JP2023532726A - 抗プロテインｓシングルドメイン抗体及びそれを含むポリペプチド - Google Patents

Abstract

ビタミンＫ依存性プロテインＳ（ＰＳ）は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の非酵素的補因子として作用する天然の抗凝固剤である。本発明者らは、未知のメカニズムによってＰＳのＡＰＣ－補因子活性を顕著に増強する抗ＰＳナノボディを同定した。興味深いことに、このナノボディは、損傷したマウスの腸間膜微小血管において抗血栓作用を発揮する。その結果、それは、敗血症、ＣＯＶＩＤ－１９、脳卒中による遠位微小血管血栓症、又は鎌状赤血球症等の病的状態における急性微小血栓症の治療に用いられ得る新規クラスの抗血栓剤を構成する。従って、本発明は、プロテインＳ（ＰＳ）に対する単離されたシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及びそれを含むポリペプチドに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗プロテインＳ（ＰＳ）のコンフォメーション上のシングルドメイン抗体、及びそれを含むポリペプチド、並びに特に治療分野におけるそれらの使用に関する。

ビタミンＫ依存的プロテインＳ（ＰＳ）は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の両方の非酵素的補因子として作用する天然の抗凝固剤である。実際、ＰＳは歴史的に、活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）及び活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）に対するＡＰＣのタンパク質分解活性を増強し、トロンビンの生成を非常に効果的に制限することができると説明されてきた。また、ＰＳは、ＦＸａに対するＴＦＰＩ－αの阻害効果を増強することが報告されているが（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６）、このような補因子活性の生理的関連性は正確には知られていない。さらに、最近ＰＳは、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の直接的な阻害座として説明されている（Ｐｌａｕｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１８）。ＰＳの生理的重要性は、ＰＳ欠乏症患者で観察される臨床症状により証明されている。ＰＳの軽度の欠損は静脈血栓症のリスクの増加と関連しているが、重度のＰＳ欠損は、劇的で生命を脅かす血栓性表現型（すなわち、特に皮膚血管における微小血管血栓と播種性血管内凝固を伴う劇症型紫斑病）をもたらす。マウスにおいて、ＰＳの完全欠損は、重度の血栓性凝固障害と大量の脳内出血により胚性致死となる（Ｓａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｂｕｒｓｔｙｎ－Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９）。血友病マウスにおいて、ＰＳが関節に高発現しており、このことが血友病関節で観察される高度な抗凝固環境を一部説明しているかもしれない（Ｐｒｉｎｃｅ， Ｂｏｌｏｇｎａ ｅｔ ａｌ．２０１８）。興味深いことに、ＰＳの不在又はポリクローナル抗体によるその薬理学的阻害は、血友病の重要な低減をもたらす。

そこで、本発明者らは、ＰＳの抗凝固活性を調節するための独創的且つ強力なツールとして、ＰＳに対して指向性を有するナノボディの開発を目指した。ナノボディ又はシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、ラクダ科動物に存在する重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）の可変領域（ＶＨＨ）である。単離されたナノボディは１５ｋＤａという小さなサイズにもかかわらず、その同種抗原を完全に認識することができる。さらに、その小さなサイズ及び物理化学的特性により、従来の免疫グロブリンと比較して種々の利点がある。例えば、それらは元のＨｃＡｂの残余から分離されても高い安定性を保持する。また、それらは高濃度で可溶であり、インビボでの組織浸透性に優れていると考えられている。その結果、ナノボディは新規で且つ有望な治療用抗体の一種として登場した。さらに、それらはＥ．ｃｏｌｉで発現させることができ、他のナノボディと組み合わせることで、多価又は多特異的な種を容易に生成することができる。ナノボディの利点の１つは、従来のモノクローナル抗体と比較して、突出した相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を介して潜在性エピトープを認識できることである。そこで、発明者らは、抗ＰＳナノボディを用いることで、ＰＳの抗凝固活性を予期せぬ形で調節し得るオリジナルの抗体を同定することができるのではないかと推論した。

現在もなお、より安全性が高い抗血栓薬の開発が求められている。実際、現在用いられている抗血小板薬（例えばアスピリン及びクロピドグレル）又は抗凝固薬（例えばヘパリン誘導体、ワルファリン）は、生理的止血反応を阻害するため、出血のリスクを高めるとされている。これに対して、抗ＰＳナノボディでＡＰＣの抗凝固活性を増強しても、止血への影響は軽微である可能性があり、出血リスクの上昇とは無縁である可能性がある。

高密度リポタンパク質（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５）、カルジオリピン（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００）又は骨格筋ミオシン（Ｈｅｅｂ ｅｔ ａｌ．２０１９）等の生理的薬剤は、ＡＰＣの抗凝固活性を増強すると報告されている。しかしながら、ＡＰＣの抗凝固活性を増強する医薬品は、未だ開発されていない。興味深いことに、現在、抗血栓薬の候補として、プロテインＣの医薬活性化剤が研究されている。この活性化剤は、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥトロンビン又はＡＢ００２）であり、その凝血原特性は失われたがプロテインＣをＡＰＣに活性化することができる（Ｃａｎｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０００）。外因性ＡＰＣの全身投与又は患者における高レベルの可溶性トロンボモジュリンによるプロテインＣの全身活性化（Ｄａｒｇａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１５）は、出血傾向の増加と関連しているのに対し、ＡＢ００２の投与は、止血をわずかに損ねるだけである（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）。これは、少なくとも部分的には、ＡＢ００２によってＡＰＣがその場で精製される可能性があり、ＡＰＣの循環への逃避が制限されている、血清表面におけるＡＢ００２の局所的な作用によるものと考えられる（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）。このことは、ＡＢ００２が血栓症の様々な動物モデルにおいて、重大な全身性抗凝固作用を伴わずに、血栓の伝播を強力に阻害することが記載されている理由を説明できるであろう（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０２０）。

本発明者らが開発したＰＳに対するナノボディは、敗血症又は脳卒中等の微小血管血栓症が主要な病因となる急性病態の治療において提案することが可能である。

本発明者らは、抗ＰＳナノボディを同定するために、ＰＳで免疫したラマから生成したナノボディの大規模ライブラリをスクリーニングできるＵＭＲ＿Ｓ１１７６で開発されたプラットフォームを活用した。彼らは、未知のメカニズムによってＰＳのＡＰＣ補因子活性を増強する、非常に驚くべき抗ＰＳナノボディを同定した。非常に興味深いことに、このナノボディは、傷ついたマウスの腸間膜微小血管において、抗血栓作用を発揮する。結果として、敗血症、ＣＯＶＩＤ－１９、又は脳卒中により誘導される遠位微小血管血栓症等の病態における急性微小血栓症の治療に用いられる新しいクラスの抗血栓剤を構成する。

従って、本発明は、プロテインＳ（ＰＳ）に対する単離されたシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びそれを含むポリペプチドに言及する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。

図１は、本研究で用いられた１価及び２価のナノボディの模式図を示す。１価のＰＳ００３及びＫＢ０１３ナノボディのオリゴヌクレオチド配列をＰｓｔＩとＢｓｔＥＩＩとの制限酵素サイト間でｐＥＴ２８プラスミドにクローニングし、Ｎ末端のＨｉｓ６タグ及びＣ末端のＨＡタグ配列に挟まれたナノボディを生成した。１価のナノボディの２つのオリゴヌクレオチド配列（ＰＳ００３、ＫＢ００４、ＰＳ００４）を（ＧＧＧＳ）４リンカーを介して融合し、合成し、ＰｓｔＩとＢｓｔＥＩＩサイト間でｐＥＴ２８プラスミドにクローニングし、同様にＮ末端のＨｉｓ６タグ及びＣ末端のＨＡタグ配列に挟まれた２価ナノボディ（ＰＳ００３ｂｉｖ、ＫＢ００４ｂｉｖ、ＰＳ００４ｂｉｖ）を作製した。 図２は、ＥＬＩＳＡにおける種々のビタミンＫ依存性タンパク質に対するＰＳ００３の結合を示す。リコンビナントヒトＦＩＸ（ＦＩＸ）、リコンビナントヒトＦＸ（ＦＸ）、血漿由来プロテインＺ（ＰｒｏＺ）、リコンビナントヒトＧａｓ６（Ｇａｓ６）及びリコンビナントヒトＰＳ（ＰＳ）をＥＬＩＳＡウェルに固定化し、２０ｎＭのＰＳ００３の結合性を分析した。 図３は、ＥＬＩＳＡにおけるＰＳ００３のＰＳ及びＧａｓ６への結合を示す。ＰＳとＧａｓ６とは相同性が高く（４７％相同）、共にＳＨＢＧ様ドメインを含むため、固定化したｒｈＰＳ及びｒｈＧａｓ６に対するＰＳ００３の結合を、さらに直接ＥＬＩＳＡで分析した。その結果、ＰＳ００３はｒｈＰＳに強く結合し、ｒｈＧａｓ６には結合しないことが示され、ＰＳ００３のｒｈＰＳに対する特異性が確認された。 図４は、ＰＳ００３のエピトープマッピングを示す。ｒｈＰＳ、ＰＳの単独ＳＨＢＧ様ドメインの組換体（ｒｈＳＨＢＧ）、及びＢＳＡを固定化し、（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）、ＰＳ００３の結合を直接ＥＬＩＳＡで分析した。これらの結果から、ＰＳ００３はｒｈＳＨＢＧに結合することができ、ＰＳ００３のエピトープがＰＳのＣ末端ＳＨＢＧ様ドメイン内に局在していることが示唆された。一方、ＰＳ００４は、ｒｈＳＨＢＧに結合しなかった（データは示さず）。このことは、ＰＳ００４のエピトープがＰＳのＮ末端部分に局在していることを示唆する。 図５は、ＥＬＩＳＡにおける溶液中の組換えヒト及び血漿由来ＰＳと固定化ＰＳ００３との結合を示す。精製したＰＳ００３（１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）をＥＬＩＳＡウェルに固定化し、２つの異なる形態のＰＳの結合を分析した。これらの結果から、ＰＳ００３は組換型又は血漿由来のいずれかのヒトＰＳに結合し、ＰＳ００３のＰＳへの結合は、非ネイティブの固定化形態のＰＳに限定されないことが示された。 図６は、直接ＥＬＩＳＡにおける固定化ＰＳへのＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの結合比較を示す。ｒｈＰＳ（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に２．５μｇ／ｍＬで６０μＬ）をＥＬＩＳＡウェルに固定化し、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖ（０～２００ｎＭ）の結合をペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ６タグポリクローナル抗体で分析した。３回の個別実験を簡便に行い、結果を各ナノボディの最大結合量に対するパーセンテージとして表した。結合曲線は、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの両方が固定化ｒｈＰＳに効率的に結合することを示した。ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのＰＳへの結合能をさらに比較するために、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのｒｈＰＳに対する親和性を、単純化して行った３つの個別実験において、増加する濃度（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に０．６、１．２５及び５ｍｇ／ｍＬ）で固定化したｒｈＰＳに同様の結合曲線を得ることによって、記載されているように（Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８７）評価した。各ナノボディについて、質量作用の法則に基づく式を用いて解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。この方法に基づき、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのＫ_Ｄは、それぞれ２６．８±２．７ｎＭ及び１３．８±５．７ｎＭであり、ＰＳ００３ｂｉｖはｒｈＰＳに僅かに高い親和性（１．９倍）で結合することが示唆された。 図７は、ＰＳ００３ｂｉｖのエピトープマッピング及びＰＳ００３ｂｉｖのＰＳに対する特異性を示す。組換型ヒトＰＳ（ｒｈＰＳ）、ＰＳ ＳＨＢＧ様領域のみの組換型（ｒＳＨＢＧ）、組換型ヒトＧａｓ６（ｒｈＧａｓ６）、又はＢＳＡ（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬで６０μＬ）をＥＬＩＳＡウェルに固定化し、ＰＳ００３ｂｉｖ（ＴＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ－５ｍＭＣａＣｌ_２に０．５ｎＭ）の結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ６タグポリクローナル抗体を用いて分析した。結果は、ｒｈＰＳ上で得られたＡｂ_{ｓ４５０ｎｍ}のパーセンテージで表される。３つの個別実験を簡略化して行った。その結果、ＰＳ００３ｂｉｖはｒＳＢＨＧに効率的に結合し、従って、ＰＳ００３ｂｉｖのエピトープはＰＳのＳＨＢＧ様領域内に局在していることが示された。この領域は、Ｇａｓ６にしか見られないため、ＰＳ００３ｂｉｖがｒｈＧａｓ６に結合しないことは、ＰＳ００３ｂｉｖがＰＳに特異的であることを強く示唆した。 図８Ａ－Ｄは、ＡＰＴＴベースの血漿凝固アッセイ（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＰＳ、Ｓｔａｇｏ）におけるｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性に対するＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの増強効果を示す。図８Ａは、市販のＡＰＴＴベースの血漿凝固アッセイ（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＰＳ、Ｓｔａｇｏ）を用いて、ｒｈＰＳ（最終濃度５ｎＭ）がＡＰＣの補因子として作用する能力を測定した結果を示す。このアッセイにおいて、ＡＰＣはＰＳ欠乏血漿の凝固時間を延長し、５ｎＭのｒｈＰＳはＡＰＣと共に添加すると凝固時間をさらに延長させた。図８Ｂは、我々のＡＰＴＴベースのＡＰＣ－補因子活性アッセイにおけるｒｈＰＳ（最終濃度０～１０ｎＭ）の用量依存的な効果を示す。図８Ｃは、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果を、ＡＰＣの抗凝固活性を増強するｒｈＰＳ（最終濃度６ｎＭ）の能力で試験した結果を示す。ＰＳ００３、ＫＢ０１３（コントロール１価ナノボディ）、ＰＳ００３ｂｉｖ及びＫＢ００４ｂｉｖ（コントロール２価ナノボディ）を、ｒｈＰＳと室温で１５分間プレインキュベートし、ｒｈＰＳ±ナノボディの混合物を我々のアッセイで添加した。ｒｈＰＳ及びナノボディの最終濃度は、それぞれ６ｎＭ及び２μＭであった。実験はトリプリケートで行った。図８Ｄでは、先の結果についてｒｈＰＳ存在下での凝固時間（ｔ＋ＰＳ）とｒｈＰＳ非存在下での凝固時間（ｔ－ＰＳ）との比として表した。統計学検定として、独立スチューデントｔ検定を用いた。その結果、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖは共に、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強し、ＰＳ００３よりもＰＳ００３ｂｉｖの方がｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性の増強作用が高いことが示された。 図９Ａ－Ｂは、インビトロＦＶａ不活性化アッセイにおけるＰＳのＡＰＣ－補因子活性に対するＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果を示す。ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強するＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの能力は、精製タンパク質を用いて、ｒｈＰＳの存在下で、ＡＰＣによるＦＶａの特異的タンパク質分解不活性化を測定するインビトロアッセイで評価された。図９Ａでは、ＦＶａ不活性化混合物中の各ｒｈＰＳ濃度について傾きを求め、ＦＶａ活性の値を、ｒｈＰＳ存在下で得られた傾きとｒｈＰＳ非存在下で得られた傾きとの比として表した。３つの実験を簡略化して行った。図９Ｂは、残存ＦＶａ活性を先に記載したようにプロトロンビナーゼアッセイを用いて各条件について測定し、ｒｈＰＳをナノボディ又は抗体の非存在下（ＴＢＳ）でプレインキュベートしたときに得られたＦＶａ活性と比較した。３つの実験を簡略化して行い、統計的検定として独立スチューデントｔ検定を使用した（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 図１０Ａ－Ｃは、ｒｈＰＳのＴＦＰＩ－補因子活性に対するＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果を示す。ＩＦＰＩαによるＦＸａの直接阻害をｒｈＰＳが増強する能力を評価するためにインビトロアッセイが開発された。図１０Ａでは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた組換型ヒト全長ＴＦＰＩαを最終濃度５ｎＭで用い、ＦＸａのアミド分解活性を阻害した。図１０Ｂでは、ｒｈＰＳをブロッキング用ウサギポリクローナル抗ＰＳ抗体（α－ＰＳ）（ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）、又はウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）と共に室温で１５分間プレインキュベートした場合のＴＦＰＩαの阻害活性を増強する能力について検討した。図１０Ｃでは、ｒｈＰＳをＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖ、又はそれぞれの１価（ＫＢ０１３）及び２価（ＫＢ００４ｂｉｖ）対照ナノボディ（最終濃度１０μＭ）と室温で１５分間プレインキュベートしたときのＴＦＰＩαの阻害活性を増強する能力を評価した。結果は、ナノボディ非存在下（ＴＢＳ）でのｒｈＰＳのＴＦＰＩα－補因子活性に対するパーセンテージで表し、３つの実験を単純化して行い、統計検定として独立スチューデントのｔ検定を用いた。 図１１は、直接ＥＬＩＳＡにおけるＰＳ００３ｂｉｖ及びＰＳ００４ｂｉｖの固定化マウスＰＳへの結合の比較を示す。ＰＳ００４ｂｉｖは、ＥＬＩＳＡウェルに固定化したｒｈＰＳを選択し、同定した１価のナノボディ（ＰＳ００４）から生成した自社製の抗ヒトＰＳナノボディである。ＰＳ００４ｂｉｖは、直接ＥＬＩＳＡでｒｈＰＳと強く結合するが、ＰＳ００３ｂｉｖとは対照的に、そのエピトープはＰＳのＮ末端部内に局在し、ＰＳのＳＨＢＧ様ドメイン内には無い（データは示さず）。ＰＳ００３ｂｉｖ及びＰＳ００４ｂｉｖの固定化ｒｈＰＳへの結合をＥＬＩＳＡにより分析した。その結果、ＰＳ００３ｂｉｖはｒｍＰＳに結合したが、ＰＳ００４ｂｉｖは結合しないことが明らかとなった。このことから、ＰＳ００４ｂｉｖはＰＳ００３ｂｉｖと共に、我々のインビボＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルにおける対照の２価ナノボディとして用い得ることが示唆された。 図１２Ａ－Ｂは、マウスＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルにおけるＰＳ００３ｂｉｖのインビボ抗血栓効果を示す。４～５週齢のＣ５７ＢＬ６／ＪＲｃｃＨｓｄ雄マウスにおいて、本質的に以前に記載されたように（Ａｙｍｅ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０）、ＦｅＣｌ_３傷害を誘導した。血栓形成の可視化を促進するために、麻酔したマウスの血小板を、ローダミン６Ｇ（３．３ｍｇ／ｋｇ、すなわち０．９％ ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍＬで２．５μＬ／ｇ）の眼窩後部叢への静脈内注入によりインビボで蛍光標識化した。ＰＳ００３ｂｉｖ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＳ００４ｂｉｖ（１０ｍｇ／ｋｇ）又は同僚のＴＢＳバッファー（Ｃｔｌ）を、０．９％のＮａＣｌで希釈し、同時に投与した。代替的に、ローダミン６Ｇの静脈内注射後に低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ、ロベノックス）２００ＵＩ／Ｋｇを皮下注射した。標識血小板を１０分間循環させた後、ＦｅＣｌ_３溶液（水中で１０％）を腸間膜血管に局所投与し、倒立型落射蛍光顕微鏡（×１０）で血栓の成長をリアルタイムに観察した。各マウスについて、１つの静脈及び１つの動脈を分析した。統計解析は、クラスカル－ウォリス及びダン検定により評価した。図１２Ａにおいて、我々のＡＰＣ－補因子活性アッセイで用いた対照の２価抗ＶＷＦ（ＫＢ００４ｂｉｖ）は、このナノボディでマウスを処理すると１匹のマウスの静脈及び細動脈で閉塞時間の遅延が生じたため、ＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルで用いることはできなかった。従って、組換えマウスＰＳに結合できない対照２価抗ＰＳナノボディ（ＰＳ００４ｂｉｖ）を用いた。我々の血栓症モデルは、ＬＭＷＨ（２００ＵＩ／ｋｇ、ＳＣ）でマウスを処理すると、静脈及び細動脈の閉塞時間が遅延したため、抗凝固剤に敏感であった（ｎ＝６マウス）。ＰＳ００４ｂｉｖによる処理（ｎ＝６マウス）は、閉塞時間に影響を及ぼさなかったが、ＰＳ００３ｂｉｖによる処理は、静脈（ｎ＝１０マウス）での閉塞時間の有意な遅延をもたらした。ＰＳ００３ｂｉｖで処理したマウスの細動脈（ｎ＝９マウス）でも同様の傾向が見られたが、統計学的な差は示さなかった。図１２Ｂでは、ＰＳ００３ｂｉｖを投与したマウスの腸管膜血管では、ナノボディを投与していないマウス（図示せず）又は対照のＰＳ００４ｂｉｖナノボディを投与したマウスの腸間膜血管で形成された血栓と比較して、血栓の安定性が低く、高い割合で塞栓することが確認された。 図１３は、マウス尾部クリップ出血モデルにおけるＰＳ００３ｂｉｖの生理的止血に対する効果を示す。麻酔したＣ５７／ＢＬ６マウスにＰＳ００３ｂｉｖの（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射する、又は低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｌｏｖｅｎｏｘ、２００ＵＩ／Ｋｇ）を皮下注射した。出血時間は、最初の出血停止と定義した。また、総出血量を定量化するために、２０分間の採血を行った。各バーは、評価した複数のマウスから得られた平均値を表す。統計学的な分散検定として、ターキーの多重比較検定による通常の１元配置分散分析を用いた。

