの主要な副作用である出血を指す。
第6の態様では、本発明は、ベクターに挿入されている又は挿入されていない、本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
本発明の単一ドメイン抗体及び薬物コンジュゲート(又は単一ドメイン抗体及び薬物コンジュゲートを含むベクター)は、医薬組成物を形成するために、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、任意に徐放性マトリックス(例えば生分解性ポリマーなど)と組み合わせてもよい。本明細書中で使用するように、用語「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与した場合、有害な、アレルギー性の、又は他の厄介な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の型の補助製剤を指す。
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分との組み合わせで、従来の医薬的支持体との混合物として、動物及びヒトに単位投与形態で投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態(例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液など)、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態及び直腸投与形態を含む。
好ましくは、医薬組成物は、注射することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液(リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物)、又は乾燥、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合に依存して、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に注射可能な溶液の構成を許す。
注射可能な使用のために適切な医薬的形態は、無菌水溶液又は分散剤;ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び無菌の注射可能な溶液又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物(例えば細菌及び真菌など)の汚染作用に対して保存されなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の化合物を含む溶液は、界面活性剤(例えばヒドロキシプロピルセルロースなど)と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲート(又は単一ドメイン抗体もしくは薬物コンジュゲートを含むベクター)は、中性又は塩の形態の組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸、あるいは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから由来しうる。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適した流動性は、例えば、コーティング(例えばレシチンなど)の使用により、要求される粒子サイズの維持により(分散剤の場合において)、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど)によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤(例えば、糖又は塩化ナトリウム)を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物(例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン)中での使用によりもたらすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙する他の成分のいくつかを伴う適当な溶媒中に、要求される量で活性ポリペプチドを取り込ませることにより調製し、必要な場合、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分+先に無菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
製剤化時、溶液は、投与製剤と適合する様式で治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態(例えば上に記載する注射可能な溶液の型など)で容易に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、1投与量を、1mlの等張性NaCl溶液中に溶解し、1000mlの皮下注入液に添加する、又は提案された注入部位に注射することができうる。投与量における一部の変動が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与に責任のある人は、任意の事象において、個々の被験体のための適当な用量を決定する。
ポリペプチド(又はポリペプチドを含むベクター)を、約0.0001〜1.0ミリグラム、又は約0.001〜0.1ミリグラム、又は約0.1〜1.0、又はさらには約100ミリグラム/用量を含むように治療用混合物内で製剤化してもよい。複数用量を投与することもできる。本発明をさらに、以下の図面及び実施例により例証する。
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例:実施例1:ヒト及びマウスアンチトロンビンへの抗アンチトロンビンsdAbの結合。
アンチトロンビンを認識するsdAb(KB−AT−001、−002、−003、−004、−005、−006、及び−007)を、ハーフウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio−One、Les Ulis、France)中の50マイクロリットルの容量において4℃で16時間にわたり10mM NaHCO3、50mM Na2CO3(pH9.5)中で固定化した(5マイクログラム/ml)。0.1%Tween−20(TBS−T)を添加したTris緩衝化生理食塩水(pH 7.6)を使用してウェルを100マイクロリットル/ウェルで3回洗浄した後、ウェルを、5%スキムミルクを添加した100マイクロリットル/ウェルのTBS−Tで、37℃で30分間にわたりブロッキングした。ウェルを上に記載するように洗浄し、その後、異なる濃度の精製ヒトアンチトロンビン又はマウスアンチトロンビン(5%スキムミルクを添加したトリス緩衝生理食塩水(pH7.6)中に0〜5マイクロモルに希釈;50マイクロリットル/ウェル)を、固定化したsdAbの各々に加えて、2時間にわたりインキュベートした。ウェルを次に、TBS−Tを用いて100マイクロリットル/ウェルで3回洗浄した。結合したアンチトロンビンを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルウサギ抗アンチトロンビン抗体(Diagnostica Stago、Asniers−sur−Seine、France;希釈1/100)を用いて、37℃で1時間にわたり50マイクロリットル/ウェルでプローブした。ウェルを次に、TBS−Tを使用して100マイクロリットル/ウェルで3回洗浄した。残留ペルオキシダーゼ活性を、3,3’,5,5’テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。OD値をアンチトロンビン濃度に対してプロットした(図1)。
