JP2022537031A - プロテアーゼネキシン－１に対する立体構造的な単一ドメイン抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）は、その主な標的がトロンビンである、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）ファミリーの一員である。ＰＮ－１に対する現在のポリクローナル抗体及びモノクロ―ナル抗体は、構造的及び機能的に相同なセルピンである、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に頻繁に交差反応する。本明細書において、本発明者らは、ヒト（ｈＰＮ－１）及びマウス（ｍＰＮ－１）のＰＮ－１の両方に特異的な結合を示し、ＰＡＩ－１に交差反応しない、阻害性の単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を開発する。重要なことには、全てのＶＨＨが、血漿中のＰＮ－１活性、並びに、止血中のＰＮ－１の主な発生源の１つである活性化血小板から放出されたＰＮ－１を遮断することができた。したがって、本発明は、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する立体構造的な単一ドメイン抗体、及び特に出血性疾患の処置のための治療分野におけるその使用に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する立体構造的な単一ドメイン抗体、及び特に治療分野におけるその使用に関する。

発明の背景：
血友病患者及びより一般的には恒常的な出血性疾患を有する患者における出血エピソードを制御するための現在の処置は、多くの欠点を呈する。阻害剤を用いたこれらの患者の処置は、組換え型第ＶＩＩａ因子又は血漿由来活性化プロトロンビン複合体などの、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子迂回剤に限定されている。しかしながら、これらの製品は高価であり、かなりの数の患者が、これらの薬剤に応答しない。したがって、組換え型又は血漿由来第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子の静注に大半が依拠する現在の処置の限界に因り、天然抗凝固タンパク質をターゲットとすることを目的とした新規な戦略が出現した。

本発明者らは以前に、血小板のＰＮ－１が、トロンビンの活性及び生成の両方の負の調節因子であり、ＰＮ－１の欠乏は、インビボにおいて凝固を促進することを実証した（Boulaftali et al. 2010）。本発明者らは、ＰＮ－１をターゲットとすることで、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の欠乏を処置することができたことを示し、ＰＮ－１の遮断が、出血性疾患の処置において役割を果たすことを実証した。

本明細書において、本発明者らは、天然かつ強力なトロンビン阻害剤である、血小板のプロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する阻害性単一ドメイン抗体（ＶＨＨ又はナノボディーズ）を開発する。本発明者らは、ＰＮ－１に対する特異的な抗体を作製することの難しさを強調する。本発明者らが試験したＰＮ－１に対する市販の抗体の大半も非特異的であることが判明した。本発明のナノボディーズは、マウス及びヒトの両方のＰＮ－１の抗トロンビン活性を遮断することのできる、最初の特異的な生物学的ツールであるようである。したがって、それらは、血小板中のＰＮ－１を遮断して、血友病患者における止血バランスを回復させるための良い候補である。

発明の要約：
セルピン２としても知られている、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）は、多くの生物学的事象における重要な調節因子である、セルピンと称される、セリンプロテアーゼ阻害剤の一員である。ＰＮ－１は、血漿中には殆ど検出不可能であるが、多くの器官において見られ、大半の細胞型（単球、血小板、及び血管細胞を含む）によって産生される、セルピンである。ＰＮ－１は、ヒト染色体２ｑ３３－ｑ３５上のセルピン２遺伝子によってコードされる、４５から５０ｋＤａの糖タンパク質である。ＰＮ－１は、分子のタンパク質コア内でジスルフィド結合を形成していない３つのシステイン残基を含有している、３７８アミノ酸残基の一本鎖である（Bouton et al., 2012 and Mc Grogan et al 1988 Boulaftali et al., 2010）。本発明者らは以前に、ＰＮ－１をターゲットとすることが、軽症及び中等症の血友病患者におけるトロンビン生成を改善することを実証した。これらの所見は、血小板における特異的な抗凝固剤としてのＰＮ－１の阻害のための必要条件を確立し、ＰＮ－１の遮断が、出血性疾患の処置に役割を果たすことを実証した。

本出願において、本発明者らは、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する立体構造的な単一ドメイン抗体の成功裡な選択及び特徴を記載する。該抗体の配列は、表１に示されている。ヒト及びマウスの両方のＰＮ－１を認識するＶＨＨをスクリーニングするための、ラマ由来又は合成のナノボディーズライブラリーを使用したファージディスプレイ実験が行なわれた。ラマ由来ライブラリーを使用して、計７回のパンニング及び９４０個の試験されたＶＨＨにより、ＰＮ－１を認識する５２個の候補が得られた。しかしながら、注意深い特徴付けにより、これら全てのＶＨＨが、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）も認識することが判明した。この特異性の欠如は、本発明者らに、合成ライブラリーのスクリーニングを促し、その結果、他のセルピンと交差反応性を示すことなく、ヒト及びマウスの両方のＰＮ－１に効率的に結合する、７個の陽性のナノボディーズが得られた。４つが、ヒト及びマウスのＰＮ－１の抗トロンビン活性を阻害することができることが判明した。特に、本発明者らは、３つの別個のエピトープに結合する、３つの異なる特異的な抗ＰＮ－１クローンを単離した。興味深いことには、３つ全ての単一ドメイン抗体が、他のセルピン又はプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）と交差反応することなく、ＰＮ－１に特異的であることが判明した。したがって、これらの抗体は、アンチトロンビンを遮断する最初の特異的な生物学的ツールであるようであり、血友病患者における止血バランスを回復させやすいようである。

したがって、本発明は、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する単一ドメイン抗体、及び特に治療分野におけるその使用に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、プロテアーゼネキシン－１（ＰＮ－１）に対する選択的な結合を可能とする、３つの特異的なＣＤＲを含む、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を開発した。これらのｓｄＡｂは、治療剤としての実行ツールを構成する。

定義
本明細書において使用する「プロテアーゼネキシン－１」すなわち「ＰＮ－１」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、セルピン２としても知られるプロテアーゼネキシン－１を指す。ＰＮ－１は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、多くの生物学的事象における重要な調節因子である、セルピンと称される、セリンプロテアーゼ阻害剤の一員を指す。ＰＮ－１は、血漿中には殆ど検出不可能であるが、多くの器官において見られ、大半の細胞型（単球、血小板、及び血管細胞を含む）によって産生される、セルピンである。ＰＮ－１は、ヒト染色体２ｑ３３－ｑ３５上のセルピン２遺伝子によってコードされる、４５から５０ｋＤａの糖タンパク質である。ＰＮ－１は、分子のタンパク質コア内でジスルフィド結合を形成していない３つのシステイン残基を含有している、３７８アミノ酸残基の一本鎖である（Bouton et al., 2012 and Mc Grogan et al 1988 Boulaftali et al., 2010）。

本明細書において使用する「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、軽鎖を天然的に欠失しているラクダ科哺乳動物に見ることのできる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ又は「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明については、上記に列挙されている先行技術、並びに、欧州特許第０３６８６８４号、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号にも言及されている。ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量を有し、該タンパク質は、僅か数ナノメートルの物理的直径を有する。小さなサイズであることの１つの結果は、ラクダ科ナノボディーズが、より大きな抗体タンパク質には機能的に見えない抗原性部位に結合できることであり、すなわち、ラクダ科ナノボディーズは、古典的な免疫学的技術を使用すると見つけることができない抗原を検出するための試薬として、及び治療剤の候補として有用である。したがって、小さなサイズであることのさらに別の結果は、ナノボディが、標的タンパク質の溝又は狭い間隙内の特定の部位に結合する結果として阻害することができ、したがって、古典的な抗体よりも古典的な低分子薬の機能により近似しているという能力の点で役に立ち得ることである。低分子量及びコンパクトなサイズによりさらに、ナノボディーズは極めて熱に安定となり、極端なｐＨに対して安定となり、タンパク質溶解による消化に対して安定となり、弱い抗原性となる。別の結果は、ナノボディーズが容易に循環系から組織へと移動し、血液脳関門さえ通過し、神経組織を冒す障害を処置することができることである。ナノボディーズはさらに、血液脳関門を横断した薬物輸送を促進することができる。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願第２００４０１６１７３８号を参照されたい。ヒトに対する低い抗原性を兼ね備えたこれらの特色は、優れた治療能を示す。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、当技術分野において及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」すなわち「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」すなわち「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」すなわち「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」すなわち「ＦＲ４」と称される、４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」から構成されると考えられ得；該フレームワーク領域は、当技術分野においてそれぞれ、「相補性決定領域１」すなわち「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」すなわち「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」すなわち「ＣＤＲ３」と称される、３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」によって分断されている。したがって、単一ドメイン抗体は、一般的な構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するアミノ酸配列として定義され得、ここでＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、相補性決定領域１～３を指す。本発明の文脈において、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、国際的免疫遺伝学情報システムによるアミノ酸の番号付け（http://imgt.cines.fr/）によって示される、ＶＨドメインについての一般的な番号付けに従って番号が付けられる。

本明細書において使用する「アミノ酸配列」という用語はその一般的な意味を有し、タンパク質にその一次構造を付与するアミノ酸配列である。本発明によると、アミノ酸配列は、相互作用的な結合能の明らかな減少を伴うことなく、１つ、２つ、又は３つの保存的アミノ酸置換を用いて修飾されていてもよい。「保存的アミノ酸置換」によって、アミノ酸は、類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置換されていてもよいことを意味する。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似した側鎖を有するアミノ酸ファミリーが、当技術分野において定義されている。

本発明によると、第二のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第一のアミノ酸配列は、第一の配列が、第二のアミノ酸配列に対して７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の同一性は典型的には、ＢＬＡＳＴＰ（Karlin and Altschul, 1990）などの適切な配列アラインメントアルゴリズム及びデフォールトパラメーターを使用して決定される。

本発明の意味によると、「同一性」は、比較窓における２つの整列させた配列を比較することによって計算される。配列アラインメントは、比較窓における２つの配列について共通の位置の数（ヌクレオチド又はアミノ酸）を決定することを可能とする。それ故、共通の位置の数を、比較窓における位置の総数で割り、１００を乗じることにより、同一性が得られる。配列の同一性の決定は、手作業で行なっても、又は周知のコンピュータープログラムにより行なってもよい。

本明細書において使用する「精製された」及び「単離された」という用語は、本発明の単一ドメイン抗体に関し、単一ドメイン抗体が、同じ種類の他の生物学的巨大分子が実質的に存在しない中で存在することを意味する。ここで使用されているような「精製された」という用語は好ましくは、巨大分子の総重量と比較して、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９８重量％の抗体が存在することを意味する。

本明細書において使用する「核酸分子」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。

単一ドメイン抗体及びポリペプチド
本出願における関心対象の配列は、以下の表１に示されている：

本発明の第一の目的は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
（式中、
ＣＤＲ１は、以下の配列：Ｘ_１－Ｔ－Ｗ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｅ－Ｉ（ここでのＸ_１はＳ又はＤであり、Ｘ_４はＦ又はＲであり、Ｘ_５はＲ又はＬである）を有し；そして
ＣＤＲ２は、以下の配列：Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｗ－Ｈ－Ａ（ここでのＸ２はＤ又はＥであり、Ｘ３はＰ又はＤであり、Ｘ４はＴ又はＧである）を有し；そして
ＣＤＲ３は、配列番号３又は配列番号７として示される配列を有する）
で示される式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む、単離された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む（「Ｂ１１誘導体」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む（「Ｆ０６誘導体」）。

