KR20230038658A

KR20230038658A - Adamts13 단백질 변형체 및 그것의 용도

Info

Publication number: KR20230038658A
Application number: KR1020227045100A
Authority: KR
Inventors: 조한스 제이코버스 부르벨그; 누노 알렉산드레 고메스 그라카; 보갓 엘식
Original assignee: 산퀸 아이피 비.브이.
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2023-03-21
Also published as: WO2021242092A1; IL298429A; US20230242896A1; EP4158012A1; CN115835880A; JP2023529510A; AU2021278756A1; CA3179894A1

Abstract

본 발명은 ADAMTS13의 잔기 1 내지 685를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체에 관한 것으로서, 상기 변형체에서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. 본 발명은 또한 이러한 ADAMTS13 변형체를 포함하는 조성물과 그것의 제조방법과 그것의 용도, 특히 항혈전제로의 용도, 그리고 혈전성 질병, 혈전성 미세혈관증, 혈전성 혈소판 감소 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP), 용혈성 요독증(hemolytic-uremic syndrome, HUS), 허혈성 뇌졸중, 전신성 색전증, COVID19, 항인지질 증후군, 전자간증(pre-eclampsia)/HELLP 증후군, 패혈증, 낫모양 적혈구증(sickle cell disease)의 치료용도에 대한 것이다.

Description

ADAMTS13 단백질 변형체 및 그것의 용도

본 발명은 마리 스클로도프스카-퀴리 보조금 협정(Marie Sklodowska-Curie grant agreement) No 675746 하의 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램(European Union's Horizon 2020 research and innovation program)의 지원을 받아 만들어졌다(프로젝트 프로파일).

본 발명은 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor, VWF)가 관련된 질병의 치료 분야에 대한 것이다. 본 발명은 지혈기능 유지에 관여하는 변형된 프로테아제에 대한 것으로서, 구체적으로 자가항체의 결합이 강력하게 줄어들지만 활성을 유지하는 변형 프로테아제와 그것의 질병의 치료에의 용도에 대한 것이다.

면역 매개 혈전성 혈소판 감소 자반증(Immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura, iTTP)은 드물지만 생명을 위협하는 자가면역 질병으로서, ADAMTS13 (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin type 1 motifs, member 13)에 대한 자가항체 발달로 인한 것이다. ADAMTS13은 폰 빌레브란트 인자(VWF)의 A2 도메인에서 Tyr1605-Met1606 결합을 단백 분해하여 자르는 금속단백질분해효소(metalloprotease)이다. VWF는 손상된 혈관에 혈소판이 부착되는 것을 매개하는 다량체(multimer) 단백질이다. VWF의 다량체(멀티머) 크기는 그것의 생물학적 활성과 직접적으로 비례하는데, 손상된 혈관 벽으로의 혈소판 부착을 촉진시키는 데 더 큰 멀티머가 더 높은 활성을 가진다. 정상적인 개체에서, VWF의 멀티머 크기는 VWF 절단 프로테아제 ADAMTS13에 의해 조절된다. iTTP 환자의 VWF 멀티머 가공과정은 이런 환자에서 발달되는 ADAMTS13를 향하는 병적인 자가항체의 존재 때문에 망가진다. ADAMTS13에 대한 자가항체가 있는 iTTP 환자에서 VWF 멀티머의 높은 분자량이 지속되어 미세혈관에서의 과도한 혈전 형성으로 이어지고 생명을 위협하는 미세혈관 혈전증으로 나타난다.

