CN115884986A

CN115884986A - 抗蛋白s单域抗体和包含其的多肽

Info

Publication number: CN115884986A
Application number: CN202180046679.6A
Authority: CN
Inventors: F·萨勒; C·丹尼斯; D·博热尔; F·亚当; O·克里斯多夫; P·伦廷
Original assignee: Paris Public Relief Institute Aphp; Paris Thackeray, University of; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Paris Public Relief Institute Aphp; Paris Thackeray, University of; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2023-03-31
Also published as: AU2021299932A1; WO2022002880A1; US20230265211A1; JP2023532726A; CA3187283A1; KR20230030644A; EP4153636A1

Abstract

维生素K依赖性蛋白S(PS)是一种天然抗凝血剂，作为活化蛋白C(APC)和组织因子途径抑制物(TFPI)的非酶辅因子。发明人发现了一种抗PS纳米抗体，该抗体通过未知的机制非常令人惊讶地增强了PS的APC辅因子活性。非常有趣的是，该纳米抗体在小鼠受损的肠系膜微血管中发挥抗血栓作用。因此，它构成了一类新型的抗血栓药物，可用于治疗脓毒症、COVID‑19、中风诱发的末梢微血管血栓、镰状细胞病等病理状态下的急性微血栓。因此，本发明涉及针对蛋白S(PS)的可分离的单域抗体(sdAb)以及包含其的多肽。

Description

抗蛋白S单域抗体和包含其的多肽

技术领域

本发明涉及抗蛋白S(PS)的构象单域抗体和包含其的多肽及其用途，特别是在治疗领域中的用途。

背景技术

维生素K依赖性蛋白S(PS)是一种天然抗凝血剂，作为活化蛋白C(APC)和组织因子途径抑制物(TFPI)的非酶辅因子。事实上，PS曾被描述为能够增强APC对活化因子V(FVa)和活化因子VIII(FVIIIa)的蛋白水解活性，这非常有效地限制了凝血酶的生成。也有大量报道称PS可增强TFPI-α对FXa的抑制作用(Hackeng等人.2006)，尽管这种辅因子活性的生理学意义尚不明确。此外，PS最近被描述为活化因子IX(FIXa)的直接抑制剂(Plautz等人.2018)。PS缺乏患者的临床表现证实了PS的生理重要性。PS轻度缺乏会增加静脉血栓形成的风险，而PS严重缺乏会导致严重的威胁生命的血栓表型(即暴发性紫癜伴微血管血栓，尤其是真皮血管和弥散性血管内凝血)。在小鼠中，由于严重的血栓性血凝病和大面积脑出血，PS的完全缺乏是胚胎致死的(Saller等人.2009；Burstyn-Cohen等人.2009)。在血友病小鼠中，PS在关节中高度表达，这可能部分解释了在血友病关节中观察到的高度抗凝血环境(Prince,Bologna等人.2018)。有趣的是，PS的缺乏或其多克隆抗体的药理抑制导致了关节积血的显著减少。

在此背景下，发明人旨在开发直接针对PS的纳米抗体，作为调节PS抗凝血活性的原始且有效的工具。纳米抗体，或单域抗体(sdAb)是存在于骆驼科动物体内的重链抗体(HcAb)的可变区(VHH)。尽管它们尺寸很小(15kDa)，分离的纳米抗体可以完全识别它们的同源抗原。此外，由于其较小的尺寸和理化性质，与传统的免疫球蛋白相比具有多种优势。例如，即使从其来源的HcAb的剩余部分中分离出来，它们仍然保持着高度的稳定性。此外，它们可以在高浓度下溶解，并且被认为在体内表现出优异的组织渗透性。因此，纳米抗体已成为一类新型的、有前景的治疗性抗体。此外，它们可以在大肠杆菌中表达，并且可以很容易地与其他纳米抗体结合以产生多价或多特异性物种。与经典的单克隆抗体相比，纳米抗体的优势之一是可以通过其突出的互补决定区3(CDR3)识别隐性表位。发明人因此推断，抗PS纳米抗体可能允许以非预期的方式识别能够调节PS抗凝血活性的原始抗体。

迄今为止，仍然需要开发更安全的抗血栓药物。事实上，目前使用的抗血栓药物如抗血小板药物(如阿司匹林和氯吡格雷)或抗凝血药物(如肝素衍生物、华法林)与出血风险增高有关，因为它们干扰了生理性止血反应。相比之下，用抗PS纳米抗体增强APC的抗凝血活性可能对止血作用影响较小，可能与出血风险增高无关。

生理性药物如高密度脂蛋白(Griffin等人.1999；Fernandez等人.2015)、心磷脂(Fernandez等人.2000)或骨骼肌肌球蛋白(Fernandez等人.2000)等已被报道可增强APC的抗凝血活性。然而，迄今为止尚未开发出能够增强APC抗凝血活性的药物。有趣的是，蛋白C药物活化剂目前被研究作为一种潜在的抗血栓药物。该活化剂是凝血酶变体W215A/E217A(WE凝血酶或AB002)，其丧失了促凝血特性，但仍能激活蛋白C成为APC(Cantwell等人.2000)。尽管，当患者全身施用外源性APC或通过高水平可溶性血栓调节蛋白全身活化蛋白C(Dargaud等人.Blood 2015)时与出血倾向增加相关，施用AB002仅轻微损害止血作用(Gruber等人.2002)。这可能至少部分归因于AB002在血栓表面的局部作用，其中APC可能由AB002原位产生，而APC有限地逃逸进循环中(Gruber等人.2007)。这可以解释为什么AB002在各种血栓形成的动物模型中被描述为能有效阻断血栓传播(Gruber等人.2002；Tucker等人.Blood 2020)，而没有巨大的全身性抗凝血作用。

本发明人开发的针对PS的纳米抗体可用于治疗例如脓毒症或中风等急性病状，其中微血管血栓起主要致病作用。

发明内容

为了识别抗PS纳米抗体，发明人利用了UMR_S1176开发的平台，该平台允许我们能够筛选出一个由PS免疫美洲驼产生的大型纳米抗体库。他们发现了一种抗PS纳米抗体，其通过未知的机制非常惊人地增强了PS的APC辅因子活性。非常有趣的是，这种纳米抗体在小鼠受损的肠系膜微血管中发挥了抗血栓作用。因此，它构成了一类新型的抗血栓药物，可用于治疗脓毒症、COVID-19或中风诱导的末梢微血管血栓等病理状态下的急性微血栓。

因此，本发明涉及一种针对蛋白S(PS)单域抗体(sdAb)及其多肽。特别地，本发明由权利要求限定。

附图说明

图1：本研究中使用的单价和二价纳米抗体的示意图。将单价纳米抗体PS003和KB013的寡核苷酸序列克隆到pET28质粒的Pstl和BstEII限制性位点之间，以生成两侧带有N端His6标签和C端HA标签序列的纳米抗体。将单价纳米体(PS003、KB004、PS004)的两个寡核苷酸序列通过(GGGS)4接头融合，合成并克隆到pET28质粒的Pstl和BstEII位点之间，获得其两侧同样带有N端His6标签和C端HA标签序列的二价纳米抗体(PS003biv、KB004biv、PS004biv)。

图2：ELISA中PS003与多种维生素K依赖性蛋白的结合。将重组人FIX(FIX)、重组人FX(FX)、血浆衍生蛋白Z(ProZ)、重组人Gas6(Gas6)和重组人PS(PS)固定在ELISA孔上，然后分析20nM PS003的结合情况。

图3：ELISA中PS003与PS和Gas6的结合。由于PS和Gas6高度同源(同源性为47％)，且均含有SHBG样结构域，因此通过直接ELISA法进一步分析PS003与固定化rhpS和rhGas6的结合。结果表明，PS003与rhpS强结合，而不与rhGas6结合，这证实了PS003对rhpS的特异性。

图4：PS003的表位图。将重组形式的PS唯一SHBG样结构域(rhSHBG)rhPS和BSA固定(60μL，10μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS)，并在直接ELISA法中分析PS003的结合。这些结果表明，PS003能够与rhSHBG结合，这表明PS003的表位位于PS的C端SHBG样结构域内。相反，PS004不与rhSHBG结合(数据未显示)，表明PS004的表位位于PS的N端部分。

图5：ELISA中固定化的PS003与重组人和血浆来源的PS溶液的结合。纯化后的PS003(60μL，10μg/mL)固定在ELISA孔上，分析两种不同形态PS的结合情况。这些结果表明，PS003与重组或血浆来源的人PS结合，并且PS003与PS的结合不限于一种非天然的固定形式的PS。

图6：直接ELISA法比较PS003和PS003biv与固定化PS的结合。将rhPS(60μL，2.5μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS)固定到ELISA孔上，用过氧化物酶标记的多克隆抗His6标签抗体分析PS003和PS003biv(0～200nM)的结合。以简化方式进行了三个单独试验，结果用每个纳米抗体的最大结合百分比表示。结合曲线表明，PS003和PS003biv均与固定化的rhPS有效结合。为了进一步比较PS003和PS003biv与PS的结合能力，根据描述(Beatty等人，J ImmunolMethods 1987)估计了PS003和PS003biv对rhPS的亲和力，通过在三个简化的单独实验中获得在递增浓度(0.6、1.25、2.5和5μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS)下固定的rhPS的相似结合曲线。对于每种纳米抗体，使用基于质量作用定律的公式测定解离常数(KD)。基于此方法，PS003和PS003biv的KD分别为26.8±2.7nM和13.8±5.7nM，表明PS003biv与rhPS的结合亲和力略高(1.9倍)。

图7：PS003biv的表位图和PS003biv对PS的特异性。将重组人PS(rhPS)、单独的重组形式的PS SHBG样区(rSHBG))、重组人Gas6(rhGas6)或BSA(60μL，10μg/mL，含有5mMCaCl₂的TBS)固定在ELISA孔上，用过氧化物酶标记的多克隆抗His6标签抗体分析PS003biv(0.5nM，TBS-0.1％Tween-5mM CaCl₂)的结合情况。结果表示为在rhPS上获得的Abs_450nm的百分比。以简化方式进行了三个单独试验。

结果表明，PS003biv与rSBHG有效结合，因此，PS003biv的表位位于PS的SHBG样区域，而该区域仅存在于Gas6中，因此，PS003biv与rhGas6没有结合，这表明PS003biv对PS具有特异性。

图8：在基于APTT的血浆凝固试验(

PS,Stago)中，PS003和PS003biv对rhPS的APC辅因子活性的增强作用。A.使用基于APTT的商业血浆凝固试验(/>

PS,Stago)测量rhPS(最终浓度5nM)作为APC辅因子的能力。在本试验中，APC延长了PS缺失血浆的凝血时间，当5nM rhPS与APC一起添加时，进一步延长了凝血时间。B.在我们基于APTT的APC辅因子活性检测中，rhPS(最终浓度0～10nM)的剂量依赖效应。C.测试了PS003和PS003biv对rhPS(最终浓度6nM)增强APC抗凝血活性能力的影响。将PS003、KB013(对照单价纳米抗体)、PS003biv和KB004biv(对照二价纳米抗体)与rhPS在室温下预孵育15分钟，并在我们的检测中添加了rhPS±纳米抗体的混合物。rhPS和纳米抗体的最终浓度分别为6nM和2μM。试验进行了三次。D.之前的结果表示为存在rhPS(t_+Ps)时的凝血时间与不存在rhPS(t_-PS)时的凝血时间之比。以非配对学生t检验作为统计学检验。

结果表明，在我们的血浆试验中，PS003和PS003biv均增强了rhPS的APC辅因子活性，且PS003biv对rhPS的APC辅因子活性的增强作用高于PS003。

图9：在体外FVa灭活试验中，PS003和PS003biv对PS的APC辅因子活性的影响。在一项体外试验中评估了PS003和PS003biv增强rhPS的APC辅因子活性的能力，该试验测量在rhPS存在情况下APC对FVa的特异性蛋白水解失活，使用纯化蛋白。A.测定FVa灭活混合物中每种rhPS浓度的斜率，FVa活性值表示为存在rhPS时所得斜率与不存在rhPS时所得斜率之比。简单地做了三个实验。B.使用如上所述的凝血酶原酶分析法测定每种条件下的残留FVa活性，并与在没有纳米抗体或抗体(TBS)的情况下对rhPS进行预孵育时获得的FVa活性进行比较。3个实验以简化的方式进行，以非配对学生t检验作为统计学检验(***P<0.001)。

图10：PS003和PS003biv对rhPS的TFPI辅因子活性的影响。A.已开发了一种体外试验来评估rhPS增强TFPIα对FXa的直接抑制作用的能力。A.在大肠杆菌中表达的重组人全长TFPIα在最终浓度为5nM时以抑制FXa的酰胺分解活性。B.将阻断型兔多克隆抗PS抗体(α-PS)(DAKO，最终浓度0.5μM)或兔IgG(DAKO，最终浓度0.5μM)在室温下与rhPS预孵育15分钟，研究了rhPS增强TFPIα抑制活性的能力。C.将rhPS与PS003和PS003biv或其各自的单价(KB013)和二价(KB004biv)对照纳米抗体(最终浓度为10μM)在室温下预孵育15分钟时，评估rhPS增强TFPIα抑制活性的能力。结果表示为在不存在纳米抗体(TBS)的情况下rhPS的TFPIα辅因子活性的百分比，3个实验以简化的方式进行，以非配对学生t检验作为统计学检验。