最大OD値における差が30%未満である場合、sdAbはヒト及びマウスアンチトロンビンを同様に認識すると考えられた。この基準を使用して、sdAbs KB−AT−001、−002、−003、及び004は、ヒト及びマウスアンチトロンビンへの同様の結合を呈した。KB−AT−006及びKB−AT−007は、マウスアンチトロンビンと比較して、ヒトアンチトロンビンにより効率的に結合したのに対し、KB−AT−005は、ヒトアンチトロンビンと比較して、マウスアンチトロンビンへの結合においてより効率的であった。
見掛けの解離定数(KD、app)を決定するために、ヒトアンチトロンビンに対するsdAb KB−AT−001、KB−AT−002、KB−AT−003、及びKB−AT−006の間での相互作用を、Octet−QK装置を使用した生体層−干渉法分析を介してさらに分析した。この目的のために、sdAb KB−AT−001、KB−AT−002、KB−AT−003、及びKB−AT−006を、EDC/NHS活性化アミン反応性バイオセンサー(Fortebio、Menlo Park、CA、USA)に共役するために、200マイクログラム/mlの濃度に0.1M Mes(pH5.0)中に希釈した。センサーを0.2mlの0.1M MES、pH5.0中で300秒間にわたり再水和させた。センサーを次に、0.1mlの0.2M EDC/0.095M NHS混合物とのインキュベーションを介して300秒間にわたり活性化し、その後、0.1mlのsdAb溶液と600秒間にわたりインキュベートした。非占有アミン反応部位を1Mエタノールアミンと180秒間にわたりインキュベートすることによりクエンチし、センサーを、0.1%Tween−20(PBS−T)を添加したリン酸緩衝食塩水との300秒間にわたるインキュベーションを介して、安定したベースラインレベルに到達させた。sdAb被覆センサーを次に、種々の濃度の精製アンチトロンビン(PBS−T中0、12.5、25、及び50μg/ml)を含むウェルに移し、アンチトロンビンと固定化sdAbとの会合を視覚化するために600秒間にわたりインキュベートした。この会合段階に続き、センサーをPBS−Tを含むウェルに移し、900秒間にわたりインキュベートし、アンチトロンビン−sdAb複合体の解離を可能にした。得られたデータは、その後、Octet−QKデータ解析ソフトウェア(Origin vs 4)を使用して分析し、KD、appを推定した。この分析によって、以下の値が明らかになった:KB−AT−001、KB−AT−002、KB−AT−003、及びKB−AT−006について、それぞれKD、app=14nM、4nM、0.4nM、及び22nM。
実施例2:これらのタンパク質の半減期を延長する抗アンチトロンビンsdAbへのタンパク質の融合。
バイパラトープsdAb変異体KB−AT−002/003に融合した位置1362(全長VWFに対応する番号付け)にKからAの変異を含むヒトフォン・ヴィレブランド因子(VWF)−A1ドメインをコードする構築物を確立したが、これはsdAbs KB−AT−002とKB−AT−003(配列番号38)を組み合わせている。変異は、単離されたA1ドメインが血小板受容体糖タンパク質Ibαと相互作用しないことを確実にするために導入された。結果として得られたタンパク質をVWF−A1/KB−AT−002/003と命名した。対照として、VWF A1/p.K1362Aを非特異的sdAbに融合させ、これはマウス血漿タンパク質と反応しない(VWF−A1/KB−UT−01)。精製VWF−A1/KB−AT−002/003又はVWF−A1/KB−UT−01を、野生型C57B/6マウスに静脈内(10mg/kg)投与した。注射後の異なる時間点(5分、15分、30分、1時間、3時間、6時間、及び24時間)で、血液サンプルを、イソフルラン麻酔したマウスからの眼窩後穿刺により得て、血漿を遠心分離(1500g、22℃で20分間)により調製した。残留血漿濃度は、捕捉抗体としてのマウスモノクローナル抗体mAb712及びプロービング抗体としてのペルオキシダーゼ標識マウスモノクローナル抗体mAb724を用いて、ヒトVWF A1ドメインを特異的に測定する自家製ELISAを使用して測定した。
注射後5分での回復は、VWF−A1/KB−UT−01と比較してVWF−A1/KB−AT−002/003について有意に高かった(92.7±17.7%対47.1±6.7%;等しいSDを伴う対応のないt検定においてp=0.012)。本発明者らは次に、注射後の時間に対して残留タンパク質濃度をプロットし(図2)、注射後の全ての時間点での残留タンパク質レベルにおける顕著な差を明らかにした。両方のタンパク質は、双方向指数関数的な様式において循環から排除されたように見えた。双指数関数的減衰についてのモデルを使用して見掛けの初期半減期及び終末半減期を算出した。初期半減期(T1/2α)を、VWF−A1/KB−AT−002/003及びVWF−A1/KB−UT−01のそれぞれについて0.30時間(95%信頼区間(CI)0.20〜0.60時間)及び0.03時間(95%CI 0.02〜0.05時間)と算出した。終末半減期(T1/2β)を、VWF−A1/KB−AT−002/003及びVWF−A1/KB−UT−01のそれぞれについて38時間(95%CI 21〜178時間)及び0.7時間(95%CI 0.5〜1.0時間)と算出した。これによって、アンチトロンビンを認識するsdAbへの比較的短い半減期を伴うタンパク質の融合により、そのようなタンパク質の循環中での半減期がかなり増加することが実証される。
実施例3:ヘパリンの非存在におけるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、一価sdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃でインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質S−2238の存在においてトロンビン(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図3にプロットしているのは、アンチトロンビンの非存在又は存在におけるトロンビンについての、ならびにトロンビン、アンチトロンビン、及びsdAbを含む混合物についての基質加水分解の速度(デルタOD/分)である。これらのデータによって、アンチトロンビンに対するsdAbの各々により、アンチトロンビンの存在においてトロンビン活性を増加させることができることが示され、これは、これらの条件下でトロンビンに対するアンチトロンビンの阻害活性に干渉するsdAbと適合性がある。sdAbがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表1にまとめている。
表1:ヘパリンの非存在における一価sdAbによるアンチトロンビンの中和:
表1:ヘパリンの非存在における一価sdAbによるアンチトロンビンの中和:
このように、テストした全ての一価sdAbによって、トロンビンに対するアンチトロンビン活性を部分的に中和することができた(図3及び表1)。しかし、それらのいずれでも、アンチトロンビン活性を完全に遮断することはできなかった。
実施例4:ヘパリンの存在における一価sdAbによるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和の欠如。