현재 iTTP의 치료관리는 혈장 교환(plasma exchange, PEX) 및 고용량 글루코코르티코이드 면역억제를 포함한다. 혈장교환술은 외래 ADAMTS13의 원천을 제공하지만 외래 ADAMTS13을 포함하는 ADAMTS13을 표적으로 하는 병적인 항체가 혈중에 유지되기 때문에 그 효과가 짧다. 혈장교환술에 더해 B-세포 고갈 항CD20 치료 단클론항체인 리툭시맙(Rituximab)을 iTTP의 치료에 사용한다. 리툭시맙은 또한 iTTP환자의 재발을 막기 위해 사용되고 있다. 최근 VWF에 혈소판이 달라붙는 것을 막는 인간화 항 VWF 나노체인 카플라시주맙(Caplacizumab)이 혈소판 수치를 1.55배까지 정상화되도록 가속화함을 보여줬다(Scully et al., 2019). 카플라시주맙 치료의 부작용으로 출혈이 있다(Mazepa et al., 2019). Mazepa 등은 HERCULES 임상시험에서 출혈이 카플라시주맙 치료의 주된 부작용이고 65%에서(위약 모둠에서는 48%) 나타남을 보여줬다. 코피와 잇몸 출혈을 포함하는 점막피부 출혈이 가장 흔한 부작용이었고, 대부분의 출혈은 치료없이 해결되는 약에서 중 정도의 심각도였다. 카플라시주맙에 대해 심한 출혈을 일으킨 세 개체는 VWF 농축액 (심각한 코피), 트라넥삼산(tranexamic acid)(잇몸 출혈), 그리고 적혈구 수혈(상부 위장관 출혈)을 투여받았다. 전체적으로, 대부분의 카플라시주맙 연관 출혈은 개입없이 해결되는 한편(그 약물을 중단할 필요가 있을 수는 있지만), 다른 사람들에서는 국소 혈관수축제 및 항피브린용해제(antifibrinolytics)가 효과적이었고, 심각한 재발성 출혈이 있는 환자에게는 VWF 농축액이 함께 투여되었다.

이렇게 iTTP 환자의 치료방법이 개선되고 있지만 현재의 치료법은 여전히 차선이다. iTTP 환자의 혈소판 수치 정상화를 가속화하도록 돕는 ADAMTS13 활성을 빠르게 다시 회복시킬 수 있는 치료법에 대한 명확한 요구가 있다.

자가항체 저항성 ADAMTS13 변형체가 문헌에 보고된 바 있다(Jian et al., 2012). ADAMTS13의 스페이서 도메인이 병적인 자가항체가 결합되는 주요 부위로 제공된다. 스페이서 도메인 내 5 잔기에서의 보존적 돌연변이를 통해 소위 기능획득(Gain-of-Function, GoF) 변형체가 만들어지는데, 그것이 iTTP 환자에서 발달되는 병적인 자가항체가 결합하는 데 저항성을 갖는다고 한다 (Jian et al., 2012). ADAMTS13의 이런 GoF 변형체는 또한 미국특허 US 9,546,360에 기술되어 있다. 그러나, 후속 연구를 통해 ADAMTS13의 GoF 변형체가 여전히 환자 유래 자가항체의 표적이 되고 그것의 억제 작용에 저항하지 못한다는 것이 밝혀졌다(Graca et al., 2019). 그러나, ADAMTS13의 다른 도메인에 결합하는 병적인 자가항체 또한 보고되고 있다.

그러므로, 자가항체의 결합을 효율적으로 피하면서 ADAMTS13 활성을 유지하는 ADAMTS13 변형체에 대한 여전한 요구가 있다. 이러한 ADAMTS13 변형체는 현재 이용가능한 치료 선택지와 비교할 때 iTTP 및 다른 관련 질병 환자의 임상 증상을 빠르게 교정할 수 있는 그것의 잠재력에 기초해 큰 치료적 이익을 가질 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 자가항체 결합은 덜 되고 단백질 분해 활성은 유지하는 개선된 ADAMTS13 변형체를 제공하는 것이다.