图11：直接ELISA法比较PS003biv和PS004biv与固定化重组鼠PS的结合。PS004biv是单价纳米抗体(PS004)由固定在ELISA孔上的rhPS筛选后产生的体内抗人PS纳米抗体。直接ELISA法显示PS004biv与rhPS强结合，但与PS003biv不同的是，其表位位于PS的N端部分，而不在PS的SHBG样结构域内(数据未显示)。ELISA分析PS003biv和PS004biv与固定化rmPS的结合情况。结果表明，PS003biv与固定化rmPS结合，而PS004biv与固定化rmPS未结合。这表明在我们的体内中，PS004biv可与PS003biv一起用作对照二价纳米体，用于我们的体内FeCl₃诱导血栓模型。

图12：PS003biv在小鼠FeCl₃诱导的血栓模型中的体内抗血栓作用。在4至5周龄的C57BL6/JRccHsd雄性小鼠中诱导FeCl₃损伤，基本上如前述(Ayme等人.2017；Ada等人.2010)。为了便于观察血栓形成情况，通过向眼眶后神经丛静脉注射罗丹明6G(3.3mg/kg，即2.5μL/g罗丹明6G在0.9％氯化钠溶液中为1mg/mL)，对麻醉小鼠的血小板进行了体内荧光标记。将PS003biv(10mg/kg)、PS004biv(10mg/kg)或相同体积的TBS缓冲液(Ctl)在0.9％NaCl中稀释，并同时给药。静脉注射罗丹明6G后皮下注射200UI/kg低分子肝素(LMWH,Lovenox)。将标记的血小板循环10分钟，将FeCl₃溶液(10％溶于水)局部沉积于肠系膜血管后，用倒置荧光显微镜(×10)实时监测血栓生长。对每只小鼠的单个小静脉和单个小动脉进行分析。采用Kruskal-Wallis和Dunn's检验进行统计学分析。A.我们的APC辅因子活性测定中使用的对照二价抗VWF(KB004biv)不能用于我们的FeCl₃诱导血栓模型，因为使用这种纳米抗体治疗小鼠导致一只小鼠的小静脉和小动脉的闭塞时间延迟。因此，我们使用了不能与重组鼠PS结合的对照二价抗PS纳米抗体(PS004biv)。我们的血栓模型对抗凝血药物敏感，因为LMWH(200UI/kg，SC)治疗小鼠导致小静脉和小动脉闭塞时间延迟(n＝6只小鼠)。PS004biv治疗(n＝6只小鼠)对闭塞时间无影响，而PS003biv治疗导致小静脉闭塞时间显著延迟(n＝l0只小鼠)。在接受PS003biv治疗的小鼠的小动脉(n＝9只小鼠)中观察到了类似的趋势，但未显示出统计学差异。B.在用PS003biv给药的小鼠肠系膜血管中，与未用纳米抗体(未显示)给药或用对照PS004biv纳米抗体给药的小鼠肠系膜血管中形成的血栓相比，发现在高栓塞率下的血栓稳定性较低。

图13：PS003biv对小鼠尾夹出血模型生理性止血的影响。向麻醉的C57/BL6小鼠静脉注射PS003biv(10mg/kg)或皮下注射低分子量肝素(LMWH)(Lovenox，200UI/kg)。出血时间定义为首次出血停止。在20分钟内采集血液，以量化总失血量。每条柱状图代表从被评估的几只小鼠获得的平均值。采用普通单因素方差分析(Ordinary one-way ANOVA)与Tukey多重比较法进行方差的统计学检验。

具体实施方式

蛋白S(PS)是一种天然抗凝血剂，作为活化蛋白C(APC)和组织因子途径抑制物(TFPI)的辅因子。发明人假设调节PS活性将是治疗凝血障碍的有效方法。为此，发明人用重组人PS(rhPS)免疫的美洲驼中的单域抗体(sdAb)构建了一种免疫库，并通过噬菌体展示技术筛选出靶向PS的sdAb。

发明人发现sdAb与PS较强的结合，在体外具有抗凝血作用，在体内具有抗血栓作用。

定义

如本文所述，术语“蛋白S(Protein S)”或“PS”在本领域具有一般含义，指主要在肝脏中合成的维生素K依赖性血浆糖蛋白。在循环中，蛋白S以两种形式存在：游离形式和与补体蛋白C4b-结合蛋白(C4BP)结合的复合形式。在人类中，蛋白S由PSI基因编码。蛋白S是一种天然抗凝血剂，可作为活化蛋白C(APC)和组织因子途径抑制物(TFPI)的非酶辅因子。事实上，PS曾被描述为能够增强APC对活化因子V(FVa)和活化因子VIII(FVIIIa)的蛋白水解活性，这非常有效地限制了凝血酶的生成。也有大量报道称PS可增强TFPI-α对FXa的抑制作用(Hackeng等人.2006)，尽管这种辅因子活性的生理学意义尚不明确。此外，PS最近被描述为活化因子IX(FIXa)的直接抑制剂(Plautz等人.2018)。

如本文所述，术语“单域抗体(single-domain antibody)”在本领域具有一般含义，指可在天然缺失轻链的骆驼科哺乳动物体内发现的该类型抗体的单重链可变区域。所述单域抗体也称为VHH或“纳米抗体(

)”。对于(单)域抗体的一般描述，还可参考上文所引用的现有技术以及EP0368684、Ward等人(Nature 1989 Oct 12；341(6242):544-6)、Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490、及WO06/030220、WO06/003388。纳米抗体的分子量大约是人类IgG分子的十分之一，蛋白质的物理直径只有几纳米。尺寸小的一个结果是，骆驼科纳米抗体能够与较大抗体蛋白功能性上不可见的抗原位点结合。骆驼科纳米抗体可用作检测经典免疫学技术中隐性抗原的试剂以及可能用作治疗药剂。因此，尺寸小的另一个结果是，纳米抗体可以通过与靶蛋白的沟槽或狭缝中的特定位点结合发挥其生物学效应，因此，与经典抗体相比，其功能更接近于经典低分子量药物。低分子量和小尺寸进一步导致纳米抗体具有极强的耐热性、对极端pH值和蛋白水解消化的稳定性以及较差的抗原性。另一个结果是，纳米抗体很容易从循环系统进入组织，其中一些甚至可以穿过血脑屏障，治疗影响神经组织的疾病。纳米抗体可以进一步促进药物跨血脑屏障的转运。参见2004年8月19日公布的美国专利申请20040161738。这些特征加上对人体的低抗原性预示着巨大的治疗潜力。单域抗体的氨基酸序列及结构可被认为是由4个框架区(framework region)或“FR”组成，其在本领域和本文中分别被称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；及“框架区4”或“FR4”，这些框架区被3个互补决定区(complementary deter分钟ing region)或“CDR”中断，在本领域中分别被称为“互补决定区”“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”及“互补决定区3”或“CDR3”。据此，单域抗体可定义为具有一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1至4，CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。在本发明的背景下，根据国际免疫遗传学信息系统(International ImMunoGeneTics information system)氨基酸编号所给出的VH结构域通用编号对单域抗体的氨基酸残基进行编号(http://imgt.cines.fr/)。/>

如本文所述，术语“氨基酸序列”具有其一般含义，是赋予蛋白质一级结构的氨基酸序列。根据本发明，氨基酸序列可以通过用一个、两个或三个保守氨基酸取代进行修饰，而不会明显丧失相互结合能力。“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸可以被另一个具有相似侧链的氨基酸取代。本领域已定义具有相似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷胺酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱胺酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱胺酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

根据本发明，与第二氨基酸序列具有至少70％同一性的第一氨基酸序列意味着第一序列与第二氨基酸序列具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％的同一性。氨基酸序列的同一性通常使用合适的序列比对算法和默认参数确定，默认参数如BLAST P(Karlin and Altschul,1990)。

根据本发明的含义，通过比较一个比较窗口中的两个对齐序列来计算“同一性”。通过序列比对，可以确定比较窗口中两个序列共有位置(核苷酸或氨基酸)的数量。因此，共有位置数量除以比较窗口中总位置数量，再乘以100，得到同一性百分比。序列同一性百分比的确定可以手动进行，也可以借助于众所周知的计算机程序进行。

如本文所述，术语“纯化的”和“分离的”与本发明的sdAb有关，意味着sdAb存在于其他同型生物大分子大量缺失的情况下。本文使用的术语“纯化的”是指相对于存在的大分子的总重量，抗体重量优选至少75重量％，更优选至少85重量％，甚至更优选至少95重量％，并且更优选至少98重量％。

如本文所述，术语“核酸分子”其在本领域具有一般含义，是指DNA或RNA分子。

如本文所述，术语“特异性结合”是指抗体仅结合目标抗原，例如蛋白S(PS)，使用重组形式的蛋白质、其中的抗原表位或存在于分离的靶细胞表面的天然蛋白质进行评估，其不会与其他抗原发生交叉反应。

单域抗体和多肽

本申请中涉及的序列如表1所示：

在第一个方面，本发明涉及针对蛋白S(PS)的分离的单域抗体(sdAb)。

在第一个方面，本发明涉及特异性结合蛋白S(PS)的分离的单域抗体(sdAb)。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体是一种PS激动剂抗体。

如本文所述，一种“PS激动剂”抗体是指表现出PS活性的抗体。根据本发明，PS激动剂抗体是指能够增强PS的APC辅因子活性，即增强APC对活化因子V(FVa)和活化因子VIII(FVIIIa)的蛋白水解活性的抗体。根据本发明，PS激动剂抗体是指能够增强蛋白S的抗凝血活性的抗体。

因此，在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体增强了PS的APC辅因子活性。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体结合重组或血浆来源的人PS，并且没有显著干扰它们的TFPI辅因子活性。

根据本发明，针对PS的单域抗体增强了PS的APC辅因子活性。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体具有抗血栓活性。

如本文所述，术语“抗血栓活性”其在本领域具有的一般含义，指减少血栓形成的活性。根据本发明，分离的单域抗体减少血栓的形成和/或溶解血栓。

测定抗体显示抗血栓形成活性的能力的试验是本领域技术人员熟知的。用于确定抗体特异性增强PS的APC辅因子活性的能力的试验是本领域技术人员熟知的，包括基于凝血功能的检测，例如凝血酶原时间(PT)检测、活化部分凝血活酶时间(APTT)检测(见图8C～8D)、特异性一期凝固法检测、校准自动血栓造影(CAT)或其他凝血酶生成检测、FVa失活试验(见图9)和FVIIIa失活试验，以及TFPIα辅因子活性试验(见图10)。

具体而言，本发明涉及一种分离的单域抗体(sdAb)，其包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3(“PS003衍生物”)。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体与如SEQ ID NO:4所示的序列(“PS003衍生物”)具有至少70％的同一性。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体与如SEQ ID NO:4所示的序列具有至少70％的同一性，并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体包含如SEQ ID NO:4所示的序列(“PS003”)。

在一些实施方式中，根据本发明的分离的单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列。

应该进一步注意的是，sdAb“PS003”增强了PS的APC辅因子活性。

还应注意，sdAb“PS003”与重组或血浆来源的人PS结合，并未显著干扰其TFPI辅因子活性。

在一些实施方式中，分离的单域抗体是“人源化”的单域抗体。

如本文所述，术语“人源化”指本发明的单域抗体，其中与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应的氨基酸序列已被“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列(特别是在框架序列中)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基替换为来自人的常规链抗体的VH结构域中相应位置的一个或多个氨基酸残基。人源化单结构域抗体的方法是本领域所熟知的。通常，应该选择人源化取代，使得所得人源化单域抗体仍保留本发明单结构域抗体的良好特性。本领域技术人员能够确定和选择合适的人源化取代或人源化取代的合适组合。

在一些实施方式中，本发明的单域与进一步用于治疗高凝状态疾病的治疗剂结合。

本发明的另一方面涉及一种交叉竞争单域抗体，所述抗体与本发明的单域抗体交叉竞争结合PS。在一些实施方式中，本发明的交叉竞争单域抗体与包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDRl、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3的单域抗体交叉竞争结合PS。

在一些实施方式中，本发明的交叉竞争单域抗体与包含或由SEQ ID NO:4所示序列组成的单域抗体交叉竞争结合PS。

如本文所述，术语“交叉竞争(cross-compete)”指具有与抗原特定区域结合能力的单域抗体。本公开中“交叉竞争”的单域抗体具有在标准竞争性结合试验中干扰另一单域抗体与抗原结合的能力。根据非限制性理论，这种单域抗体可能与其竞争的单域抗体结合相同或相关或邻近(例如，结构相似或空间邻近)的表位。与缺少一种所述单域抗体的阳性对照相比，如果单域抗体A与单域抗体B的结合至少减少60％，特别是至少减少70％，更具体的是至少减少80％，则存在交叉竞争，反之亦然。正如本领域技术人员所理解的，可以在不同的测试设置中评估竞争。一种合适的检测方法包括使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，该技术可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种用于测量交叉竞争的方法是基于ELISA的方法。此外，在国际专利申请WO2003/48731中描述了基于抗体交叉竞争的高通量“分箱(binning)”工艺。

根据本发明，上述交叉竞争抗体保留了单一抗体的活性，其中包含具有如SEQ IDNO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3。

根据本发明，上述交叉竞争抗体保留了包含或由SEQ ID NO:4所示序列组成的单一抗体的活性。

因此，在一些实施方式中，本发明的交叉竞争单域抗体是一种PS激动剂抗体。

在一些实施方式中，本发明的交叉竞争单域抗体增强了PS的APC辅因子活性。

在一些实施方式中，本发明的交叉竞争单域抗体与重组人PS或血浆来源的人PS结合，对其TFPI辅因子活性无明显干扰。

本发明的另一方面涉及包含至少一个本发明单域抗体的多肽。

通常，本发明的所述多肽包含一个本发明的单域抗体，该抗体在其N端、C端或同时在其N端和C端融合至少一个氨基酸序列，即提供融合蛋白。根据本发明，构成单一单域抗体的多肽称为“单价”多肽。包含或基本上由两种或多种根据本发明的单域抗体组成的多肽在本文中被称为“多价”多肽。通常，多价多肽可以是：双价抗体、三价抗体或四价抗体。