精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、一価sdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃で未分画ヘパリン(1U/ml)とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質S−2238の存在においてトロンビン(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図4にプロットしているのは、アンチトロンビン&ヘパリンの非存在又は存在におけるトロンビンについての、ならびにトロンビン、アンチトロンビン、ヘパリン、及びsdAbを含む混合物についての基質加水分解の速度(デルタOD/分)である。これらのデータは、アンチトロンビンに対するsdAbのいずれも、アンチトロンビン&ヘパリンの存在においてトロンビン活性を増加させることができないことを示す。sdAbがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージは5%未満であった。これによって、一価sdAbが、未分画ヘパリンの存在においてトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害に干渉する能力を欠くことが実証される。
実施例5:ヘパリンの存在における一価sdAbによる第Xa因子のアンチトロンビン媒介性阻害の中和の欠如。
精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、一価sdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃で低分子量ヘパリン(LMW−ヘパリン;Lovenox;1U/ml)とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質S−2765の存在において第Xa因子(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図5にプロットしているのは、アンチトロンビン&LMWヘパリンの非存在又は存在における第Xa因子についての、ならびに第Xa因子、アンチトロンビン、ヘパリン、及びsdAbを含む混合物についての基質加水分解の速度(デルタOD/分)である。これらのデータは、アンチトロンビンに対するsdAbのいずれも、アンチトロンビン&LMWヘパリンの存在において第Xa因子活性を実質的に増加させることができないことを示す。sdAbがアンチトロンビン媒介性第Xa因子阻害を中和するパーセンテージは15%未満であった。これによって、一価sdAbが、LMWヘパリンの存在において第Xa因子のアンチトロンビン媒介性阻害に弱く干渉することが実証される。
実施例6:ヘパリンの存在におけるバイパラトープsdAbによるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
アンチトロンビンに対する2つの異なるsdAbからなるsdAb組み合わせをコードする構築物を確立した(バイパラトープsdAb):KB−AT−001/002(配列番号30)、KB−AT−001/003(配列番号31)、KB−AT−001/005(配列番号32)、及びKB−AT−002/003(配列番号29)。精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、バイパラトープsdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃で未分画ヘパリン(1U/ml)とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質S−2238の存在においてトロンビン(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図6にプロットしているのは、アンチトロンビン&ヘパリンの非存在におけるトロンビン活性と比較した、残留トロンビン活性のパーセンテージである。アンチトロンビン&ヘパリンのみの存在における残留トロンビン活性は5%未満であったのに対し、有意に高いトロンビン活性がバイパラトープsdAbの存在において測定された。バイパラトープsdAbがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージは表2に要約される。これらのデータによって、異なるsdAbを組み合わせにより、未分画ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表2:ヘパリンの存在におけるバイパラトープsdAbによるアンチトロンビンの中和:
表2:ヘパリンの存在におけるバイパラトープsdAbによるアンチトロンビンの中和:
実施例7:バイパラトープsdAbによるヘパリンの存在における第Xa因子のアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
バイパラトープsdAbも、LMW−ヘパリンの存在において第Xa因子に対するアンチトロンビン活性を中和するそれらの能力についてテストした。精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、バイパラトープsdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃で低分子量(LMW−ヘパリン;Lovenox;1U/ml)とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解性基質S−2765の存在において第Xa因子(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図7にプロットしているのは、アンチトロンビン&LMW−ヘパリンの非存在における第Xa因子活性と比較した、残留第Xa因子活性のパーセンテージである。アンチトロンビン&LMW−ヘパリンのみの存在における残留第Xa因子活性は5%未満であったのに対し、有意に高い第Xa因子活性がバイパラトープsdAbの存在において測定された。バイパラトープsdAbがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表3にまとめている。これらのデータによって、異なるsdAbを組み合わせることにより、LMW−ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表3:LMW−ヘパリンの存在におけるバイパラトープsdAbによるアンチトロンビンの中和:
表3:LMW−ヘパリンの存在におけるバイパラトープsdAbによるアンチトロンビンの中和:
実施例8:血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおけるバイパラトープsdAbの効果。
バイパラトープsdAbを、第VIII因子(FVIII)欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるそれらの能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたFluoroscan Ascent蛍光光度計(Thermolabsystems OY、Helsink、Finland)において、Hemkerら(pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253)により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水(対照)、精製FVIII(0.025、0.1、1U/ml Kogenate(登録商標)FS、Bayer HealthCare、Puteaux、France)、又はバイパラトープsdAb(10マイクロモル)を添加した80μlの血漿を、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。TF(組換え脂質化ヒト組織因子、Innovin(登録商標)、Dade Behringから得た)及びリン脂質(PL)小胞を含む20マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、1pMのTF及び4マイクロモルのPL小胞の最終濃度を得た。PL小胞を、L−α−ホスファチジル−L−セリン(PS)L−α−フォスファチジルエタノールアミン(PE)及びL−α−フォスファチジルコリン(PC)(Avanti Polarlipids、Albaster、Alabama、USA)からPC:PE:PS=3:1:1の比率で調製し、公称100nm直径であった。
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びCaCl2を含む20マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質I−1140(Z−Gly−Gly−Arg−AMC)はBachem AG(Bubendorf、スイス)からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して37℃で60分間にわたりモニターし、Thrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope B.V.、Maastricht、オランダ)を使用して分析した。4つのウェルが各々の実験のために必要であった(血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための2つのウェル及び較正のための2つのウェル)。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル(ETP)、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、及びトロンビン検出についての遅延時間を決定した。
図8には、トロンビン生成曲線の例を示している。図8Aには、FVIII欠損血漿及び異なる濃度のFVIII(2.5%、10%、及び100%)を用いてスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図8Bには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−001/002(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図8Cには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−001/003(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図8Dには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−001/005(10マイクロモル)をスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図8Eには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−002/003(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。トロンビン生成パラメータを表4にまとめる。これらのトロンビン生成曲線は、sdAbの組み合せKB−AT−001/002、KB−AT−001/003、及びKB−AT−001/005によって、FVIII欠損血漿中でのトロンビン生成を限られた範囲でのみ刺激し、FVIIIの2.5%未満に相当するトロンビン生成レベルに達することを示す。対照的に、組み合わせKB−AT−002/003は、トロンビン生成量においてずっとより効率的である(100%FVIIIと比較して1.7倍)。それにもかかわらず、トロンビン生成が開始する前の遅延時間は、100%FVIIIの存在と比較して、依然として有意に遅延している(表4を参照のこと)。
表4:バイパラトープsdAbについてのトロンビン生成パラメータ:
表4:バイパラトープsdAbについてのトロンビン生成パラメータ:
実施例9:多価sdAbによるヘパリンの存在におけるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
アンチトロンビンに対する2つ又は3つの異なるsdAbからなるsdAbの組み合わせをコードする構築物を確立した。それにおいて、sdAbの少なくとも1つが二重に存在した:(多価sdAb):KB−AT−001/001/002(配列番号33、KB−AT−112として言及する)、KB−AT−001/001/003(配列番号34、KB−AT−113)、KB−AT−001/001/005(配列番号35;KB−AT−115)、及びKB−AT−001/001/002/003(配列番号36;KB−AT−1123)。
精製されたヒトアンチトロンビン(5nM)を、TBSC緩衝液(50mM CaCl2、0.1%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、0.1% PEG8000、pH 7.4を添加したトリス緩衝生理食塩水)中で、多価sdAb(100nM)の非存在又は存在において15分間にわたり37℃で未分画ヘパリン(1U/ml)とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解性基質S−2238の存在においてトロンビン(0.5nM)に加えて、加水分解を波長405nmで光学密度(OD)を測定することにより20分間にわたりモニターした。図9にプロットしているのは、アンチトロンビン&ヘパリンの非存在におけるトロンビン活性と比較した、残留トロンビン活性のパーセンテージである。アンチトロンビン&ヘパリンのみの存在における残留トロンビン活性は5%未満であったのに対し、有意に高いトロンビン活性が多価sdAbの存在において測定された。多価sdAbがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表5にまとめている。これらのデータによって、異なるsdAbを組み合わせることにより、未分画ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表5:ヘパリンの存在における多価sdAbによるアンチトロンビンの中和。
表5:ヘパリンの存在における多価sdAbによるアンチトロンビンの中和。
実施例10:血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおける多価sdAbの効果。