본 발명은 ADAMTS13의 1 내지 1427 잔기를 포함하거나 또는 적어도 1 내지 685 잔기를 포함하는 잘린 버전의 ADAMTS13 단백질 변형체를 제공하는데, 여기에 야생형 ADAMTS13에 비해 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13에 비해 하나 이상의 기존재하는 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. 바람직하게는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541 아미노산 잔기로는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되지 않고, 상기 기존재하는 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 N-연결 글리코실화 부위는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541 아미노산 잔기에는 존재하지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, ADAMTS13 단백질 변형체는 전장 ADAMTS13 변형체, 즉 ADAMTS13의 1 내지 1427 잔기를 포함하며, 여기서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하며, 선택적으로 여기 기술한 바와 같은 추가적인 돌연변이를 포함한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산서열 구성체를 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 본 발명에 따른 핵산 구성체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬번트, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 제공하는데, 바람직하게 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체는 치료용으로 사용되기 위한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고, 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 제공하는데, 바람직하게 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체는 항혈전제로 사용되기 위한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 제공하는데, 바람직하게 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체는 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 가공과정을 특징으로 하는 질병의 치료에 사용되기 위한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 가공과정을 특징으로 하는 질병의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 치료적 유효량으로 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체를 투여한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 가공과정을 특징으로 하는 질병의 치료를 위한 의약의 제조를 위해, ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 혈전증의 치료에 사용하기 위한, ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체, 바람직하게는 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 후천성 또는 선천성 혈전 질병인 혈전증의 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은 ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 치료적 유효량으로 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체를 투여한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 후천성 및 선천성 혈전 질병인 혈전증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, ADAMTS13의 아미노산 잔기 1 내지 685를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 상기 ADAMTS13 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 N-연결 글리코실화를 할 수 있는 숙주세포, 바람직하게는 진핵 숙주세포에 본 발명에 따른 핵산 분자를 도입하고, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다.

상세한 설명

본 발명자들은 N-글리칸을 추가하기 위한 새로운 공통 부위의 삽입을 기초로 하여 병적인 자가항체들이 덜 달라붙는 ADAMTS13 변형체를 발달시키는 새로운 전략을 확인했다. 이러한 N-글리칸 공통 부위는 바람직하게는 ADAMTS13 내의 면역원성 구역에 삽입된다. 실시예에서 보여지다시피, 야생형 ADAMTS13 단백질에 아미노산 돌연변이를 도입하여 다른 자리에 N-글리칸 부위를 도입하였다. 이런 기술이 iTTP 환자 내에서 발달되는 병적인 ADAMTS13 자가항체의 결합을 상당히 줄이기 위해 사용될 수 있다는 것이 추가로 확인되었다. 이론에 얽매임이 없이, 도입된 N-글리칸이 자가 항체가 달라붙는 에피토프를 차폐할 수 있다고 가정했다. 더욱 구체적으로, 도입된 N-글리칸이 ADAMTS13을 표적으로 하는 자가항체가 에피토프에 붙는 것을 차단하는데, 스페이서 도메인, TSP-1 (트롬보스폰딘 1형) 반복부 및 CUB (보체성분 Clr/Cls, Uegf, 및 골형성 단백질 1(Bone morphogenic protein 1)), 금속단백질분해효소 도메인, 디스인테그린 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 다른 도메인과 항 ADAMTS13 자가항체의 결합부위를 제공하는 ADAMTS13의 다른 도메인의 노출부위를 포함하는 에피토프에의 자가항체의 결합을 막는다. 특히, ADAMTS13 스페이서 도메인의 주된 에피토프를 차폐함으로써 자가항체와의 반응성을 상당히 줄인다고 여겨진다. 스페이서 도메인의 이 에피토프는 ADAMTS13 서열의 아미노산 잔기 R568, F592, R660, Y661, Y665 주변에 중심을 두고 있다고 생각된다. 이 5개의 잔기의 돌연변이는 ADAMTS13에 대한 자가항체의 결합을 효과적으로 줄일 수 있지만, 그것은 보통 활성도 잃게 한다 (Graca et al, 2019). 본 발명에서, 기존 에피토프 잔기(R568, F592, R660, Y661 및 Y665)의 내부 및/또는 외부에 N-글리칸을 도입하면 단백질 분해능을 잃지 않고, 즉 ADAMTS13의 VWF 절단 활성의 적어도 일부는 유지한 채로 ADAMTS13의 자가항체와의 반응성을 줄일 수 있음이 확인되었다. 이러한 ADAMTS13 N-글리칸 변형체는 ADAMTS13을 표적으로 하는 자가항체에 저항하고 VWF가 스페이서 도메인에 결합하는 것은 유지하여, 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및 폰 빌레브란트 인자 가공과정과 연관된 질병의 치료에 높은 중요성을 가진다.