在一些实施方式中，本发明的多肽增强了PS的APC辅因子活性。

在一些实施方式中，本发明的多肽与重组或血浆来源的人PS结合，并且未显著干扰它们的TFPI辅因子活性。

在一些实施方式中，所述多肽包含本发明的至少一个单域抗体和至少一个其他结合单元(即针对另一种表位、抗原、靶标、蛋白质或多肽)，其通常也是单域抗体。这种多肽在本文中被称为“多特异性”多肽；与包含相同单域抗体(“单特异性”多肽)的多肽相反。因此，在一些实施方式中，本发明的多肽还可以提供至少一个针对任何所需蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位的进一步结合位点。所述结合位点针对与本发明单域抗体所针对的同一蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或者可能针对与本发明单域抗体不同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含至少一个单域抗体，所述抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNOID NO:3所示序列的CDR3。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含至少两个单域抗体，所述抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNOID NO:3所示序列的CDR3。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含2、3、4或5个单域抗体，所述抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNOID NO:3所示序列的CDR3。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含至少两个与SEQ ID NO:4所示序列具有至少70％同一性的单域抗体。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含至少两个单域抗体，其与如SEQ ID NO:4所示序列具有至少70％的同一性，并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO IDNO:3所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含至少两个具有如SEQ ID NO:4所示序列的单域抗体。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含2、3、4或5个具有如SEQ ID NO:4所示序列的单域抗体。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少70％同一性的序列(“PS003Biv衍生物”)。

在一些实施方式中，本发明所述多肽包含如SEQ ID NO:5所示的序列(“PS003Biv”)。

在一些实施方式中，本发明所述多肽具有如SEQ ID NO:5所示的序列(“PS003Biv”)。

在一些实施方式中，本发明所述多肽的单域抗体可以直接(即不使用接头)或通过接头彼此连接。接头通常是肽接头，并且根据本发明将被选择以允许两个单域抗体与其至少两个不同的PS表位的每一个结合。合适的接头其中包括取决于抗原表位，特别是单域抗体结合的PS上抗原表位之间的距离，并且基于本文的公开内容，任选地在一些有限程度的常规试验之后，对技术人员来说是清楚的。此外，当与PS结合的两个单域抗体也可能通过第三单域抗体彼此连接(其中两个单域抗体可以直接连接，也可以通过合适的接头连接)。例如，这种第三单域抗体可能是一个提供增加半衰期的单域抗体。如本文进一步描述，例如，后一种单域抗体可以是能够结合(人)血清蛋白如(人)血清白蛋白或(人)铁传递蛋白的单域抗体。在一些实施方式中，与PS结合的两个或多个单域抗体串联(直接或通过合适的接头)，第三个(单)单域抗体(其可以如上所述提供增加的半衰期)直接或通过接头与这两个或多个上述单域抗体中的一个连接。本文结合本发明的特定多肽描述了合适的接头，其可以例如但不限于包含氨基酸序列，所述氨基酸序列优选具有9个或更多个氨基酸的长度，更优选至少17个氨基酸的长度，例如约20至40个氨基酸的长度。然而，上限不是关键，而是出于方便起见而选择的，例如用于此种多肽的生物制药生产。接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。如果用于治疗目的，则所述接头在本发明的抗EGFR多肽给药对象中优选为非免疫原性。一组有用的接头序列是来源于重链抗体铰链区的接头，如WO 96/34103和WO 94/04678中所述。其他示例是聚丙氨酸接头序列，如Ala-Ala-Ala。接头序列的其它优选示例为不同长度的Gly/Ser接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。

本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即蛋白S，PS)的单域抗体和至少一个针对第二抗原(即不同于PS)的进一步结合位点的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即PS)的单域抗体，至少一个针对第二抗原(即不同于PS)的进一步结合位点和至少一个针对第三抗原(即不同于第一和第二抗原)的进一步结合位点的多肽，等等。

在一些实施方式中，进一步结合位点针对血清蛋白，以使单域抗体的半衰期增加。通常，所述血清蛋白是白蛋白。

通常，一个或多个进一步结合位点可以包含常规链抗体(特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，本发明的单域抗体可以通过接头序列与常规的(通常是人的)VH或VL连接。

在一些实施方式中，所述多肽包含与免疫球蛋白结构域连接的本发明的单域抗体。例如，所述多肽包含与Fc部分(如人Fc)连接的本发明的单域抗体。所述Fc部分可用于增加本发明的单域抗体的半衰期，甚至可增加其产量。例如，所述Fc部分可以结合血清蛋白，从而增加单域抗体的半衰期。在一些实施方式中，所述至少一个单域抗体还可以任选地通过接头序列与一个或多个(通常是人)CH1和/或CH2和/或CH3结构域连接。例如，连接到合适的CH1结构域的单域抗体可以与合适的轻链一起用，以产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但其中一个或(在F(ab’)2片段的情况下)一个或两个常规VH结构域已经被本发明的单域抗体取代。在一些实施方式中，本发明的一个或多个单域抗体可以(任选地通过合适的接头或铰链区)连接到一个或多个恒定结构域(例如，可用作Fe部分的一部分/形成Fc部分的2或3个恒定结构域)、Fc部分和/或赋予本发明多肽一种或多种效应子功能和/或可赋予与一种或多种Fc受体结合的能力的一种或多种抗体部分、片段或结构域。例如，为此目的且不限于此，一个或多个进一步的氨基酸序列可包含抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，例如来自重链抗体且更典型地来自常规人链抗体；和/或可以形成和Fc区，例如来自IgG(例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、来自IgE或来自另一人Ig如IgA、IgD或IgM。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼科VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体(即单域抗体)，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域取代，从而提供了由2条重链组成的免疫球蛋白，每条重链包含单域抗体和人CH2和CH3结构域(但不包含CHI结构域)，该免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且该免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥作用。

在一些实施方式中，所述多肽如WO2006064136中描述。特别地，所述多肽可以包含i)第一融合蛋白，其中，抗体的CL恒定区通过其N端与根据本发明的单域抗体(即针对PS的单抗体)的C端融合；以及ii)第二融合蛋白，其中，抗体的CH1恒定区通过其N端与针对不同于PS的抗原的单域抗体的C端融合。在另一个具体实施方式中，所述多肽由第一融合蛋白和第二融合蛋白组成，所述第一融合蛋白中抗体的CH1恒定区通过其N端与针对效应细胞(例如CD16)上的激活触发分子的单域抗体的C端融合，所述第二融合蛋白中抗体的CL恒定区通过其N端与本发明单结构域抗体(即PS)的C端融合。

在一些实施方式中，本发明的所述多肽与用于治疗血栓性疾病的其它治疗剂结合。

在一些实施方式中，考虑对本发明治疗方法中使用的本发明所述单域抗体或本发明所述多肽进行修饰，以提高其治疗效果。对治疗性化合物的此类修饰可用于降低毒性、增加循环时间或改变生物分布。例如，通过与多种改变生物分布的药物载体工具结合，可以显著降低潜在重要治疗性化合物的毒性。

提高药物活性的一个策略是利用水溶性聚合物。各种水溶性聚合物已被证明能够改变生物分布，改善细胞摄取模式，通过生理屏障改变渗透率；并修改从体内清除的速率。为了实现靶向或缓释效果，已经合成了水溶性聚合物，其含有药物分子作为终端基团，作为主链的一部分，或作为聚合物链上的悬挂基团。

聚乙二醇(PEG)具有高度的生物相容性和易修饰性，已被广泛用作药物载体。研究显示，附着在各种药物、蛋白质和脂质体上可延长停留时间并降低毒性。PEG可以通过链端的羟基和其他化学方法与活性剂偶联；然而，PEG本身被限制为每个分子至多有两种活性物质。在另一种不同的方法中，探索了PEG和氨基酸的共聚物作为新型生物材料，其将保留PEG的生物相容性，但其将具有每个分子多个附着点的额外优势(提供更大的载药量)，并且其可被合成设计以适合各种应用。本领域技术人员知道聚乙二醇化技术对于药物的有效修饰。例如，由PEG和三官能单体(如赖氨酸)的交替聚合物组成的药物递送聚合物已被VectraMed(Plainsboro,N.J.)使用。PEG链(通常为2000道尔顿以下)与赖氨酸的a-氨基和e-氨基通过稳定的尿烷连接。这类共聚物保留了聚乙二醇的优良性能，同时在聚合物链上以严格控制和预定的间隔提供活性悬挂基团(赖氨酸的羧基)。所述活性悬挂基团可用于衍生、交联或与其他分子偶联。通过改变聚合物的分子量、PEG片段的分子量以及药物与聚合物之间的可裂解键，这些聚合物可用于生产稳定、长循环的前体药物。PEG片段的分子量影响药物/连接基团复合物的间距和每分子量缀合物的药物量(PEG片段越小，载药量越大)。通常，增加嵌段共聚物缀合物的总分子量将增加缀合物的循环半衰期。然而，所述缀合物必须是可容易降解的，或者其分子量低于阈值限制的肾小球滤过率(例如，小于45kDa)。此外，由于聚合物主链在维持循环半衰期和生物分布中具有重要作用，因此接头可用于将治疗剂维持在前药形式，直到通过特定触发(通常是靶组织中的酶活性)从主链聚合物中释放。例如，当需要将药物递送到生物分布的特定部位并在病理部位或附近释放治疗剂时，这类组织活化药物递送特别有用。用于活化药物递送的连接基团库为本领域技术人员所熟知，并且可基于酶动力学、活性酶的流行率以及所选疾病特异性酶的裂解特异性(参见例如由VectraMed,Plainsboro,N.J.建立的技术)。此类接头可用于修饰本文所述的用于治疗性递送的本发明多肽。

根据本发明，本发明所述单域抗体和所述多肽可以通过常规的自动化多肽合成方法或通过重组表达来生产。设计和制备蛋白质的一般原理是本领域技术人员所熟知的。

本发明的单域抗体和多肽可按照常规技术在溶液中或在固体载体上合成。各种自动合成设备均是商用的，并且可以按照Stewart和Young；Tam等人，1983；Merrifield，1986及Barany和Merrifield，Gross和Meienhofer，1979中描述的已知协议使用。本发明的单域抗体和多肽也可通过固相合成技术合成，采用示例性的肽合成器，例如来自美国应用生物系统公司的433A型。任意给定蛋白质的纯度，通过自动肽合成或通过重组方法产生的可使用反相HPLC分析测定。每种肽的化学真实性可以通过本领域技术人员所熟知的任何方法确定。

在另一个实施方式中，对本发明所述单域抗体或本发明所述多肽进行修饰，以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，可引入以下一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如Ward在美国专利第6,277,375中所述。或者，如Presta等人在美国专利5,869,046和6,121,022中所述，为了延长生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体，使其包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中获得的补救受体结合表位。具有半衰期延长和与新生儿Fc受体(FcRn)更好结合的抗体，FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.immunol.24:249(1994))，在US 2005/0014934(Hinton等人)中描述。所述抗体包含一个Fc区，其中有一个或多个取代基，可改善Fc区与FcRn的结合。此种Fc变体包括在一个或多个Fc区残基上具有取代的变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利7,371,826)。

本发明设想的本发明所述单域抗体或本发明所述多肽的另一种修饰方式为聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了聚乙二醇化抗体，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所述，术语“聚乙二醇”旨在包括已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，被聚乙二醇化的抗体是一种糖基化抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域是已知的，可以应用于本发明的抗体。例如Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。

本发明设想的本发明所述单域抗体或本发明所述多肽的另一种修饰方式，是至少将本发明所述抗体的抗原结合区与血清蛋白如人血清白蛋白或其片段进行缀合或蛋白融合，以增加所得分子的半衰期。这种方法如Ballance等人在EP0322094中所述。另一种可能性是至少将本发明所述抗体的抗原结合区与能够结合血清蛋白的蛋白(如人血清白蛋白)融合，以增加所得分子的半衰期。这种方法如Nygren等人在EP 0486525中所述。

另一种技术为聚唾液酸化(Polysialytion)，其使用天然聚合物聚唾液酸(polysialic acid，PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的有效寿命和提高其稳定性。PSA是唾液酸(一种糖)的聚合物。当用于蛋白质及治疗性肽药物递送时，聚唾液酸在缀合时提供保护性微环境。这延长了治疗性蛋白质在循环中的有效寿命，并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。进化超过数百万年的某些细菌采用PSA聚合物来覆盖它们的细胞壁。这些天然聚唾液酸化细菌然后能够凭借分子拟态来阻挡人体防御系统。此类细菌中可容易产生大量且具有预定物理特征的PSA(天然的终极隐匿技术)。由于细菌PSA与人体中的PSA在化学上相同，因此即使与蛋白质偶合，细菌PSA完全不具免疫原性。

另一项技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，“HES”)衍生物。HES是一种由蜡质玉米淀粉衍生而来的改性天然聚合物，可被机体酶代谢。通常HES溶液的给药是为了取代血容量不足及改善血液的流变特性。抗体的羟乙基淀粉化(Hesylation)通过提高分子的稳定性以及降低肾脏清除速率来实现循环半衰期的延长，从而提高生物活性。通过改变不同的参数，如HES的分子量，可定制各种HES抗体缀合物。

核酸、载体、重组宿主细胞及其用途

作为自动化肽合成的替代方案，可采用重组DNA技术，其中，将编码所选蛋白的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在如下所述的适于表达的条件下培养。重组方法特别优选用于生产较长的多肽。