プロテインＳ（ＰＳ）は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の補因子として作用する天然の抗凝固剤である。本発明者らは、ＰＳの活性を調節することが、凝固障害の治療において有効なアプローチになると考えた。そこで、ヒトＰＳを免疫したラマからシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の免疫ライブラリを作製し、ファージディスプレイによりＰＳを標的とするｓｄＡｂを選択した。

発明者らは、ＰＳと強く結合し、インビトロで抗凝固作用を示し、インビボで抗血栓作用を示すｓｄＡｂを同定した。

（定義）
本明細書で用いられる「プロテインＳ」又は「ＰＳ」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、主に肝臓で合成されるビタミンＫ依存性の血漿糖タンパク質を意味する。プロテインＳは循環系において、遊離型、及び補体タンパク質Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）と結合した複合型の２つの形態で存在する。ヒトにおいて、プロテインＳは、ＰＳ１遺伝子によりコードされている。プロテインＳは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の両方の非酵素的補因子として作用する天然の抗凝固剤である。実際、ＰＳは歴史的に、活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）及び活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）に対するＡＰＣのタンパク質分解活性を増強し、トロンビンの生成を非常に効果的に制限することができると報告されている。また、ＰＳは、ＦＸａに対するＴＦＰＩαの阻害効果を増強することも大きく報告されているが（Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６）、このような補因子活性の生理的関連性は正確には分かっていない。さらに、最近ＰＳは、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の直接的な阻害剤として説明されている（Ｐｌａｕｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

本明細書において用いられる「シングルドメイン抗体」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、軽鎖を自然に欠く、ラクダ科哺乳動物に見られ得る型の抗体の単一重鎖可変ドメインを意味する。そのようなシングルドメイン抗体は、ＶＨＨ又は「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。（シングル）ドメイン抗体の一般的な説明については、上記で引用した先行文献、並びに欧州特許第０３６８６８４号、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ １２；３４１（６２４２）：５４４－６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４－４９０；及び国際公開第０６／０３０２２０号、国際公開第０６／００３３８８号を参照することができる。ナノボディは、分子量がヒトＩｇＧ分子の約１０分の１であり、タンパク質の物理的直径はわずか数ナノメートルである。サイズが小さいことの１つの結果として、ラクダのナノボディは、大きな抗体タンパク質では機能的に見えない抗原部位に結合する能力がある。ラクダ科動物のナノボディは、従来の免疫学的手法では検出できない抗原を検出するための試薬として、また治療薬として有用である。従って、ナノボディは、標的タンパク質の溝又は狭い裂け目にある特定の部位に結合した結果として生物学的効果を発揮することができるので、古典的な抗体よりも古典的な低分子量薬剤の機能に近い能力を発揮することができる。さらに、低分子量及びコンパクトなサイズにより、ナノボディは非常に耐熱性が高く、極端なｐＨ及びタンパク質分解に対して安定であり、抗原性が低いという特徴がある。さらに、ナノボディは循環系から組織へ容易に移動し、血液脳関門を通過するものもあり、神経組織に影響を与える障害を治療できる。ナノボディは、血液脳関門を通過する薬物輸送をさらに促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願第２００４／０１６１７３８号を参照できる。これらの特徴は、ヒトに対する低い抗原性と相まって、大きな治療的可能性を示している。シングルドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」から構成されていると考えられ、これらは本技術分野及び本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって中断されており、これらは本技術分野において、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる。従って、シングルドメイン抗体は、一般構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するアミノ酸配列として定義でき、ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を示し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は相補性決定領域１～３を示す。本発明の文脈において、シングルドメイン抗体のアミノ酸残基は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システムアミノ酸ナンバリング（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）によって与えられるＶＨドメインに対する一般的なナンバリングに従ってナンバリングされる。

本明細書で用いられる「アミノ酸配列」の用語は、その一般的な意味を有し、タンパク質にその１次構造を付与するアミノ酸の配列である。本発明によると、アミノ酸配列は、相互作用結合能力の著しい損失無しに、１つ、２つ又は３つの保存的アミノ酸置換で修飾され得る。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸を類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置換され得ることを意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、本技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）である。

本発明によると、第２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列とは、第１の配列が第２のアミノ酸配列に対して７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の同一性は、典型的には、ＢＬＡＳＴ Ｐ（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）等の適切な配列アライメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータを用いて決定される。

本発明の意味によると、「同一性」は、比較ウインドウにおいてアライメントされた２つの配列を比較することによって算出される。配列アライメントにより、比較ウインドウ内の２つの配列について共通する位置（ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を決定することができる。そこで、共通する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割って、１００を乗じることで同一性パーセンテージを得る。配列の同一性パーセンテージの決定は、手動で行うことができ、又は周知のコンピュータプログラムによって行うこともできる。

本明細書で用いられる「精製」及び「単離」の用語は、本発明のｓｄＡｂに関連し、ｓｄＡｂが同じ型の他の生体高分子の実質的な非存在下において存在することを意味する。本明細書で用いられる「精製」の用語は、存在する高分子の総重量と比較して、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、さらに好ましくは少なくとも９８重量％の抗体が存在することを意味する。

本明細書で用いられる「核酸分子」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。

本明細書で用いられる「特異的に結合」の用語は、タンパク質、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するネイティブタンパク質のいずれかの組換体を用いて評価した場合に、抗体が目的の抗原、例えばプロテインＳ（ＰＳ）にのみ結合し、他の抗原に対して交差反応を示さないことを意味する。

（シングルドメイン抗体及びポリペプチド）
本願において対象の配列を以下の表１に示す。

第１の態様において、本発明は、プロテインＳ（ＰＳ）に対する単離シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。

第１の態様において、本発明は、プロテインＳ（ＰＳ）に対して特異的に結合する単離シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。

いくつかの実施形態において、本発明による単離されたシングルドメイン抗体は、ＰＳアゴニスト抗体である。

本明細書において用いられる「ＰＳアゴニスト」抗体とは、ＰＳの活性を示す抗体を意味する。本発明によると、「ＰＳアゴニスト」抗体は、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強することができる、すなわち活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）及び活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）に対するＡＰＣのタンパク質分解活性を増強できる抗体を意味する。本発明によると、「ＰＳアゴニスト」抗体は、プロテインＳの抗凝固活性を増強できる抗体を意味する。

従って、いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強する。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、組換型又は血漿由来のヒトＰＳのいずれかに結合し、それらのＴＦＰＩ－補因子活性に有意に干渉しなかった。

本発明によると、ＰＳに対するシングルドメイン抗体は、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強する。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、抗血栓活性を示す。

本明細書で用いられる「抗血栓活性」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、血栓の形成を抑制する活性を意味する。本発明によると、単離されたシングルドメイン抗体は、血栓の形成を抑制し、及び／又は血栓を溶解する。

抗血栓活性を示す抗体の能力を決定するための試験は、当業者に周知である。ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を特異的に増強する抗体の能力を決定するための試験は、当業者に周知であり、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイ（図８Ｃ～８Ｄを参照）、特異的一段階凝固アッセイ、較正自動トロンビノグラフィー（ＣＡＴ）又は他のトロンビン生成アッセイ、ＦＶａ不活性化アッセイ（図９参照）及びＦＶＩＩＩａ不活性化アッセイ、並びにＴＦＰＩα－補因子活性アッセイ（図１０参照）等の血栓ベースアッセイを含む。

特に、本発明は、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む単離されたシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する（「ＰＳ００３誘導体」）。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する（「ＰＳ００３誘導体」）。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、配列番号４の配列を含む（「ＰＳ００３」）。

いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたシングルドメイン抗体は、配列番号４の配列を有する。

さらに、ｓｄＡｂ「ＰＳ００３」は、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強することも特筆すべき点である。