본 발명은 이와 같이, 첫번째 측면에서, ADAMTS13의 1 내지 685 잔기를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체를 제공하는데, 그것에서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-글리코실화 부위가 추가 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-글리코실화 부위가 이동했으며, 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위 추가 및 상기 기 존재 N-연결 글리코실화 부위 이동은 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 아미노산 잔기 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541에는 일어나지 않는다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 1 내지 685 잔기를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 치료에 사용하기 위해 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 1 내지 685 잔기를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체, 또는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 항혈전제로 사용하기 위해 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 ADAMTS13의 1 내지 685 잔기를 포함하고 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및 폰 빌레브란트 인자 가공과정과 연관된 질병의 치료에 사용하기 위해 제공한다.

여기 쓰인 "단백질"이라는 용어는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 가리킨다. 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 하나의 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열에 제한되지 않고 단백질의 전사 후 변형도 포함할 수 있다.

여기 쓰인 "ADAMTS13" 및 "ADAMTS13 단백질"이라는 용어는 ADAMTS13 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 가리킨다. ADAMTS13은 금속단백질분해효소 유전자 모둠 ADAM(a disintegrin and metalloproteinase)의 일원인데, 그 모둠은 서로 다른 기능을 가지는 막-부착 단백질 분해효소로 이루어져 있다. ADAMTS 모둠의 구성원들은 C-말단에 하나 이상의 트롬보스폰딘-1-양(thrombospondin 1-like, TSP1) 도메인을 가지고, ADAM 금속단백질분해효소에 존재하는 EGF 반복부, 막통과(transmembrane) 도메인 및 세포질 꼬리가 없는 것을 또 다른 특징으로 한다. ADAMTS13은 두 개의 C-말단 CUB (Complement component Clr/Cls, Uegf, and Bone morphogenic protein) 도메인과 VWF 절단 프로테아제 활성을 갖는 유일한 ADAMTS 구성원이다 (Kelwick et al, 2015). "야생형 ADAMTS13" 및 "야생형 ADAMTS13 단백질"이라는 용어는 자연발생, 인간 ADAMTS13을 가리킨다. 도 1에 야생형 ADAMTS13의 전장 아미노산 서열을 나타냈다.

여기 쓰인 용어 "ADAMTS13 단백질 변형체"는 야생형 ADAMTS13에는 존재하지 않는 적어도 하나의 N-글리코실화 부위를 가지는, 야생형 ADAMTS13과는 아미노산 서열이 다른 아미노산 서열을 가지는 ADAMTS13의 변형체를 가리킨다. 또한, 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체는 도 1에 나타낸 ADAMTS13 아미노산 서열의 적어도 1 내지 685 아미노산을 포함한다. 도 1에 나타낸 1 내지 685 아미노산으로 구성된 짧아진 ADAMTS13 단백질은 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (Tao et al. 2005). 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체는 전장 ADAMTS13 단백질 변형체로, 도 1에 나타낸 바와 같은 ADAMTS13의 1 내지 1427 아미노산 잔기를 포함하는 전체 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미하는데, 그 안에서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동했고, 선택적으로 여기 설명된 바와 같은 추가적인 돌연변이를 갖는다.

여기 설명되는 아미노산 서열 또는 단백질 변형체에서, 아미노산은 한 글자 또는 세 글자 부호로 표시된다. 이 한 글자 부호 및 세 글자 부호는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음의 의미를 가진다: A (Ala)는 알라닌, C (Cys)는 시스테인, D (Asp)는 아스파르트산, E (Glu)는 글루탐산, F (Phe)는 페닐알라닌, G (Gly)는 글리신, H (His)는 히스티딘, I (Ile)는 이소류신, K (Lys)는 리신, L (Leu)은 류신, M (Met)은 메티오닌, N (Asn)은 아스파라긴, P (Pro)는 프롤린, Q (Gln)는 글루타민, R (Arg)는 아르기닌, S (Ser)는 세린, T (Thr)는 트레오닌, V (Val)는 발린, W (Trp)는 트립토판, Y (Tyr)는 타이로신이다.