有多种表达载体/宿主系统可用于包含和表达所述肽或蛋白质编码序列。其中包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母(Giga-Hama等,1999)；用病毒表达载体(例如，杆状病毒，参见Ghosh等,2002)感染的昆虫细胞系；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒；例如，见Babe等人,2000)转化的；或动物细胞系统。本领域技术人员已知用于优化哺乳动物蛋白质表达的各种技术，例如参见Kaufman,2000；Colosimo等人,2000。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(如COS-7)、W138细胞、BHK细胞、HepG2细胞、3T3细胞、RIN细胞、MDCK细胞、A549细胞、PC12细胞、K562细胞和293细胞。在细菌、酵母和其它无脊椎动物中重组表达所述肽底物或融合多肽的示例性方案是本领域技术人员已知的，并在下文简要描述。用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员熟知的。宿主细胞株可被选择，使其具有加工所表达蛋白质或产生某些翻译后修饰的特定能力，这些修饰将有助于提供蛋白质活性。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白质“前体(prepro)”形式的翻译后处理对于正确插入、折叠和/或功能也可能很重要。不同的宿主细胞例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对于此类翻译后活动具有特定的细胞机制和特征性机制，并且可以选择以确保正确修饰和加工引入的外源蛋白。

在本发明所述单域抗体和所述多肽的重组生产中，有必要使用包含用于编码本发明所述单域抗体和所述多肽的多聚核苷酸分子的载体。制备此类载体以及产生用这样的载体转化的宿主细胞的方法是本领域技术人员熟知的。

因此，本发明的另一个目的涉及编码根据本发明所述的单域抗体和/或多肽的核酸分子。

典型地，所述核酸是一种DNA或RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，例如质粒、粘粒、游离体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。如本文所述，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞的载体，从而转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。术语“表达载体”、“表达构建体”或“表达盒”在本说明书中可互换使用，是指包括含有编码基因产物的核酸的任何类型的遗传构建体，其中核酸编码序列的部分或全部能够被转录。

因此，本发明的另一个方面涉及一种包含本发明所述核酸的载体。所述载体可包括调控元件，如启动子、增强子、终止子等，以在给受试者给药时引起或指导所述抗体表达。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等人,1987)、莫洛尼氏小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等人,1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等人,1985)和增强子(Gillies SD等人,1983)等。只要可以插入并表达编码人抗体C区的基因，任何用于动物细胞的表达载体都可以使用。合适载体的实例包括pAGEl 07(Miyaji H等人,1990)、pAGE103(Mizukami T等人,1987)、pHSG274(Brady Get等人,1984)、pKCR(O'hare K等人,1981)、pSGl beta d2-4-(Miyaji H等人,1990)等。质粒的其它实例包括包含复制起点的复制质粒或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可通过本领域已知的技术，例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染产生。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可在例如WO95/14785、WO96/22378、US5,882,877、US6,013,516、US4,861,719、US5,278,056和WO94/19478中找到。

用于表达本发明所述肽或多肽的合适表达载体的选择当然取决于要使用的特定宿主细胞，并且在本领域普通技术人员所能掌握的范围内。

表达需要在载体中提供合适的信号，例如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，其可用于驱动目标核酸在宿主细胞中的表达。通常，被表达的核酸在启动子的转录调控下。“启动子”是指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动基因特异性转录所需的DNA序列。当调控序列在功能上与编码目标蛋白(例如，单域抗体)的DNA相关时，核苷酸序列被可操作地连接。因此，如果启动子核苷酸序列指导序列的转录，则启动子核苷酸序列可操作地连接到给定的DNA序列。

本发明的又一方面涉及已被根据本发明所述核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。

术语“转化”是指将“外源”(即外源或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”。

本发明所述核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的抗体。术语“表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如，用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或酵母菌酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Agl4细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(以下称为“DHFR基因”)缺陷型的CHO细胞(Urlaub G等；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，以下简称“YB2/0细胞”)等。本发明还涉及产生表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将如上所述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这种重组宿主细胞可用于产生本发明的抗体。

本发明的抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基中适当分离，例如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析。

治疗方法和用途

本发明所述单域抗体和多肽增强了APC辅因子活性但对PS的TFPI辅因子活性没有影响或影响很小。本发明所述单域抗体和多肽在小鼠血栓模型中发挥体内抗血栓作用。

因此，本发明所述单域抗体和多肽特别适用于预防或治疗有此需要的受试者的血栓性疾病。

在另一方面，本发明涉及本发明的单域抗体和/或本发明的多肽用作药物。

在具体的实施方式中，本发明涉及本发明的分离的单域抗体和/或本发明的多肽，用于治疗有需要的受试者的血栓性疾病。

换句话说，本发明涉及一种用于预防或治疗有需要的受试者的血栓性疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的本发明的单域抗体和/或本发明的多肽。

如本文所述，术语“受试者”是指哺乳动物。在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的受试者是指患有血栓性疾病或易患血栓性疾病的任何受试者(优选为人)。

如本文所述，术语“血栓性疾病”其在本领域中具有一般含义，也称为凝血障碍或血栓形成倾向，并且是指一种会增加过量血栓形成的风险的遗传或获得性疾病。当血管受到损伤时，它开始向外或向组织内渗漏血液。正常凝血在受伤期间很重要，因为它有助于阻止伤口出血并启动愈合过程。然而，如果血液凝结过多，它被称为高凝状态或血栓形成倾向。在健康人群中，促凝(凝血)力与抗凝和纤溶力之间存在稳态平衡。许多遗传性、获得性和环境因素都可使平衡倾向于凝血，从而导致静脉(如深静脉血栓[DVT])、动脉(如心肌梗死、缺血性中风)或心房的病理性血栓形成。血栓可阻塞形成部位的血流，或脱落和堵塞远端血管(如肺栓塞、栓塞性中风)。获得性疾病通常是手术、创伤、药物或增加血栓性疾病风险的医疗条件导致的。

根据本发明，血栓性疾病包括凝血酶原基因突变、预防凝血的天然蛋白如抗凝血酶、蛋白C和蛋白S的缺失；凝血因子如因子VII、因子IX和XI水平升高；莱登第五(V Leiden)因子缺失；溶解血纤维蛋白系统异常，例如低纤溶酶原血、纤溶酶原不良血症和纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)水平升高；纤维蛋白溶解异常；中心静脉置管；支架再狭窄；肥胖；妊娠期高凝状态；抗磷脂抗体综合征；癌症；高胱氨酸血症；粘性血小板综合征；肺动脉栓塞(PE)；骨髓增生性疾病，例如真性红细胞增多症或原发性血小板增多症；阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；医源性血栓栓塞性疾病，例如肝素特发性血小板减少症(HIT)或血友病治疗(emicuzimab，fistusiran)引起的血栓栓塞；发炎性肠道症候群，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病；获得性免疫缺陷综合症(AIDS)；新冠肺炎(COVID-19)；肾病综合征；血栓形成，例如急性微血栓形成、远端微血管血栓形成、深静脉血栓形成(DVT)、Paget-Schroetter病、Budd-Chiari综合征、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颅内静脉窦血栓形成、颈静脉血栓形成和海绵窦血栓形成；limn贫血；脓毒症；贫血症；镰状细胞病；脑型疟疾；栓塞，例如肺栓塞和脑栓塞；和心血管疾病，例如中风、心肌梗塞(或心脏病发作)、心房纤维性颤动、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭和人工心脏瓣膜放置。

在一些实施方式中，血栓形成障碍选自包括但不限于脓毒症、镰状细胞性贫血；栓塞(肺部和脑部)和心血管疾病。

在一些实施方式中，血栓性疾病为脓毒症或中风。

在一些实施方式中，血栓性疾病为镰状细胞性贫血。

如本文所述，术语“脓毒症(sepsis)”具有其在本领域中的一般含义，表示以全身炎性状态为特征的严重医学病症。除了与引起感染相关的症状外，脓毒症的特征还包括全身存在急性炎症，因此，通常与发热且白细胞计数升高(白细胞增多)或白细胞计数降低且体温低于平均水平以及呕吐有关。特别是，脓毒症定义为对感染的免疫反应失调，转化为危及生命的器官功能障碍，其定义为连续器官衰竭评估(Sequential Organ FailureAssessment)评分为2分以上。感染可以是疑似感染，也可以是确诊感染，或者可以是将临床综合征作为感染的病理表现。脓毒症性休克的定义是感染和需要血管加压药来维持平均血压>65mmHg和动脉血乳酸水平>2mmol/L。

如本文所述，术语“中风”是指由流向大脑任何部分的血液或氧流的中断、减少或停止引起的任何病况。具体而言，术语“中风”包括但不限于缺血性中风、短暂性脑缺血发作(TIA)和出血性中风。

如本文所述，术语“栓塞”是指血管内的栓子，即造成阻塞的物质。栓子可以是血块(血栓)、脂肪球(脂肪栓塞)、空气或或其他气体的气泡(气体栓塞)或异物。在本发明的背景中，存在不同类型的栓塞，栓塞由血块引起，并且选自包括但不限于：动脉栓塞、静脉栓塞或反常栓塞。通常，动脉栓塞会导致身体任何部位的闭塞。它是梗死(由于血液供应阻塞而导致组织死亡)的主要原因。从心脏或颈动脉进入大脑的栓子很有可能是局部缺血导致中风的原因。通常，静脉栓塞是指在穿过心脏右侧后，在全身静脉中形成的栓子，该栓子将始终影响肺部。这将形成肺栓塞，导致肺主动脉堵塞，并且可能是深静脉血栓形成的并发症。肺栓塞最常见的起源部位是股静脉。小腿的深静脉是血栓形成的最常见部位。通常，静脉栓塞是肺栓塞或脑栓塞。

如本文所用，术语“心血管疾病”，也称为“动脉血管疾病”，是一种用于对影响心脏、心脏瓣膜、血液和身体脉管系统的多种疾病进行分类的通用术语，包括影响心脏或血管的任何疾病，包括但不限于代谢综合征、X综合征、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓、冠状动脉疾病、稳定型和不稳定型心绞痛、中风、主动脉及其分支疾病(如主动脉狭窄、血栓形成或主动脉瘤)、外周动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病，包括但不限于任何暂时性或永久性的缺血性动脉疾病。如本文所用，动脉血管疾病是指最常见的缺血性或促缺血性疾病，而非泛指非缺血性疾病。如本文所用，“动脉粥样硬化”和“动脉粥样硬化血栓”是指与对多方面血管病变的复杂炎症反应相关的全身性炎症疾病状态，其涉及内皮的炎症活化、作为血栓形成刺激物来源的炎症性白细胞、作为血栓形成期间促凝剂来源和炎症反应放大剂的平滑肌细胞以及作为炎症和血栓形成介质的血小板。动脉硬化和狭窄的原因是内壁上积聚了一种叫做“斑块”的物质。随着斑块的发展和大小的增加，动脉内部变得更窄(“狭窄”)，通过它们的血流更少。狭窄或斑块破裂可能导致感染的血管系统部分或完全闭塞。因此，由血管系统供应的组织被剥夺了其氧合来源(局部缺血)，并且可能发生细胞死亡(坏死)。“CAD”或“冠状动脉疾病”是指当向心肌供血的动脉(冠状动脉)发生动脉粥样硬化、钙化和/或变窄时发生的动脉血管疾病。最终，流向心肌的血流量减少，并且，由于血液携带急需的氧气，心肌无法接收到其所需的氧气量，经常发生坏死。CAD包括多种疾病状态，如急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗死(心脏病发作)、心绞痛(稳定型和不稳定型)以及发生于为心脏提供富氧血液的血管中的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化性血栓。“CVD”或“脑血管疾病”是一种向面部和脑部输送富氧血液的血管中的动脉血管疾病，如动脉粥样硬化和动脉粥样硬化性血栓。该术语通常用于描述为大脑供血的颈动脉的“硬化”。这是一种常见的与CAD和/或PAD(外周动脉疾病)并存的疾病。它也被称为缺血性疾病，或导致血流不足的疾病。CVD包括脑血管缺血、急性脑梗死、中风、缺血性中风、出血性中风、动脉瘤、轻度认知障碍(MCI)和短暂性脑缺血发作(TIA)等疾病状态。缺血性CVD被认为与CAD和PAD密切相关；非缺血性CVD可能有多种病理生理机制。

如本文所用，术语“镰状细胞病”或“SCD”具有其在本领域中的一般含义，是指一种红细胞呈异常、刚性、镰状形状的遗传性血液疾病。红细胞镰状化会降低细胞的灵活性，并导致各种危及生命的并发症的风险。该术语包括镰状细胞性贫血、血红蛋白SC病和血红蛋白镰状beta-地中海贫血。这种单基因疾病的特点是突变型血红蛋白S(HbS)和慢性血管内溶血。镰状细胞贫血患者常出现由血管闭塞危象(VOC)引起的急性疼痛发作。VOC是镰状细胞贫血最常见的并发症，也是急诊科就诊和住院的常见原因。

如本文所用，术语“血管闭塞危象(vaso-occlusive crisis)”(VOC)具有其在本领域中的一般含义，是指小血管的阻塞，其阻止对组织的氧气供应并造成损伤。VOC可导致极度疼痛，被视为紧急医疗事件。