さらに、ｓｄＡｂ「ＰＳ００３」が、組換型又は血漿由来ヒトＰＳに結合し、それらのＴＦＰＩ－補因子活性を大きく阻害しなかったことは注目すべきことである。

いくつかの実施形態において、単離されたシングルドメイン抗体は、「ヒト化」シングルドメイン抗体である。

本明細書で用いられる「ヒト化」の用語は、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列が「ヒト化」された本発明のシングルドメイン抗体を意味し、すなわち、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基（特にフレームワーク配列）を、ヒトからの従来の鎖状抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つ以上で置換することによって「ヒト化」される。シングルドメイン抗体をヒト化する方法は、本技術分野において周知である。典型的には、ヒト化置換は、得られるヒト化シングルドメイン抗体が、本発明のシングルドメイン抗体の好ましい特性を依然として保持するように選択されることが望ましい。当業者は、適切なヒト化置換又はヒト化置換の適切な組み合わせを決定し、選択できる。

いくつかの実施形態において、本発明のシングルドメインは、抗凝固障害を治療するために用いられる更なる治療剤とコンジュゲートされる。

本発明の更なる態様は、本発明のシングルドメイン抗体とＰＳとの結合について交差競合する交差競合シングルドメイン抗体を示す。いくつかの実施形態において、本発明の交差競合シングルドメイン抗体は、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含むシングルドメイン抗体とＰＳとの結合に対して交差競合する。

いくつかの実施形態において、本発明の交差競合シングルドメイン抗体は、配列番号４の配列を含む又はその配列からなるシングルドメイン抗体とＰＳとの結合について交差競合する。

本明細書で用いられる「交差競合」の用語は、抗原の特定の領域に結合する能力を共有するシングルドメイン抗体を意味する。本開示において、「交差競合」するシングルドメイン抗体は、標準的な競合結合アッセイにおいて、抗原に対する別のシングルドメイン抗体の結合に干渉する能力を有する。そのようなシングルドメイン抗体は、非限定的な理論によると、競合するシングルドメイン抗体と同一又は関連する又は近くの（例えば構造的に類似又は空間的に近接する）エピトープに結合し得る。シングルドメイン抗体Ａが、シングルドメイン抗体Ｂの結合に対して、前記シングルドメイン抗体の１つを欠く陽性対照と比較して、少なくとも６０％、具体的に少なくとも７０％、より具体的に少なくとも８０％低減する場合、また、その逆の場合も、交差競合が存在する。当業者が理解するように、競合は、異なるアッセイセットアップで評価され得る。１つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定できるＢｉａｃｏｒｅ技術の使用（例えば、ＢｉＡｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の使用による）を含む。交差競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを用いる。さらに、抗体の交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するための高スループットプロセスは、国際特許出願第２００３／４８７３１号に記載されている。

本発明によると、上記のような交差競合抗体は、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む単一の抗体の活性を保持する。

本発明によると、上記のような交差競合抗体は、配列番号４の配列を含む又は配列からなるシングル抗体の活性を保持する。

従って、いくつかの実施形態において、本発明の交差競合シングルドメイン抗体は、ＰＳアゴニスト抗体である。

いくつかの実施形態において、本発明の交差競合シングルドメイン抗体は、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強する。

いくつかの実施形態において、本発明の交差競合シングルドメイン抗体は、組換え又は血漿由来のヒトＰＳのいずれかに結合し、それらのＴＦＰＩ－補因子活性を有意に阻害しなかった。

本発明の更なる態様は、本発明の少なくとも１つのシングルドメイン抗体を含むポリペプチドに関する。

典型的に、本発明のポリペプチドは、本発明のシングルドメイン抗体を含み、それはそのＮ末端、そのＣ末端、又はそのＮ末端及びそのＣ末端の両方に、少なくとも１つの更なるアミノ酸配列に融合され、すなわち、融合タンパク質を提供するように融合される。本発明によると、単一のシングルドメイン抗体を含むポリペプチドは、本明細書において「１価」ポリペプチドと呼ばれる。本発明に係る２つ以上のシングルドメイン抗体を含む又は本質的にそれらからなるポリペプチドは、本明細書において「多価」ポリペプチドと呼ばれる。典型的に、多価ポリペプチドは、２価抗体、３価抗体又は４価抗体であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強する。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、組換え又は血漿由来のヒトＰＳのいずれかに結合し、それらのＴＦＰＩ－補因子活性を優位に阻害しなかった。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのシングルドメイン抗体と、少なくとも１つの他の結合ユニット（すなわち、他のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに対して指向性がある）とを含み、典型的にはそれもシングルドメイン抗体である。そのようなポリペプチドは、同一のシングルドメイン抗体を含むポリペプチド（「単特異性」ポリペプチド）に対して、本明細書において「多特異性」ポリペプチドと呼ばれる。従って、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原性決定基又はエピトープに対して指向性がある少なくとも１つの更なる結合部位を提供し得る。前記結合部位は、本発明のシングルドメイン抗体において指向性があるものと同一のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープに対して指向性があり、又は本発明のシングルドメイン抗体とは異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープに指向性があってもよい。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む少なくとも１つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む２つ、３つ、４つ又は５つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４の配列を有する少なくとも２つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４の配列を有する２つ、３つ、４つ又は５つのシングルドメイン抗体を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む（「ＰＳ００３ｂｉｖ誘導体」）。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５の配列を含む（「ＰＳ００３ｂｉｖ」）。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号５の配列を有する（「ＰＳ００３ｂｉｖ」）。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドのシングルドメイン抗体は、互いに直接に（すなわちリンカーの使用無く）、又はリンカーを介して結合され得る。リンカーは、典型的にはリンカーペプチドであり、本発明によると、２つのシングルドメイン抗体におけるそれらの少なくとも２つの異なるＰＳのエピトープのそれぞれへの結合を可能とするように選択され得る。適切なリンカーは、特にエピトープ、具体的にはシングルドメイン抗体が結合するＰＳにおけるエピトープ間の距離に依存し、本明細書に基づいて任意にある程度限定されたルーチン実験の後に当業者には明らかであろう。また、ＰＳに結合する２つのシングルドメイン抗体は、第３のシングルドメイン抗体を介して互いに連結され得る（この場合、２つのシングルドメイン抗体は、第３のシングルドメイン抗体に直接に結合されてもよく、又は適切なリンカーを介して結合されてもよい）。そのような第３のシングルドメイン抗体は、例えば半減期の増大をもたらすシングルドメイン抗体であってもよい。例えば、後者のシングルドメイン抗体は、本明細書にさらに記載されるように、（ヒト）血清アルブミン又は（ヒト）トランスフェリン等の（ヒト）血清タンパク質に結合できるシングルドメイン抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＳに結合する２つ以上のシングルドメイン抗体は、（直接に又は適切なリンカーを介して）直列に結合され、第３の（シングル）シングルドメイン抗体（これは、上記で説明したように半減期の増大を提供し得る）は、これらの２つ以上の上記のシングルドメイン抗体の１つに直接又はリンカーを介して結合される。適切なリンカーは、本発明の特定のポリペプチドに関連して本明細書に記載され、例えば限定されないが、アミノ酸配列からなり、このアミノ酸配列は、好ましくは９以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１７アミノ酸、例えば約２０～４０アミノ酸の長さを有していてもよい。しかしながら、上限は決定的なものではなく、そのようなポリペプチドの例えばバイオ医薬品生産に関する便宜上の理由から選択される。リンカー配列は、天然に存在する配列であってもよく、非天然に存在する配列であってもよい。治療目的で用いられる場合、リンカーは、好ましくは本発明の抗ＥＧＦＲポリペプチドが投与される対象において非免疫原性である。リンカー配列の有用な一群は、国際公開第９６／３４１０３号及び国際公開第９４／０４６７８号に記載されているような重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ等のポリアラニンリンカー配列である。さらに好ましいリンカー配列の例としては、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）、ｇｌｙ３及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３を含む異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。

本発明の「２重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちプロテインＳ、ＰＳ）に対する少なくとも１つのシングルドメイン抗体と、第２の抗原（すなわちＰＳとは異なる）に対する少なくとも１つの更なる結合部位とを含むポリペプチドであり、本発明の「３重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＰＳ）に対する少なくとも１つのシングルドメイン抗体と、第２の抗原（すなわちＰＳとは異なる）に対する少なくとも１つの更なる結合部位と、第３の抗原（すなわち第１及び第２の抗原の両方とは異なる）に対する少なくとも１つの更なる結合部位とを含むポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、更なる結合部位は、シングルドメイン抗体の半減期が増大するように、血清タンパク質に対して指向性がある。典型的には、前記血清タンパク質はアルブミンである。

典型的に、１つ以上の更なる結合部位は、従来の鎖抗体（及び特にヒト抗体）及び／若しくは重鎖抗体の１つ以上の部分、断片又はドメインを含み得る。例えば、本発明のシングルドメイン抗体は、任意にリンカー配列を介して従来の（典型的にはヒトの）ＶＨ又はＶＬに結合され得る。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、免疫グロブリンドメインに結合された本発明のシングルドメイン抗体を含む。例えば、ポリペプチドは、Ｆｃ部分（ヒトＦｃ等）に結合される本発明のシングルドメイン抗体を含む。前記Ｆｃ部分は、本発明のシングルドメイン抗体の半減期、及び産生を増大するのに有用であり得る。例えば、Ｆｃ部分は、血清タンパク質に結合でき、従ってシングルドメイン抗体の半減期を増大できる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのシングルドメイン抗体は、任意にリンカー配列を介して１つ以上の（典型的にはヒトの）ＣＨ１、及び／又はＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインに結合され得る。例えば、適切なＣＨ１ドメインに結合されるシングルドメイン抗体は、例えば適切な軽鎖と共に、従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片に類似する抗体断片／構造を生成するために用いられ得るが、従来のＶＨドメインの一方又は（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合）一方又は両方が本発明のシングルドメイン抗体に置換されたものである。いくつかの実施形態において、本発明の１つ以上のシングルドメイン抗体は、１つ以上の定常ドメイン（例えばＦｃ部分の一部として／Ｆｃ部分を形成するために用いられ得る２つ又は３つの定常ドメイン）、Ｆｃ部分、及び／又は本発明のポリペプチドに１つ以上のエフェクタ機能を付与する１つ以上の抗体部分、断片若しくはドメインに、（任意に適切なリンカー又はヒンジ領域を介して）結合されてもよく、及び／又は１つ以上のＦｃ受容体に結合する能力が付与され得る。例えば、この目的のために、そしてそれに限定されること無く、１つ以上の更なるアミノ酸配列は、重鎖抗体から、より典型的には従来のヒト鎖抗体から等、抗体の１つ以上のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含んでもよく、及び／又は例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）からの、ＩｇＥからの、又はＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＭ等の他のヒトＩｇからのＦｃ領域を形成してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６７８号は、ラクダ科ＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（すなわちシングルドメイン抗体）を含む重鎖抗体について記載されており、それぞれがシングルドメイン抗体並びにヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む（しかしＣＨ１ドメインを含まない）２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供するために、それはラクダ科ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインがヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインに置換されており、この免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインによりエフェクタ機能を有し、いかなる軽鎖も存在せずに機能できる。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは国際公開第２００６／０６４１３６号に記載されている通りである。特に、ポリペプチドは、ｉ）抗体のＣＬ定常ドメインが本発明に係るシングルドメイン抗体（すなわちＰＳに対するシングル抗体）にそのＮ末端がＣ末端に融合している第１の融合タンパク質と、ｉｉ）抗体のＣＨ１定常ドメインがＰＳと異なる抗原に対するシングルドメイン抗体のＣ末端にそのＮ末端が融合している第２の融合タンパク質からなり得る。他の特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体のＣＨ１定常ドメインがエフェクタ細胞上の活性化トリガー分子（例えばＣＤ１６）に対するシングルドメイン抗体のＣ末端にそのＮ末端が融合している第１の融合タンパク質と、抗体のＣＬ定常ドメインが本発明のシングルドメイン抗体に対してそのＮ末端がＣ末端に融合している第２の融合タンパク質からなる（すなわちＰＳ）。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、血栓性障害の治療に用いられる更なる治療薬にコンジュゲートされている。

いくつかの実施形態において、本発明の治療方法で用いられる本発明のシングルドメイン抗体又は本発明のポリペプチドは、その治療効果を改善するために修飾され得ることが企図される。治療化合物のそのような修飾は、毒性の減少、循環時間の増大、又は生体内分布の改変のために用いられ得る。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、生体内分布を改変する種々の薬物キャリアビヒクルとの組み合わせによって顕著に低減できる。

薬物バイアビリティの改善のための戦略には、水溶性ポリマーの使用がある。種々の水溶性ポリマーは、生体内分布の改変、細胞への取り込み様式の改善、生理的バリアの透過性の変化、及び体内からのクリアランス速度の変化をもたらすことが示されてきた。水溶性ポリマーは、薬物部分を末端基、骨格の一部、又はポリマー鎖におけるペンダント基として含み、標的化又は徐放化効果を得るために合成されてきた。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高い生体適合性と修飾の容易さから薬物キャリアとして広く用いられている。種々の薬物、タンパク質及びリポソームへの付着は、滞留時間の改善及び毒性の減少につながることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端における水酸基及び他の化学的方法を介して活性剤と結合できるが、ＰＥＧ自体は１分子に最大２つの活性剤に制限される。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧ及びアミノ酸のコポリマーは、ＰＥＧの生体適合性を維持しつつ、１分子当たり多数の結合点を有し（より多くの薬物をローディングできる）、種々の用途に適合するように合成設計できるという利点を有する新規のバイオマテリアルとして探索された。当業者は、薬物の効果的な修飾のためのＰＥＧ化技術について知っている。例えば、ＰＥＧとリジン等の三官能性モノマーとの交互ポリマーからなるドラッグデリバリーポリマーは、ＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，Ｎ．Ｊ．）により用いられてきた。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を介してリジンのａ－及びｅ－アミノ基と結合する。そのようなコポリマーは、ＰＥＧの望ましい特性を維持し、ポリマー鎖に沿って厳密に制御され、所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基は、他の分子への誘導体化、架橋又はコンジュゲーションのために用いられ得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の開裂可能な結合を改変することにより、安定で長期間循環するプロドラッグを製造するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／結合基複合体の間隔及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量に影響を与える（ＰＥＧセグメントが小さいほど薬物の負荷が大きくなる）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体の分子量を増大すると、コンジュゲートの循環半減期が増大する。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解される、又は咽頭ろ過を制限する閾値以下の分子量（例えば４５ｋＤａ未満）でなければならない。さらに、循環半減期及び生体内分布の維持に重要なポリマー骨格に加え、特定のトリガー、典型的には標的組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで治療薬をプロドラッグの形態で維持するためにリンカーが使用されてもよい。例えば、この種の組織活性化ドラッグデリバリーは、生体内分布の特定部位へのデリバリーが要求され、治療薬が病変部位又はその近傍で放出される場合に特に有用である。活性化ドラッグデリバリーに用いるための結合基ライブラリは、当業者に周知であり、酵素動態、活性酵素の有病率、及び選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づき得る（例えばＶｅｃｔｒａＭｅｄ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，Ｎ．Ｊにより確立された技術を参照）。そのようなリンカーは、治療的送達のために本明細書に記載された本発明のポリペプチドを修飾するのに用いられ得る。