여기 표시된 아미노산 잔기의 모든 위치는 도 1에 도시된 바와 같은 야생형 ADAMTS13 서열의 아미노산 잔기의 번호를 가리킨다.

돌연변이, 구체적으로 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환은 여기서 당업계 표준 방식, 즉 야생형 ADAMTS13 서열에 존재하는 아미노산과 서열에서의 그 위치, 그 위치에 도입된 아미노산을 지칭함으로써 표현된다. 예를 들어 "R568K"는 568번 위치의 아르기닌이 리신으로 치환되었음을 나타낸다. "568REY570에서 568NET570으로"는 568-570 위치의 아르기닌-글루탐산-타이로신 서열이 아스파라긴-글루탐산-트레오닌 서열로 치환되었음을 가리킨다.

"N-연결 글리코실화"는 질소 원자, 전형적으로 아스파라긴 잔기의 N4에 올리고당 부분이 부착되는 것을 가리킨다. "N-연결 글리코실화 부위" 또는 "N 글리코실화 부위"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ADAMTS13 단백질 변형체에서 N-연결 글리코실화가 가능한 부위를 가리킨다. 이러한 부위는 아미노산 서열 NXT 또는 NXS를 갖는데, 여기서 X는 P를 제외한 임의의 아미노산이다. N-연결 글리코실화는 번역 후 변형이고, 단백질의 N-연결 글리칸은 단백질의 접힘, 세포 부착 및/또는 기능을 바꿀 수 있다. N-연결 글리칸은 만노즈, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 푸코스 및 시알산 잔기의 여러가지 조합을 가질 수 있다. ADAMTS13 상에서 몇몇 N 연결 글리칸이 확인되었는데, 142, 146, 552, 579, 614, 667, 707, 828, 1235 및 1354번 아스파라긴 잔기에 부착되었고(도 2 참조), O-글리코실화, 및 S- 및 C- 만노실화를 포함하는 다른 유형의 글리코실화도 확인되었다(Verbij et al. 2016). 도 2는 또한 ADAMTS13에서 확인된 가장 흔한 다른 구조의 N-글리칸도 보여준다.

전장 ADAMTS13 시스테인 풍부 도메인의 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541 잔기로의 N-연결 글리코실화 부위의 도입은 De Groot et al.에 의해 설명된 바 있다. 이 도메인에서의 서열 교환은 물론이고 이러한 부위의 삽입과 한 지점 돌연변이는 ADAMTS13의 시스테인 풍부 도메인이 VWF와 결합하고 단백질 분해하는 것에 대한 기능적 역할을 연구하기 위해 수행되었다.

본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 기 존재하는 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 이동된다. 이는 야생형 ADAMTS13에서는 N-글리코실화 부위가 존재하지 않는 아미노산 잔기에 그것이 있다는 것을 의미한다(NXT 또는 NXS, 여기서 X는 P를 제외한 임의의 아미노산임). 이것은 하나 이상의 추가적인 N-연결 글리코실화 부위를 더하거나, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위를 이동시키거나, 또는 그것을 조합함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 또는 2개의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 이동된다.

다른 바람직한 실시예에서, ADAMTS13 서열에서 본 발명에 따라 도입되거나 이동한 N-연결 글리코실화 부위 NXS 또는 NXT 의 주변에 존재하는 프롤린(P)은 다른 아미노산으로 대체되는데, 바람직한 실시예에서 알라닌으로 대체된다. 이런 위치에서 프롤린을 대체하면 N-글리칸이 N-연결 글리코실화 부위로 부착되는 것을 촉진시킨다. 여기 사용된, '주변에'는 N-연결 글리코실화 부위의 앞 또는 뒤의 1 또는 2개의 아미노산을 의미한다. 바람직하게는 N-글리코실화 부위 바로 뒤의 프롤린이 다른 아미노산으로 대체되고, 바람직한 실시예에서는 알라닌으로 대체된다.