本発明の別の目的は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）からなる式（Ｉ）：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
（式中、
ＣＤＲ１は、配列番号９として示される配列を有し；そして
ＣＤＲ２は、配列番号１０として示される配列を有し；そして
ＣＤＲ３は、配列番号１１として示される配列を有する）
で示されるアミノ酸配列を含む、単離された単一ドメイン抗体に関する（「Ａ０８誘導体」）。

別の言葉では、本発明は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）からなる式（Ｉ）：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
（式中、
ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号５及び配列番号９からなる群より選択される配列を有し；そして
ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０からなる群より選択される配列を有し；そして
ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号７及び配列番号１１からなる群より選択される配列を有する）
で示されるアミノ酸配列を含む、単離された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。

いくつかの実施態様では、ＦＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、ＦＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、ＦＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、ＦＲ４は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する（「Ｂ１１誘導体」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を含む。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号４として示される配列を含む（「Ｂ１１」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号４として示される配列を有する。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する（「Ｆ０６誘導体」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を含む。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号８として示される配列を含む（「Ｆ０６」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号８として示される配列を有する。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し（「Ａ０８誘導体」）、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を含む（「Ｆ０６誘導体」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号１２として示される配列を含む（「Ａ０８」）。

いくつかの実施態様では、本発明に記載の単離された単一ドメイン抗体は、配列番号１２として示される配列を有する。

いくつかの実施態様では、単離された単一ドメイン抗体は、「ヒト化」単一ドメイン抗体である。

本明細書において使用する「ヒト化」という用語は、天然のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、「ヒト化」されている、すなわち、天然に存在するＶＨＨ配列（及び特にフレームワーク配列内）のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の慣用的な鎖の抗体に由来するＶＨドメイン内の対応する位置（群）に存在する１つ以上のアミノ酸残基によって置換することによって、「ヒト化」されている、本発明の単一ドメイン抗体を指す。単一ドメイン抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。典型的には、ヒト化置換は、結果として得られたヒト化単一ドメイン抗体が依然として、本発明の単一ドメイン抗体の好ましい特性を保持しているように選択されるべきである。当業者は、適切なヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを決定及び選択することができる。

本発明のさらなる態様は、本発明の単一ドメイン抗体とＰＮ－１への結合に関して交差競合する、交差競合する単一ドメイン抗体を指す。

いくつかの実施態様では、本発明の交差競合する単一ドメイン抗体は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）からなる、式（Ｉ）：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
（式中、
ＣＤＲ１は、以下の配列：Ｘ_１－Ｔ－Ｗ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｅ－Ｉ（ここでのＸ_１はＳ又はＤであり、Ｘ_４はＦ又はＲであり、Ｘ_５はＲ又はＬである）を有し；そして
ＣＤＲ２は、以下の配列：Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｗ－Ｈ－Ａ（ここでのＸ２はＤ又はＥであり、Ｘ３はＰ又はＤであり、Ｘ４はＴ又はＧである）を有し；そして
ＣＤＲ３は、配列番号３又は配列番号７として示される配列を有する）
で示されるアミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体と、ＰＮ－１への結合に関して交差競合する。

いくつかの実施態様では、本発明の交差競合する単一ドメイン抗体は、配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体と、ＰＮ－１への結合に関して交差競合する。

いくつかの実施態様では、本発明の交差競合する単一ドメイン抗体は、配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体と、ＰＮ－１への結合に関して交差競合する。

いくつかの実施態様では、本発明の交差競合する単一ドメイン抗体は、配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体と、ＰＮ－１への結合に関して交差競合する。

いくつかの実施態様では、本発明の交差競合する単一ドメイン抗体は、配列番号４、配列番号８及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸を含む単一ドメイン抗体と、ＰＮ－１への結合に関して交差競合する。

本明細書において使用する「交差競合する」という用語は、抗原の特定の領域に結合する能力を共有する、単一ドメイン抗体を指す。本開示において、「交差競合する」単一ドメイン抗体は、標準的な競合結合アッセイにおいて、抗原に対する別の単一ドメイン抗体の結合に干渉する能力を有する。このような単一ドメイン抗体は、限定するわけではない理論によると、それが競合する単一ドメイン抗体と同じ又は関連した又は近くの（例えば構造的に類似した又は空間的に近位の）エピトープに結合し得る。単一ドメイン抗体Ａが、単一ドメイン抗体Ｂの結合を、前記の単一ドメイン抗体の１つを欠失した陽性対照と比較して、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、より特定すると少なくとも８０％減少させる場合、及びその逆である場合に、交差競合が存在する。当業者は、競合は、様々なアッセイ設定で評価され得ることを理解している。１つの適したアッセイは、ビアコア技術の使用（例えば、ビアコア３０００機器（ビオコア、ウプサラ、スウェーデン）を使用することによる）を含み、これは表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の範囲を測定することができる。交差競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づいたアプローチを使用する。さらに、それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、国際特許出願の国際公開公報第２００３/４８７３１号に記載されている。

本発明によると、上記のような交差競合する抗体は、配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、単一抗体の活性を保持する。

本発明によると、上記のような交差競合する抗体は、配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、単一抗体の活性を保持する。

本発明によると、上記のような交差競合する抗体は、配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、単一抗体の活性を保持する。

本発明によると、上記のような交差競合する抗体は、配列番号４、配列番号８及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸を含む、単一抗体の活性を保持する。

本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを指す。

典型的には、本発明のポリペプチドは、そのＮ末端において、そのＣ末端において、又はそのＮ末端及びそのＣ末端の両方において、少なくとも１つのさらに他のアミノ酸配列に融合して、すなわち、融合タンパク質を与えるような、本発明の単一ドメイン抗体を含む。本発明によると、たった１つの単一ドメイン抗体を含むポリペプチドは本明細書において、「一価」ポリペプチドと称される。２つ以上の本発明に記載の単一ドメイン抗体を含むか又は実質的にからなるポリペプチドは本明細書において、「多価」ポリペプチドと称される。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、本発明の少なくとも１つの単一ドメイン抗体及び少なくとも１つの他の結合単位（すなわち、別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質、又はポリペプチドに対して指向される）（これも典型的には単一ドメイン抗体である）を含む。このようなポリペプチドは本明細書において、同一の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド（「単一特異的」ポリペプチド）に対して、「多重特異的」ポリペプチドと称される。したがって、いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドはまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基、又はエピトープに対して指向される、少なくとも１つのさらに他の結合部位を提供し得る。該結合部位は、本発明の単一ドメイン抗体が指向するのと同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基、若しくはエピトープに対して指向されるか、又は、本発明の単一ドメイン抗体とは異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基、若しくはエピトープに対して指向されていてもよい。

本発明の「二重特異的」ポリペプチドは、第一の抗原（すなわちプロテアーゼネキシン－１、ＰＮ－１）に対して指向される少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、第二の抗原（すなわち、ＰＮ－１とは異なる）に対して指向される少なくとも１つのさらに他のの結合部位とを含む、ポリペプチドであり、一方、本発明の「三重特異的」ポリペプチドは、第一の抗原（すなわちＰＮ－１）に対して指向される少なくとも１つの単一ドメイン抗体、第二の抗原（すなわちＰＮ－１とは異なる）に対して指向される少なくとも１つのさらに他の結合部位、及び第三の抗原（すなわち、両方の抗原、すなわち第一の抗原及び第二の抗原とは異なる）に対して指向される少なくとも１つのさらに他の結合部位を含む、ポリペプチドである。

いくつかの実施態様では、さらに他の結合部位は、血清タンパク質に対して指向され、よって、単一ドメイン抗体の半減期は延長される。典型的には、該血清タンパク質は、アルブミンである。

典型的には、１つ以上のさらに他の結合部位は、慣用的な鎖の抗体（特にヒト抗体）の、及び／又は重鎖抗体の、１つ以上の部分、断片、若しくはドメインを含み得る。例えば、本発明の単一ドメイン抗体は、場合によりリンカー配列を介して、慣用的な（典型的にはヒトの）ＶＨ又はＶＬに連結されていてもよい。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、免疫グロブリンドメインに連結されている、本発明の単一ドメイン抗体を含む。例えば、該ポリペプチドは、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃ）に連結されている、本発明の単一ドメイン抗体を含む。該Ｆｃ部分は、本発明の単一ドメイン抗体の半減期を、及びその生成さえも増加させるのに有用であり得る。例えば、Ｆｃ部分は、血清タンパク質に結合することができ、よって、単一ドメイン抗体の半減期は延長される。いくつかの実施態様では、少なくとも１つの単一ドメイン抗体はまた、１つ以上の（典型的にはヒトの）ＣＨ１ドメイン、及び／又はＣＨ２ドメイン、及び／又はＣＨ３ドメインに、場合によりリンカー配列を介して連結されていてもよい。例えば、適切なＣＨ１ドメインに連結された単一ドメイン抗体は、例えば、適切な軽鎖と一緒に使用されることにより、慣用的なＦａｂ断片又はＦ（ａｂ'）２断片に対する抗体断片／構造の類似体を生じることができる（しかし、ここで、慣用的なＶＨドメインの一方又は（Ｆ（ａｂ'）２断片の場合）一方若しくは両方が、本発明の単一ドメイン抗体によって置換されている）。いくつかの実施態様では、本発明の１つ以上の単一ドメイン抗体は、１つ以上の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として使用され得る／Ｆｃ部分を形成するために使用され得る、２つ又は３つの定常ドメイン）に、Ｆｃ部分に、並びに／あるいは本発明のポリペプチドに１つ以上のエフェクター機能を付与する及び／又は１つ以上のＦｃ受容体に対する結合能を付与し得る、１つ以上の抗体部分、断片、若しくはドメインに連結されていてもよい。例えば、この目的のために、それに限定されるわけではないが、１つ以上のさらに他のアミノ酸配列は、例えば重鎖抗体及びより典型的には慣用的なヒトの鎖の抗体に由来する、抗体の１つ以上のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく；並びに／あるいは、例えばＩｇＧに由来するか（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する）、ＩｇＥに由来するか、又は別のヒトＩｇ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＭに由来するＦｃ領域を形成していてもよい。例えば、国際公開公報第９４/０４６７８号は、ラクダ科のＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体を含む重鎖抗体（すなわち単一ドメイン抗体）を記載し、ここでは、ラクダ科のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、ヒトのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインによって置換されることにより、２本の重鎖からなる免疫グロブリンが得られ、各々が単一ドメイン抗体とヒトのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン（しかしＣＨ１ドメインは全く含まない）とを含み、該免疫グロブリンは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクター機能を有し、該免疫グロブリンは、全く軽鎖が存在することなく機能することができる。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、国際公開公報第２００６０６４１３６号に記載の通りである。特に、該ポリペプチドは、ｉ）第一の融合タンパク質（ここでは、抗体のＣＬ定常ドメインが、そのＮ末端によって、本発明に記載の単一ドメイン抗体（すなわち、ＰＮ－１に対して指向される単一抗体）のＣ末端に融合している）、及びｉｉ）第二の融合タンパク質（ここでは、抗体のＣＨ１定常ドメインが、そのＮ末端によって、ＰＮ－１とは異なる抗原に対して指向される単一ドメイン抗体のＣ末端に融合している）からなり得る。別の特定の実施態様では、該ポリペプチドは、第一の融合タンパク質（ここでは抗体のＣＨ１定常ドメインは、そのＮ末端によって、エフェクター細胞上の活性化トリガー分子（例えばＣＤ１６）に対して指向される単一ドメイン抗体のＣ末端に融合している）及び第二の融合タンパク質（ここでは抗体のＣＬ定常ドメインは、そのＮ末端によって、本発明の単一ドメイン抗体（すなわちＰＮ－１）のＣ末端に融合している）からなる。

いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、
－以下の配列：Ｘ_１－Ｔ－Ｗ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｅ－Ｉ（ここでのＸ_１はＳ又はＤであり、Ｘ_４はＦ又はＲであり、Ｘ_５はＲ又はＬである）を有するＣＤＲ１；及び
－以下の配列：Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｗ－Ｈ－Ａ（ここでのＸ２はＤ又はＥであり、Ｘ３はＰ又はＤであり、Ｘ４はＴ又はＧである）を有するＣＤＲ２；及び
－配列番号３又は配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３
を含む、少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、一価パラトープ性ポリペプチドである。本明細書において使用する「一価パラトープ性」ポリペプチドという用語は、本明細書において定義されているような第二の単一ドメイン抗体に連結された、本発明の単一ドメイン抗体を含む、ポリペプチドを意味し、ここでのこれらの２つの単一ドメイン抗体は、１つの抗原の同じエピトープに対して指向されている。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性抗体は、配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１、配列番号２及び配列番号３として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号４として示される配列を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１７として示される配列を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性抗体は、配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号５、配列番号６及び配列番号７として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号８として示される配列を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の一価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１２として示される配列を有する、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、二価パラトープ性ポリペプチドである。本明細書において使用する「二価パラトープ性」ポリペプチドという用語は、本明細書において定義されているような単一ドメイン抗体と第二の単一ドメイン抗体とを含むポリペプチドを意味し、ここではこれらの２つの単一ドメイン抗体は、１つの抗原（例えばＰＮ－１）の２つの異なるエピトープに結合することができ、該エピトープは通常、１つの単一特異的な免疫グロブリン、例えば慣用的な抗体又は１つの単一ドメイン抗体と同時に結合しない。本発明に記載の二価パラトープ性ポリペプチドは、異なるエピトープ特異性を有する単一ドメイン抗体から構成され、同じエピトープに結合する互いに相補的な可変ドメイン対は含有していない。それ故、それらはＰＮ－１への結合に関して互いに競合しない。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、上記に定義されているようなＢ１１誘導体及び上記に定義されているようなＦ０６誘導体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性抗体は、ｉ）配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体、並びにｉｉ）配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第一の単一ドメイン抗体；及びｉｉ）配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１、配列番号２及び配列番号３として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体；並びにｉｉ）配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号５、配列番号６及び配列番号７として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列を有する第一の単一ドメイン抗体、及びｉｉ）配列番号８として示される配列を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、二価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１８として示される配列を有する。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、上記に定義されているようなＢ１１誘導体及び上記に定義されているようなＡ０８誘導体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性抗体は、ｉ）配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体、並びにｉｉ）配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第一の単一ドメイン抗体；及びｉｉ）配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１、配列番号２及び配列番号３として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体；並びにｉｉ）配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号４として示される配列を有する第一の単一ドメイン抗体、及びｉｉ）配列番号１２として示される配列を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、二価パラトープ性ポリペプチドは、配列番号１９として示される配列を有する。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、上記に定義されているようなＦ０６誘導体及び上記に定義されているようなＡ０８誘導体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性抗体は、ｉ）配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体、並びにｉｉ）配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第一の単一ドメイン抗体；及びｉｉ）配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号５、配列番号６及び配列番号７として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第一の単一ドメイン抗体；並びにｉｉ）配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１として示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチドは、ｉ）配列番号８として示される配列を有する第一の単一ドメイン抗体、及びｉｉ）配列番号１２として示される配列を有する第二の単一ドメイン抗体を含む。

いくつかの実施態様では、本発明の二価パラトープ性ポリペプチド又は一価パラトープ性ポリペプチドの２つの単一ドメイン抗体は、互いに直接連結されていても（すなわちリンカーを使用することなく）又はリンカーを介して連結されていてもよい。該リンカーは典型的にはリンカーペプチドであり、本発明によると、２つの単一ドメイン抗体の、ＰＮ－１のそれらの少なくとも２つの異なるエピトープの各々への結合を可能とするように選択されるだろう。適切なリンカーはとりわけエピトープに依存し、特に、単一ドメイン抗体が結合するＰＮ－１上のエピトープ間の距離に依存し、場合によりいくつかの限定された程度の通例の実験の後に、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかとなるであろう。また、ＰＮ－１に結合する２つの単一ドメイン抗体も、第三の単一ドメイン抗体を介して互いに連結されていてもよい（ここでは２つの単一ドメイン抗体は、第三のドメイン抗体に直接的に連結されていても、又は適切なリンカーを介して連結されていてもよい）。このような第三の単一ドメイン抗体は、例えば、延長された半減期をもたらす単一ドメイン抗体であり得る。例えば、後者の単一ドメイン抗体は、本明細書にさらに記載されているような、（ヒト）血清アルブミン又は（ヒト）トランスフェリンなどの（ヒト）血清タンパク質に結合することのできる、単一ドメイン抗体であり得る。いくつかの実施態様では、ＰＮ－１に結合する２つ以上の単一ドメイン抗体は、連続して（直接的に又は適切なリンカーを介して）連結され、第三の（１つの）単一ドメイン抗体（これは上記されているように、延長された半減期をもたらし得る）は、直接的に又はリンカーを介して、これらの２つ以上の前記の単一ドメイン抗体の１つに接続されている。適切なリンカーは、本発明の特定のポリペプチドに関連して本明細書に記載され、例えばであって限定するものではないが、アミノ酸配列を含み得、このアミノ酸配列は、好ましくは９以上のアミノ酸長、より好ましくは少なくとも１７アミノ酸長、例えば約２０～４０アミノ酸長を有する。しかしながら、上限は重要ではないが、例えば、このようなポリペプチドのバイオ医薬品の生産に関する簡便性の理由から選択される。リンカー配列は、天然配列であっても、非天然配列であってもよい。治療目的で使用される場合、該リンカーは好ましくは、本発明の抗ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）ポリペプチドが投与される被験者において非免疫原性である。リンカー配列の１つの有用な群は、国際公開公報第９６/３４１０３号及び国際公開公報第９４/０４６７８号に記載のような重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列、例えばＡｌａ－Ａｌａ－Ａｌａである。リンカー配列のさらに好ましい例は、様々な長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えば、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）、ｇｌｙ３、及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３である。

いくつかの実施態様では、本発明の治療法に使用される本発明のポリペプチドは、その治療有効性を向上させるために改変されていてもよいと考えられる。治療用化合物のこのような改変を使用して、毒性を低下させ得るか、循環時間を延長させ得るか、又は体内分布を改変させ得る。例えば、重要である可能性のある治療用化合物の毒性は、体内分布を改変させる多種多様な薬物担体ビヒクルとの組合せによってかなり減少させることができる。

いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、免疫グロブリンドメインに連結されている、本発明の単一ドメイン抗体を含む。例えば、前記ポリペプチドは、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃ）に連結されている、本発明の単一ドメイン抗体を含む。該Ｆｃ部分は、本発明の単一ドメイン抗体の半減期及びその産生さえも増加させるのに有用であり得る。例えば、Ｆｃ部分は血清タンパク質に結合することができ、よって、単一ドメイン抗体の半減期を延長させる。

薬物の寿命を改善させるための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。様々な水溶性ポリマーが、体内分布を改変させ、細胞内への取り込み形態を改善させ、生理学的障壁を通した透過性を変化させ；体内からの消失速度を改変させることが示されている。標的化効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上の吊り下がった基として、薬物部分を含有している、水溶性ポリマーが合成されている。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高い生体適合度及び改変のし易さから、薬物担体として幅広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームへ付着させることが、滞留時間を改善し、毒性を低減させることが示された。ＰＥＧを、鎖の末端のヒドロキシル基を通して、及び他の化学的方法を介して活性物質に結合させることができるが、しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子あたり最大で２つの活性物質に制限されている。異なるアプローチでは、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合特性は保持するが、１分子あたり多くの付着点を有するという利点が加わり（より多くの薬物がローディングされる）、様々な適用に適合するように合成的に設計され得る、新規生体材料として探索された。当業者は、薬物の効果的な修飾のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧと三官能性モノマー（例えばリジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed社（プレインズボロ、ＮＪ州）によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を通してリジンのａ－及びｅ－アミノ基に連結されている。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されかつ予め決定された間隔で反応性の吊り下がった基（リジンのカルボン酸基）を与えつつ、ＰＥＧの所望の特性を保持する。反応性の吊り下がった基は、他の分子を用いての誘導体化、架橋、又はコンジュゲーションに使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーの間の切断可能な結合を変化させることによって、安定で長時間循環するプロドラッグを生成するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基の複合体の間隔、及びコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量に影響を及ぼす（より小さなＰＥＧセグメントには、より大きな薬物がローディングされる）。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させると、コンジュゲートの循環半減期は延長されるだろう。それにも関わらず、コンジュゲートは、容易に分解可能でなければならないか、又は糸球体ろ過限界閾値未満の分子量（例えば４５ｋＤａ未満）を有さなければならない。さらに、循環半減期及び体内分布の維持に重要であるポリマー骨格に、リンカーを使用することにより、特定のトリガー、典型的には標的組織内の酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまでプロドラッグ形で治療剤を維持し得る。例えば、このタイプの組織活性化薬物送達は、体内分布の特定の部位への送達が必要とされ、治療剤が病態部位に又は病態部位の近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用される連結基ライブラリーは当業者には公知であり、かつ酵素動態学、活性化酵素の遍在、及び選択された疾患特異的酵素の開裂特異性に基づき得る（例えばVectraMed社、プレインズボロ、ＮＪ州によって確立された技術を参照）。このようなリンカーは、治療剤送達のために本明細書に記載された本発明のポリペプチドを改変するのに使用され得る。