本発明によると、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、従来の自動ペプチド合成法又は組換え発現により生成され得る。タンパク質を設計し、生成するための一般的な原理は、当業者に周知である。

本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、従来の技術に従って、溶液中又は固体担体上で合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８６ ａｎｄ Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，１９７９に記載されているように、既知のプロトコールに従って用いられ得る。また、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ４３３Ａ等の例示的なペプチド合成機を採用した固相技術によって合成され得る。自動ペプチド合成又は組換法によって生成された所定のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を用いて決定され得る。各ペプチドの化学的認証は、当業者に周知の方法により確立され得る。

他の実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、その生物学的半減期を増大するために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄによる米国特許第６２７７３７５号に記載されているように、以下の変異の１つ以上が導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。代替的に、生物学的半減期を増大するために、抗体は、ＣＨ１又はＣＬ領域内で改変されて、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５８６９０４６号及び６１２１０２２号に記載されているようにＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むことができる。半減期が増大し、母体ＩｇＧの胎児への移行を担う新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ以上の置換、例えばＦｃ領域残基の４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものを含む。

本発明によって企図される、本明細書に記載の本発明のシングルドメイン抗体又は本発明のポリペプチドの他の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を増大するためにペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体又はその断片は、典型的には１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体断片に付着するような条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体等のＰＥＧと反応される。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われ得る。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」の用語は、モノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコール－マレイミド等の他のタンパク質を誘導体化するのに用いられてきたＰＥＧの形態のいずれかを含むことを意図する。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、本技術分野において周知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えばＮｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号及びＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照できる。

本発明により企図される本発明のシングルドメイン抗体又は本発明のポリペプチドの他の修飾は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域とヒト血清アルブミン又はその断片等の血清タンパク質とのコンジュゲート又は融合タンパク質であり、得られる分子の半減期を増大させるための修飾である。そのようなアプローチは、例えばＢａｌｌａｎｃｅらの欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。他の可能性は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域をヒト血清アルブミン等の血清タンパク質に結合可能なタンパク質に融合させて、得られる分子の半減期を増大させることである。このようなアプローチは、Ｎｙｇｒｅｎらの欧州特許第０４８６５２５号に記載されている。

ポリシアル酸は、天然高分子であるポリシアル酸（ＰＳＡ）を用いて、治療用ペプチドやタンパク質の活性寿命の延長及び安定性の改善を行う技術である。ＰＳＡは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療ペプチドのドラッグデリバリーに用いると、ポリシアル酸がコンジュゲートの際に保護的な微小環境を提供する。これは、循環中の治療タンパク質の活性寿命を増大し、免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、ヒトの体内において天然に見られる。何百万年もかけて進化した所定の種の細菌によって採用され、それらの壁をこれによりコーティングするようになった。これらの天然のポリシアリル化された細菌は、分枝模倣によって、体の防御システムを覆うことができる。ＰＳＡは、天然の究極のステルス技術であり、このような細菌から容易に大量に、また所定の物理的特性をもって生産できる。細菌ＰＳＡは、ヒトの体内のＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質に結合しても完全に非免疫原性である。

他の技術は、抗体に結合されたヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ワキシーメイズデンプン由来の修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素で代謝され得る。ＨＥＳ溶液は、通常、不足した血液量を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のヘシル化は、分子の安定性を増大し、腎クリアランスを低減することにより循環半減期を延長することにより、生物活性を向上できる。ＨＥＳの分子量等の種々のパラメータを変更することにより、種々のＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。

（核酸、ベクター、組換え宿主細胞及びそれらの使用）
自動ペプチド合成の代替案として組換えＤＮＡ技術が用いられ、それは、選択のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションし、以下に述べるように発現に適した条件下で培養する。組換え法は、より長いポリペプチドを生成するのに特に好ましい。

種々の発現ベクター／宿主システムが、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む及び発現するために用いられ得る。これらは、以下に限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌等の微生物、酵母発現ベクターで形質変換された酵母（Ｇｉｇａ－Ｈａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ウイルス発現ベクターで感染された昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照）、ウイルス発現ベクターでトランスフェクションされた植物細胞系（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）若しくはバクテリア発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド、例えばＢａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照）、又は動物細胞系を含む。当業者は、タンパク質の哺乳動物発現を最適化するための種々の技術を認識しており、例えばＫａｕｆｍａｎ，２０００、Ｃｏｌｏｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照できる。組換えタンパク質生産に有用な哺乳動物細胞は、以下に限定されないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ－７等）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞を含む。細菌、酵母及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的プロトコールは、当業者に周知であり、以下に簡単に記載される。また、組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系も当業者に周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質を処理する能力、又はタンパク質活性を提供するのに有用な所定の翻訳後修飾を生成する能力で選択され得る。ポリペプチドのそのような修飾は、以下のものに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化を含む。また、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセスは、正しい挿入、折り畳み及び／又は機能にとって受容となり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等の種々の宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするために選択され得る。

本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドの組換え生産において、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドをコードするためのポリヌクレオチド分子を含むベクターを用いることが必要となり得る。そのようなベクターを調製する方法、及びそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を生成する方法は、当業者に周知である。

従って、本発明の更なる対象は、本発明に係るシングルドメイン抗体及び／又はポリペプチドをコードする核酸分子に関する。

典型的に、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それらはプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクター等の適切なベクターに含まれ得る。本明細書において用いられる「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」の用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、宿主を形質転換し、導入した配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進できるビヒクルを意味する。「発現ベクター」、「発現コンストラクト」又は「発現カセット」の用語は、本明細書を通じて互換的に用いられ、核酸コード配列の一部又は全てが転写可能な遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子コンストラクトを含むことを意味する。

そこで、本発明の更なる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、対象への投与時に前記抗体の発現を引き起こす又は誘導するためのプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の調節エレメントを含み得る。動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）及びエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３）等を含む。動物細胞用の発現ベクターは、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入して発現できる限り、いかなるものも用いることができる。適切なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ． １９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ． １９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ． １９８１）、ｐＳＧ１ベータｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ． １９９０）等を含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等の統合型プラスミドを含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターを含む。そのような組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクション、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスの一過性トランスフェクション等の本技術分野において周知の技術によって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等を含む。そのような複製欠陥組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、例えば国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５８８２８７７号、米国特許第６０１３５１６号、米国特許第４８６１７１９号、米国特許第５２７８０５６号及び国際公開第９４／１９４７８号で見られ得る。

本発明のペプチド又はポリペプチドの発現に適する発現ベクターの選択は、当然に、用いる特定の宿主細胞に依存し、当業者の技術範囲内である。

発現には、宿主細胞において目的の核酸の発現を促進するのに用いられ得る、ウイルス及び哺乳動物の両方のソースからのエンハンサー／プロモーター等の適切なシグナルがベクターに提供されることが必要である。通常、発現される核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味する。ヌクレオチド配列は、調節配列が目的のタンパク質（例えばシングルドメイン抗体）をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、作動可能に連結される。従って、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を指示する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、所定のＤＮＡ配列に作動可能に連結される。

本発明の更なる態様は、本発明による核酸及び／又はベクターによってトランスフェクション、感染又は形質転換された宿主細胞に関する。

「形質転換」の用語は、「外来」（すなわち外部又は細胞外）の遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を発現して所望の物質、通常は導入された遺伝子又は配列によってコードされたタンパク質又は酵素を産生することを意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り、発現する宿主細胞は、「形質転換」されたことになる。

本発明の核酸は、適切な発現系において、本発明の抗体を生成するのに用いられ得る。「発現系」の用語は、例えばベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下での宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。一般的な発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例は、以下のものに限定されないが、原核細胞（細菌等）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を含む。具体例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、クルイベロマイセス又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）、並びに初代又は樹立細胞培養物（例えばリンパ芽細胞、線維芽細胞、胚細胞、神経細胞、脂肪細胞等から生成されたもの）を含む。また、例えば、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）等を含む。また、本発明は、本発明に係る抗体を発現する組換え宿主細胞を生成する方法に関し、該方法は、以下のステップを含む：（ｉ）上記のような組換え核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞にインビトロ又はエクスビボで導入するステップ、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養するステップ、及び（ｉｉｉ）任意に、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択するステップ。そのような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の生成のために用いられ得る。

本発明の抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン生成手法により培養液から適切に分離される。

（治療方法及び使用）
本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、ＡＰＣを増強するがＰＳのＴＦＰＩ－補因子活性には全く又はほとんど影響を与えない。本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、マウス血栓症モデルにおいてインビボ抗血栓作用を発揮する。

従って、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、それを必要とする対象における血栓性障害の予防又は治療に特に適する。

さらに他の態様において、本発明は、薬剤として用いるための本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドに関する。

特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において血栓性障害を治療するための、本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドに関する。

すなわち、本発明は、本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象における血栓性障害の予防又は治療方法に関する。

本明細書で用いられる「対象」の用語は、哺乳動物を意味する。本発明の好ましい実施形態において、本発明に係る対象は、血栓性障害に罹患している、又は罹患しやすい任意の対象（好ましくはヒト）を意味する。

本明細書で用いられる凝固障害又は血栓症としても知られている「血栓性障害」の用語は、本技術分野において一般的な意味を有し、過剰な血栓形成のリスクを増大する遺伝性又は後天性の状態を意味する。血管が傷つくと、外部又は組織内へ血液が漏れ始める。正常な凝固は、傷口の出血を止め、治癒のプロセスを開始させるので、傷害の際に重要である。しかしながら、血液が凝固し過ぎる傾向にある場合、それは凝固亢進状態又は血栓症と呼ばれる。健康な人では、凝固促進力と抗凝固力及び線溶力との間に恒常的なバランスが存在する。多くの遺伝的、後天的、及び環境的要因は、凝固に有利なバランスを崩し、静脈（例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ））、動脈（例えば心筋梗塞、虚血性脳卒中）、又は心室での血栓形成という病的な事態を引き起こし得る。血栓は、形成された部位で血流を阻害したり、剥離して塞栓し、遠くの血管を塞ぎ得る（例えば肺塞栓症、塞栓性脳梗塞）。後天性疾患は、通常手術、外傷、薬剤、又は血栓性障害のリスクを増大する医学的状態の結果である。

本発明によると、血栓性障害は、プロトロンビン遺伝子の変異、アンチトロンビン、プロテインＣ及びプロテインＳ等の凝固を防ぐ天然タンパク質の欠損、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩ因子等の凝固因子のレベルの増大、第Ｖ因子ライデン欠陥、低プラスミノーゲン血症、プラスミノーゲン異常症及びプラスミノーゲン活性因子の阻害因子（ＰＡＩ－１）のレベルの増大等の線溶系の異常、線溶不全、中心静脈カテーテル留置、ステントによる再狭窄、肥満、妊娠中の凝固亢進、抗リン脂質抗体症候群、癌、ホモシスチン血症、粘着性血小板症候群、肺塞栓症（ＰＥ）、真性多血症若しくは本態性血小板症候群等の骨髄増殖性障害、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）又は血友病治療（エミグジマブ、フィストシラン等）により誘導される血栓塞栓症等の医原性血栓塞栓症、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、ネフローゼ症候群、急性微小血栓症、遠位微小血管血栓症、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、パジェット－シュロッター病、バッド－キアリ症候群、門脈血栓症、腎静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、頸静脈血栓症及び海綿静脈血栓症等の血栓症、辺縁部虚血、敗血症、貧血、鎌状赤血球症、脳マラリア、肺塞栓症及び脳塞栓症等の塞栓症、並びに脳卒中、心筋梗塞（心臓発作）、心房細動、冠動脈疾患、うっ血性心不全及び人工心臓弁の設置等の心血管疾患を含む。

いくつかの実施形態において、血栓性障害は、以下のものに限定されないが、敗血症、鎌状赤血球貧血、塞栓症（肺及び脳）、並びに心血管疾患からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、血栓性障害は、敗血症又は脳卒中である。

いくつかの実施形態において、血栓性障害は、鎌状赤血球貧血である。

本明細書において用いられる「敗血症」の用語は、本技術分野において一般的な意味を有し、全身の炎症状態によって特徴付けられる重篤な医学的状態を表す。誘発する感染症に関連する症状に加えて、敗血症は、全身に存在する急性炎症の存在を特徴とし、従って、発熱及び白血球数の上昇（白血球増加）又は白血球数の低下及び平均よりも低い体温、並びに嘔吐を頻繁に伴う。特に、敗血症は、感染に対する免疫反応の異常であり、生命を脅かす臓器機能障害と定義され、逐次臓器不全評価スコアが２点以上により定義づけられる。感染症は、感染が疑われる若しくは証明される場合があり、又は臨床症候群は感染が特徴的症状である場合がある。敗血症ショックは、感染と、平均血圧が６５ｍｍＨｇを超え、動脈乳酸値が２ｍｍｏｌ／Ｌを超えることを維持するための血管内圧の必要性とによって定義される。

本明細書において用いられる「脳卒中」の用語は、脳のいずれかの部分への血液又は酸素の流れの中断、減少又は停止に起因する任意の状態を意味する。特に、「脳卒中」の用語は、以下のものに限定されないが、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）及び出血性脳卒中を含む。

本明細書において用いられる「塞栓症」の用語は、血管内に閉塞を引き起こす物質である塞栓が留まることを意味する。塞栓は、血栓（血栓）、脂肪球（脂肪塞栓）、空気若しくは他のガスの泡（ガス塞栓）、又は異物であり得る。塞栓症には種々の型があり、本発明の文脈において、塞栓症は血栓によって引き起こされ、以下に限定されないが、動脈塞栓症、静脈塞栓症又は奇異性塞栓症からなる群から選択される。一般に、動脈塞栓症は、身体のどの部位においても閉塞を引き起こし得る。それは梗塞（血液供給の遮断による組織死）の主要な原因である。心臓又は頸動脈から脳内に塞栓が生じると、虚血による脳梗塞の原因となる可能性が高い。一般に、静脈塞栓症は、全身の静脈に形成された塞栓が心臓の右側を通過した後、常に肺に影響を与えることを意味する。これは、肺の主要な動脈を塞ぐ肺塞栓症を形成し、深部静脈血栓症の合併症となり得る。肺塞栓の発生部位として最も多いのは大腿静脈である。実際の血栓の発生部位は、ふくらはぎの深部静脈が最も一般的である。通常、静脈塞栓症は、肺塞栓症又は脳塞栓症である。