本文中，发明人证明本发明所述单域抗体和多肽可减少小鼠模型中的血管闭塞危象。

在具体的实施方式中，本发明涉及用于减少有需要的受试者的血管闭塞危象的本发明的分离的单域抗体及/或本发明的多肽。

在一些实施方式中，受试者患有镰状细胞性贫血。

换句话说，本发明涉及一种用于预防或治疗有需要的受试者的血管闭塞危象(VOC)的方法，包含向所述受试者施用有效量的本发明的单域抗体和/或本发明的多肽。

通常，本发明所述单域抗体和多肽以及如上文所述的血栓性疾病的经典治疗方法以治疗有效量向受试者施用。如本文所用，术语“治疗”或“治疗”是指预防性或预防性治疗以及治愈性或疾病缓解性治疗，包括对有感染疾病风险或疑似已感染疾病的受试者以及患病或已被诊断为患有疾病或医学病症的受试者的治疗，并且包括抑制临床复发。为了预防、治愈、延迟疾病或复发性疾病的发作、减轻其严重程度或改善其一种或多种症状，或延长受试者的存活期，使其超过在没有该治疗的情况下预期的存活期，可对患有医学疾病或最终可能获得该疾病的受试者施用所述治疗。“治疗方案”是指一种疾病的治疗模式，例如，治疗期间使用的给药模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可(部分或全部)采用“负荷方案”，其可包括施用药剂量超过医生在维持方案期间的给药剂量、给药频率超过医生在维持方案期间的给药频率，或两者兼有。短语“维持方案”或“维持期”是指在疾病治疗期间用于维持受试者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使受试者长期(数月或数年)处于缓解期。维持方案可采用连续治疗(例如，定期(例如，每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发时治疗、或达到特定预定标准(例如疼痛、疾病表现等))。

如本文所用，“治疗有效量”是指给予患者治疗益处所必需的活性剂的最小量。例如，对患者的“治疗有效量的活性剂”是诱导、改善或引起与影响患者疾病相关的病理症状、疾病进展或身体状况改善的活性剂的量。应当理解，本发明化合物及组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的给药时间、给药途径和排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定多肽联合使用或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的因素。例如，本领域技术人员熟知以低于实现期望治疗效果所需剂量开始进行所述化合物的给药，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。然而，该产品的日剂量可能在每名成人每天0.01至1,000mg的较大范围内变化。优选地，所述组合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，以对于需要治疗的患者对症调整用药剂量。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选为1mg至约100mg的活性成分。该药物的有效剂量通常以每天0.0002mg/kg体重至约100mg/kg体重的剂量水平提供。

如本文所用，术语“给药”或“施用”是指将存在于体外的物质(例如，根据本发明所述纳米抗体或多肽)注射或以其它方式物理递送到受试者中的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、皮下、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其它物理递送方法。当一种疾病或其症状被治疗时，所述物质的施用通常发生在所述疾病或其症状发作之后。当一种疾病或其症状被预防时，该物质的施用通常发生在疾病或其症状发作之前。

在另一个实施方式中，根据本发明所述单域抗体或多肽可结合载体进行递送。本发明所述单域抗体或药物缀合物包含在合适的载体中，例如质粒、装配型质粒、粘粒、游离体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。因此，本发明另一个目的涉及包含本发明的一种单域抗体或药物缀合物的载体。通常，所述载体是病毒载体，其为腺相关病毒(adena-associated virus,AAV)、逆转录病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒、多瘤病毒或感染性病毒。在一些实施方式中，所述载体是AAV载体。如本文所用，术语“AAV载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其突变形式。AAV载体可以具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因，优选为rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼ITR序列。由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外源遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，并能在特殊细胞系中包装，因此可被选择作为基因递送载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码所需基因的核酸插入病毒基因组中以取代某些病毒序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒颗粒，构建了含有gag、pol和/或env基因但不含LTR和/或包装组分的包装细胞系。当含有cDNA的重组质粒连同反转录病毒LTR和包装序列一起引入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装成病毒颗粒，然后这些病毒颗粒分泌到培养基中。然后收集含有重组反转录病毒的培养基，选择性浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种类型的细胞。慢病毒是一类复杂的逆转录病毒，除常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还含有其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染过程中。慢病毒的一些示例包括人类免疫缺陷病毒(HIV1、HIV2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过对HIV毒力基因的多重削弱而产生的，例如，删除env、vif、vpr、vpu和nef基因，使得载体具有生物学安全性。慢病毒载体是本领域已知的，参见，例如美国专利6,013,516和5,994,136，两者均以引用方式并入本文中。通常，所述载体是基于质粒或基于病毒的，并被配置为携带用于整合外源核酸、选择和将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。所关注载体的gag、pol和env基因也是本领域已知的。因此，将相关基因克隆到所选载体中，然后用于转化所需的靶细胞。美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中用两种或多种携带包装功能的载体，即gag、pol和env以及rev和tat，转染合适的宿主细胞，该专利以引用方式并入本文中。本发明描述了一种可提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体和可提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞的另一载体。将提供外源基因的载体引入该包装细胞产生生产细胞，该生产细胞释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒。env优选地是一种允许转导人和其他物种的细胞的两性包膜蛋白。通常，本发明所述核酸分子或载体包括“控制序列”，其统称为启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起始点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同提供了编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译。只要所选编码序列能够在合适的宿主细胞中被复制、转录和翻译，所有这些控制序列并不需要总是存在。另一种核酸序列是“启动子”序列，其在本文中以其一般意义用于指代包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列衍生自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“抑制型启动子”(其中与启动子可操作连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。

在一个具体的实施方式中，本发明所述单域抗体和多肽可与血栓性疾病的经典治疗联合使用。

因此，本发明涉及一种用于在需要其的受试者中预防或治疗血栓性疾病的方法，包括对所述受试者施用i)有效量的本发明所述单域抗体和/或多肽和ii)经典治疗，作为用于治疗血栓性疾病的联合制剂。

如本文所用，术语“血栓性疾病的经典治疗”是指用于治疗血栓性疾病和/或血栓切除术的任何天然或合成化合物。

根据本发明，用于治疗血栓形成的化合物可选自维生素K拮抗剂如香豆素、华法林、醋硝香豆素、苯丙香豆素、裂盒蕈色素、氟茚二酮和苯茚二酮；肝素及其衍生物如依诺肝素、达肝素、那屈肝素和亭扎肝素；Xa因子的合成的五糖抑制剂如磺达肝癸钠、艾卓肝素和生物素化艾卓肝素(idrabiotaparinux)；直接作用的口服抗凝血剂如达比加群酯、利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班和贝曲西班，直接凝血酶抑制剂如水蛭素、重组水蛭素、比伐卢定、阿加曲班和达比加群酯；抗凝血酶蛋白；巴曲酶；吻蛭素(hementin)；组织型纤溶酶原激活剂(tPA)；重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)如阿替普酶、瑞替普酶、尿激酶和替奈普酶；链激酶；阿尼普酶；血小板凝集抑制剂如氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、阿司匹林、三氟柳、坎格勒(cangerlor)、噻氯匹定、西洛他唑、沃拉帕沙、阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、双嘧达莫、血栓烷抑制剂和特鲁曲班；血小板GPVI抑制剂如ACT017和Revacept；P-选择素抑制剂如Crizanlizumab蛋白C激活剂，如AB002(WE凝血酶)和可溶性血栓调节蛋白(BDCA-3)；或重组活化蛋白C(APC)。

如本文所用，术语“取栓术(thromboectomy)”具有其在本领域中的一般含义，是指从血管中去除血凝块(血栓)的介入性手术。通常在脑动脉(介入神经放射学)中进行。支架取栓术可在全身麻醉或清醒镇静下在血管造影室进行。同轴导管系统被推入动脉循环内，通常通过皮肤进入右股动脉。最后将微导管置于闭塞段之外，并且展开支架取栓器以捕获血栓；最后，通常在较大导管的持续抽吸下，将支架从动脉中拔出。另一种脑内取栓技术是直接抽吸。它是将一根大的软抽吸导管推入闭塞的血管，直接抽吸取血栓；它可以与支架取栓技术相结合，以获得更高的再通率。

如本文所用，术语“联合治疗”、“联合疗法”或“治疗组合”是指使用一种以上药物的治疗。联合治疗可以是二联疗法(dual therapy)或双重治疗(bi-therapy)。

将用于根据本发明联合治疗中使用的药物同时、单独或顺序地施用于受试者。

如本文所用，术语“同时给药”是指通过相同途径并在相同时间或基本上相同时间施用两种活性成分。术语“单独给药”是指通过不同途径在相同时间或基本上在相同时间施用两种活性成分。术语“顺序给药”是指在不同时间施用两种活性成分，给药途径相同或不同。

本发明的药物组合物和试剂盒

通常，本发明所述单域抗体和多肽(单独或与载体一起)可与药学上可接受的赋形剂和任选地缓释基质(如可生物降解的聚合物)组合以形成药物组合物。因此，本发明所述单域抗体和多肽以药物组合物的形式向受试者施用。

“药学上”或“药学上可接受的”是指适当地对哺乳动物，特别是人给药时不产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封包材料或任何类型的配方助剂。

在本发明的用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠给药的药物组合物中，活性成分单独或与另一种活性成分组合，以单位给药形式，作为与常规药物载体的混合物，给药于动物和人。适宜的单位给药形式包括口服给药形式如片剂、凝胶胶囊、散剂、颗粒剂和口服混悬液或溶液、舌下和颊部给药形式、气雾剂、植入剂、皮下、经皮、局部、腹腔内、肌内、静脉内、皮下、经皮、鞘内和鼻内给药形式和直肠给药形式。

优选地，所述药物组合物含有药学上可接受用于能够注射的制剂的载体。特别地，这些载体可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或二钠、钠、钾、钙或氯化镁等盐或此类盐的混合物)，或干燥的、特别是冻干的组合物，根据情况，添加无菌水或生理盐水后允许构成可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；配方包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该剂型必须是无菌的，并且必须是易于注射的液体。它在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

包含本发明抑制剂作为游离基或药学上可接受的盐的溶液可在水中制备，适宜地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散液。在常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

本发明所述单域抗体和/或多肽可以被配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其由无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性例如可通过使用涂层(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持。多种抗菌和抗真菌剂可对微生物的作用起到预防作用，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长注射组合物的吸收。

无菌注射溶液的制备是在适当的溶剂中加入所需量的活性化合物，并根据需要加入上述几种其他成分，然后进行过滤灭菌。通常，分散液的制备是通过将各种灭菌活性成分加入到含有基本分散介质和上述所需其他成分的无菌载体中。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中获得活性成分的粉末和任何额外所需成分。

在配制时，溶液将以与剂量配方相适应的方式和以治疗有效的量施用。该配方易于以多种剂型(例如上述的注射溶液类型)给药，但也可使用药物释放胶囊等。

例如，对于水溶液的肠外给药，如有必要，应适当缓冲溶液，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂呈等渗状态。这些特定的水溶液特别适合静脉内、肌内、皮下和腹腔内给药。在这方面，本领域技术人员根据本公开将知道可使用的无菌水溶液介质。根据所治疗受试者的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，由负责给药的人员确定个体受试者的适当剂量。

除了配制用于肠外给药(如静脉内或肌内注射)的本发明抑制剂外，其它药学上可接受的形式还包括例如用于口服给药的片剂或其它固体；脂质体制剂；缓释胶囊；以及目前使用的任何其他形式。

本发明的药物组合物可包括用于治疗血栓性疾病的任何其它药剂。

在一个实施方式中，所述附加的活性剂可以包含在相同组合物中或单独给药。

在另一个实施方式中，本发明的药物组合物涉及在预防和治疗血栓性疾病中同时、单独或顺序施用的组合制剂。

最后，本发明还提供了包含本发明的至少一种单域抗体或多肽的试剂盒。含有本发明分离的单域抗体和/或本发明多肽的试剂盒可用于治疗方法。

本发明将借由以下图及实例进一步阐释。然而，不应将这些实例和图以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例1

材料与方法

利用噬菌体展示技术筛选PS003纳米抗体

抗PS纳米抗体的鉴定基本上与前面描述的抗VWF纳米抗体相同(Ayme等人.2017)。简言之，用重组人PS(rhPS)对一只美洲驼(L.glama)进行免疫的工作外包给了癌症研究中心(艾克斯-马赛大学，马赛，法国)。采血分离外周血淋巴细胞，用淋巴细胞总mRNA构建单域抗体(sdAb)库。简言之，总mRNA使用CH2'引物经逆转录酶合成cDNA。通过巢式PCR反应从cDNA中获得sdAb编码DNA片段，随后将片段克隆到pHEN6噬菌体载体中。使用连接的材料转化感受态TG1大肠杆菌细胞(ThermoFischer Scientific)，从而建立>10⁷个转化子库。暴露每种sdAbs的噬菌体通过用M13KO7辅助噬菌体感染该库的培养物而被拯救，将噬菌体颗粒与包被纯化rhPS(1mg/mL)的Dynabeads M-450环氧珠在含2％BSA和5mM CaCl₂的pH值为7.4的50mM Tris、150mM NaCl(TBS缓冲液)中室温孵育1h。使用含0.1％Tween-20和5mM CaCl₂的TBS洗涤磁珠9次，使用含5mM CaCl₂的TBS洗涤磁珠2次。在室温下，用500μL 1mg/mL胰蛋白酶在TBS中孵育30分钟，洗脱捕获的噬菌体。将洗脱的噬菌体(500μL)稀释在500μL TBS中，连续稀释5μL洗脱的噬菌体以感染TG1大肠杆菌细胞，并进行平板培养以评估PS特异性富集。剩余部分的洗脱的噬菌体溶液经M13KO7辅助噬菌体拯救后扩增，以进行新一轮富集。连续进行了两轮富集。经第二轮富集后，连续稀释5μL洗脱的噬菌体以感染TG1大肠杆菌细胞，并平板培养以获得单个耐氨苄青霉素菌落。为了分离出真正的PS特异性纳米抗体，将这些TG1克隆在0.5mL 2YT培养基的96孔深培养板中培养过夜，并用1mM IPTG诱导纳米抗体的表达。按照所述方法制备含有纳米抗体的周质提取物，并用直接ELISA法检测其与固定化rhPS或BSA的结合。这样可以鉴定出一种强而特异的PS结合剂，命名为PS003。