本発明によると、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、慣用的な自動ペプチド合成法によって、又は組換え発現によって産生され得る。タンパク質を設計及び作製するための一般的な原理は、当業者には周知である。

本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、慣用的な技術に従って、溶液中又は固相支持体上で合成され得る。様々な自動合成器が市販され、Stewart and Young; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986 and Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979に記載のような公知のプロトコールに従って使用され得る。本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドはまた、アプライド・バイオシステムズ社製のモデル４３３Ａなどの例示的なペプチド合成器を使用した固相技術によって合成されてもよい。自動ペプチド合成を通して又は組換え法を通して作製された、任意の所与のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的真正は、当業者には周知である任意の方法によって確立され得る。

核酸、ベクター、組換え宿主細胞、及びその使用
自動ペプチド合成の代替法として、組換えＤＮＡ技術を使用し得、ここでは、選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされ、そして本明細書に下記されているような発現に適した条件下で培養される。組換え法は、より長いポリペプチドを産生するのに特に好ましい。

多種多様な発現ベクター／宿主系を使用して、ペプチド又はタンパク質をコードしている配列を含有及び発現させ得る。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（Giga-Hama et al., 1999）；ウイルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス、Ghosh et al., 2002参照）；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされた又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド；例えば、Babe et al., 2000参照）を用いて形質転換された植物細胞系；あるいは、動物細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、タンパク質の哺乳動物における発現を最適化するための様々な技術を知っている。例えば、Kaufman, 2000; Colosimo et al., 200参照。組換えタンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ－７）、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞及び２９３細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細菌、酵母、及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールは、当業者には公知であり、本明細書において以下に簡潔に記載されている。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系も当業者には周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングするための、又はタンパク質の活性を与える際に有用であろう特定の翻訳後修飾を生じるための、特定の能力のために選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、フォールディング、及び／又は機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、ＷＩ３８細胞などは、このような翻訳後活性のための特定の細胞機械及び特徴的な機序を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択され得る。

本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドの組換え産生において、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドをコードするためのポリヌクレオチド分子を含んでいるベクターを使用することが必要であろう。このようなベクターを調製する方法並びにこのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を産生する方法は、当業者には周知である。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明に記載の単一ドメイン抗体及び／又はポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。

典型的には、前記核酸は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり、これは、任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターに含まれていてもよい。本明細書において使用する「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、ビヒクルを意味し、これによって、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる。「発現ベクター」、「発現構築物」又は「発現カセット」という用語は、本明細書全体を通して同義語として使用され、核酸コード配列の一部又は全部が転写されることのできる、遺伝子産物をコードしている核酸を含有している任意の種類の遺伝子構築物を含むことを意味する。

よって、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、被験者に投与されると、該抗体の発現を引き起こすか又は指令する、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、終結因子などを含み得る。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。ヒト抗体定常領域をコードしている遺伝子を挿入及び発現させることができる限り、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１βｄ２－４－（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。プラスミドの他の例としては、複製起点を含んでいる複製プラスミド、又は組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知である技術によって、例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによって産生されてもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５/１４７８５号、国際公開公報第９６/２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４/１９４７８号に見られ得る。

本発明のペプチド又はポリペプチドの発現に適した発現ベクターの選択は、勿論、使用される予定の具体的な宿主細胞に依存し、これは当業者の技能範囲内である。

発現には、宿主細胞における関心対象の核酸の発現を駆動するのに使用され得る、ウイルス及び哺乳動物の両方の入手源に由来する、エンハンサー／プロモーターなどの適切なシグナルがベクターに提供されることが必要である。通常、発現される核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機械又は導入された合成機械によって認識される、ＤＮＡ配列を指す。ヌクレオチド配列は、調節配列が、関心対象のタンパク質（例えば単一ドメイン抗体）をコードしているＤＮＡに機能的に関連している場合に、作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を指令する場合に、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。

本発明のさらなる態様は、本発明に記載の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクトされたか、感染したか、又は形質転換された、宿主細胞に関する。

「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち外因性又は細胞外）の遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、これによって、宿主細胞は、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するだろう。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容し発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。

本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の抗体を産生し得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって保有され宿主細胞に導入された、外来ＤＮＡによってコードされているタンパク質の発現のための、適切な条件下における宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞、及びバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス、又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）並びに初代又は樹立された哺乳動物細胞培養液（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２/０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素（本明細書では以後、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２/３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書では以後、「ＹＢ２/０細胞」と称される）などが挙げられる。本発明はまた、本発明に記載の抗体を発現している組換え宿主細胞を産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボにおいて、上記のような組換え核酸又はベクターを、コンピテントな宿主細胞に導入する工程、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボにおいて、得られた組換え宿主細胞を培養する工程、並びに（ｉｉｉ）場合により、該抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。このような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の産生のために使用され得る。

本発明の抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーなどの、慣用的な免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。

治療法及び使用
本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、プロテアーゼネキシン－１(ＰＮ－１)の阻害剤として使用される。

したがって、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、それを必要とする被験者における出血性疾患の予防又は治療に特に適している。

本発明はまた、本発明の単一ドメイン抗体及び／又はポリペプチドの有効量を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における出血性疾患を予防又は治療するための方法に関する。

本明細書において使用する「被験者」という用語は、哺乳動物を示す。本発明の好ましい実施態様では、本発明に記載の被験者は、出血性疾患に罹患しているか又は罹患し易い任意の被験者（好ましくはヒト）を指す。別の好ましい実施態様では、本発明に記載の被験者は、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び／又は第ＸＩ因子の欠乏を伴う出血性疾患に罹患しているか又は罹患し易い任意の被験者（好ましくはヒト）を指す。

本明細書において使用する「出血性疾患」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、世界保健機関の分類Ｄ６５－Ｄ６９において改訂されているような出血性疾患を指す。「出血性疾患」という用語はまた、恒常的な出血性疾患、稀な出血障害、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び／又は第ＸＩ因子の欠乏を伴う出血性疾患も指す。「出血性疾患」という用語はまた、血友病、遺伝性の第ＶＩＩＩ因子欠乏症（不特定の血友病、血友病Ａ、古典的血友病）；遺伝性の第ＩＸ因子欠乏症（クリスマス病、機能的異常を伴う第ＩＸ因子の欠乏症、血漿トロンボプラスチン成分［ＰＴＣ］の欠乏症、血友病Ｂ）；凝固異常、例えばフォンヴィルブランド病、血管性血友病、血管異常を伴う第ＶＩＩＩ因子欠乏症、脈管性血友病；遺伝性の第ＸＩ因子欠乏症（血友病Ｃ、血漿トロンボプラスチン前駆体［ＰＴＡ］欠乏症）；遺伝性の他の凝固因子の欠乏症（先天性の無フィブリノーゲン症、促進性グロブリンの欠乏症、プロアクセレリン、第Ｉ因子［フィブリノーゲン］、第ＩＩ因子［プロトロンビン］、第Ｖ因子［不安定］、第ＶＩＩ因子［安定］、第Ｘ因子［シュチュワート・プロワー因子］、第ＸＩＩ因子［ハーゲマン因子］、及び第ＸＩＩＩ因子［フィブリン安定化因子］の欠乏症、異常フィブリノーゲン血症（先天性）、低プロコンバーチン血症、オーレン病）；循環中の抗凝固剤に起因する出血性障害（抗凝固剤の長期使用中の出血、高ヘパリン血症（hyperheparinaemia）、アンチトロンビン、抗ＶＩＩＩａ因子抗体、抗ＩＸａ因子抗体、抗Ｘａ抗体、及び抗ＸＩａ因子抗体の増加、コードヒント（Coding-Hint））；後天性凝固因子欠乏症（肝疾患及びビタミンＫ欠乏症に起因する凝固因子欠乏症）；原発性栓友病（活性化プロテインＣ抵抗性［第Ｖ因子ライデン変異］、アンチトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳの欠乏症、プロトロンビン遺伝子の突然変異）；他の栓友病（抗カルジオリピン症候群、抗リン脂質症候群、ループス抗凝固因子の存在）；紫斑病、アレルギー性紫斑病、定性的な血小板異常、血小板減少症、毛細血管脆弱性（遺伝性）及び脈管性偽血友病などの出血性疾患も指す。「出血性疾患」という用語はまた、血友病及び他の稀な出血性障害のような出血性疾患における出血エピソードも指す。

いくつかの実施態様では、出血性疾患は、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び／又は第ＸＩ因子の欠乏を伴う出血性疾患である。

いくつかの実施態様では、出血性疾患は血友病である。

いくつかの実施態様では、出血性疾患は、血友病Ａ又は血友病Ｂである。

いくつかの実施態様では、出血性疾患は、軽症又は中等症の血友病Ａである。

いくつかの実施態様では、出血性疾患は、軽症又は中等症の血友病Ｂである。

「軽症の血友病Ａ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中５～４０％の第ＶＩＩＩ因子によって定義される出血性疾患を指す。

「中等症の血友病Ａ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中１～５％の第ＶＩＩＩ因子によって定義される出血性疾患を指す。

「重症の血友病Ａ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中１％未満の第ＶＩＩＩ因子によって定義される出血性疾患を指す。

「軽症の血友病Ｂ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中５～４０％の第ＩＸ因子によって定義される出血性疾患を指す。

「中等症の血友病Ｂ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中１～５％の第ＩＸ因子によって定義される出血性疾患を指す。

「重症の血友病Ｂ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血漿中１％未満の第ＩＸ因子によって定義される出血性疾患を指す。

したがって、本発明はまた、凝固因子に対する耐性の発生の予防に使用するための、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドにも関する。

いくつかの実施態様では、本発明の単一ドメイン抗体又はポリペプチドは、出血性疾患の古典的処置と組み合わせて使用される。

したがって、本発明は、ｉ）有効量の本発明の単一ドメイン抗体及び／又はポリペプチド、並びにｉｉ）出血性疾患の古典的処置、を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における出血性疾患を予防又は治療するための方法を指す。

本明細書において使用する「出血性疾患の古典的処置」という用語は、出血性疾患の処置のために使用される、天然又は合成の任意の化合物を指す。

本発明によると、出血性疾患の処置に使用される化合物は、凝固因子；デスモプレシン、抗線維素溶解薬、例えばトラネキサム酸及びイプシロン・アミノカプロン酸；フィブリンシーラント；エミシズマブなどの凝固因子の機能を模倣した抗体からなる群より選択され得る。

本明細書において使用する「凝固因子の機能を模倣する抗体」という用語は、血友病において欠失している、凝固因子の活性を示す、抗体を指す。第ＶＩＩＩ因子の機能を模倣した抗体、例えばエミシズマブは、活性化型凝固因子の第ＩＸ因子及び第Ｘ因子の両方に結合することができ、第Ｘ因子の活性化を媒介する。

いくつかの実施態様では、本発明の単一ドメイン抗体又はポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子を模倣する抗体と組み合わせて使用される。