本明細書において用いられる「心血管疾患」の用語は、「動脈血管疾患」とも呼ばれ、身体の心臓、心臓弁、血液及び血管系に影響を及ぼす多数の状態を分類するために用いられる一般用語を有し、心臓又は血管に影響を及ぼす任意の疾患を含み、メタボリック症候群、症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、安定性及び不安定性狭心症、脳卒中、大動脈及びその分枝の疾患（大動脈弁狭窄症、血栓症又は大動脈瘤）、末梢動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、並びに一過性及び永久虚血性のあらゆる心血管イベントを含むがこれらに限定されない。本明細書において用いられる動脈血管疾患は、一般的に非虚血性疾患を意味するのではなく、虚血性疾患又は前虚血性疾患を最も一般的に意味する。本明細書において用いられる「アテローム性動脈硬化症」及び「アテローム血栓症」は、内皮の炎症活性化、血栓形成刺激の源としての炎症性白血球、凝固促進物質の源及び血栓症の間の炎症反応の増幅器としての平滑筋細胞、炎症及び血栓症の媒介物質としての血小板を含む多面的な血管病理に対する複雑な炎症応答に伴う全身性の炎症疾患状態を意味する。動脈は、その内壁に「プラーク」と呼ばれる物質が蓄積することにより硬化し、狭くなる。プラークが発達して大きくなると、動脈の内側が狭くなり（「狭窄」）、血液の流れが悪くなる。狭窄又はプラークの破裂は、幹部の血管の一部又は全部を閉塞させ得る。このため、血管から供給される組織は、酸素供給源を奪われ（虚血）、及び細胞死（壊死）が起こり得る。「ＣＡＤ」又は「冠動脈疾患」は、心臓の筋肉に血液を供給する動脈（冠動脈）が動脈硬化を起こし、石灰化及び／又は狭窄することで発症する動脈血管疾患である。心筋への血流が低下し、血液は多くの必要な酸素を運ぶため、心筋が必要な酸素を受けることができずに心筋が壊死してしまうことがある。ＣＡＤは、急性冠症候群（ＡＣＳ）、心筋梗塞（心臓発作）、狭心症（安定型及び不安定型）、並びに心臓に酸素を多く供給する血管に起こる動脈硬化及びアテローム血栓症等の病態を含む。「ＣＶＤ」又は「脳血管疾患」は、顔及び脳に酸素を多く含む血液を送る血管に起こる動脈硬化及びアテローム血栓症等の動脈血管疾患である。この用語は、脳に血液を供給する頸動脈の「硬化」を意味するのに用いられることが多い。それはＣＡＤ及び／又はＰＡＤ（末梢動脈疾患）との合併疾患として知られている。また、それは虚血性疾患、又は血流の不足を引き起こす疾患とも呼ばれる。ＣＶＤは、脳血管虚血、急性脳梗塞、脳卒中、虚血性脳梗塞、出血性脳梗塞、動脈瘤、軽度認知障害（ＭＣＩ）、及び一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）等の病態を含む。虚血性ＣＶＤは、ＣＡＤ及びＰＡＤと密接に関連すると考えられており、非虚血性ＣＶＤは複数の病態生理を有し得る。

本明細書において用いられる「鎌状赤血球症」又は「ＳＣＤ」は、本技術分野における一般的な意味を有し、赤血球が異常で硬い鎌状の形状をとる遺伝性の血液障害を意味する。赤血球の鎌状化は、細胞の柔軟性を低減し、その結果、生命を脅かす種々の合併症のリスクをもたらす。その用語は、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＳＣ症、ヘモグロビン鎌状βサレステミアを含む。その単一遺伝子疾患は、変異型ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）及び慢性的な血管内溶血により特徴付けられる。鎌状赤血球症患者は、血管閉塞性クライシス（ＶＯＣ）に起因する急性痛のエピソードを経験することが多い。ＶＯＣは、鎌状赤血球貧血の最も一般的な合併症であり、救急外来の受診及び入院の理由になることが多い。

本明細書において用いられる「血管閉塞性クライシス」（ＶＯＣ）の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、微細血管の閉塞により組織への酸素供給が妨げられ、傷害を引き起こすことを意味する。ＶＯＣは非常に痛みを伴うことがあり、医学的な緊急事態として考えられる。

ここで、本発明者らは、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、マウスモデルにおいて血管閉塞性クライシスを抑制し得ることを実証する。

特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における血管閉塞性クライシスを抑制するのに用いるための本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドに関する。

いくつかの実施形態において、対象は、鎌状赤血球貧血に罹患している。

すなわち、本発明は、それを必要とする対象における血管閉塞性クライシス（ＶＯＣ）の予防又は治療方法であって、本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む方法に関する。

典型的には、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチド、並びに上記のような血栓性障害の古典的な治療は、治療上有効な量で対象に投与される。本明細書で用いられる「治療」又は「治療する」の用語は、予防的又は予防的治療と、治癒的又は疾患修飾的治療との両方を意味し、疾患に罹患するリスクがある又は疾患に罹患した疑いのある対象、並びに疾患又は病状に苦しんでいると診断された対象に対する治療を含み、臨床再発の抑制を含む。治療は、医学的障害を有する対象又は最終的に障害を獲得する可能性のある対象に、障害又は再発する傷害の１つ以上の症状を予防、治癒、発症の遅延、重症度の軽減若しくは改善のために、又は当該治療法がない場合に予想されるよりも対象の生存期間を延長するために、投与され得る。「治療レジメン」とは、病気の治療パターン、例えば治療中に用いられる投与パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」又は「導入期間」の用語は、疾患の初期治療に用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。導入レジメンの一般的な目的は、治療レジメンの初期期間中に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、（部分的又は全体的に）「負荷レジメン」を採用してもよく、これには、医師が維持レジメン中に採用するよりも大量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン中に薬剤を投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、又はそれらの両方を含み得る。「維持レジメン」又は「維持期間」の用語は、疾病の治療中の対象の維持、例えば対象を長期間（数か月又は数年）寛解状態に維持するために用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。維持レジメンは、連続的な治療（例えば毎週、毎月、毎年等の一定の間隔で薬剤を投与すること）又は間欠的な治療（例えば、中断された治療、間欠的な治療、再発時の治療、又は特定の予め定められた基準［例えば、痛み、疾患発現等］の達成時の治療）を採用し得る。

本明細書で用いられる「治療上有効な量」は、患者に治療上の利益を付与するために必要な活性剤の最小量を意図する。例えば、患者に対する「治療上有効な量の活性剤」は、患者に影響を与える疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行、又は身体的状態の改善を誘導、向上、又は引き起こす活性剤の量である。本発明の化合物及び組成物の１日の総用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の患者に対する特定の治療上有効な用量レベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、採用する特定の化合物の投与時間、投与経路及び排泄率、治療期間、採用する特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に用いられる薬剤、並びに医学技術において周知の同様の要因を含む種々の要因により決定されるであろう。例えば、所望の治療効果を得るために必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が得られるまで徐々に投与量を増加させることは当業者に周知である。しかしながら、製品の１日の投与量は、成人１人当たり１日に０．０１～１０００ｍｇの広い範囲にわたって変化させ得る。好ましくは、組成物は、治療される患者への投与量を症状に応じて調節するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００ｍｇの活性成分を含む。医薬品は、通常、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分を含み、好ましくは１ｍｇ～約１００ｍｇの有効成分を含む。有効量は、通常、１日当たり０．０００２ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量レベルで供給される。

本明細書で用いられる「投与する」又は「投与」の用語は、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達及び／又は本明細書に記載の若しくは本技術分野において周知の物理的送達の他の方法による等、体外に存在する物質（例えば本発明に係るナノボディ又はポリペプチド）を対象に注射又はその他の物理的送達する行為を意味する。疾患又はその症状が治療される場合、物質の投与は、典型的には疾患又はその症状の発症後に行われる。疾患又はその症状が予防される場合、物質の投与は、典型的には疾患又はその症状の発症の前に行われる。

他の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体及又はポリペプチドは、ベクターと関連付けて送達され得る。本発明のシングルドメイン抗体又は薬物コンジュゲートは、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクター等の適切なベクターに含まれる。従って、本発明の更なる目的は、本発明のシングルドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含むベクターに関する。典型的には、ベクターはウイルスベクターであり、これは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、又は感染性ウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。本明細書において用いられる「ＡＡＶベクター」の用語は、以下のものに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びそれらの変異型を含むアデノ随伴ウイルス血清型から得られるベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の全部又は一部が欠失されているが、機能的なフランキングＩＴＲ配列は保持し得る。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込む能力、大量の外来遺伝物質の移送、広範な種及び細胞型への感染、並びに特殊な細胞系でのパッケージングのために遺伝子送達ベクターとして選択され得る。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入し、複製不能なウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を含み、ＬＴＲ及び／又はパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをレトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にこの細胞株に導入すると（例えばリン酸カルシウム沈殿による）、パッケージング配列によって組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージされ、これが培養液に分泌される。組換えレトロウイルスを含む培地は、その後に回収され、任意に濃縮され、遺伝子導入に用いられる。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞に感染可能である。レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて調節又は構造機能を有する他の遺伝子を含む。より高い複雑性により、ウイルスは潜伏感染の過程のようにそのライフサイクルを調節することができる。レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶの病原性遺伝子を多重に減衰させることにより作製されており、例えばｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆの遺伝子を欠失させることにより生物学的に安全なベクターとして作製されている。レンチウイルスベクターは、本技術分野において周知であり、例えば米国特許第６０１３５１６号及び第５９９４１３６号を参照でき、それらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ベクターは、プラスミドベース又はウイルスベースであり、外来核酸を組み込むため、選択のため、及び宿主細胞への核酸の移入のための必須配列を有するように構成される。目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子も、本技術分野において周知である。従って、関連する遺伝子は、選択されたベクターにクローン化され、続いて目的の標的細胞を形質転換するために用いられる。適切な宿主細胞がパッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターでトランスフェクションされた非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、米国特許第５９９４１３６号に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。これは、ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を供給できる第１のベクターと、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を供給できる他のベクターを用いてパッケージング細胞を生成することを説明するものである。そのパッケージング細胞に異種遺伝子を提供するベクターを導入すると、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。ｅｎｖは、好ましくはヒト及び他の種の細胞の形質転換を可能にする両親媒性エンベロープタンパク質である。典型的には、本発明の核酸分子又はベクターは、「制御配列」を含み、これは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を総称し、受容細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳に提供するものである。これらの制御配列は、選択されたコード化配列が適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳されることが可能である限り、常に存在する必要はない。他の核酸配列は、「プロモーター」配列であり、これは、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味する通常の意味で本明細書で用いられ、ここで、制御配列はＲＮＡポリメラーゼを結合し下流（３’方向）コード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、被分析物、補因子、調節タンパク質等によって誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、被分析物、補因子、調節タンパク質等によって誘導される）及び「構成的プロモーター」が含まれ得る。

特定の実施形態において、本発明に係るシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、血栓性障害の古典的な治療と組み合わせて用いられ得る。

従って、本発明は、それを必要とする対象における血栓性障害の予防又は治療方法であって、前記対象にｉ）本発明のシングルドメイン抗体及び／又はポリペプチドの有効量と、ｉｉ）血栓性障害の治療のための複合製剤として古典的治療とを適用することを含む、方法に関する。

本明細書で用いられる「血栓性障害の古典的治療」の用語は、血栓性障害の治療に用いられる、天然又は合成の任意の化合物及び／又は血栓除去術を意味する。

本発明によると、血栓症の治療に用いられる化合物は、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンティン、フルインジオン及びフェニンジオン等のビタミンＫアンタゴニスト、エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン及びティンサパリン等のヘパリン及び誘導体物質、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス及びイドラビオタパリヌクス等の因子Ｘａの合成五糖類阻害剤、ダビガトラン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン及びベトリキサバン等の直接作用経口抗凝固剤、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン及びダビガトラン等の直接トロンビン阻害剤、抗トロンビンタンパク質、バトロキソビン、ヘメンチン、組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、ウロキナーゼ及びテネクトプラーゼ等の組換え組織プラスミノーゲン活性剤（ｒｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、アスピリン、トリフルサル、カンゲロール、チクロピジン、クリオスタゾール、ボラパキサー、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、ジピリダモール、トロンボキサン阻害剤及びテルトロバン等の血小板凝集阻害剤、ＡＣＴ０１７及びレバセプト等の血小板ＧＰＶＩ阻害剤、クリザンリズマブ等のＰ－セレクチンの阻害剤、ＡＢ００２（ＷＥトロンビン）及び可溶性トロンボモジュリン（ＢＤＣＡ－３）等のプロテインＣの活性剤、又は組換え活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）からなる群から選択され得る。

本明細書で用いられる「血栓除去術」の用語は、本技術分野における一般的な意味を有し、血管から血栓を除去する介入的な治療を意味する。一般的に、脳動脈で行われる（介入性脳神経放射線学）。ステント－リトリーバー式血栓除去術は、血管造影室で全身麻酔又は意識下鎮静法下で行うことができる。通常は、右大腿動脈の経皮的アクセスにより、同軸のカテーテルシステムを動脈循環内に押し込む。最終的に、マイクロカテーテルが閉塞部位を越えて配置され、ステント－リトリーバーが血栓を捕えるために展開され、最後にステントは、通常、より大きいカテーテルで連続吸引しながら、動脈から引き抜かれる。脳内の血栓除去術には、直接吸引術という異なる技術がある。これは、閉塞した血管に大きなソフト吸引カテーテルを押し込み、直接吸引して血栓を回収するものであり、ステント－リトリーバー法と組み合わせることでより高い再開通率を達成できる。

本明細書で用いられる「複合治療」、「複合療法」又は「併用療法」の用語は、複数の薬剤を用いる治療を意味する。併用療法は、二剤療法又は二重療法であってもよい。

本発明に係る併用療法に用いられる薬剤は、同時に、別々に又は順次対象に投与される。

本明細書で用いられる「同時投与」の用語は、２つの活性成分を同じ経路で、同時に又は実質的に同時に投与することを意味する。「別々に投与」の用語は、異なる経路で２つの活性成分を同時に又は実質的に同時に投与することを意味する。「順次投与」の用語は、２つの活性成分を異なる時期に投与することを意味し、投与経路は同一又は異なる。

（本発明の医薬組成物及びキット）
典型的には、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチド（単独又はベクターに含まれる）は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び任意に生分解性ポリマー等の徐放性マトリクスと組み合わせて、医薬組成物を形成し得る。従って、本発明のシングルドメイン抗体及びポリペプチドは、医薬組成物の形態で対象に投与される。