PS003和PS003biv纳米抗体的构建

为了允许胞质内细菌表达，将PS003的cDNA序列克隆到pET28质粒的5’PstI和3’BSTEII限制性位点之间。在这种pET28形式中，PS003的蛋白序列两侧有一个N端His6标签和一个C端血细胞凝集素(HA)标签，以便于纯化和检测(图1)。为了潜在地提高PS003的亲和力和活性，通过柔性(GGGS)₄接头融合PS003的两个cDNA序列，构建了PS003biv的二价形式(命名为PS003biv)(图1)。合成PS003biv的cDNA序列(ProteoGenix，法国)，并克隆到pET28质粒的PstI和BstEII限制性位点之间。一种单价抗VWF纳米抗体(KB013)和一种二价抗VWF纳米抗体(KB004biv)在我们的体外功能测试中用作对照。如前对PS003和PS003biv的描述，将这些纳米抗体的cDNA序列克隆到pET28质粒中。对于我们体内FeCl₃诱导的血栓模型，使用二价抗PS纳米抗体作为对照。这种抗PS纳米抗体，命名为PS004biv，由单价纳米抗体(PS004)构建而成，该纳米抗体通过选择固定在ELISA孔上的PS上的噬菌体颗粒来鉴定。使用三轮富集法来鉴定ELISA中与固定化PS强特异性结合的单价纳米抗体(PS004)。合成PS004biv的cDNA序列，并克隆到pET28质粒中。本研究中使用的所有纳米抗体的两侧都具有一个N端His6标签和一个C端HA标签，所有的二价纳米抗体都通过(GGGS)₄接头连接。

纳米抗体的表达和纯化

使用编码单价和二价纳米抗体的质粒转化感受态T7 SHuffle大肠杆菌细胞(NewEngland Biolabs)。对于每个纳米抗体，在30℃下含30g/mL卡那霉素的LB培养基中培养单个耐卡那霉素菌落，直至0.4<OD_600nm<0.6。然后通过添加0.1mM IPTG诱导纳米抗体的细胞质表达，并在20℃下制备纳米抗体16小时。在含10μg/mL溶菌酶(Sigma)和25U/mL苯甲酶(Sigma)的pH值为7.4的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl中重悬细菌颗粒，并添加SigmaFAST蛋白酶抑制剂(Sigma)。对悬浮液进行超声处理并且在4℃下以12000rpm离心30分钟。将裂解产物冷冻于-20℃。

采用固定化金属离子色谱(IMAC)纯化单价纳米抗体。简单地说，将裂解产物在37℃解冻，并在20℃以4700rpm离心30分钟。将上清液以1mL/分钟的速度装入HiTrap TALONCrude色谱柱(GE Healthcare)上，在pH值为7.4的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl中预平衡。使用>20柱体积的pH值为7.4的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl洗涤该柱，并使用>20柱体积的pH值为7.4的含10mM咪唑的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl洗涤。用pH值为7.4的含150mM咪唑的50mMNaH₂PO₄、0.3M NaCl洗脱结合的纳米抗体，并收集组分(1mL)。通过测量OD₂₈₀ _nm来测定各组分中的蛋白质含量，合并相关组分并在pH值为7.4的50mM Tris、150mM NaCl(TBS缓冲液)下透析。最终将透析液浓缩于

Ultra-15离心过滤装置(3kDa截止)(MerckMillipore)。

通过蛋白A亲和层析纯化双价纳米抗体。简言之，将裂解产物在37℃解冻，并在20℃以4700rpm离心30分钟。将上清液以0.5～1mL/分钟的速度装入HiTrap蛋白A快速流动柱(GE Healthcare)上，该柱在pH值为7.4的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl中进行预平衡。用>20柱体积的pH值为7.4的50mM NaH₂PO₄、0.3M NaCl洗涤该柱，用pH值为2.7的0.1M甘氨酸洗脱结合的纳米抗体。用含pH值为8.5的100μL 1M Tris HCl的试管收集组分(1mL)。通过OD₂₈₀ _nm测定各组分的蛋白质含量，将相关组分混合并在TBS缓冲液中透析。最终将透析液浓缩于

Ultra-15离心过滤装置(3kDa截止)(Merck Millipore)。

PS003的表位图

单独的重组形式的PS SHBG样结构域(rSHBG)先前已被表达并纯化(Saposnik etal.2003)。将BSA、纯化的rhPS和纯化的rSHBG(60μL 8μg/mL含5mM CaCl₂的TBS)固定在96孔NUNC Maxisorp板上，4℃下16小时。用3×200μL的洗涤缓冲液(含5mM CaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，在室温下用含5mM CaCl₂和5％BSA的TBS封孔1h。用3×200μL的洗涤缓冲液洗涤孔，在37℃下用固定浓度的PS003(2nM，含5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)孵育1小时。用3×200μL的洗涤缓冲液洗涤孔，用过氧化物酶标记的多克隆抗HA标签抗体(Abcam，1μg/mL，在含5mM CaCl₂和1％BSA的TBS中，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL的2M的H₂SO₄终止反应。结果表明，PS003的表位位于PS的SHBG样结构域内(图4)。此外，在Gas6 SHBG样结构域内未发现PS003的表位(图4)。因此，PS和Gas6 SHBG样结构域之间不保守的氨基酸残基可能是介导PS003和PS之间相互作用的候选氨基酸。

结论

PS003对rhPS的特异性

为了深入了解PS003的特异性，我们测试了纯化的PS003与PS和含有同源结构域(Gla和EGF样结构域)的各种维生素K依赖性蛋白的结合能力。将重组人PS(rhPS)、重组人FIX(BeneFIX，Pfizer)、重组人FX(Haematologic technologies)、血浆衍生蛋白Z(HyphenBioMed)和重组人Gas6(rhGas6)(Clauser et al.2012)(60μL，10μg/mL，含有5mMCaCl₂的TBS)固定在96孔NUNC Maxisorp平板上，在4℃下16小时。用3×200μL洗涤缓冲液(含0.1％Tween-20和5mM CaCl₂的TBS)洗涤孔，在室温下用含5mM CaCl₂和5％BSA的TBS封孔1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将固定浓度(20nM，含5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)的纯化PS003在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将过氧化物酶标记的多克隆抗HA标签抗体(Abcam，1g/mL，在含有5mM CaCl₂和1％BSA的TBS中，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL的2M的H₂SO₄终止反应。结果表明，PS003仅与rhPS强结合(图2)，因此PS003对PS具有较高的特异性。

维生素K依赖性Gas6与PS高度同源(总体同源性为47％)，而且与其他维生素K依赖性蛋白不同，维生素K依赖性Gas6也包含一个SHBG样结构域。为了进一步证实PS003对PS的特异性，rhPS和rhGas6(60μL，10μg/mL，含5mM CaCl₂的TBS)被固定在96孔NUNC Maxisorp板上，4℃下16小时。用3×200μL洗涤缓冲液(含5mM CaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，并在室温下在含5mM CaCl₂和5％BSA的TBS中封孔1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，将浓度增加的PS003(0～200nM，含5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL的缓冲液洗涤孔，用过氧化物酶标记的多克隆抗HA标签抗体(Abcam，1μg/mL，含5mMCaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL 2M的H₂SO₄停止反应。结果表明，PS003与rhPS呈剂量依赖性强结合，但与rhGas6未结合(图3)，这证实了PS003对rhPS的特异性。

ELISA夹心法中重组和血浆来源PS与固定化PS003的结合

在我们的噬菌体展示策略中，PS003是在与磁珠共价偶联的固定形式的rhPS上选择的。此外，我们发现PS003能与固定在ELISA孔上的rhPS强结合。为排除PS003仅识别非天然固定化形式的rhPS，采用夹心ELISA法分析溶液中rhPS与固定化PS003的结合情况。此外，由于PS003是在重组形式的PS上选择的，我们在相同的夹心ELISA法中分析了血浆来源的PS溶液与PS003的结合。简言之，rhPS和纯化的血浆来源的人PS(HaematologicTechnologies)(60μL，10μg/mL，含5mM CaCl₂的TBS中)固定在96孔NUNC Maxisorp板上在4℃下16小时。用3×200μL洗涤缓冲液(含5mM CaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，用含5mM CaCl₂和5％BSA的TBS在室温下封孔1小时。用3×200μL的洗涤缓冲液洗涤孔，将浓度增加的PS003(0～200nM，含5mM CaCl₂和1％BSA的TBS溶液，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL的缓冲液洗涤孔，用过氧化物酶标记的多克隆抗HA标签抗体(Abcam，2μg/mL，含5mMCaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL 2M的H₂SO₄停止反应。结果表明，PS003与重组或血浆来源的人PS结合(图5)，并且PS003与PS的结合并不局限于非天然固定化的PS形式。

ELISA法中PS003和PS003biv与固定化PS结合的比较

将重组人PS(rhPS)(60μL，2.5μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS中)固定在96孔NUNCMaxisorp板上在4℃下16小时。用3×200μL洗涤缓冲液(含有5mM CaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，并在室温下用含有5mM CaCl₂和5％BSA的TBS封孔1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将浓度不断增加的PS003和PS003biv(0～200nM，含有5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50μL/孔)在室温下孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将过氧化物酶标记的多克隆抗His6标记抗体(Abcam，1μg/mL，含有5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50L/孔)在室温下孵育1小时，以检测结合的纳米抗体。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL 2M的H₂SO₄停止反应。对于每一个纳米抗体，以简化方式进行三次单独实验，结果用每一个纳米抗体的最大结合百分比表示。结合曲线表明，PS003和PS003biv均与固定化的rhPS有效结合(图6)。

为了进一步比较PS003和PS003biv与PS结合的能力，按照描述(Beatty等人，JImmunol Methods 1987)估计了PS003和PS003biv对rhPS的亲和力，通过在三个简化的单独实验中获得在递增浓度(0.6、1.25、2.5和5μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS)下固定的rhPS的结合曲线。对于每种纳米抗体，使用基于质量作用定律的公式测定解离常数(KD)。

基于此方法，PS003和PS003biv的KD分别为26.8±2.7nM和13.8±5.7nM，表明PS003biv与rhPS的结合亲和力略高(1.9倍)。

PS003biv的表位图及PS003biv对PS的特异性

将rhPS、单独的重组形式的PS SHBG样区域(rSHBG)(Saposnik等人，2003)、重组人Gas6(rhGas6)或BSA(60μL，10μg/m L，pH值为7.4的50mM Tris、150mM NaCl(TBS)含有5mMCaCl₂)固定在96孔NUNC Maxisorp板上，在4℃下16小时。使用3×200μL洗涤缓冲液(含5mMCaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，并在室温下用含5mM CaCl₂和5％BSA的TBS中封孔1小时。使用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，在室温下将0.5nM PS003biv(在含5mM CaCl₂和0.1％Tween-20和2％BSA的TBS中，50μL/孔)孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将过氧化物酶标记的多克隆抗His6标签抗体(Abcam，1g/mL，含有5mM CaCl₂、0.1％Tween-20和2％BSA的TBS，50μL/孔)在室温下孵育1小时，以检测结合的纳米抗体。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL 2M的H₂SO₄停止反应。结果用在rhPS上获得的Abs450nm的百分比表示。以简化方式做了三个单独的实验。

结果表明，PS003biv与rSBHG有效结合(图7)，并且PS003biv的表位位于PS的SHBG样区域内。由于该区域仅在Gas6中发现，因此PS003biv与rhGas6不存在结合(图7)，强烈表明PS003biv对PS具有特异性。

在基于APTT的血浆凝固试验中，PS003和PS003biv对PS的AFC辅因子活性的增强作用

我们使用KC4凝血仪(Stago)上的商业APTT血浆凝固试验(

PS,Stago)来测量rhPS在FVa和FVIIIa灭活过程中作为APC辅因子的能力。简言之，将25μL在含0.1％BSA的TBS中稀释的rhPS与APC(R2试剂，25μL)和牛FVa(试剂R3，25μL)一起加入25μLPS缺失血浆(R1试剂)中。在37℃下孵育2分钟后，通过添加25μL 50mM的CaCl₂引发凝血。在该试验中，APC延长了PS缺失血浆的凝血时间，当rhPS与APC一起加入时，rhPS(最终浓度5nM)以剂量依赖性方式进一步延长了凝血时间(图8A)。这种延长反映了rhPS的APC辅因子活性。在该试验中，在不存在APC的情况下，rhPS不会延长凝血时间(图8A)。在该试验中，rhPS增强APC抗凝血活性的能力被多克隆抗PS抗体(DAKO，A0384)所抵消，该抗体已被大量描述为能有效阻断rhPS的APC辅因子活性(数据未显示)，这进一步证明了该试验非常依赖于rhPS的存在。

剂量-反应曲线表明，在存在固定浓度的APC时，rhPS剂量依赖性地延长凝血时间(图8B)。选择了中等浓度的rhPS(6nM)，使t_+PS/t_-PS的比值为～2，以便能够检测纳米抗体的任何抑制或刺激作用。

然后，我们检测了PS003和PS003biv对rhPS(6nM)增强APC抗凝血活性能力的影响。在室温下，将PS003、KB013、PS003biv和KB004biv与rhPS(30nM)在含0.1％BSA的TBS中以10μM浓度预培养15分钟。将rhPS±纳米抗体的混合物(25μL)与APC(R2试剂，25μL)和牛FVa(试剂R3，25μL)一起加入25μL的PS缺失血浆(R1试剂)中。在37℃下孵育2分钟后，通过添加25μL50mM的CaCl₂触发凝血。rhPS和纳米抗体的最终浓度分别为6nM和2μM。实验进行了三次。