多価sdAbを、第VIII因子(FVIII)欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるそれらの能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたFluoroscan Ascent蛍光光度計(Thermolabsystems OY、Helsink、Finland)において、Hemkerら(pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253)により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水(対照)、精製FVIII(0.025、0.1、1U/ml Kogenate(登録商標)FS、Bayer HealthCare、Puteaux、France)、又は多価sdAb(10マイクロモル)を添加した80μlの血漿を、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。TF(組換え脂質化ヒト組織因子、Innovin(登録商標)、Dade Behringから得た)及びリン脂質(PL)小胞を含む20マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、1pMのTF及び4マイクロモルのPL小胞の最終濃度を得た。PL小胞を、L−α−ホスファチジル−L−セリン(PS)L−α−フォスファチジルエタノールアミン(PE)及びL−α−フォスファチジルコリン(PC)(Avanti Polarlipids、Albaster、Alabama、USA)からPC:PE:PS=3:1:1の比率で調製し、公称100nm直径であった。
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びCaCl2を含む20マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質I−1140(Z−Gly−Gly−Arg−AMC)はBachem AG(Bubendorf、スイス)からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して37℃で60分間にわたりモニターし、Thrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope B.V.、Maastricht、オランダ)を使用して分析した。4つのウェルが各々の実験のために必要であった(血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための2つのウェル及び較正のための2つのウェル)。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル(ETP)、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、トロンビン検出についての遅延時間、及びトロンビンピークまでの時間を決定した。
図10には、トロンビン生成曲線の例を示している。図10Aには、FVIII欠損血漿及び異なる濃度のFVIII(2.5%、10%、及び100%)を用いてスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図10Bには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−112(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図10Cには、FVIII欠損血漿、100%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−113(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図10Dには、FVIII欠損血漿、2.5%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−115(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図10Eには、FVIII欠損血漿、100%FVIIIでスパイクしたFVIII欠損血漿、及びKB−AT−1123(10マイクロモル)でスパイクしたFVIII欠損血漿でのトロンビン生成を示す。トロンビン生成パラメータを表6にまとめる。これらのトロンビン生成曲線は、sdAbの組み合せKB−AT−112及びKB−AT−115によって、FVIII欠損血漿中でのトロンビン生成を限られた範囲でのみ刺激し、FVIIIの2.5%未満に相当するトロンビン生成レベルに達することを示す。組み合せKB−AT−113は、その存在により、10%FVIIIの存在と比較してより多くのトロンビン生成がもたらされるため、より効率的である。それにもかかわらず、100%FVIIIと比較してより少ないトロンビンが生成される。対照的に、組み合わせKB−AT−1123は、トロンビン生成量においてずっとより効率的である(100%FVIIIと比較して1.4倍)。さらに、トロンビン生成が開始されるまでの遅延時間は、100%FVIIIの存在と比較して有意に短い(表6を参照のこと)。これらのデータは、sdAbの異なる組み合せの全てが、FVIII欠損血漿中のトロンビン生成を異なる程度にまで調節すること、ならびに、特定の組み合わせ(この場合、KB−AT−1123)だけが、より多くのトロンビン産生することにより、及びより急速なトロンビン形成の開始により、このトロンビン生成テストにおいてFVIIIをしのぐことができることを示す。
表6:多価sdAbについてのトロンビン生成パラメータ。
表6:多価sdAbについてのトロンビン生成パラメータ。
実施例11:血友病マウスを使用した尾静脈横切開アッセイにおける失血に対するバイパラトープsdAb KB−AT−002/003の効果。
8〜12週齢の血友病マウスに、静脈内尾注射を介して賦形剤(生理食塩水)又はsdAb KB−AT−002/003(10mg/kg)を与えた。注射後10分に、イソフルラン麻酔したマウスの側静脈を0.7mmの深さで切断し、そこでは尾の直径は2.3mmであった。横切開した尾を、温かい生理食塩水で満たした10mlチューブに横切開後直ちに浸した。血液を37℃で30分間にわたり収集した。30分後、血液及び生理食塩水の混合物を1500gで遠心した。赤血球ペレットを次に、H2O中で溶解し、416nmでの吸光度を読み取ることによりヘモグロビンの量を得た。上に記載するようにヘモグロビンを抽出するために、H2O中の一定量(20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、80マイクロリットル、及び100マイクロリットル)のマウス血液を溶解することにより得られた標準曲線から各々のサンプル中の失われた血液の容量を算出した。賦形剤及びKB−AT−002/003処置マウスでの失血を図11に示す。KB−AT−002/003の注入によって、血友病マウスにおける失血の低下がもたらされる。失血は、KB−AT−002/003(10mg/kg)を受けたマウスについて334±133マイクロリットル(平均値±SE;n=4)及び賦形剤を受けたマウスについて755±90マイクロリットル(n=7)であった。この差は、等しいSDを伴う対応のないt検定において分析した場合に統計的に有意であった(p=0.0243)。これらのデータは、KB−AT−002/003によるアンチトロンビンの中和によって、血友病マウスにおいて少なくとも部分的に止血が回復することを示す。
実施例12:七量体sdAb−C4BP融合タンパク質のインビボ発現によって、ヘパリンの過剰投与により誘導される出血傾向が中和される。