「医薬的」又は「医薬的に許容可能」は、哺乳動物、特にヒトに投与されたときに、有害、アレルギー性又は他の不快な反応を生じない分子体及び組成物を適宜意味する。医薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤は、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又はあらゆる型の製剤補助剤を意味する。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性原理は、単独又は別の活性原理と組み合わせて、単位投与形態で従来の医薬支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することが可能である。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶媒等の経口投与形態、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻内投与形態、並びに直腸投与形態を含む。

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤として医薬的に許容可能なビヒクルを含む。これらは、特に等張で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等又はこれらの塩の混合物）、又は乾燥、特に滅菌水又は生理食塩水を加えることにより、場合によって注射可能な溶液の構成を可能にする凍結乾燥組成物であってもよい。

注射に適した医薬品の形態は、無菌の水溶液又は分散液、ごま油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤、及び無菌の注射用溶液又は分散液の即席調製のための無菌粉末を含む。いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動的でなければならない。それは、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。

本発明の阻害剤を遊離塩基又は医薬的に許容可能な塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合して水中で調製され得る。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中で調製され得る。通常の保管及び使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。

本発明のシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドは、中性又は塩の形態で組成物中に配合され得る。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）を含み、それは、例えば塩酸又はリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。

また、キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物、及び植物油等を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤の使用、分散させる場合の必要な粒子径の維持、及び界面活性剤の使用等によって維持され得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物への使用によってもたらされ得る。

無菌注射液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他の成分のいくつかと共に組み込み、その後、ろ過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙した成分のうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに、種々の滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、その予め無菌ろ過した溶液から任意の追加の所望の成分を得る真空乾燥及び凍結乾燥の技術である。

製剤化されると、溶液は、投与形態に適合した方法で、治療上有効な量で投与されることとなる。製剤は、上述のタイプの注射用溶液等の種々の投与形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も用いられ得る。

水溶液での非経口投与の場合、例えば必要に応じて溶液を適切に緩衝可し、液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで、まず等張にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、採用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に周知であろう。投与量には、治療される対象の状態に応じて、必然的にいくらかの変動が生じる。投与に責任を負う者は、いずれにしても、個々の対象に対して適切な投与量を決定する。

静脈内又は筋肉内注射等の非経口投与用に製剤化された本発明の阻害剤に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体、リポソーム製剤、時間放出カプセル、及び現在用いられている他の任意の形態を含む。

本発明の医薬組成物は、血栓性障害の治療に用いられる任意の更なる薬剤を含み得る。

一実施形態において、前記追加の活性剤は、同一の組成物に含まれていてもよく、別々に投与されてもよい。

他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、血栓性障害の予防及び治療における同時の、別々の又は順次の使用のための複合製剤に関する。

最後に、本発明は、少なくとも１つの本発明のシングルドメイン抗体又はポリペプチドを含むキットも提供する。本発明の単離されたシングルドメイン抗体及び／又は本発明のポリペプチドを含むキットは、治療方法における使用を見出す。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明される。但し、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして何ら解釈されるべきでない。

［実施例１］
＜材料及び方法＞
（ファージディスプレイによるＰＳ００３ナノボディの選択）
抗ＰＳナノボディは、本質的に抗ＶＷＦナノボディについて以前に記載されているように同定された（Ａｙｍｅ ｅｔ ａｌ．２０１７）。簡潔には、組換えヒトＰＳ（ｒｈＰＳ）によるラマ（Ｌ．ｇｌａｍａ）１頭の免疫化を、Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｉｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ａｉｘ－Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に外注した。末梢血リンパ球の分離のために血液を採取し、リンパ球の総ｍＲＮＡをシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）ライブラリの構築に用いた。簡潔には、総ｍＲＮＡは、ＣＨ２’プライマーを用いた逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成に用いた。ｓｄＡｂコードＤＮＡ断片をネステッドＰＣＲ反応により取得し、その後、断片をｐＨＥＮ６ファージミドベクターにクローニングした。ライゲーションしたものを用いてコンピテントＴＧ１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を形質転換し、１０^７個を超える形質転換体のライブラリを作製できた。各ｓｄＡｂを曝露したファージを、このライブラリの培養物をＭ１３ＫＯ７－ヘルパーファージで感染させることによりレスキューし、ファージ粒子を、精製ｒｈＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０エポキシビーズと共に、２％のＢＳＡ及び５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４（ＴＢＳバッファー）中で室温にて１時間インキュベートした。磁気ビーズは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳで９回、５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳで２回洗浄した。捕捉されたファージは、５００μＬの１ｍｇ／ｍＬトリプシンを含むＴＢＳと共に室温で３０分間インキュベートすることにより溶出させた。溶出したファージ（５００μＬ）は、５００μＬのＴＢＳで希釈し、５μＬの溶出ファージを段階希釈してＴＧ１Ｅ．ｃｏｌｉに感染させ、プレートに播種し、ＰＳ特異的濃縮性を評価した。溶出したファージ液の残りは、Ｍ１３ＫＯ７－ヘルパーファージを用いてレスキュー後に増幅し、新たなラウンドの濃縮を行った。濃縮は２ラウンド連続で行った。２回目のラウンドの濃縮後、５μＬの溶出ファージを段階希釈してＴＧ１Ｅ．ｃｏｌｉに感染させ、プレートに播種し、アンピシリン耐性シングルコロニーを取得した。真正のＰＳ特異的ナノボディを単離するために、これらのＴＧ１クローンを０．５ｍＬの２ＹＴ培地で９６穴の深穴培養プレートで一晩中培養し、１ｍＭのＩＰＴＧでナノボディ発現を誘導した。ナノボディを含むペリプラズム抽出物を記載のように調製し、直接ＥＬＩＳＡで固定化ｒｈＰＳ又はＢＳＡへの結合を試験した。これにより、ＰＳ００３と名付けられた強力且つ特異的なＰＳバインダを同定することができた。

（ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖナノボディの構築）
細胞質内の細菌発現を可能にするために、ＰＳ００３のｃＤＮＡ配列は、５’ＰｓｔＩと３’ＢｓｔＥＩＩ制限サイトとの間のｐＥＴ２８プラスミドにクローニングされた。このｐＥＴ２８フォーマットにおいて、ＰＳ００３のタンパク質配列は、精製及び検出を容易にするために、Ｎ末端のＨｉｓ６タグ及びＣ末端のヘマグルチニン（ＨＡ）タグにより挟まれる（図１）。ＰＳ００３の親和性及び活性を潜在的に増大するために、ＰＳ００３の２つの２つのｃＤＮＡ配列を柔軟な（ＧＧＧＳ）_４リンカーを介して融合することにより、２価の形態のＰＳ００３ｂｉｖ（ＰＳ００３ｂｉｖと命名）が構築された（図１）。ＰＳ００３ｂｉｖのｃＤＮＡ配列を合成し（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限サイト間でｐＥＴ２８プラスミドにクローニングした。１価の抗ＶＷＦナノボディ（ＫＢ０１３）及び２価の抗ＶＷＦナノボディ（ＫＢ００４ｂｉｖ）をインビトロ機能アッセイにおいてコントロールとして用いた。これらのナノボディのｃＤＮＡ配列は、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖについて上述したように、ｐＥＴ２８プラスミドにクローニングされた。我々のインビボＦｅＣｌ_３誘導血栓症モデルでは、２価の抗ＰＳナノボディをコントロールとして用いた。この抗ＰＳナノボディは、ＰＳ００４ｂｉｖと命名され、ＥＬＩＳＡウェルに固定化したＰＳ上のファージ粒子を選択することで同定した１価のナノボディ（ＰＳ００４）から構築されたものである。３ラウンドの濃縮により、ＥＬＩＳＡで固定化したＰＳに強く特異的に結合する１価のナノボディ（ＰＳ００４）を同定した。ＰＳ００４ｂｉｖのｃＤＮＡ配列を合成し、ｐＥＴ２８プラスミドにクローニングした。本研究で用いた全てのナノボディは、Ｎ末端のＨｉｓ６タグ及びＣ末端のＨＡタグで挟まれ、全ての２かのナノボディは（ＧＧＧＳ）_４リンカーにより連結されている。

（ナノボディの発現及び精製）
１価及び２価のナノボディをコードするプラスミドを用いて、コンピテントＴ７ＳＨｕｆｆｌｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換した。各ナノボディについて、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地中、３０℃で０．４＜ＯＤ_{６００ｍｍ}＜０．６までカナマイシン耐性のシングルコロニーを培養した。その後、０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加により、ナノボディの細胞質発現を誘導し、２０℃で１６時間ナノボディを産生させた。細菌ペレットを、１０μｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）及び２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４に再懸濁し、ＳｉｇｍａＦＡＳＴプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を添加した。懸濁液を超音波処理し、１２０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。溶出液を－２０℃で凍結した。

１価のナノボディは、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。簡単に言うと、溶出液を３７℃で解凍し、４７００ｒｐｍで２０℃、３０分間遠心分離を行った。上清を５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ ＴＡＬＯＮ Ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍＬ／ｍｉｎでロードした。カラムを、２０カラム容量を超える５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、１０ｍＭのイミダゾールを含む２０カラム容量を超える５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄した。結合したナノボディを１５０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で溶出し、画分（１ｍＬ）を回収した。各画分中のタンパク質含量をＯＤ_{２８０ｎｍ}の測定により求め、目的の画分をプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳバッファー）に対して透析を行った。透析液は、最終的にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルタ装置（３ｋＤａカットオフ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮された。

２価のナノボディは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。簡単に言うと、溶出液を３７℃で解凍し、４７００ｒｐｍで２０℃、３０分間遠心分離を行った。上清を５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に０．５～１ｍＬ／ｍｉｎでロードした。カラムを、２０カラム容量を超える５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．３ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合したナノボディを０．１Ｍのグリシン ｐＨ２．７で溶出した。１００μＬの１ＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．５を含むチューブに画分（１ｍＬ）を回収した。各画分中のタンパク質含量をＯＤ_{２８０ｎｍ}の測定により決定し、目的の画分をプールし、ＴＢＳバッファーに対して透析を行った。析液は、最終的にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルタ装置（３ｋＤａカットオフ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮された。

（ＰＳ００３のエピトープマッピング）
ＰＳ ＳＨＢＧ様ドメインのみの組換型（ｒＳＨＢＧ）は、以前に発現させ精製された（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＢＳＡ、精製ｒｈＰＳ及び精製ｒＳＨＢＧ（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中８μｇ／ｍＬで６０μＬ）を９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で１６時間固定化した。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、固定濃度のＰＳ００３（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中２ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢを添加した。反応は、５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加により停止させた。その結果、ＰＳ００３のエピトープがＰＳのＳＨＢＧ様ドメイン内に配置されていることが示された（図４）。さらに、ＰＳ００３のエピトープは、Ｇａｓ６のＳＨＢＧ様ドメイン内には見られなかった（図４）。ＰＳとＧａｓ６のＳＨＢＧ様ドメインとの間で保存されていないアミノ酸残基が、ＰＳ００３とＰＳとの間の相互作用を仲介する候補であると考えられる。

＜結果＞
（ｒｈＰＳに対するＰＳ００３の特異性）
ＰＳ００３の特異性を知るために、精製ＰＳ００３のＰＳ及び相同ドメイン（Ｇｌａ及びＥＧＦ様ドメイン）を含む種々のビタミンＫ依存性タンパク質への結合能を試験した。組換えヒトＰＳ（ｒｈＰＳ）、組換えヒトＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ、Ｐｆｉｚｅｒ）、組換えヒトＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、血漿由来タンパク質Ｚ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ）、及び組換えヒトＧａｓ６（ｒｈＧａｓ６）（Ｃｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１２）（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）を、９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で１６時間固定化させた。３×２００μＬの洗浄バッファー（０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、精製ＰＳ００３の一定濃度（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳに２０ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に１ｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。その結果、ＰＳ００３はｒｈＰＳにのみ強く結合し（図２）、ＰＳ００３はＰＳに特異的に結合することが示唆された。

ビタミンＫ依存性Ｇａｓ６は、ＰＳと高い相同性（全体の４７％）を有し、他のビタミンＫ依存性タンパク質とは対照的に、ＳＨＢＧ様ドメインも含む。ＰＳ００３のＰＳに対する特異性をさらに確認するため、ｒｈＰＳとｒｈＧａｓ６（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳに１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）を９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに４℃で１６時間固定化させた。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、濃度が増大するＰＳ００３（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳに０～２００ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に１μ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。その結果、ＰＳ００３はｒｈＰＳに強く、用量依存的に結合したが、ｒｈＧａｓ６には結合せず（図３）、ＰＳ００３のｒｈＰＳに対する特異性が確認された。

（サンドイッチＥＬＩＳＡにおける固定化ＰＳ００３に対する組換え及び血漿由来ＰＳの結合）
我々のファージディスプレイ戦略において、ＰＳ００３は、磁気ビーズに共有結合したｒｈＰＳの固定化体上で選択された。さらに、ＰＳ００３はＥＬＩＳＡウェルに固定化したｒｈＰＳに強く結合することがわかった。ＰＳ００３が非ネイティブの固定化されたｒｈＰＳのみを認識することを排除するために、溶液中のｒｈＰＳと固定化ＰＳ００３の結合をサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。また、ＰＳ００３は組換型ＰＳを選択したため、溶液中の血漿由来型ＰＳのＰＳ００３への結合を同じサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。簡単に言うと、ｒｈＰＳと精製血漿由来ヒトＰＳ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）を９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で１６時間固定化させた。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、濃度が増大するＰＳ００３（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳに０～２００ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に１μ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。その結果、ＰＳ００３は組換型又は血漿由来ヒトＰＳと結合し（図５）、ＰＳ００３のＰＳに対する結合は非ネイティブの固定化形態に制限されないことが示された。

（ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのＥＬＩＳＡにおける固定化ＰＳに対する結合の比較）
９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに組換えヒトＰＳ（ｒｈＰＳ）（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に２．５μｇ／ｍＬで６０μＬ）を４℃で１６時間固定化した。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、濃度が増大するＰＳ００３（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳに０～２００ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗Ｈｉｓ６タグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートしてナノボディを検出した。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。各ナノボディについて、３つの個別実験を単純化して行い、結果は各ナノボディの最大結合のパーセンテージで表される。結合曲線は、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの両方が、固定化ｒｈＰＳに効率的に結合することを示した（図６）。

ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのＰＳへの結合能力をさらに比較するために、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのｒｈＰＳに対する親和性は、単純化して行った３つの個々の実験において増大する濃度（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に０．６、１．２５、２．５及び５μｇ／ｍＬ）で固定化したｒｈＰＳに対する結合曲線を得ることによって、記載されている（Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８７）ように評価された。各ナノボディについて、解離定数（Ｋ_Ｄ）を質量作用の法則に基づく式を用いて決定した。

この方法に基づくと、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖのＫ_Ｄは、それぞれ２６．８±２．７ｎＭ及び１３．８±５．７ｎＭであり、ＰＳ００３ｂｉｖはｒｈＰＳと少し高い親和性（１．９倍）で結合することが示唆された。