いくつかの実施態様では、本発明の単一ドメイン抗体又はポリペプチドは、エミシズマブと組み合わせて使用される。

したがって、さらなる態様では、本発明は、それを必要とする被験者における出血性疾患の予防又は治療に使用するための、エミシズマブと組み合わせた、本発明に記載の単一ドメイン抗体及びポリペプチドに関する。

本明細書において使用する「凝固因子」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、血漿由来の活性化プロトロンビン複合体及びフィブリノーゲンを指す。「凝固因子」という用語はまた、組換え型又は精製された凝固因子にも関する。

いくつかの実施態様では、本発明の単一ドメイン抗体又はポリペプチドは、１つ以上の凝固因子と組み合わせて使用される。

したがって、さらなる態様では、本発明は、それを必要とする被験者における出血性疾患の予防又は治療に使用するための、１つ以上の凝固因子と組み合わせた、本発明に記載の単一ドメイン抗体及びポリペプチドに関する。

典型的には、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチド並びに上記のような出血性疾患の古典的処置は、治療有効量で被験者に投与される。

上記のような本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドの「治療有効量」によって、阻害剤の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の阻害剤及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されるだろうことが理解されるだろう。任意の特定の被験者における具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害、及び障害の重症度；使用される具体的な阻害剤の活性；使用される具体的な組成物、被験者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；投与時刻、投与経路、及び使用される具体的な阻害剤の排泄速度；処置期間；使用される具体的な阻害剤と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知である同様な要因を含む、様々な要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドの用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加することは当業者の十分に技能範囲内である。しかしながら、製品の１日用量は、１日あたり成人１人あたり０．０１～１，０００mgの幅広い範囲で変更されてもよい。典型的には、該組成物は、処置される予定の被験者への用量の症候による調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの本発明の阻害剤を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mgから約５００mgの本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチド、好ましくは１mgから約１００mgの本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドを含有している。薬物の有効量は通常、１日あたり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の用量レベルで供給される。

特定の実施態様では、本発明に記載の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、０．０１μMから２０μMの濃度で使用され得、特に、本発明の阻害剤は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２０．０μMの濃度で使用され得る。

本発明の凝固因子の治療有効量は、当技術分野において周知である。典型的には、治療有効量の凝固因子は、約１０IUから３００IU/kg（体重）、特に約１０IUから１００IU/kg（体重）の凝固因子に関する。特に、治療有効量の凝固因子は、１０．０、１５．０．２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０IU/kg（体重）の凝固因子の量に関する。

特定の実施態様では、本発明に記載の凝固因子は、凝固因子に対する耐性の発生を回避するために低用量で使用されてもよい。典型的には、「低用量」という用語は、約５IUから４０IU/kg（体重）の凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子）を指す。特に、「低用量」という用語は、約５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０IU/kg（体重）の凝固因子の量を指す。

本発明によると、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、１つ以上の凝固因子と共に、順次又は同時に投与される。

本発明の医薬組成物及びキット
典型的には、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、医薬組成物を形成し得る。したがって、本発明の単一ドメイン抗体及びポリペプチドは、医薬組成物の形態で被験者に投与される。

「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。

好ましくは、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。

注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。

本発明の阻害剤を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。

本発明の阻害剤は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。

担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。

無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。

水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の阻害剤の他に、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、出血性疾患の予防又は治療に使用される、任意のさらに他の薬剤を含み得る。

１つの実施態様では、前記の追加の活性薬剤は、同じ組成物に含められても、別々に投与されてもよい。

別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、出血性疾患の予防及び治療に同時に、別々に、又は順次使用するための合剤に関する。

最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの単一ドメイン抗体又はポリペプチドを含んでいるキットも提供する。本発明のＰＮ－１に対する単一ドメイン抗体又はポリペプチドを含有しているキットは、治療法に用途を見出す。

本発明はさらに、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

合成ライブラリーから単離された単一ドメイン抗体の同定及び配列。３回のファージディスプレイ実験後に得られた陽性クローンを決定する吸着されていないファージのＥＬＩＳＡ。ファージを、ヒトＰＮ－１、マウスＰＮ－１、又はヒトＰＡＩ－１でコーティングされたプレートに加えた。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ＭＩ３抗体及び比色定量基質を使用して、結合を測定した。マウスＰＮ－１及びヒトＰＮ－１の存在下において、有意なＥＬＩＳＡシグナルを示し、かつヒトＰＡＩ－１の存在下において非常に低いシグナルを示したＶＨＨクローンを特異的と考えた。 合成ライブラリーから得られたＶＨＨの特徴。Ａ～Ｂ：ウェルを、抗ＰＡＩ－１モノクローナル抗体でコーティングし、２pg/mLのヒトＰＡＩ－１（Ａ）又はマウスＰＡＩ－１（Ｂ）をＶＨＨ（１０μg/mL）と共にインキュベートした。結合したＶＨＨを、ペルオキシダーゼで標識された抗６×ヒスチジンタグ精製抗体を用いてプローブした。Ｃ～Ｄ：ウェルを、０．５μgのヒトＰＮ－１（Ｃ）又はマウスＰＮ－１（Ｄ）でコーティングし、様々な濃度の一価ＶＨＨ（０．３～２０μg/mL）と共にインキュベートした。結合したＶＨＨを、ペルオキシダーゼで標識されたｃ－Ｍｙｃタグ精製抗体を用いてプローブした。Ｅ～Ｆ：１nMのトロンビンを、１０nMのヒトＰＮ－１（Ｅ）又はマウスＰＮ－１（Ｆ）と共に、ＶＨＨ（１０μM）の存在下又は非存在下においてインキュベートした。残留トロンビン活性は、ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質の加水分解速度によって測定された。データ（平均値±標準偏差；ｎ＝３～５）は、トロンビンのみの比率としての残留トロンビン活性を示す。Ｇ：ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ－ＰＡ；１．３nM）を、ヒトＰＡＩ－１（１０nM）と共に、ＶＨＨ（１０μM）の非存在下又は存在下においてインキュベートした。残留ｕＰａ活性は、ＰＮＡＰＥＰ－１３４４基質の加水分解速度によって測定された。データ（ｎ＝３～５）は、ｕ－ＰＡのみの比率としての残留ｕ－ＰＡ活性を示す。 一価ＶＨＨの５０％阻害濃度の決定、並びに最善の一価ＶＨＨを同定及び改善するための戦略。Ａ：ヒトＰＮ－１又はマウスＰＮ－１を、様々な濃度の一価ＶＨＨ（０～２μM）と共にインキュベートし、１nMのトロンビンを各ウェルに加えた。残留トロンビン触媒活性は、ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質の加水分解速度をアッセイすることによって測定された。データは、トロンビンのみの比率としての残留トロンビン活性を示す。各データ点は、個々の測定を示す。表は、マウスＰＮ－１及びヒトＰＮ－１について一価ＶＨＨから得られたＩＣ５０を総括する（平均値±標準偏差；ｎ＝３）。Ｂ：最善の一価のＶＨＨを選択するための戦略により、それらの特性を改善する二価ＶＨＨが選択される。 二価ＶＨＨの特徴。Ａ～Ｂ：ウェルを、０．５μgのヒト（Ａ）又はマウスのＰＮ－１（Ｂ）でコーティングし、様々な濃度の二価ＶＨＨ（０．３～２０μg/mL）と共にインキュベートした。結合したＶＨＨを、ペルオキシダーゼで標識された６×ヒスチジンタグ精製抗体を用いてプローブした。Ｃ：ヒトＰＮ－１又はマウスＰＮ－１（１０nM）を、様々な濃度の二価ＶＨＨ（０～２０００nM）と共にインキュベートし、１nMのトロンビンを各ウェルに加えた。残留トロンビン触媒活性は、ＰＮＡＰＥＰ－０２３８の加水分解速度を測定することによって測定された。残留トロンビン触媒活性は、ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質の加水分解速度をアッセイすることによって測定された。データは、トロンビンのみの比率としての残留トロンビン活性を示す。各データ点は、個々の測定を示す。表は、マウスＰＮ－１及びヒトＰＮ－１について二価ＶＨＨから得られたＩＣ５０を総括する（平均値±標準偏差；ｎ＝３）。Ｄ：反応中心ループを包含しているビオチニル化ペプチド（５０μg/mL）に対する、ＶＨＨの結合（１００μg/mL）の代表的なバイオレイヤー分析グラフ（オクテット）。固定したペプチドを、ＶＨＨに曝す前に、トロンビンの非存在下（ペプチド－反応中心ループ）又は存在下（ペプチド－反応中心ループ＋ＩＩａ）（５U/ml）において、３７℃で３０分間インキュベートした。対照曲線は、陰性対照に相当する。結果は、異なる分子の結合によって生じる波長のシフト（nm）として表現される。 二価ＶＨＨのエクスビボでの実験。Ａ：希釈されたマウス野生型血漿を、６２．５nMのマウスＰＮ－１と共にインキュベートし、２８８nMの二価ＶＨＨを添加し、プロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。Ｂ：希釈された第ＶＩＩＩ因子欠損マウス血漿を、５００nMのマウスＰＮ－１と共にインキュベートし、６２５nMの二価ＶＨＨを加え、改良された活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を行なった。Ｃ～Ｄ：０．１nMのトロンビンを、活性化されていない血小板（Ｃ）又はＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）で活性化された血小板（Ｄ）（５×１０^８個の細胞/mL）に由来する上清と共に、１μMの二価ＶＨＨの存在下又は非存在下においてインキュベートした。残留トロンビン触媒活性は、ＰＮＡＰＥＰ０２３８基質の加水分解速度によって測定された。データ（平均値±標準偏差；ｎ＝３～４）は、トロンビンのみの比率としての残留トロンビン活性を示す。

実施例１：
材料及び方法
本発明者らは、トロンビンＳ－２２３８用の発色基質（クリオペプ社、モンペリエ、フランス）を使用して、ヒト及びマウスのＰＮ－１の抗トロンビン触媒活性の阻害を決定した。Ｓ－２２３８は、ｐＮＡ（４－ニトロアニリン）に共有結合した、トロンビンに対して特異的な短いペプチドである。Ｓ－２２３８は、トロンビンによって切断されると、遊離ｐＮＡを放出し、これは、分光光度計によって４０５nmで検出され得る。ヒト又はマウスのＰＮ－１（２０nM）を、二価ハイブリッド体（１０又は１μMの、Ｂ１１－Ｂｖ、Ｂ１１－Ｆ０６、又はＢ１１－Ａ０８）と共に又はそれを伴わずに、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（２０mMのＨｅｐｅｓ、０．１５M ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ヒト血清アルブミン）中で３７℃で５分間インキュベートし、その後、トロンビン（１nM）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、その後、発色基質Ｓ－２２３８（２mM）を添加した。４０５nmにおける吸光度の変化を９０分間記録した。残留トロンビン活性は、トロンビンのみの活性に対する、二価ハイブリッド体と共に又はそれを伴わずにインキュベートされたＰＮ－１の存在下において測定された活性の比として表現される。