C4BPの57アミノ酸ペプチドモチーフに融合されたKB−AT−003をコードする構築物を確立したが、これによってタンパク質のヘプタマー化を可能になる(配列番号40;KB−AT−003/C4BPとして言及する)。KB−AT−003/C4BPをコードするcDNAをpLIVE−プラスミド(Mirus Bio、Madison、WI、USA)中にクローニングした。空のpLIVE−プラスミドを陰性対照として使用した。プラスミド(100マイクログラム/マウス)を、流体力学的遺伝子導入を介して野生型C57B6マウス中に注射した:プラスミドを、動物の体重の10%に相当する容量(即ち、20グラムのマウスについては2ml)で0.9%生理食塩水中に希釈する。この溶液を5秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入の4日後、マウスに、出血を誘導するのに十分な用量の未分画ヘパリン(2000U/kg)の単回皮下注射を与えた。ヘパリンの注射後15分に、尾の末端3mmをケタミン/キシラジン麻酔したマウスから切断した。切断した尾を、生理食塩水(37℃)で満たした50mlのチューブに横切開直後に浸し、出血の停止までの時間を、10分間の観察期間の間にモニターした。各々のマウスについての出血の停止までの時間を図14に示す。出血時間は、KB−AT−003/C4BPをコードするプラスミドを受けたマウスと比較して、対照の空のpLIVE−プラスミドを与えたマウスにおいて有意により長かった(pLIVE−empty及びpLIVE−KB−AT−003/C4BPについてそれぞれ8.6±3.6分対4.1±2.7分;平均値±SD;等しいSDを伴う対応のないt検定においてp=0.02)。実際に、出血は、対照マウス6匹中5匹において10分間の観察期間の間に止まらず、KB−AT−003/C4BPを発現する8匹中7匹で5分以内に出血が止まった。
実施例13:異なる種の血漿中に存在するアンチトロンビンへのsdAbの結合
sdAb KB−AT−001、−002、−003、−004、−005、−006、及び007を、ハーフウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio−One、Les Ulis、France)において10mM NaHCO3、50mM Na2CO3(pH9.5)中の50μlの容量中で、4℃で16時間にわたり培養した。陽性対照として、ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体(MATIII−EIAキット、Affinity Biologicals、Ancaster Canada)も同様の様式において固定化した。陰性対照として、抗フォン・ヴィレブランドsdAb KB−VWF−006を固定化した。ウェルを、0.1%Tween−20(TBS−T)を添加したトリス緩衝化生理食塩水(pH 7.6)を使用して、100μl/ウェルで3回洗浄した後、ウェルを、3%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した100マイクロリットル/ウェルのTBS−Tを用いて37℃で30分間にわたりブロッキングした。ウェルを上に記載するように洗浄し、その後、以下の血漿調製物(TBS−T/3%BSAで1/4希釈、ウェル当たり100マイクロリットル、37℃で2時間)を、固定化sdAbの各々及び両方の型の対照ウェルに加えた:ウサギ血漿、イヌ血漿、サル血漿、ウシ血漿、ブタ血漿、ラット血漿、マウス血漿、及びヒト血漿。
ウェルを次に、TBS−Tを使用して100マイクロリットル/ウェルで3回洗浄した。結合したアンチトロンビンをペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体(MATIII−EIAキット、Affinity Biology、Ancaster Canada;1/100に希釈)を用いて50μl/ウェルで、37℃で2時間にわたりプローブした。ウェルを次に、TBS−Tを使用して100マイクロリットル/ウェルで3回洗浄した。残留ペルオキシダーゼ活性を、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。
陰性結合(−)は、光学密度(OD)が≦0.1であるとして定義し、中程度陽性結合(+)は、ODが>0.1及び<0.5であると定義し、強陽性結合(++)は、ODが≧0.5であると定義した。これらの定義に基づいて、sdAbのいずれも陰性対照に中程度又は強陽性結合を呈さなかった(表1)。全ての血漿調製物が、陽性対照(ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体)に中程度又は強陽性結合を有した。異なるsdAbへの血漿調製物の結合を表7にまとめる。
実施例16に属する表7:異なる種のアンチトロンビンへのsdAbの結合。
実施例16に属する表7:異なる種のアンチトロンビンへのsdAbの結合。
陽性ctl:陽性対照、ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体(Affinity Biologicals)。陰性ct1:抗VWF sdAb KB−VWF−006固定化。
−:ODが≦0.1であるとして定義する陰性結合;
+:ODが>0.1−<0.5であるとして定義する中程度陽性結合;
++:0.5以上であるとして定義する強陽性結合。
−:ODが≦0.1であるとして定義する陰性結合;
+:ODが>0.1−<0.5であるとして定義する中程度陽性結合;
++:0.5以上であるとして定義する強陽性結合。
実施例14:血友病マウスを使用した尾静脈横切開アッセイにおける失血に対する多量体sdAb KB−AT−113の効果。
8〜12週齢の血友病マウスに、静脈内尾注射を介して賦形剤(生理食塩水)又はsdAb KB−AT−113(10mg/kg)を与えた。注射後10分に、イソフルラン麻酔したマウスの側静脈を0.7mmの深さで切断し、そこでは尾の直径は2.3mmであった。横切開した尾を、温かい生理食塩水で満たした10mlチューブに横切開後直ちに浸した。血液を37℃で60分間にわたり収集した。60分後、血液及び生理食塩水の混合物を1500gで遠心した。赤血球ペレットを次に、H2O中で溶解し、416nmでの吸光度を読み取ることによりヘモグロビンの量を得た。上に記載するようにヘモグロビンを抽出するために、H2O中の一定量(20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、80マイクロリットル、及び100マイクロリットル)のマウス血液を溶解することにより得られた標準曲線から各々のサンプル中の失われた血液の容量を算出した。賦形剤及びKB−AT−113処置マウスでの失血を図13に示す。KB−AT−113の注入によって、血友病マウスにおける失血の低下がもたらされる。失血は、KB−AT−113(10mg/kg)を受けたマウスについて363±238マイクロリットル(平均値±SE;n=3)及び賦形剤を受けたマウスについて1235±233マイクロリットル(n=3)であった。この差は、等しいSDを伴う対応のないt検定において分析した場合に統計的に有意であった(p=0.0105)。これらのデータは、KB−AT−113によるアンチトロンビンの中和によって、血友病マウスにおいて少なくとも部分的に止血が回復することを示す。
実施例15:FVIII−AT−0203融合タンパク質の発現によって、血友病マウスにおける止血が矯正される。