（ＰＳに対するＰＳ００３ｂｉｖのエピトープマッピング及びＰＳ００３ｂｉｖの特異性）
ｒｈＰＳ、ＰＳ ＳＨＢＧ様領域単独の組換型（ｒＳＨＢＧ）（Ｓａｐｏｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．２００３）、組換えヒトＧａｓ６（ｒｈＧａｓ６）、又はＢＳＡ（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）中に１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）を９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に、４℃で１６時間固定化した。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、０．５ｎＭのＰＳ００３ｂｉｖ（５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び２％のＢＳＡを含むＴＢＳ、５０μＬ／ウェル）を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗Ｈｉｓ６タグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び２％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートして結合ナノボディを検出した。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。各ナノボディについて、３つの個別実験を単純化して行い、結果はｒｈＰＳ上で得られたＡｂｓ_{４５０ｎｍ}のパーセンテージで表される。３つの個別実験を簡略化して行った。

その結果、ＰＳ００３ｂｉｖはｒｈＳＢＨＧに効率よく結合し（図７）、ＰＳ００３ｂｉｖのエピトープがＰＳのＳＨＢＧ様領域内に配置されていることが示された。この領域はＧａｓ６にしか見られないため、ＰＳ００３ｂｉｖがｒｈＧａｓ６に結合しないことは（図７）、ＰＳ００３ｂｉｖがＰＳに特異的であることを強く示唆した。

（ＡＰＴＴベース血漿凝固アッセイでのＰＳのＡＰＣ－補因子活性におけるＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの増強効果）
我々は、ＫＣ４ Ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ（Ｓｔａｇｏ）上で市販のＡＰＴＴベースの血漿凝固アッセイ（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＰＳ、Ｓｔａｇｏ）を用いて、ＦＶａ及びＦＶＩＩＩａの不活性化においてＡＰＣの補因子として作用するｒｈＰＳの能力を測定した。簡単に言うと、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳで希釈した２５μＬのｒｈＰＳを、ＡＰＣ（Ｒ２試薬、２５μＬ）及びウシＦＶａ（Ｒ３試薬、２５μＬ）と共に、２５μＬのＰＳ欠損血漿（Ｒ１試薬）に加えた。３７℃で２分間インキュベートした後、５０ｍＭのＣａＣｌ_２を２５μＬ加えることにより凝固を誘導した。このアッセイにおいて、ＡＰＣがＰＳ欠損血漿の凝固時間を延長し、ｒｈＰＳ（最終濃度５ｎＭ）をＡＰＣと共に加えると、凝固時間は用量依存的にさらに延長した（図８Ａ）。この延長は、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を反映する。このアッセイにおいて、ｒｈＰＳは、ＡＰＣの非存在下では凝固時間を延長しない（図８Ａ）。このアッセイにおいて、ＡＰＣの抗凝固活性を増強するｒｈＰＳの能力は、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を強力にブロックすることが大きく記載されていたポリクローナル抗ＰＳ抗体（ＤＡＫＯ、Ａ０３８４）により消失し（データは示さず）、このアッセイがｒｈＰＳの存在に非常に依存することがさらに示された。

容量反応曲線は、ｒｈＰＳが一定濃度のＡＰＣの存在下で用量依存的に凝固時間を延長することを示した（図８Ｂ）。ナノボディの阻害又は刺激効果を検出できるように、比率ｔ_＋ＰＳ／ｔ_－ＰＳが２以下となるｒｈＰＳの中間濃度（６ｎＭ）を選択した。

次に、我々は、ｒｈＰＳ（６ｎＭ）がＡＰＣの抗凝固活性を増強する能力に対するＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果を試験した。ＰＳ００３、ＫＢ０１３、ＰＳ００３ｂｉｖ及びＫＢ００４ｂｉｖを、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中でｒｈＰＳ（３０ｎＭ）と共に１０μＭで、室温で１５分間プレインキュベートした。ｒｈＰＳ±ナノボディの混合物（２５μＬ）を、ＡＰＣ（Ｒ２試薬、２５μＬ）及びウシＦＶａ（Ｒ３試薬、２５μＬ）と共に、２５μＬのＰＳ欠損血漿（Ｒ１試薬）に加えた。３７℃で２分間インキュベートした後、５０ｍＭのＣａＣｌ_２を２５μＬ加えることにより凝固を誘導した。ｒｈＰＳ及びナノボディの最終濃度は、それぞれ６ｎＭ及び２μＭであった。実験はトリプリケートで行った。

ｒｈＰＳ及びＡＰＣの存在下において、非存在下（ＴＢＳ）、１価（ＫＢ０１３）及び２価（ＫＢ００４ｂｉｖ）ナノボディの存在下（最終濃度２μＭ）で凝固時間が約２倍に延長され、ｒｈＰＳの通常のＡＰＣ－補因子を反映した（図８Ｃ）。一方、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖ（最終濃度２μＭ）の存在下では、凝固時間がさらに２．８倍及び３．６倍延長され、従ってＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖが、それぞれの対照ナノボディと比較して、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性が驚くほど増強する効果があることが示された（図８Ｃ）。さらに、ＰＳ００３ｂｉｖのｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性に対する増強効果は、ＰＳ００３よりも高かった。

先の結果は、ｒｈＰＳの存在下での凝固時間（ｔ_＋ＰＳ）のｒｈＰＳの非存在下での凝固時間（ｔ_－ＰＳ）に対する比として表した（図８Ｄ）。統計学的検定として、独立スチューデントｔ検定を用いた。

（インビトロＦＶａ不活性化アッセイにおけるＰＳのＡＰＣ－補因子活性でのＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果）
ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖがｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を増強する能力は、精製タンパク質を用いて、ｒｈＰＳ存在下で、ＡＰＣによるＦＶａの特異的タンパク質分解不活性化を測定するインビトロアッセイで評価された。血漿由来ヒトＦＶａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８０ｎＭ）を、２５μＭのＰＣ／ＰＥ／ＰＳリン脂質ベシクル、並びに５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．２％のＰＥＧ、及び０．２％のＢＳＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）中の濃度を増大したｒｈＰＳ（０～１００ｎＭ）（「ＦＶａ不活性化混合物」）の存在下で、血漿由来ヒトＡＰＣ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，０．５ｎＭ）で２０分間不活性化させた。ＦＶａ不活性化混合物を、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．２％のＰＥＧ及び０．２％のＢＳＡを含むＴＢＳで希釈して（１：１０）、反応を停止させた。次に、血漿由来ヒトプロトロンビン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００ｎＭ）及びＦＸａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２００ｎＭ）を用いたプロトロンビナーゼアッセイで、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．２％のＰＥＧ及び０．２％のＢＳＡと、５０μＭのＰＣ／ＰＥ／ＰＳリン脂質ベシクルとを含むＴＢＳ中で、残存ＦＶａ活性を測定した。トロンビンのアミド分解活性は、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＰＥＧ及び０．２％のＢＳＡを含むＴＢＳ中で発色基質（ｐＮＡＰＥＰ０２３８，２００μＭ）を用いて追跡し、進行曲線の傾きを算出した。ＦＶａ不活性化混合物中の各ｒｈＰＳ濃度について傾きを求め、ＦＶａ活性の値は、ｒｈＰＳ存在下で得られた傾きとｒｈＰＳ非存在下で得られた傾きとの間の比として表された。３回の実験を簡便に行った。

その結果、ｒｈＰＳは、ＡＰＣのＦＶａを不活性化する能力を用量依存的且つ非常に効率的に増強することが示され（図９Ａ）、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果を評価するために６ｎＭのｒｈＰＳ濃度が選択された。我々のアッセイがｒｈＰＳの存在に依存していることを確認するために、我々はまた、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を強力にブロックすることが主に記載されているポリクローナル抗ＰＳ抗体（ＤＡＫＯ、Ａ０３８４）を用いた。そして、８０ｎＭのＦＶａを、０．５ｎＭのＡＰＣ、２５μＭのＰＣ／ＰＳ／ＰＥリン脂質ベシクルを用いて２０分間不活性化し、６ｎＭのｒｈＰＳを、ナノボディ（ＰＳ００３、ＰＳ００３ｂｉｖ、コントロール１価ナノボディＫＢ０１３及びコントロール２価ナノボディＫＢ００４ｂｉｖ、最終濃度１０μＭ）、ウサギポリクローナル抗ＰＳ抗体（α－ＰＳ、ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）、及びウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）を用いて又は用いずに（ＴＢＳ）１５分間プレインキュベートした。残存ＦＶａ活性は、先に説明したようにプロトロンビナーゼアッセイを用いて各条件で測定し、ｒｈＰＳをナノボディ又は抗体の非存在下（ＴＢＳ）でプレインキュベートしたときに得られるＦＶａ活性と比較した。３つの実験を単純化して行い、統計的検定として独立スチューデントｔ検定を用いた（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

その結果、このＡＰＣ－補因子活性アッセイにおいて、ブロッキング抗ＰＳ抗体（α－ＰＳ、ＤＡＫＯ）は、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性を効果的に阻害することが示された（図９Ｂ）。ＡＰＴＴベースのＡＰＣ－補因子活性をアッセイで観察されたこととは対照的に、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖは、この「還元主義」ＦＶａ不活性化アッセイにおけるｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性に対して増強効果を示さなかった（図９Ｂ）。

（ＰＳのインビトロＴＦＰＩα－補因子活性アッセイにおけるＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖの効果）
ＴＦＰＩαによるＦＸａの直接阻害をｒｈＰＳが増強する能力を評価するために、インビトロアッセイが開発された。１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．２％のＰＥＧ、０．２％のＢＳＡ及び２５μＭのＰＣ／ＰＳ／ＰＥリン脂質ベシクルを含む最終容量１００μＬのＴＢＳ中で、ＦＸａに特異的な発色基質（ｐＮＡＰＥＰ、Ｃｒｙｏｐｅｐ、４００μＭ）に対する血漿由来のヒトＦＸａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，最終濃度０．２ｎＭ）のアミド分解活性を、６０分間で８秒ごとに監視した。ＦＸａのアミド分解活性を阻害するために、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された組換えヒト完全長ＴＦＰＩα（Ｔｉｌｍａｎ Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより譲り受けた）を最終濃度５ｎＭで用いた。我々は、ＴＦＰＩα単独では弱く阻害されるが、ｒｈＰＳ（最終濃度２０ｎＭ）がＴＦＰＩαによるＦＸａ阻害を効果的に増強する実験条件を選択した（図１０Ａ）。ＴＦＰＩαの非存在下において、ｒｈＰＳはアミド分解活性ＦＸａに影響を与えなかった（データは示さず）。

ｒｈＰＳがＴＦＰＩαの阻害活性を増強する能力は、ブロッキング用のウサギポリクローナル抗ＰＳ抗体（α－ＰＳ）（ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）と共に室温で１５分間プレインキュベートすることで消失し、ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ、最終濃度０．５μＭ）では消失しなかった（図１０Ｂ）。

ｒｈＰＳをＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖ、又はそれぞれの１価（ＫＢ０１３）及び２価（ＫＢ００４ｂｉｖ）対照ナノボディ（最終濃度１０μＭ）と共に室温で１５分間プレインキュベートした場合、ＴＦＰＩαの阻害活性を増強するｒｈＰＳの能力が評価された。各条件下でのＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害のための動力学定数（ｋ_ｏｂｓ）を、以前に記載されているように（Ｎｄｏｎｗｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）、進行曲線から計算した。結果は、ナノボディ非存在下（ＴＢＳ）でのｒｈＰＳのＴＦＰＩα－補因子活性に対するパーセンテージで表し、３つの実験を単純化して行い、統計的検定として独立スチューデントのｔ検定を用いた。

その結果、このインビトロ機能アッセイにおいて、ＰＳ００３及びＰＳ００３ｂｉｖは、ｒｈＰＳのＴＦＰＩα－補因子活性を増強せず、むしろわずかに阻害することを示した（図１０Ｃ）。

（固定化した組換えマウスＰＳ（ｒｍＰＳ）に対するＰＳ００３ｂｉｖ及びＰＳ００４ｂｉｖの結合）
ｒｈＰＳについては、組換えマウスＰＳ（ｒｍＰＳ）をＨＥＫ２９３細胞で１０μｇ／ｍＬのビタミンＫ１の存在下で発現させ、以前に説明されたように（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２００９）２段階陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。９６ウェルＮＵＮＣ ＭａｘｉｓｏｒｐプレートにｒｍＰＳ（５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むＴＢＳ中に１０μｇ／ｍＬで６０μＬ）を４℃で１６時間固定化した。３×２００μＬの洗浄バッファー（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）でウェルを洗浄し、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び５％のＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、増大する濃度のＰＳ００３ｂｉｖ及びＰＳ００４ｂｉｖ（５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に０～５０ｎＭ、５０μＬ／ウェル）を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１％のＢＳＡを含むＴＢＳ中に２μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を室温で１時間インキュベートして結合ナノボディを検出した。ウェルを３×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬのＴＭＢバッファーを添加した。５０μＬの２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。

その結果、ＰＳ００３ｂｉｖは、ｒｍＰＳと強く結合し（図１１）、ＰＳ００３ｂｉｖはマウスにおける血栓症及び出血モデルで試験できることが示された。ＰＳ００４ｂｉｖはこのアッセイでｒｍＰＳに結合しなかったため（図１１）、ＰＳ００３ｂｉｖの対照ナノボディとして、我々のマウスインビボモデルにおいて使用できる可能性がある。

マウスとヒトとのＰＳはＳＨＢＧ様領域間で７８％の配列相同性を有しているため、この結果はＰＳ００３ｂｉｖのエピトープを特定するのにも役立ち得る。実際、候補となるアミノ酸残基は、ヒト及びマウスのＰＳのＳＨＢＧ様領域では保存されているが、ヒトのＧａｓ６のＳＨＢＧ様領域では保存されていない可能性が高い。

（マウスＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルにおけるＰＳ００３ｂｉｖのインビボ抗血栓症効果）
塩化第二鉄（ＦｅＣｌ_３）傷害を、本質的に以前に記載されたように（Ａｙｍｅ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０）、４～５週齢のＣ５７ＢＬ６／ＪＲｃｃＨｓｄ雄マウスに誘発させた。血栓形成の可視化を容易にするために、ペントバルビタールで麻酔したマウスの血小板を、ローダミン６Ｇ（３．３ｍｇ／ｋｇ、すなわち０．９％のＮａＣｌ中に１ｍｇ／ｍＬで２．５μＬ／ｇのローダミン６Ｇ）の眼窩後部叢への静脈内注射によりインビボで蛍光標識化した。ＰＳ００３ｂｉｖ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＳ００４ｂｉｖ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は同量のＴＢＳバッファー（Ｃｔｌ）を０．９％ＮａＣｌで希釈し、同時に投与した。代替的に、血栓症モデルが凝固の薬理学的阻害に感受性があることを確認するために、ローダミン６Ｇ単独の静脈内注射の後に２００ＵＩ／ｋｇの低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ、Ｌｏｖｅｎｏｘ）を皮下注射した。標識化血小板を１０分間循環させた後、ＦｅＣｌ_３溶液（水中で１０％）を腸間膜血管に局所投与し、倒立型落射蛍光顕微鏡（×１０）（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｕ）で血栓形成をリアルタイムで観察した。各マウスについて、１つの静脈及び１つの動脈を分析した。統計分析は、クラスカル－ウォリス及びダンの検定を介して評価した。その結果、ＰＳ００３ｂｉｖはＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルにおいてマウスの腸間膜血管で抗血栓作用を発揮することを示した。ＰＳ００３ｂｉｖでマウス処理すると、特に静脈の閉塞が遅延した（図１２Ａ）。ＰＳ００３ｂｉｖを投与したマウスの細動脈においても、コントロールのナノボディと比較して同様の傾向が見られたが、統計的な差には至らなかった（図１２Ａ）。また、ＰＳ００３ｂｉｖの投与は、血栓の安定性及び血栓塞栓の高い発生率に関連していた（図１２Ｂ）。これらのＰＳ００３ｂｉｖの明白な抗血栓効果は、少なくとも部分的に、ｒｈＰＳのＡＰＣ－補因子活性に対するＰＳ００３ｂｉｖの増強効果を反映している可能性がある。

我々のＡＰＣ－及びＴＦＰＩ－補因子活性アッセイで用いられたコントロールの２価抗ＶＷＦナノボディ（ＫＢ００４ｂｉｖ）は、ＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルで用いられなかったことに注意すべきである。実際、このナノボディでマウスを処理すると、１匹のマウスの静脈と動脈で閉塞時間の遅延が生じた。従って、我々は、組換えマウスＰＳに結合できない自社製の２価抗ＰＳナノボディ（ＰＳ００４ｂｉｖ）を用いることにした（図１１）。

（マウス尾部クリップ出血モデルにおける生理学的止血のＰＳ００３ｂｉｖの効果）
麻酔したＣ５７／ＢＬ６マウスにＰＳ００３ｂｉｖ（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射するか、ＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルで説明したように、低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）（Ｌｏｖｅｎｅｘ、２００ＵＩ／ｋｇ）を皮下注射した。尾を０．９％ＮａＣｌに３７℃で１０分間浸漬し、尾の先端から３ｍｍを切断し、直ちに３７℃で１０ｍＬの０．９％のＮａＣｌを含むチューブに浸漬した。出血時間は、最初の出血停止で定義した。また、２０分間の採血を行い、総出血量を定量化した。各バーは、評価した複数のマウスから得られた平均値を表す。統計学的分散検定としてターキーの多重化比較検定による通常の一元配置分散分析が用いられた。

その結果、２００ＵＩ／ｋｇの低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）投与により、出血時間が有意に延長し、出血量が有意に増加したことから、このマウス出血モデルは薬理学的凝固阻害に感受性があることが示された（図１３）。この容量のＬＭＷＨは、我々のマウスＦｅＣｌ_３誘導性血栓症モデルにおいても閉塞時間を有意に延長した（図１２Ａ）。ＬＭＷＨに対して、ＰＳ００３ｂｉｖでは、出血時間及び出血量の両方に有意な影響はなかった（図１３）。これらの結果は、ＰＳ００３ｂｉｖの投与によるＰＳの抗凝固活性の増強が生理学的止血の障害とは関連しないとする我々の仮説を支持するものであった。従って、本研究は、ＰＳ００３ｂｉｖの強力且つ安全な抗血栓剤としての治療可能性を示唆するものであった。

＜考察＞
我々は、ＰＳ００３／ＰＳ００３ｂｉｖナノボディは、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の治療に有用となり得ることを提案する。ＳＣＤは、ＨＢＢ遺伝子の点変異に起因する遺伝病であり、脱酸素時にヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の重合を引き起こし、赤血球を鎌状に変形させる。そのような鎌状化は、赤血球の微小血管における通過性を損ない、溶血を起こしやすくする。赤血球の溶血は、血管内皮細胞を活性化し、活性化した内皮に白血球及び血小板を世着させる等の有害なメディエーターを放出する。これらの病的現象は、最終的に微小血管の閉塞を引き起こし、ＳＣＤの特徴である再発性の痛みを伴う血管閉塞性クライシス（ＶＯＣ）を引き起こす。これらの血管閉塞現象は、最終的に末端臓器障害を引き起こし、多くの場合、早期の死亡を引き起こす。

ＶＯＣの病態生理は複雑であり、鎌状赤血球、内皮細胞、血小板及び白血球の相互作用が関与している。また、一般的にＳＣＤ患者は、これらの患者におけるトロンビン－アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、プロトロンビン断片Ｆ１．２及びＤ－ダイマーのレベルの上昇によって証明されるように、慢性の凝固亢進状態であると考えられている（Ａｔａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ ２００７）。この高凝固性状態は、ＳＣＤ患者においてよく報告されている静脈血栓塞栓症及び脳卒中のリスク上昇と関連している（Ｓｐａｒｋｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｐａｗｌｉｎｋｓｉ．ＪＴＨ ２０１７；Ｂｒｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１７；Ｓｈｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１８）。しかしながら、ＳＣＤにおける慢性的な凝固活性化は、ＳＣＤの重要な病態生理学的特徴である血管の炎症を局所的に誘発及び／又は増強する可能性もある。実際、種々の血栓炎症性疾患において、凝固及び炎症が互いに増幅することが長い間認識されており、この凝固及び炎症のクロストークは、ＳＣＤにおける血管閉塞の病態生理の中心であると考えられている（Ｓｐａｒｋｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１３）。

組織因子（ＴＦ）の発現は、ＳＣＤ患者及びＳＣＤのマウスモデルにおいて白血球で増大していることが示されており、ＴＦがＳＣＤにおける凝固亢進に寄与している可能性が高いことを示唆されている。白血球のＴＦは、ＳＣＤにおける凝固活性化に寄与するＴＦの最も可能性が高い供給源と考えられていますが（Ｓｐａｒｋｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｐａｗｌｉｎｓｋｉ．ＪＴＨ ２０１７）、ＴＦは血管内皮細胞においても誘導的に発現している。ＳＣＤの凝固亢進における接触系の役割については、ほとんど知られていない。ＦＸＩＩは、種々の種類の細胞（鎌状赤血球及び内皮細胞等）、並びに内皮細胞、血小板又は単球由来のマイクロベシクルのホスファチジルセリン露出部位で活性化され得る。これは、ＦＸＩＩがアポトーシス細胞によって露出したホスファチジルセリンに結合することができ、その急速な切断と活性化をもたらすという研究（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７）から推論され得る。そのようなホスファチジルセリンによるＦＸＩＩの活性化は、ＳＣＤにおけるＴＦとは別の凝固活性化のトリガーとなり得る。あるいは、ＦＸＩＩ及び接触系は、グリコサミノグリカン及びヘパリン等の肥満細胞由来産物、又は溶血によって放出された糖化ヘモグロビンによって活性化され得る（Ｓｐａｒｋｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｐａｗｌｉｎｓｋｉ．ＪＴＨ ２０１７）。

鎌状赤血球、内皮細胞及びマイクロベシクルの表面におけるホスファチジルセリンの露出は、ＳＣＤにおける凝固能亢進の重要なドライバーである。このホスファチジルセリンの露出は、凝固反応の速度をかなり加速させ、ＴＦの脱離及び活性化も促進し得る（Ａｎｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１９）。興味深いことに、ＰＳはホスファチジルセリンを含むアニオン性リン脂質膜に高い親和性を有し、ＰＳがこれらの部位に蓄積し、トロンビンの生成を局所的に制限する重要な抗凝固性の役割を発揮し得ることが示唆される。しかしながら、ホスファチジルセリンが広く血管内又は血管外に露出することで、ＰＳが捕捉され、血漿プールから枯渇し得る。これは、種々の研究においてＳＣＤ患者に観察されたＰＳの明らかな後天的欠損と一致するであろう（Ｗｈｅｌｉｈａｎ ｅｔ ａｌ．ＪＴＨ ２０１６）。ＰＳの肝臓発現がＨＩＦ－１αを介して低酸素によりダウンレギュレートされることが見出されたことから、急性又は慢性の低酸素症もＳＣＤ患者で観察されるＰＳの血漿レベルの低減に関与し得る（Ｐｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１８）。そのようなＰＳ欠損がどのようにＳＣＤ患者の凝固性亢進に寄与し、血栓性傾向を悪化させるかは不明である。興味深いことに、プロテインＣの欠損もＳＣＤ患者において見られ（Ｗｈｅｌｉｈａｎ ｅｔ ａｌ．ＪＴＨ ２０１６）、ＳＣＤでは抗凝固性プロテインＣ経路がより広範に変化され得ることが示唆されている。実際に、ＳＣＤにおけるＰＳ及びプロテインＣの複合的な欠損は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の抗凝固活性を発揮する能力に大きな影響を及ぼすと予想される。これは、ＳＣＤ患者におけるＦＶＩＩＩレベルの上昇も一因となり得るにもかかわらず、ＳＣＤ患者の血漿に見られるＡＰＣ耐性によって裏付けられている（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｗｈｅｌｉｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）。

重要なことは、局所的な凝固活性化及びトロンビンの生成が、血栓形成時のフィブリン生成能とは独立して、ＶＯＣの病態生理に直接大きな役割を担っている可能性があるということである。実際、トロンビンはフィブリノーゲンを切断してフィブリンを生成するだけでなく、特にＰＡＲ１活性化を通じて内皮細胞、血小板及び白血球の強力な活性化因子である。内皮細胞において、トロンビンはＰＡＲ１依存性の炎症促進作用、アポトーシス促進作用及びバリア破壊作用を発揮する（Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｃｅｕｎｙｎｃｋ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２０１７）。さらに、トロンビンを介した内皮細胞におけるＰＡＲ１の活性化は、ウィルブランド因子（ＶＷＦ）及びＰ－セレクチンを含むバイベル－パラーデ小体のエキソサイトーシスを誘導し（Ｃｌｅａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１４）、鎌状赤血球と内皮細胞との間の相互作用を助長又は増強させる。さらに、そのようなバイベル－パラーデ小体のエキソサイトーシスは、アンジオポエチン－２等の血管血栓炎症の可溶性メディエーターを放出し得る。さらに、トロンビンは、直接又は間接的に内皮細胞におけるホスファチジルセリンの露出を誘導し、その表面で凝固とトロンビン生成を促進及び継続させ得る。

従って、血栓形成及び広範な凝固活性化が無くても、ＴＦ及び内皮表面の接触系によって開始される局所的且つ低レベルのトロンビン生成は、血管炎症及び血管閉塞現象の初期誘因となり得る。最近、抗ＴＦ抗体、ＦＸａ（リバーロキサバン）及びトロンビン（ダビガトラン）を標的とする直接経口抗凝固剤、並びにＰＡＲ１アンタゴニスト（ボラパクサー）は、ＶＯＣのマウスモデルにおいてヘモグロビン誘導性微小血管収縮を顕著に抑制した（Ｓｐａｒｋｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０２０）。従って、トロンビンを介した内皮ＰＡＲ１活性化の薬理学的標的化は、ＳＣＤにおけるＶＯＣを予防及び／又は軽減する魅力的な治療戦略であると思われる。また、本研究は、ＰＳ、ＡＰＣ及び組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）等の天然抗凝固剤によって内皮表面でのトロンビン生成を適切に制御することがＶＯＣを制限するのに重要となり得ることを示唆する。

ＰＳは、活性化された内皮表面に露出したホスファチジルセリンに高い親和性を示し、ＡＰＣとＴＦＰＩαとの両方の補因子として機能するユニークな能力を有する。ＡＰＣ及びＴＦＰＩαの両方の抗凝固活性を刺激することにより、ＰＳは、ＳＣＤにおける内皮細胞表面でのトロンビン生成の制限に中心的な役割を担い得る。その結果、ＰＳは、トロンビンによって誘導される血管閉塞現象の重要な負のレギュレーターである可能性があるが、このことは未だ実験的研究によって確証されていない。

我々は、ＰＳ００３／ＰＳ００３ｂｉｖナノボディによるＰＳのＡＰＣ－補因子活性の増強がＳＣＤ患者における血管閉塞性イベントの予防又は軽減のための新規治療戦略となり得ることを提案する。特に、ＳＣＤ患者にはＰＳ欠損及びＡＰＣ耐性が認められるため、ＰＳ００３／ＰＳ００３ｂｉｖの抗血栓性により、治療中の患者の静脈血栓塞栓症及び脳卒中のリスク低減に寄与し得る。

［参考文献］
本出願を通じて種々の参考文献は、本発明が属する技術の状況について説明する。これらの文献の開示内容は、参照することにより本開示に組み込まれる。

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Claims (16)

1. プロテインＳ（ＰＳ）のＡＰＣ－補因子活性を増強するＰＳに対する単離されたシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
2. 前記ｓｄＡｂは、配列番号１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離されたシングルドメイン抗体。
3. 配列番号４の配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１又は２に記載の単離されたシングルドメイン抗体。
4. 配列番号４の配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載の単離されたシングルドメイン抗体。
5. ＰＳの結合において請求項１に記載のシングルドメイン抗体と交差競合する、交差競合シングルドメイン抗体。
6. 請求項１に記載のシングルドメイン抗体を少なくとも１つ含む、ポリペプチド。
7. 請求項１に記載のシングルドメイン抗体を少なくとも２つ含む、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 請求項１に記載のシングルドメイン抗体を２つ含む、請求項６に記載のポリペプチド。
9. 配列番号５の配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
10. 請求項１に記載のシングルドメイン抗体及び／又は請求項６に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
12. 請求項１０に記載の核酸及び／又は請求項１１に記載のベクターによりトランスフェクション、感染又は形質転換された宿主細胞。
13. 対象における血栓性障害を予防又は治療する方法であって、
    請求項１に記載のシングルドメイン抗体及び／又は請求項６に記載のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
14. 対象における血管閉塞性クライシスを予防又は治療する方法であって、
    請求項１に記載のシングルドメイン抗体及び／又は請求項６に記載のポリペプチドの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
15. 前記血栓性障害は、敗血症、鎌状赤血球貧血、塞栓症（肺及び脳）、脳卒中又は心血管系疾患である、請求項１３に記載の方法。
16. 請求項１に記載のシングルドメイン抗体及び／又は請求項６に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。