在rhPS和APC存在的情况下，在不存在(TBS)和存在单价(KB013)和二价(KB004biv)纳米抗体(最终浓度2μM)时，凝血时间延长了约2倍，这反映了rhPS的正常APC辅因子(图8C)。相比之下，当PS003和PS003biv存在时(最终浓度为2μM)，凝血时间分别延长了2.8倍和3.6倍，从而反映出与各自的对照纳米抗体相比，PS003和PS003biv对rhPS的APC辅因子活性的增强作用令人惊讶(图8C)。此外，PS003biv对rhPS的APC辅因子活性的增强作用高于PS003。

之前的结果表示为rhPS存在时的凝血时间(t_+PS)与rhPS不存在时的凝血时间(1_-PS)的比值(图8D)。采用非配对学生t检验进行统计学检验。

在体外FVa灭活实验中，PS003和PS003biv对PS的APC辅因子活性的影响

在一项体外试验中评估了PS003和PS003biv增强rhPS的APC辅因子活性的能力，该试验测量了在rhPS存在下APC对FVa的特异性蛋白水解失活，使用纯化蛋白。在存在25μM的PC/PE/PS磷脂囊泡和增加浓度的rhPS(0～100nM)存在下，在含有5mM CaCl₂、0.2％PEG和0.2％BSA(“FVa灭活混合物”)的pH值为7.4的50mM Tris、150mM NaCl(TBS)中，用血浆来源人APC(Haematologic Technologies，0.5nM)灭活血浆来源人FVa20分钟。通过在含有5mMCaCl₂、0.2％PEG和0.2％BSA的TBS中稀释FVa灭活混合物(1:10)来终止反应。然后，在含有5mM CaCl₂、0.2％PEG和0.2％BSA以及50M PC/PS/PE磷脂囊泡的TBS中，使用血浆来源人凝血酶原(Haematologic Technologies，200nM)和FXa(Enzyme ResearchLaboratories，200nM)进行凝血酶原酶分析，测定残留FVa活性。在含有10mM EDTA、0.2％PEG和0.2％BSA的TBS中，使用显色底物(pNAPEP0238，200M)跟踪凝血酶的酰胺分解活性，并计算进展曲线的斜率。测定FVa灭活混合物中每种rhPS浓度的斜率，FVa活性值表示为存在rhPS时获得的斜率与不存在rhPS时获得的斜率之比。简单地做了三个实验。

结果表明，rhPS剂量依赖性且非常有效地增强了APC灭活FVa的能力(图9A)，选择浓度为6nM的rhPS评估PS003和PS003biv的作用。为了验证我们的检测是否依赖于rhPS的存在，我们还使用了多克隆抗PS抗体(DAKO，A0384)，已在很大程度上描述了该抗体可有效阻断rhPS的APC辅因子活性。因此，用0.5nM的APC、25μM的PC/PS/PE磷脂囊泡对80nM的FVa灭活20分钟，用6nM的rhPS与纳米抗体(PS003、PS003biv、对照单价纳米抗体KB013和对照二价纳米抗体KB004biv；最终浓度10μM)、兔多克隆抗PS抗体(α-PS，DAKO；最终浓度0.5μM)和兔IgG(DAKO；最终浓度0.5μM)预孵育15分钟或不及进行预孵育(TBS)。如前所述，使用凝血酶原酶分析法测定每种条件下的残留FVa活性，并与在无纳米抗体或抗体(TBS)的情况下对rhPS进行预孵育时获得的FVa活性进行比较。以简化方式进行了3个实验，以非配对学生t检验作为统计学检验(***P<0.001)。

结果表明，在APC辅因子活性测定中，阻断型抗PS抗体(α-PS,DAKO)有效地抑制了rhPS的APC辅因子活性(图9B)。与基于APTT的APC辅因子活性测定中观察到的结果相反，在这种“还原论”FVa灭活测定中，PS003和PS003biv对rhPS的APC辅因子活性没有增强作用(图9B)。

PS003和PS003biv对PS体外TFPIα辅因子活性测定的影响

已开发了一种体外试验来评估rhPS增强TFPIα对FXa的直接抑制作用的能力。在含有10mM CaCl₂、0.2％PEG、0.2％BSA和25μM的PC/PS/PE磷脂囊泡的终体积100μL的TBS中，监测血浆来源人FXa(Enzyme Research Laboratories，最终浓度0.2nM)对FXa特异性生色底物(pNAPEP,Cryopep,400μM)的酰胺分解活性，在60分钟内，每8秒监测一次。使用在大肠杆菌中表达的最终浓度为5nM的重组人全长TFPIα(来自荷兰马斯特里赫特市Tilman Hackeng的捐赠)来抑制FXa的酰胺分解活性。我们选择了这样的实验条件，在这些条件下，FXa仅受到TFPIα较弱的抑制，但rhPS(最终浓度为20nM)有效地增强了TFPIα对FXa的抑制(图10A)。在没有TFPIα的情况下，rhPS对酰胺分解活性FXa没有影响(数据未显示)。

当在室温下将rhPS与阻断型兔多克隆抗PS抗体(a-PS)(DAKO，最终浓度0.5μM)预孵育15分钟，但不与兔IgG(DAKO，最终浓度0.5μM)预孵育时，rhPS增强TFPIα抑制活性的能力被消除(图10B)。

室温条件下，将rhPS与PS003和PS003biv或各自的单价(KB013)和二价(KB004biv)对照纳米抗体(最终浓度10μM)共孵育15分钟，评价rhPS增强TFPIα抑制活性的能力。如前所述(Ndonwi et al.2010)，我们根据进展曲线计算了每种条件下TFPIα抑制FXa的动力学常数(Kobs)。结果表示为在不存在纳米抗体(TBS)的情况下，rhPS的TFPIα辅因子活性的百分比，并以简化方式进行了3次试验，采用非配对学生t检验进行统计学检验。

结果表明，在这一体外功能试验中，PS003和PS003biv没有增强，而是轻微抑制了rhPS的TFPIα辅因子活性(图10C)。

PS003biv和PS003biv与固定化重组鼠PS(rmPS)的结合

如前所述(Fernandez等人，2009)，对于rhPS，重组鼠PS(rmPS)在存在10g/mL维生素K1的HEK293细胞中表达，并通过两步阴离子交换色谱法纯化。rmPS(60μL，10μg/mL，含有5mM CaCl₂的TBS)固定在96孔NUNC Maxisorp板上在4℃下16小时。用3×200μL洗涤缓冲液(含有5mM CaCl₂和0.1％Tween-20的TBS)洗涤孔，在室温下用含有5mM CaCl₂和5％BSA的TBS封孔1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并在室温下用浓度不断增加的PS003biv和PS004biv(0～50nM，含有5mM CaC1₂和1％BSA，50μL/孔)孵育1小时。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并将过氧化物酶标记的多克隆抗HA标签抗体(Abcam，2g/mL，含有5mM CaCl₂和1％BSA的TBS，50L/孔)在室温下孵育1小时，以检测结合的纳米抗体。用3×200μL洗涤缓冲液洗涤孔，并加入50μL的TMB。加入50μL 2M H₂SO₄停止反应。

结果表明，PS003biv与rmPS强结合(图11)，并且可以在小鼠血栓和出血模型中检测PS003biv。由于在此试验中PS004biv不与rmPS结合(图11)，因此它可能在我们的小鼠体内模型中用作PS003biv的对照纳米抗体。

由于鼠和人PS在其SHBG样区域之间具有78％的序列同源性，因此该结果也有助于PS003biv的表位作图。实际上，候选氨基酸残基可能在人和鼠PS的SHBG样区域内保守，但在人Gas6的SHBG样区域内不保守。

在小鼠FeCl₃诱导的血栓模型中PS003biv的体内抗血栓作用

与先前描述基本相同(Ayme等人，2017；Adam等人，2010)，在4至5周龄的C57BL/JRccHsd雄性小鼠中诱导了氯化铁(FeCl₃)损伤。为了便于观察血栓形成情况，通过向眼眶后神经丛静脉注射罗丹明6G(3.3mg/kg，即2.5μL/g罗丹明6G在0.9％氯化钠溶液中为1mg/mL)，对麻醉小鼠的血小板进行了体内荧光标记。将PS003biv(10mg/kg)、PS004biv(10mg/kg)或相同体积的TBS缓冲液(Ctl)在0.9％NaCl中稀释，并同时给药。或者，单独静脉注射罗丹明6G后皮下注射200UI/kg低分子肝素(LMWH，Lovenox)，以验证我们的血栓模型对药物抑制凝血敏感。将标记的血小板循环10分钟，将FeCl₃溶液(10％溶于水)局部沉积在肠系膜血管后，用倒置荧光显微镜(×10)(尼康Eclipse TE2000-U)实时监测血栓生长。对每只小鼠的单个小静脉和单个小动脉进行分析。采用Kruskal Wallis和Dunn's检验进行统计学分析。结果表明，在我们的FeCl₃诱导的小鼠肠系膜血管血栓形成模型中，PS003biv具有抗血栓形成作用。用PS003biv治疗小鼠导致延迟闭塞，尤其是在静脉中(图12A)。与对照纳米体相比，在接受PS003biv治疗的小鼠的小动脉中观察到了类似的趋势，但未达到统计学差异(图12A)。PS003biv给药还与血栓稳定性和较高的血栓栓塞率相关(图12B)。PS003biv的这些明显抗血栓形成作用可能至少部分反映了PS003biv对rhPS的APC辅助因子活性的增强作用。

应当注意的是，在我们的APC和TFPIα辅因子活性检测中使用的对照双价抗VWF纳米抗体(KB004biv)不能用于我们的FeCl₃诱导的血栓模型。事实上，用这种纳米抗体治疗小鼠导致一只小鼠的小静脉和小动脉的闭塞时间延迟。因此，我们决定使用不能与重组小鼠PS结合的体内二价抗PS纳米抗体(PS004biv)(图11)。

PS003biv对小鼠尾夹出血模型生理性止血的影响

如FeCl₃诱导的血栓模型所述，对麻醉的C57/BL6小鼠静脉注射PS003biv(10mg/kg)或皮下注射低分子量肝素(LMWH)(Lovenox，200UI/kg)。在37℃下将尾部浸入0.9％NaCl中10分钟，从尾巴顶端切下3mm，然后立即浸入37℃的含10mL 0.9％NaCl的试管中。出血时间定义为首次止血。在20分钟内采集血液以量化总失血量。每条柱状图代表从被评估的几只小鼠获得的平均值。采用普通单因素方差分析与Tukey多重比较检验进行方差的统计学检验。

结果表明，该小鼠出血模型对药物抑制凝血敏感，因为给予200UI/kg低分子量肝素(LMWH)显著延长了出血时间并显著增加了失血量(图13)。该剂量的LMWH也显著延长了小鼠FeCl₃诱导血栓模型的闭塞时间(图12A)。与LMWH相比，PS003biv对出血时间和失血量均无显著影响(图13)。这些结果支持了我们的假设，即PS003biv给药增强了PS的抗凝血活性且与生理性止血功能损害无关。因此，我们目前的研究表明PS003biv作为一种有效和安全的抗血栓药物具有治疗潜力。

讨论

我们认为PS003/PS003biv纳米抗体可能对镰状细胞病(SCD)具有治疗意义。SCD是一种由HEB基因点突变引起的遗传性疾病，会导致血红蛋白S(HbS)在脱氧过程中聚合，并使红细胞变形为镰刀状。这种镰刀状损伤红细胞在微血管中的转运，使它们易于溶血。红细胞裂解释放有害介质，其中，激活血管内皮细胞，并驱动白细胞和血小板粘附到活化的内皮上。这些病理事件最终会导致微血管阻塞，从而导致作为SCD特征的复发性和疼痛性血管闭塞危象(VOC)。这些血管闭塞事件最终会导致末端器官损伤，并在许多情况下会导致过早死亡。

VOC的病理生理学非常复杂，涉及镰刀状红细胞、内皮细胞、血小板和白细胞之间的相互作用。此外，SCD患者通常被认为处于慢性高凝状态(Whelihan等人，JTH，2016)，证据是这些患者的凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、凝血酶原片段F1.2和D-二聚体的水平升高(Ataga等人，Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007)。这种高凝状态与静脉血栓栓塞和中风的风险增加有关，已在SCD患者中得到很好的描述(Sparkenbaugh和Pawlinksi.JTH 2017；Brunson等人，Br J Helol 2017；Shet等人，Blood 2018)。然而，SCD的慢性凝血活化也可能局部触发和/或增强血管炎症，这是SCD的一个重要病理生理特征。事实上，人们早就认识到，在各种血栓炎性疾病中，凝血和炎症可以相互放大，并且凝血和炎症之间的相互作用被认为是SCD中血管闭塞的病理生理学的核心(Sparkenbaugh等人.BrJ Haematol 2013)。

组织因子(TF)在SCD患者和SCD小鼠模型的白细胞中表达增加，显示TF可能参与了SCD的高凝状态。白细胞TF被认为是SCD中最有可能促进凝血激活的TF来源(Sparkenbaugh和Pawlinski.JTH，2017)，但TF也可在血管内皮细胞中诱导表达。关于接触系统在SCD高凝状态中的作用尚不清楚。FXII可能在各种细胞类型(如镰状红细胞和内皮细胞)和来自内皮细胞、血小板或单核细胞衍生的微囊泡上的磷脂酰丝氨酸暴露位点被激活。这可以从一项研究中推断出来，该研究表明FXII能够与凋亡细胞暴露的磷脂酰丝氨酸结合，导致其快速裂解和激活(Yang等人，Front Immunol 2017)。这种由磷脂酰丝氨酸激活的FXII可能是SCD中凝血激活的另一个触发因素，与TF无关。或者，FXII和接触系统可被肥大细胞衍生的产物(如糖胺聚糖和肝素)激活，或由溶血释放的糖化血红蛋白激活(Sparkenbaugh和Pawlinski.JTH 2017)。