野生型B−domainless FVIII(WT−FVIII−SQ)及びFVIII−AT−0203をコードするcDNA構築物をpLIVE−プラスミド(Mirus Bio、WI、USA)中にクローニングした。プラスミド(1.5マイクログラム/マウス)を、流体力学的遺伝子導入を介して第VIII因子欠損マウス中に注射した:プラスミドを、動物の体重の10%に相当する容量(即ち、20グラムのマウスについては2ml)で0.9%生理食塩水中に希釈する。この溶液を5秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入後4日に、イソフルラン麻酔マウスからの眼窩後穿刺を介して血液を採取し、遠心(22℃で20分間にわたり1500g)により血漿を調製した。血漿を次に使用し、発色2段階活性アッセイ(Biophen FVIII:C;Hyphen Biomed、Neuville−sur−Oise、France)を使用してFVIII活性を測定した。平均FVIII活性は、WT−FVIII−SQ(n=3)については0.14±0.07U/ml及びFVIII−AT−0203については0.12±0.06U/mlであった。遺伝子導入後5日に、イソフルラン麻酔マウスの側方尾静脈を、直径2.3mm及び深さ0.7mmで横切開した。血液を30分間にわたり収集し、失血の容量を測定した(図14)。失血は、WT−FVIII−SQを発現するマウスについては216±333マイクロリットル(平均値±SD;n=3)であり、失血は、FVIII−AT−0203を発現するマウスについては89±92マイクロリットル(平均値±SD;n=3)であった。失血は、両方の変異体の間で有意に異ならなかった。このように、FVIII−AT−0203は、第VIII因子欠損マウスにおける止血欠損を矯正する際に、WT−FVIII−SQと少なくとも同じくらい効率的である。
実施例16:FVIII−AT−0203は、WT−FVIII−SQとしてより長い循環生存を有する。
野生型B−domainless FVIII(WT−FVIII−SQ)及びFVIII−AT−0203をコードするcDNA構築物をpLIVE−プラスミド(Mirus Bio、WI、USA)中にクローニングした。プラスミド(100マイクログラム/マウス)を、流体力学的遺伝子導入を介して第VIII因子欠損マウス(構築物当たりn=2)中に注射した:プラスミドを、動物の体重の10%に相当する容量(即ち、20グラムのマウスについては2ml)で0.9%生理食塩水中に希釈する。この溶液を5秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入後4日に、イソフルラン麻酔マウスからの眼窩後穿刺を介して血液を採取し、遠心(22℃で20分間にわたり1500g)により血漿を調製した。血漿を次に使用し、発色2段階活性アッセイ(Biophen FVIII:C;Hyphen Biomed、Neuville−sur−Oise、France)を使用してFVIII活性を測定した。FVIII活性は、WT−FVIII−SQについては3.5及び4.5U/mlであり、FVIII−AT−0203については5.6及び4.4U/mlであった。マウスからの血漿を、第VIII因子欠損マウスの尾静脈中への静脈内注入のために使用した。投薬は1U第 VIII因子/マウスであった。対照として、組換えWT−FVIII−SQを注入した。示した時間点で、イソフルラン麻酔マウスから後眼窩穿刺により血液を採取し、遠心(22℃で20分間にわたり1500g)により血漿を調製した。残存第VIII因子活性を発色2段階活性アッセイにおいて測定した。注射された量(平均値±SD;n=3〜4の各時間点)に対する残存活性を、注射後の時間に対してプロットした(図15)。このアプローチによって、残留因子VIIIレベルが、注入後の時間点4時間、8時間、及び24時間に、FVIII−AT−0203と比較して、WT−FVIII−SQについて有意に低いことが明らかになった。値は次の通りである:
WT−FVIII−SQ間の統計分析は、Holm−Sidak方法(GraphPrism vs Mac OS Xでは6.0h;GraphPad SoftWare)を使用した多重t検定を使用して決定した。算出した半減期において翻訳されたWT−FVIII−SQと比較して、FVIII−AT−0203のより高い残留レベルは2.5倍増加していた(3.7時間[95%信頼区間2.4〜7.7]対1.5[95%信頼区間:0.8−14.2])。半減期を、単一の指数関数的減衰を記載する式を使用して算出した。GrapPrismを使用した統計分析によって、半減期がWT−FVIII−SQ及びFVIII−AT−0203について有意に異なることが明らかになった(p=0.026)。
実施例17血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおける多価sdAb KB−AT−113の効果。
sdAb KB−AT−443を、第VIII因子(FVIII)欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるその能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたFluoroscan Ascent蛍光光度計(Thermolabsystems OY、Helsink、Finland)において、Hemkerら(pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253)により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水(対照)、精製FVIII(0.1又は1U/ml Kogenate(登録商標)FS、Bayer HealthCare、Puteaux、France)、又はKB−AT−443(4マイクロモル)を添加した80μlの血漿を、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。TF(組換え脂質化ヒト組織因子、Innovin(登録商標)、Dade Behringから得た)及びリン脂質(PL)小胞を含む20マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、1pMのTF及び4μMのPL小胞の最終濃度を得た。PL小胞を、L−α−ホスファチジル−L−セリン(PS)L−α−フォスファチジルエタノールアミン(PE)及びL−α−フォスファチジルコリン(PC)(Avanti Polarlipids、Albaster、Alabama、USA)からPC:PE:PS=3:1:1の比率で調製し、公称100nm直径であった。
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びCaCl2を含む20マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質I−1140(Z−Gly−Gly−Arg−AMC)はBachem AG(Bubendorf、スイス)からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して37℃で60分間にわたりモニターし、Thrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope B.V.、Maastricht、オランダ)を使用して分析した。4つのウェルが各々の実験のために必要であった(血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための2つのウェル及び較正のための2つのウェル)。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル(ETP)、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、及びトロンビン検出についての遅延時間を決定した。
図16には、トロンビン生成曲線の例を示している。トロンビン生成パラメータを表16にまとめている。これらのトロンビン生成曲線は、KB−AT−443が遅延時間及びETPに関してFVIII 100%に類似していることを示す。
参考文献:
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最先端技術が記載されている。これらの参考文献の開示を、本開示中への参照により本明細書に組み入れる。