本発明者らは、発色基質ＰＮＡＰＥＰ－１３４４（クリオペプ社、モンペリエ、フランス）を使用して、ＰＡＩ－１によるｕＰＡの阻害に対する、二価ハイブリッド体の効果を測定することによって、ＰＮ－１に対するハイブリッド体の特異性を確認した。ヒトＰＡＩ（１０nM）を、二価ハイブリッド体（１０又は１μMの、Ｂ１１－Ｂｖ、Ｂ１１－Ｆ０６、又はＢ１１－Ａ０８）と共に又はそれを伴わずに、０．１％ヒト血清アルブミンを含有しているＰＢＳ緩衝液中で３７℃で５分間インキュベートし、その後、ｕＰＡ（１．３nM）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、その後、発色基質Ｓ－１３４４（０．４mM）を添加して反応を開始した。４０５nmにおける吸光度の変化を１２０分間記録した。残留ｕＰＡ活性は、ｕＰＡのみの活性に対する、二価ハイブリッド体と共に又はそれを伴わずにインキュベートされたＰＮ－１の存在下において測定された活性の比として表現される。

本発明者らは、トロンビンＳ－２２３８用の発色基質（クリオペプ社、モンペリエ、フランス）を使用して、ヒトＰＮ－１に対する二価ハイブリッド体のＩＣ５０を決定した。ヒト又はマウスのＰＮ－１（２０nM）を、漸増濃度の二価ハイブリッド体（１０又は１μMの、Ｂ１１－Ｂｖ、Ｂ１１－Ｆ０６、又はＢ１１－Ａ０８）と共にＨｅｐｅｓ緩衝液（２０mMのＨｅｐｅｓ、０．１５M ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ヒト血清アルブミン）中で３７℃で５分間インキュベートし、その後、トロンビン（１nM）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、その後、発色基質Ｓ－２２３８（２mM）を添加した。４０５nmにおける吸光度の変化を９０分間記録した。グラフにおける阻害％は、ＰＮ－１活性の％に等しい。

結果
ヒト及びマウスのＰＮ－１の抗トロンビン活性の阻害
ラマ由来ライブラリーを使用して、計７回のパンニング及び９４０個の試験されたＶＨＨにより、ＰＮ－１を認識する５２個の候補が得られた。３つのナノボディーズ（Ｂ１１、Ｆ０６、及びＡ０８）が、ヒト及びマウスのＰＮ－１の抗トロンビン活性を阻害することができることが判明した。より良好な親和性及び阻害活性を示す、二量体の組合せを試験した。実際に、ハイブリッド体のＢ１１－Ｂｖ、Ｂ１１－Ｆ０６及びＢ１１－Ａ０８は、ヒト及びマウスのＰＮ－１の抗トロンビン活性を阻害することができた（図２Ｅ～Ｆ）。

最初の特異的な抗ＰＮ－１抗体
ラマ由来ライブラリーを認識する候補の注意深い特徴付けにより、これらの全てのＶＨＨにより、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）も認識する５２個の候補がもたらされた。さらに、本発明者らが試験した全ての市販の抗ＰＮ－１抗体も非特異的であることが判明した。本明細書において、本発明者らは、単一ドメイン抗体のＢ１１、Ｆ０６及びＡ０８、並びにハイブリッド体の二価Ｂ１１－Ｂｖ；Ｂ１１－Ｆ０６、Ｂ１１－Ａ０８は、ヒト及びマウスの両方のＰＮ－１に、ＰＮ－１の系統学的に最も近いセルピン類縁体であるＰＡＩ－１との交差反応を伴うことなく、効率的に結合することを発見した（図２Ｅ～Ｇ）。

本発明者らは以前に、ＰＮ－１阻害剤、例えば抗ＰＮ－１抗体が、軽症及び中等症の血友病患者において、トロンビン生成を改善することを示した。本発明者らは、ＰＮ－１の遮断が、出血性疾患の処置に役割を果たすことを確立する。本明細書において、本発明者らは、他のセルピンと交差反応を伴うことなく、マウス及びヒトの両方のＰＮ－１の抗トロンビン活性を遮断することができる、最初の特異的な単一ドメイン抗体を記載した。これらの単一ドメイン抗体は、特に血友病患者における出血性疾患の処置における強力なツールであり得る。

実施例２：
材料及び方法
材料
イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、シグマ・アルドリッチ社（サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）製であった。ペルオキシダーゼで標識されたポリクローナルウサギ抗ｃ－Ｍｙｃタグ抗体、ポリクローナルウサギ抗６ｘヒスチジンタグ抗体は、アブカム社（パリ、フランス）製であった。ヒト及びマウスのＰＮ－１並びにヒトα－トロンビンは記載の通りに調製された^{２０、２１}。プロトロンビン時間及び活性化プロトロンビン時間の試薬は、スタゴ・ダイアグノスティカ社（アンエール・シュル・セーヌ、フランス）製であった。発色基質のＰＮＡＰＥＰ－１３４４及びＰＮＡＰＥＰ－０２３８は、クリオペプ社（モンペリエ、フランス）製であった。ダイナビーズＭ－４５０エポキシビーズ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞、テリフィックブロス（ＴＢ）培地、溶原性ブロス（ＬＢ）培地は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ヴィルボン・シュル・イヴェット、フランス）製であった。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＰＡＩ－１）は、スタゴＢＮＬ社（リール、フランス）製であった。ＡＥＢＳＦは、ｖＷＲ社（フォントネー・スー・ボワ、フランス）製であった。

ファージディスプレイによるリンパ球ライブラリーからの抗ＰＮ－１ＶＨＨの構築
１匹のラマ（ラマ・グラマ）の免疫化は、がん研究センター（エクス・マルセイユ大学、マルセイユ、フランス）に外注された^２２。簡潔に言えば、ラマを、等しい比率のフロイント不完全アジュバントと、ヒト又はマウスのＰＮ－１の混合物１００μgを用いて免疫化した。血液採取後、ｍＲＮＡをリンパ球から抽出し、ＶＨＨライブラリーを記載の通りに構築した^{２２～２４}。該ライブラリーは、ＶＨＨをコードするＤＮＡ断片を含有し、これをｐＨＥＮ６－ファージミドベクターにクローニングし、これをエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞２５（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）において形質転換することにより、０．９×１０^８個のクローンのライブラリーが作製された。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用して、ＴＧ１ ＶＨＨライブラリーに感染させて、ＶＨＨの表面における発現を可能とした。

ＶＨＨの陰性選択及び陽性選択
ＰＡＩ－１と交差反応するＶＨＨの数を減少させるために、ファージ粒子をまず、１００μgのＰＡＩ－１でコーティングされたビーズと共にインキュベートした（室温でＰＢＳ－３％ウシ血清アルブミン中で１時間）。結合していないファージを、マウスＰＮ－１及びヒトＰＮ－１（各々５０μg）の混合物でコーティングされたビーズ上に通過させた。捕捉されたファージを、０．５mg/mlのトリプシンで溶出した。連続して３回の濃縮が行なわれた。

抗ＰＮ１特異的ＶＨＨの選択
単離されたファージをＴＧ１細菌に感染させた後、細胞を、撹拌下でＴＢ培地中で４時間増殖させ、その後、１mMのＩＰＴＧを加えて、３０℃でＶＨＨの発現を誘導した。誘導から１８時間後、細胞を遠心分離にかけ、周辺質の抽出物を、ＴＥＳ緩衝液（２００mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、０．５mMのＥＤＴＡ、及び５００mMのショ糖）中で４℃で１時間溶解し、その後、ＰＢＳで４倍希釈されたＴＥＳ緩衝液中で３０分間溶解した後に収集した。放出された可溶性タンパク質を、ＰＮ－１、ＰＡＩ－１又はウシ血清アルブミンへの結合について試験した。ＰＢＳ中のタンパク質（１□g/ウェル）を、ヌンクマキシソーププレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）上に４℃で一晩かけてコーティングした。飽和（ＰＢＳ－ウシ血清アルブミン３％、３７℃で１時間）後、結合したＶＨＨを、アルカリホスファターゼに結合させたポリクローナル抗６ｘヒスチジンタグ抗体を使用してプローブし、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の加水分解を介して検出し、４５０nmにおける吸光度を解読した。

合成ライブラリーからの抗ＰＮ－１ＶＨＨの単離
第二のアプローチにおいて、合成ＶＨＨライブラリーを使用して、抗ＰＮ－１ ＶＨＨ（ハイブリジェニクス・サービスＳＡＳ社、パリ、フランス）を単離した。３×１０^９個のＶＨＨを含有している、このｈｓ２ｄＡｂ（ヒト化合成単一ドメイン抗体）ファージディスプレイライブラリーをまず、ヒトＰＡＩ－１でコーティングされたビーズと共にインキュベートして、非特異的な結合物質を減少させた。その後、結合していないＶＨＨを、マウス又はヒトのＰＮ－１でコーティングされたビーズと共にインキュベートした。計３回のファージディスプレイが行なわれ、除去工程は、各回の最中に繰り返された。３回の後、９０個のＥ．ｃｏｌｉクローンを無作為に拾い上げ、ヒト及びマウスのＰＮ－１並びにＰＡＩ－１への結合について分析した。ＰＡＩ－１よりもＰＮ－１に対しての方が５倍超で増加したシグナルを示したファージクローンを、ＰＮ－１（マウス、ヒト、又はその両方）に対する特異的な結合物質と判断した。陽性クローンのシークエンスにより、１８個の異なる陽性ＶＨＨの存在が判明した。これらの中の４つが、マウスＰＮ－１及びヒトＰＮ－１の両方を認識し、さらなる特徴付けのためにｐＨＥＮ２ベクターにサブクローニングした。

ＶＨＨのサブクローニング、発現、及び精製
抗ＰＮ－１ ＶＨＨを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＫ６細胞に直接形質転換した。各クローンをまず、１０mLのＬＢ培地/１００μg/mLのアンピシリン/２％グルコース/１mMのＭｇＣｌ_２中、穏やかな撹拌下で３７℃で一晩かけて増殖させた。このプレ培養液３mLを使用して、３３０mLのＴＢ培地/１００μg/mLのアンピシリン/０．１％グルコース/１mMのＭｇＣｌ_２に接種した。培養液を、ＯＤ６００が０．８～１に達するまで、撹拌した（１７０rpm、３７℃）。その後、ＶＨＨの発現は、１mMのＩＰＴＧによって誘導され、培地を一晩増殖させたままにした（１７０rpm、２８℃）。周辺質タンパク質を、１０秒間オン／１０秒間オフのサイクルを用いた３０分間の超音波処理（フィッシャーサイエンティフィック社、イルキルシュ、フランス）によって抽出した。溶解率は、（溶解後の吸光度／溶解前の吸光度）×１００によって確認された。ヒスチジンのタグの付いたＶＨＨを次に、指示されているように（ｖＷＲ社）、Ｃｏ２＋アフィニティクロマトグラフィーを介して精製した。少数派の混入物は、サイズ排除クロマトグラフィーを介して、平衡緩衝液として２０mMのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）/０．１ＭのＮａＣｌを使用して除去された。精製されたＶＨＨは、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ及びクーマシー染色を介して評価したところ、９５％を超える均一度を示した。二価ＶＨＨについては、２コピーの一価ｓｄＡｂが、［ＧＧＧｓ］３及びＣ末端６ｘヒスチジンタグからなるリンカーによって分離され、これにより、Ｃｏ２＋アフィニティクロマトグラフィーを介した精製が可能となった。

ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１のＥＬＩＳＡ
マイクロロンの中結合の半ウェルプレート（グライナーバイオワン社、コートアボフ、フランス）を、０．５μｇ/ウェルのマウスＰＮ－１又はヒトＰＮ－１で４℃で一晩かけてコーティングし、その後、ＰＢＳ／ウシ血清アルブミン０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．１％中の様々な濃度のＶＨＨ（０～２０μg/mL）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結合した抗ＰＮ－１ＶＨＨを、一価ＶＨＨについては、ペルオキシダーゼで標識されたポリクローナル抗ｃＭｙｃタグ抗体を用いて、又は二価ＶＨＨについては抗６ｘヒスチジンタグ抗体を用いて同じ緩衝液中でプローブし、ＴＭＢの加水分解を介して検出し、４５０nmにおける吸光度を解読した。

ＰＮ－１によるトロンビン活性の阻害
９６ウェルプレート（グライナーバイオワン社）において、様々な濃度の抗ＰＮ－１ＶＨＨを、１０nMのＰＮ－１と共に、室温で１５分間、２０mMのＨｅｐｅｓ/０．１５ＭのＮａＣｌ/０．１％のヒト血清アルブミン中でインキュベートした。その後、１nMの精製されたトロンビンをウェルに加え、３０分間室温でインキュベートした。トロンビン活性は、３７℃における発色基質Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｉｐ－Ａｒｇ－ｐＮＡ（ＰＮＡＰＥＰ－０２３８）（０．２mM）からのｐ－ニトロアニリンの放出速度を測定することによって定量され、マルチウェルプレートリーダーで４０５nmにおいて解読した。各ＶＨＨのＩＣ５０を計算するために、僅かに改変されたプロトコールを使用した：抗ＰＮ－１ＶＨＨは、０～２μMの濃度で使用され、ＶＨＨのインキュベーションは５分間行なわれ、その後、１nMのトロンビンと共に１０分間インキュベートした。ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質を、０．２mMの濃度で加え、３７℃で２時間インキュベートした。トロンビン活性の定量は、上記のように行なわれた。

内因性ＰＮ－１によるトロンビン活性の阻害
血液試料は、ＡＣＤ－Ａ液の抗凝固剤のチューブ中に採取された。血液を、１２０ｇで１５分間の遠心分離にかけて、多血小板血漿（ＰＲＰ）を回収した。その後、２μL/mLのアピラーゼ（５mg/mL）及び１μL/mLのＰＧＥ１（１０mM）を加え、多血小板血漿を１２００ｇで２０℃で１２分間遠心分離にかけた。ペレットを、洗浄緩衝液（３．６mMのクエン酸、０．５mMのグルコース、０．５mMのＫＣｌ、１０．３mMのＮａＣｌ、２mMのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５、０．３０％のウシ血清アルブミン、２μL/mLのアピラーゼ（５mg/mL）及び１μL/mLのＰＧＥ１（１０mM））中に穏やかに再懸濁し、１２００ｇで２０℃で１２分間遠心分離にかけた。血小板を、反応緩衝液（０．０３mMのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．５mMのＨｅｐｅｓ、０．５５mMのグルコース、０．２mMのＭｇＣｌ_２、０．１mMのＫＣｌ、１１３．７mMのＮａＣｌ、１２mMのＮａＨＣＯ_３、２mMのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．３、及び０．３％ウシ血清アルブミン）中、５×１０^８個の細胞/mLの濃度に調整した。「活性化血小板」の状態のために、５０μMのＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）を、血小板に３７℃で３０分間かけて加えた。血小板を１２００ｇで室温で１０分間遠心分離にかけて、上清を保持した。９６ウェルプレート（グライナーバイオワン社）において、８０μLの活性化された又は活性化されていない血小板の上清に、１μMのＶＨＨを加え、室温で１５分間インキュベートした。その後、０．１nMのトロンビンを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質を、０．２mMの濃度で加え、３７℃で２時間インキュベートした。トロンビン活性の定量は、上記の通りに実施された。

ヒトＰＡＩ－１によるｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター）の阻害
９６ウェルプレート（グライナーバイオワン社）において、１０μMの抗ＰＮ－１ＶＨＨを、２０mMのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０mMのＮａＣｌ、０．１％ヒト血清アルブミン、ｐＨ７．５中、１０nMのＰＡＩ－１と共に室温で１５分間インキュベートした。続いて、１．３nMのｕＰＡを加えた。室温で１０分間インキュベートした後、ウェルを、発色基質Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ、ＰＮＡＰＥＰ－１３４４（０．２mM）からのｐ－ニトロアニリンの放出速度を３７℃で測定することによって、ｕＰＡ活性について定量し、マルチウェルプレートリーダーによって４０５nmにおいて解読した。

バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）分析による、ＶＨＨの特異性の試験
平衡的な結合が、ＯｃｔｅｔＱＫ機器（フォルテバイオ社、レディング、イギリス）を使用したＢＬＩ分析を介して行なわれた。１００mMのＭＥＳ（ｐＨ５．０）で希釈された一価ＶＨＨ（２５μg/mL）を、アミン反応性バイオセンサー上に固定した。エタノールアミンによってクエンチした後、ＶＨＨでコーティングされたセンサーを、ヒト若しくはマウスのＰＮ－１又はヒトＰＡＩ－１（１μM）と共に、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．１％緩衝液中で１５分間インキュベートして、会合を可能とした。続いて、バイオセンサーを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．１％緩衝液中で１０分間インキュベートし、解離を開始した。代替的な実験では、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．１％緩衝液中５０μg/mLのビオチニル化されたＰＮ－１の反応中心ループを、ストレプトアビジンセンサー上に固定した。会合前に、５Ｕのトロンビン又はＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液を、センサーと共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、３７℃で１５分間かけての二価ＶＨＨ（１００μg/mL）の会合が続いた。続いて、バイオセンサーを、ＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ０．１％緩衝液に１０分間入れ、解離を開始した。データは、Ｏｃｔｅｔソフトウェアバージョン４．０を使用して分析された。

改良されたプロトロンビン時間（ＰＴ）
５０μlのマウスの正常なプールされた血漿（ＭＮＰＰ）を、オウレン・コーラー緩衝液で８倍希釈し、５０μLの第ＩＩ因子欠損（プロトロンビン欠損）凍結乾燥血漿（スタゴ・ダイアグノスティカ社）を加えた。混合物を、６２．５nMのマウスＰＮ－１と共に、２８８nMの二価ＶＨＨの存在下又は非存在下において、３７℃で１５分間インキュベートした。プロトロンビン時間は、１００μLのネオプラスチンＣＩ（スタゴ・ダイアグノスティカ社）を混合物に加えることによって開始された。凝塊形成は、凝固計ＳＴＡｒｔ（スタゴ・ダイアグノスティカ社）によって測定された。アッセイは、３７℃で２回同じ実験が３回実施された。

改良された活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
５０μlの第ＶＩＩＩ因子欠損マウス血漿を、オウレン・コーラー緩衝液で８倍希釈し、これに、５０μLの第ＶＩＩＩ因子欠損凍結乾燥血漿及び５０μLのＰＴＴ試薬（スタゴ・ダイアグノスティカ社）を加えた。１００秒間インキュベーションした後、６２５nMのＶＨＨ及び５００nMのマウスＰＮ－１を加えた。３７℃で２４０秒間インキュベーションした後、活性化トロンボプラスチン時間の試験が、１００μLの０．０２５ＭのＣａＣｌ_２の添加によって開始された。凝塊形成は、凝固計によって測定された。アッセイは、３７℃で、２回同じ実験が３回実施された。

統計分析
データは、平均値と標準誤差（ＳＤ）として提示され、プリズムソフトウェアを使用して分析された。一元分散分析を、対照との数値の比較のために使用した。０．０５未満のＰ値、又は０．０００１未満のＰ値が、それぞれ有意及び非常に有意と判断された。

結果：
合成ＶＨＨライブラリーからの抗ＰＮ－１ＶＨＨの開発
特異的で強力な阻害性の抗ＰＮ－１ＶＨＨを得るために、本発明者らは、合成ＶＨＨライブラリーを使用した。ＶＨＨは、古典的なＶＨＨのために使用されたのと同じプロトコールを使用して選択された。４つの最強の結合物質を、さらなる特徴付けのために選択した：Ｈ１２、Ｂ１１、Ｆ０６及びＡ０８。図１に提示されたヒトＰＮ－１、マウスＰＮ－１及びＰＡＩ－１の吸着されていないファージのＥＬＩＳＡは、４つ全てのＶＨＨがヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１を個別に認識していること、並びに、それらがヒトＰＡＩ－１を認識していないことを強調する。

合成ライブラリーから得られた抗ＰＮ－１ＶＨＨの特徴
精製されたＶＨＨを、ＰＡＩ－１、並びにヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１の両方とのそれらの相互作用について分析した。初期のスクリーニングと一致して、４つの選択されたＶＨＨはいずれも、ヒト又はマウスのＰＡＩ－１に対する関連した結合を示さなかった（図２Ａ～Ｂ）。これに対して、ＶＨＨ Ｈ１２、Ｂ１１、Ｆ０６及びＡ０８は全て、ヒト及びマウスの両方のＰＮ－１に対して用量依存的な結合を示した（図２Ｃ～Ｄ）。ＰＮ－１に対する様々なＶＨＨの阻害活性を評価するために、本発明者らは次に、ＰＮ－１及び様々なＶＨＨの存在下において、トロンビン活性を測定するアッセイを実施した。ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１の両方への結合において最も効率的であったが、ＶＨＨ Ｈ１２は、ＰＮ－１により媒介されるトロンビン活性の阻害に対してほんの部分的にしか干渉せず、ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１に対してそれぞれ７４±５％及び５３±１７％までトロンビン活性を回復させた（図２Ｅ～Ｆ）。ＶＨＨ Ｂ１１、Ｆ０６及びＡ０８は、ヒトＰＮ－１によるトロンビンの阻害を上昇させるのにより効率的であることが判明し、トロンビン活性の回復は、Ｂ１１については１００±７％、Ｆ０６については１００±５％、Ａ０８については１００±１１％であった（図２Ｅ）。同じような強力な阻害能がまた、マウスＰＮ－１に対しても観察された：Ｂ１１では９２±１０％、Ｆ０６については９６±９％、Ａ０８については９４±１４％（図２Ｆ）。これらの中のいずれのＶＨＨも、ＰＡＩ－１によるｕ－ＰＡの阻害に影響を及ぼさなかった（図２Ｇ）。結論すると、この２回目の選択戦略により、ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１の両方に対して選択的かつ阻害的であるＶＨＨが生じた。