镰状红细胞、内皮细胞和微囊泡表面的磷脂酰丝氨酸的暴露是SCD高凝状态的重要驱动因素。磷脂酰丝氨酸的暴露显著加速了凝血反应的速率，也可能增强TF的译码和活化(Ansari等人，Thromb Haemost 2019)。有趣的是，PS对含磷脂酰丝氨酸的阴离子磷脂膜具有很高的亲和力，这表明PS可能积聚在这些位点，并可能发挥重要的抗凝血作用，在局部限制凝血酶的产生。然而，磷脂酰丝氨酸在血管和血管内的广泛暴露也可能导致PS的捕获及其血浆池的耗竭。这与多项研究中在SCD患者中观察到的明显获得性PS缺乏一致(Whelihan等人，JTH，2016)。急性或慢性缺氧也可能参与了SCD患者血浆PS水平的降低，因为发现PS的肝脏表达通过HIF-lα被缺氧下调(Pilli等人，Blood 2018)。尚不清楚这种PS缺失如何导致SCD患者高凝并加剧血栓形成倾向。有趣的是，在SCD患者中也发现了蛋白C缺乏症(Whelihan等人，JTH，2016)，这表明抗凝蛋白C途径可能在SCD中发生更广泛的改变。事实上，预计SCD中PS和蛋白C的联合缺乏将对活化蛋白C(APC)发挥其抗凝血活性的能力产生重大影响。这得到了在SCD患者血浆中发现的APC抗性的支持，尽管这些患者中的FVIII水平升高也可能是一个促成因素(Wright等人，1997；Whelihan等人，2016)。

重要的是，局部凝血激活和凝血酶的产生可能直接在VOC的病理生理学中起主要作用，而不依赖于其在血栓形成期间产生纤维蛋白的能力。事实上，凝血酶不仅能裂解纤维蛋白原产生纤维蛋白，而且还是内皮细胞、血小板和白细胞的有效激活剂，特别是通过PAR1激活。在内皮细胞中，凝血酶在内皮细胞中发挥PAR1依赖性促炎症、促凋亡和屏障破坏作用(Flaumenhaft和De Ceunynck.Trends Pharmacol Sci 2017)。此外，凝血酶介导的内皮细胞上PAR1的激活诱导了含有血管性假血友病因子(VWF)和P选择素的Weibel-Palade小体的胞吐作用(Cleator等人，Blood 2014)，这有助于或增强镰状红细胞和内皮细胞之间的相互作用。此外，Weibel-Palade小体的这种胞吐作用可以释放血管血栓炎症的其他可溶性介质，如血管生成素-2。此外，凝血酶可以直接或间接诱导内皮细胞上磷脂酰丝氨酸的暴露，从而促进和维持内皮细胞表面的凝血和凝血酶生成。

因此，即使在没有血栓形成和广泛凝血激活的情况下，由TF和内皮表面接触系统引发的凝血酶局部和低水平生成可能是血管炎症和血管闭塞事件的早期触发因素。最近，一种抗TF抗体、直接口服靶向FXa(利伐沙班)和凝血酶(达比加群)的抗凝剂以及PAR1拮抗剂(vorapaxar)均显著降低了VOC小鼠模型中血红蛋白诱导的微血管瘀血(Sparkenbaugh等人，Blood2020)。因此，针对凝血酶介导的内皮PAR1激活的药理学靶向治疗似乎是一种有吸引力的治疗策略，以预防和/或减少SCD中的VOC。该研究还表明，通过天然抗凝血剂(如PS、APC和组织因子途径抑制剂(TFPI))适当控制内皮表面凝血酶的生成，可能是限制VOC的关键。

PS对暴露于活化内皮表面的磷脂酰丝氨酸表现出较高的亲和力，并具有作为APC和TFPI-α辅因子的独特功能。通过刺激APC和TFPI-α的抗凝血活性，PS可能在限制SCD内皮细胞表面凝血酶生成中发挥核心作用。因此，PS可能是凝血酶诱导的血管阻塞事件的重要负调节因子，尽管这一点尚未在试验研究中得到证实。

我们在此提出，利用PS003/PS003biv纳米抗体增强PS的APC辅因子活性可能成为一种预防或减少SCD患者血管阻塞事件的新治疗策略。PS003/PS003biv通过其抗血栓特性可以同时帮助降低接受治疗患者的静脉血栓栓塞事件和中风的风险，尤其是在SCD患者中发现PS缺乏和APC抗性。

参考文献：

在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现状。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开内容中。

Adam F,Kauskot A,Nurden P,Sulpice E,Hoylaerts MF,Davis RJ,Rosa JP,Bryckaert M.Platelet JNKI is involved in secretion and thrombusformation.Blood 2010；115:4083-4092

Ansari SA,Pendurthi UR,Vijaya L,Rao M.Role of cell surface lipids andthiol-disulphide exchange pathways in regulating the encryption anddecryption of tissue factor.Thromb Haemost 2019；119:860-870

Ataga Kl,Key NS.Hypercoagulability in sickle cell disease:newapproaches to an old problem.Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007；91-96

Ayme G,Adam F,Legendre P,Bazaa A,Proulle V,Denis CV,Christophe OD,Lenting PJ.A novel single-domain antibody against Von Willebrand Factor Aldomain resolves leukocyte recruitment and vascular leakage duringinflammation.Arterioscler Thromb Vase Biol 2017；37:1736-1740

Beatty JD,Beatty BG,Vlahos WG.Measurement of monoclonal antibodyaffinity by non-competitive enzyme immunoassay.J Immunol Methods 1987；100(1-2):173-179

Brunson A,Lei A,Rosenberg AS,White RH,Keegan T,Wun T.Increasedincidence of VTE in sickle cell disease patients:risk factors,recurrence andimpact on mortality.Br J Haematol 2017；178:319-326

Cantwell AM,Di Cera E.Rational design of a potent anticoagulantthrombin.J Biol Chem 2000；275:39827-39830

Clauser S,Meilhac 0,Bieche I,Raynal P,Bruneval P,Michel JB,BorgelD.Increased secretion of Gas6 by smooth muscle cells in human atheroscleroticcarotid plaques.Thromb Haemost 2012；107:140-149

Cleator JH,Zhu WQ,Vaughan DE,Hamm EE.Differential regulation ofendothelial exocytosis of P-selectin and von Willebrand factor by protease-activated receptors and cAMP.Blood 2006；107:2736-2744

Dargaud Y,Scoazec JY,Wielders SJH,Trzeciak C,Hackeng TM,Negrier C,Hemker HC,Lindhout T,Castaldi E.Characterization of an autosomal dominantbleeding disorder caused by a thrombomodulin mutation.Blood 2015；125:1497-1501

Fernandez JA,Kojima K,Petaja J,Hackeng TM,Griffin JH.Cardiolipinenhances protein C pathway anticoagulant activity.Blood Cells Mol Dis 2000；26:115-123

Fernandez JA,Heeb MJ,Xu X,Singh I,Zlokovic BV,Griffin JH.Species-specific anticoagulant and mitogenic activities of murine proteinS.Haematologica 2009；94:1721-1731

Flaumenhaft R,De Ceunynck K.Targeting PARl:Now What？Trends PharmacolSci 2017；38:701-716

Griffin JH,Kojima K,Banka CL,Curtiss LK,Fernandez JA.High-densitylipoprotein enhancement of anticoagulant activities of plasma protein S andactivated protein C.J Clin Invest 1999；103:219-227

Gruber A,Cantwell AM,Di Cera E,Hanson SR The thrombin mutant W2 l 5A/E2 l 7A shows safe and potent anticoagulant and antithrombotic effects invivo.J Biol Chem 2002；277:27581-27584

Gruber A,Marzec UM,Bush L,Di Cera E,Fernandez JA,Berny MA,Tuker El,McCarty OJT,Griffin JH,Hanson SR Relative antithrombotic and antihemostaticeffects of protein C activator versus low-molecular-weight heparin inprimates.Blood 2007；109:3733-3740

Heeb MJ,Fernandez JA,Yamashita A,McDowell OR,Guo Z,Mosnier LO,DeguchiH,Griffin JH.Activated protein C anticoagulant activity is enhanced byskeletal muscle myosin.Haematologica 2020；105:e424-e427

McArthur JG,Svenstrup N,Chen C,Fricot A,Carvalho C,Nguyen J,Nguyen P,Parachikova A,Abdulla F,Vercellotti GM,Hermine 0,Edwards D,Ribeil JA,BelcherJD,Maciel TT.A novel,highly potent and selective phosphodiesterase-9inhibitor for the treatment of sickle cell disease.Haematologica 2020；105:623-631

Ndonwi M,Tuley EA,Broze Jr GJ.The Kunitz-3 domain of TFPI-a isrequired for protein S-dependent enhancement of factor Xa inhibition.Blood2010；116:1344-1351.

Saposnik B,Borgel D,Aiach M,Gandrille S.Functional properties of theSex-Hormone-Binding Globulin(SHBG)-like domain of the anticoagulant proteinS.Eur J Biochem 2003；270:545-555

Shet AS,Wun T.How I diagnose and treat venous thromboembolism insickle cell disease.Blood 2018；132:1761-1769

Sparkenbaugh E,Pawlinski R Interplay between coagulation and vascularinflammation in sickle cell disease.Br J Haematol 2013；162:3-14

Sparkenbaugh E,Pawlinski R Prothrombotic aspects of sickle celldisease.J Thromb Haemost 2017；15:1307-1316

Sparkenbaugh EM,Chen C,Brzoska T,Nguyen J,Wang S,Vercellotti GM,KeyNS,Sundd P,Belcher JD,Pawlinski R.Thrombin activation of PAR-1 contributes tomicrovascular stasis in mouse models of sickle cell disease.Blood 2020；135:1783-1787

Studer RA,Opperdoes FR,Nicolaes GAF,Mulder AB,Mulder R.Understandingthe functional difference between Growth arrest-specific protein 6 andprotein S:an evolutionary approach.Open Biol 2014；4:140121

Tucker El,Verbout NG,Markway BD,Wallisch M,Lorentz CU,Hinds MT,Shatzel JJ,Pelc LA,Wood DC,McCarty OJT,Di Cera E,Gruber AThe protein Cactivator AB002 rapidly interrupts thrombus development in baboons.Blood2020；135:689-699

Whelihan MF,Lim MY,Mooberry MJ,Piegore MG,Ilich A,Wogu A,Cai J,MonroeDM,Ataga Kl,Mann KG,Key NS.Thrombin generation and cell-dependenthypercoagulability in sickle cell disease.J Thromb Haemost 2016；14:1941-1952

Wright JG,Cooper P,Malia RG,Kulozik AE,Vetter B,Thomas P,Preston FE,Serjeant GR Activated protein C resistance in homozygous sickle celldisease.Br J Haematol 1997；96:854-856

Yang A,Chen F,He C,Zhou J,Lu Y,Dai J,Birge RB,Wu Y.The procoagulantactivity of apoptotic cells is mediated by interaction with factor XII.Frontlmmunol 2017；8:1188

序列表

<110> INSERM（法国国家健康医学研究院）

巴黎公共救济院（APHP）

巴黎-萨克雷大学

<120> 抗蛋白S单域抗体和包含其的多肽

<130> 29943INS

<141> 2022-12-28

<150> EP20305723.7

<151> 2020-06-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PS003 CDR1

<400> 1

Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PS003 CDR2

<400> 2

Ile Ser Tyr Asn Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PS003 CDR3

<400> 3

Ala Ala Asn Pro Arg Met Trp Gly Ser Val Asp Phe Arg Ser Trp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PS003

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Tyr Asn Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Arg Met Trp Gly Ser Val Asp Phe Arg Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 258

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PS003biv

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Tyr Asn Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Arg Met Trp Gly Ser Val Asp Phe Arg Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Tyr Asn Gly

180 185 190

Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

210 215 220

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Arg Met Trp

225 230 235 240

Gly Ser Val Asp Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker

<400> 6

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1.一种针对蛋白S(PS)的分离的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体增强PS的APC辅因子活性。

2.根据权利要求1所述的分离的单域抗体，其中，所述sdAb包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3。

3.根据权利要求1或2所述的分离的单域抗体与SEQ ID NO:4所示序列具有至少70％的同一性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的单域抗体，包含如SEQ IDNO:4所示的序列。

5.一种交叉竞争的单域抗体，与根据权利要求1所述的单域抗体交叉竞争结合PS。

6.一种多肽，包含至少一种根据权利要求1所述的单域抗体。

7.根据权利要求6所述的多肽，包含至少两个根据权利要求1所述的单域抗体。

8.根据权利要求6所述的多肽，包含两个根据权利要求1所述的单域抗体。

9.根据权利要求7所述的多肽，包含如SEQ ID NO:5所示的序列。

10.一种核酸分子，编码权利要求1所述的单域抗体和/或权利要求6所述的多肽。

11.一种载体，包含权利要求10所述的核酸。

12.一种宿主细胞，被权利要求10所述的核酸和/或权利要求11所述的载体转染、感染或转化。

13.一种预防或治疗有需要的受试者的血栓性疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1所述的单域抗体和/或权利要求6所述的多肽。

14.一种预防或治疗有需要的受试者的血管闭塞危象的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1所述的单域抗体和/或权利要求6所述的多肽。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述血栓性疾病为脓毒症、镰状细胞贫血；栓塞(肺部和脑部)、中风或心血管疾病。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的单域抗体和/或权利要求6所述的多肽。