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最先端技術が記載されている。これらの参考文献の開示を、本開示中への参照により本明細書に組み入れる。
Claims (26)
- アンチトロンビン(AT)に対する単離単一ドメイン抗体(sdAb)。
- 請求項1記載の単離単一ドメイン抗体であって、前記sdAbが以下を含む、
‐配列番号1として示す配列を有するCDR1、配列番号2として示す配列を有するCDR2、及び配列番号3として示す配列を有するCDR3;
‐配列番号5として示す配列を有するCDR1、配列番号6として示す配列を有するCDR2、及び配列番号7として示す配列を有するCDR3;
‐配列番号9として示す配列を有するCDR1、配列番号10として示す配列を有するCDR2、及び配列番号11として示す配列を有するCDR3;
‐配列番号13として示す配列を有するCDR1、配列番号14として示す配列を有するCDR2、及び配列番号15として示す配列を有するCDR3;
‐配列番号17として示す配列を有するCDR1、配列番号18として示す配列を有するCDR2、及び配列番号19として示す配列を有するCDR3;
‐配列番号21として示す配列を有するCDR1、配列番号22として示す配列を有するCDR2、及び配列番号23として示す配列を有するCDR3;又は
‐配列番号25として示す配列を有するCDR1、配列番号26として示す配列を有するCDR2、及び配列番号27として示す配列を有するCDR3。 - 請求項1又は2記載の単離単一ドメイン抗体であって、前記sdAbが以下である:
‐KB−AT−001(配列番号4)、
‐KB−AT−002(配列番号8)、
‐KB−AT−003(配列番号12)、
‐KB−AT−004(配列番号16)、
‐KB−AT−005(配列番号20)、
‐KB−AT−006 (配列番号24)、又は
‐KB−AT−007(配列番号28)。 - 異種部分に連結された、請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体を含む薬物コンジュゲート。
- 異種部分が異種ポリペプチドである、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- 異種ポリペプチドが、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体に融合されて融合タンパク質を形成する、請求項4又は5記載の薬物コンジュゲート。
- 融合タンパク質が、そのC末端で異種ポリペプチドのN末端に、もしくはそのN末端で異種ポリペプチドのC末端に直接的に又はスペーサーを介して融合されている、請求項1〜3記載の少なくとも1つの単離単一ドメイン抗体(sbAb)を含む、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- 融合タンパク質がバイパラトープポリペプチドである、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- 融合タンパク質が以下を含むバイパラトープ抗体である、請求項4記載の薬物コンジュゲート:
‐単離単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された単離単一ドメイン抗体KB−AT−002;
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された単離単一ドメイン抗体KB−AT−001、
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された単離単一ドメイン抗体KB−AT−001、又は
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−005に連結された単離単一ドメイン抗体KB−AT−001。 - 融合タンパク質が三価抗体である、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- 三価抗体が以下を含む、請求項10記載の薬物コンジュゲート:
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001、
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001、又は
‐請求項1〜3記載の単離単一ドメイン抗体KB−AT−005に連結された2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001。 - 融合タンパク質が四価抗体である、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- 四価抗体が、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体KB−AT−003に連結された単離単一ドメイン抗体KB−AT−002に連結された2つの単離単一ドメイン抗体KB−AT−001を含む、請求項12記載の薬物コンジュゲート。
- 異種部分がポリペプチドである、請求項4記載の薬物コンジュゲート。
- ポリペプチドがVWF−A1ドメインである、請求項4又は14記載の薬物コンジュゲート。
- ポリペプチドがC4BPから由来するAポリペプチドである、請求項4又は14記載の薬物コンジュゲート。
- 異種部分が循環タンパク質である、請求項6記載の薬物コンジュゲート。
- 循環タンパク質が凝固因子である、請求項18記載の薬物コンジュゲート。
- 請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体又は請求項4〜18記載の薬物コンジュゲートを含むベクター。
- ベクターがAAVベクターである、請求項19記載のベクター。
- 治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、請求項1〜3記載のアンチトロンビン又は、ベクターに挿入されたもしくは挿入されていない請求項4〜18記載の薬物コンジュゲートに対する少なくとも1つのsdAbを加える工程を含む、治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法。
- ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体又は請求項6〜18記載の薬物コンジュゲートの半減期を延長又は増加させる方法。
- ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体又は請求項4〜18記載の薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において出血障害を防止又は処置する方法。
- 出血障害が血友病A又は血友病Bである、請求項23記載の方法。
- ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体又は請求項4〜18記載の薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてヘパリン誘導性出血を防止又は処置する方法。
- ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項1〜3記載の単一ドメイン抗体又は請求項4〜18記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
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