Ｂ１１、Ｆ０６、Ａ０８のＶＨＨについてのＩＣ５０の決定
ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１に対する、Ｂ１１、Ｆ０６、及びＡ０８の５０％阻害濃度を決定するために、本発明者らは、様々な濃度のＶＨＨを、１０nMのＰＮ－１及び１nMのトロンビンと共にインキュベートした。ＰＮＡＰＥＰ－０２３８基質の分解を２時間経過観察した。ヒトＰＮ－１に対する試験されたＶＨＨについての計算されたＩＣ５０値は、Ｂ１１については０．０５±０．０１μM、Ｆ０６については０．２９±０．０３μM、Ａ０８については０．９６±０．３９μMであった（図３Ａ）。マウスＰＮ－１を使用して、それぞれ計算されたＩＣ５０値は、Ｂ１１については１．５８±０．２４μM、Ｆ０６については０．５６±０．１３μM、Ａ０８については２．８８±０．７７μMであった（図３Ａ）。特にマウスＰＮ－１に対するＶＨＨの阻害作用を増加させるために、本発明者らは次に、３つの異なる二価構築物、すなわちＢ１１ｂｖ、Ｂ１１Ｆ０６、及びＢ１１Ａ０８を作製した（図３Ｂ）。この工学操作工程後、本発明者らは、精製された二価ＶＨＨが、ヒトＰＮ－１及びマウスＰＮ－１への結合能を保持しているかどうかを確認した（図４Ａ～Ｂ）。本発明者らはまた、それらがＰＡＩ－１を依然として認識しなかったことを確認した（示されていない）。

二価ＶＨＨのＩＣ５０は、一価ＶＨＨと比較して顕著に改善され、ヒトＰＮ－１に対して、Ｂ１１ｂｖについては４１±７nM、Ｂ１１Ｆ０６については６２±６nM、Ｂ１１Ａ０８については１４２±２８nMの数値であった。マウスＰＮ－１についてのＩＣ５０も改善され、それぞれＢ１１ｂｖ、Ｂ１１Ｆ０６、及びＢ１１Ａ０８について、８２５±９nM、４１４±１４１nM、５２４±１７４nMの数値であった（図４Ｃ）。

ＰＮ－１上のＶＨＨの結合領域を同定する試みにおいて、本発明者らは、バイオレイヤー干渉分析を実施して、ＰＮ－１（インタクト又はトロンビンによる切断後のいずれか）の反応中心ループ領域を網羅するペプチドと、二価ＶＨＨとの間の相互作用を試験した。３つ全ての二価ｓｄＡｂが、反応中心ループのペプチドに効率的に結合し、このことは、それらが、タンパク質のこの領域に対して指向されることを実証する（図４Ｄ）。このペプチドへの結合は、各々の二価の構築物において、トロンビンによる反応中心ループの切断時に強く減少した。これらのデータは、反応中心ループのＣ末端部分（トロンビンによる切断後にセンサーから放出される）への、又はＰ１－Ｐ’１切断部位に重複するエピトープへの、ＶＨＨＢ１１の結合と矛盾していない。どのＶＨＨも、反応中心ループのＮ末端部分（トロンビンによる切断後にセンサーに結合したままである）を認識しないようである。データは、反応中心ループのＣ末端部分への、又は反応中心ループの外のエピトープへの、Ｆ０６の結合とＡ０８の結合を識別しない。

インビトロでの凝固アッセイに対する二価ＶＨＨの効果
凝固に対する二価ＶＨＨの効果を試験するために、本発明者らは、マウス血漿を使用してマウスＰＮ－１を用いて、改良されたプロトロンビン時間及び活性化プロトロンビン時間の凝固アッセイを実施した。

まず、プロトロンビン時間は、ほんの少量のマウスＰＮ－１を使用することができるようにするために、プロトロンビン欠乏凍結乾燥血漿と共にインキュベートされた、野生型血漿を使用して展開された。この改良されたアッセイを使用して、プロトロンビン時間は、６９．０±２．４秒間であり、６２．５nMのマウスＰＮ－１の添加後に１２３．８±６．６秒間に延長された（図５Ａ）。２８８nMの濃度では、３つ全ての二価ＶＨＨが、プロトロンビン時間を回復することができたが、添加されるマウスＰＮ－１の非存在下ではプロトロンビン時間に影響を及ぼさなかった（Ｂ１１ｂｖでは８３．５±１．１秒間；Ｂ１１Ｆ０６では８３．３±１．５秒間；Ｂ１１Ａ０８では９３．２±４．４秒間）。このアッセイにおいて、Ｂ１１Ａ０８は、他の２つのＶＨＨよりも僅かに効率が低かった。

本発明者らはまた、改良された活性化プロトロンビン時間における二価ＶＨＨの効果も試験した（図５Ｂ）。プロトロンビン時間と同じように、本発明者らは、第８因子欠損マウス血漿を使用することにより、活性化プロトロンビン時間が延長される特殊な条件を設計して、ＰＮ－１に対して試験の感度がより高くなるようにした。第８因子欠損マウス血漿における活性化プロトロンビン時間は、９７．０±２．７秒間であり、マウスＰＮ－１を添加した場合には１．６倍増加して１４８．４±７．９秒間となった。３つのＶＨＨは、活性化プロトロンビン時間を有意に短縮させ、Ｂ１１Ｆ０６は、最も効率が高かった（１１２．５±７．０秒間；図５Ｂ）。

本発明者らは次に、本発明者らの二価ＶＨＨが、血小板のα顆粒内に存在する内因性ＰＮ－１を阻害することもできるかどうかを調べた。この実験のために、活性化されていない又はＴＲＡＰ（トロンビン受容体アゴニストペプチド）により活性化された血小板に由来する上清を、ＰＮ－１源として使用した。トロンビン活性の阻害における分泌されたＰＮ－１の有効性がこのように調べられた。予想された通り、活性化されていない血小板に由来する上清がトロンビンと共にインキュベートされた場合、ＰＮ－１は血小板のα顆粒から放出されなかったので、阻害作用は全く測定されなかった（図５Ｃ）。これに対して、残留トロンビン活性は、ＴＲＡＰにより活性化された血小板に由来する上清の存在下において、１８±１５％まで低下した（図５Ｄ）。二価ＶＨＨは、分泌された血小板のＰＮ－１によるトロンビン活性の阻害を消失させ、トロンビン活性は、Ｂ１１ｂｖでは９７±+２３％、Ｂ１１Ｆ０６では８８±２１％、Ｂ１１Ａ０８では１００±１５％まで回復した。

本発明者らは以前に、血小板が、それらの活性化後にＰＮ－１を放出し、このＰＮ－１が、トロンビンの生成を損なうことを示した。実際に、活性化されていない血小板及びＴＲＡＰにより活性化された血小板の上清を使用することによって、本発明者らは、トロンビン阻害性分子の放出を確認することができた（図５Ｃ～Ｄ）。興味深いことには、この阻害作用は、ＶＨＨの添加によって中和することができ、このことは、それらが、血小板から放出されたＰＮ－１と相互作用し、阻害することができることを実証する。

総合すると、本発明者らは、ＰＡＩ－１とは交差反応しない、ＰＮ－１に標的化する阻害性ＶＨＨの開発のための戦略を開発した。これらのＶＨＨは、生理学的及び病理学的プロセスにおける、ＰＮ－１の役割をより良く理解するための研究ツールとして使用され得る。さらに、それらは、例えば血友病の処置におけるそれらの治療適用の可能性のために探索され得る。

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最先端技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によってここに組み入れられる。

Claims (20)

1. ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）からなる、式（Ｉ）：
   ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
   （式中、
   ＣＤＲ１は、以下の配列：Ｘ_１－Ｔ－Ｗ－Ｘ_４－Ｘ_５－Ｅ－Ｉ（ここでのＸ_１はＳ又はＤであり、Ｘ_４はＦ又はＲであり、Ｘ_５はＲ又はＬである）を有し；そして
   ＣＤＲ２は、以下の配列：Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｗ－Ｈ－Ａ（ここでのＸ２はＤ又はＥであり、Ｘ３はＰ又はＤであり、Ｘ４はＴ又はＧである）を有し；そして
   ＣＤＲ３は、配列番号３又は配列番号７として示される配列を有する）
   で示されるアミノ酸配列を含む、単離された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
2. ｉ）配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３；又は
   ｉｉ）配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３
   を含む、請求項１記載の単離された単一ドメイン抗体。
3. 配列番号４又は配列番号８として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１又は２記載の単離された単一ドメイン抗体。
4. 配列番号４又は配列番号８として示される配列を含む、請求項１～３記載の単離された単一ドメイン抗体。
5. ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）からなる、式（Ｉ）：
   ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（Ｉ）
   （式中、
   ＣＤＲ１は、配列番号９として示される配列を有し；そして
   ＣＤＲ２は、配列番号１０として示される配列を有し；そして
   ＣＤＲ３は、配列番号１１として示される配列を有する）
   で示されるアミノ酸配列を含む、単離された単一ドメイン抗体。
6. 配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、請求項５記載の単離された単一ドメイン抗体。
7. 配列番号１２として示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項５又は６記載の単離された単一ドメイン抗体。
8. 配列番号１２として示される配列を含む、請求項５～７記載の単離された単一ドメイン抗体。
9. 請求項１又は５記載の単一ドメイン抗体とＰＮ－１への結合に関して交差競合する、交差競合する単一ドメイン抗体。
10. 請求項１又は５記載の少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含むポリペプチド。
11. ｉ）配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３；又は
    ｉｉ）配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３；又は
    ｉｉｉ）配列番号９として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示される配列を有するＣＤＲ３
    を含む、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
12. ｉ）請求項１～４のいずれか一項記載の単一ドメイン抗体；及び
    ｉｉ）請求項５～８のいずれか一項記載の第二の単一ドメイン抗体
    を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
13. ｉ）配列番号１として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、単一ドメイン抗体；及び
    ｉｉ）配列番号５として示される配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示される配列を有するＣＤＲ３を含む、第二の単一ドメイン抗体
    を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
14. 配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９からなる群より選択される配列を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
15. 請求項１若しくは５記載の単一ドメイン抗体及び／又は請求項１０のポリペプチドをコードしている、核酸分子。
16. 請求項１５の核酸を含むベクター。
17. 請求項１５の核酸及び／又は請求項１６のベクターによってトランスフェクトされたか、感染されたか、又は形質転換された宿主細胞。
18. 請求項１若しくは５の単一ドメイン抗体及び／又は請求項１０のポリペプチドの有効量を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における出血性疾患を予防又は治療するための方法。
19. 出血性疾患が血友病である、請求項１８の方法。
20. 請求項１若しくは５の単一ドメイン抗体及び／又は請求項１０のポリペプチドを含む、医薬組成物。

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