N-연결 글리코실화 부위의 추가는, 야생형 ADAMTS13에 존재하는 자연발생 N-글리코실화 부위를 제거하지 않고, 야생형 ADAMTS13에서는 존재하지 않는 N-글리코실화 부위가 본 발명의 ADAMTS13 단백질 변형체로 도입됨을 뜻한다. N-글리코실화 부위의 추가는 N-글리코실화 부위가 도입되도록 아미노산 서열에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 만들어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 삽입하거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하거나 또는 이를 조합하여 야생형 ADAMTS13에는 존재하지 않는 N-연결 글리코실화 부위가 ADAMTS13 서열에 도입되도록 할 수 있다. 바람직한 실시예에서, N-연결 글리코실화 부위는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하여 추가된다. 구체적으로, 아스파라긴이 여기 설명된 바와 같이 N-글리코실화 부위 NXS 또는 NXT의 첫 번째 잔기가 되도록 아무 아미노산이라도 아스파라긴 잔기로 치환될 수 있고, 여기 설명된 바와 같은 N-연결 글리코실화 부위 NXS 또는 NXT의 두 번째 위치의 잠재적 프롤린이 제거되도록 프롤린이 아무 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 여기 설명된 바와 같은 N-글리코실화 부위 NXS 또는 NXT의 세 번째 잔기로서 세린 또는 트레오닌이 도입되도록 세린과 트레오닌이 아닌 다른 아미노산이 세린 또는 트레오닌으로 치환될 수 있고, 이들의 조합도 가능하다. NXS 및 NXT 부위 모두가 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 쓰이는 ADAMTS13 변형체에 도입될 수 있지만, NXT에서 NXS에 비해 더 효율적인 N-글리칸 추가가 일어나는 것으로 보인다. 예를 들어, 여기 실시예에 설명된 ADAMTS13 변형체 NGLY3에서, 608 위치에서 리신이 아스파라긴으로 치환(K608N)됨으로써 N-연결 글리코실화 부위(NMS)가 아미노산 잔기 608 내지 610에 추가된다. 다른 실시예에서, 여기 설명된 바와 같은 ADAMTS13 변형체 NGLY4에는 609 위치에서 메티오닌을 아스파라긴으로 치환하고 611 위치에서 이소류신을 트레오닌으로 치환함으로써 아미노산 잔기 609-611에 N-연결 글리코실화 부위(NST)가 추가된다(609MSI611에서 609NST611로). 당업자라면 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 추가하기 위한 ADAMTS13 서열의 적절한 돌연변이의 설계가 가능하다.

N-연결 글리코실화 부위의 이동은 야생형 ADAMTS13의 특정 아미노산 잔기, 구체적으로 142, 146, 552, 579, 614, 667, 707, 828, 1235 또는 1354 아미노산 위치에 존재하는 아스파라긴 잔기를 포함하는 잔기에 존재하는 N-연결 글리코실화 부위가 ADAMTS13 아미노산 서열의 다른 아미노산 잔기로 이동함을 의미한다. 즉, N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 안의 전체 N-연결 글리코실화 부위의 수는 야생형 ADAMTS13의 N-연결 글리코실화 부위의 수와 같다. 바람직하게는, N-연결 글리코실화 부위가 1 내지 10 개 사이의 아미노산 잔기로 이동한다. 이동은 야생형 ADAMTS13 서열의 N-연결 글리코실화 부위의 위치 대비 하위(downstream) 또는 상위로 모두 가능하다. 더욱 바람직하게는 N-연결 글리코실화 부위가 1 내지 7 개 사이의 아미노산 잔기가, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개 사이, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 개 사이, 더욱 바람직하게는 1 내지 4 개 사이,더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기와 같이 1 내지 3 개 사이의 아미노산 잔기가 야생형 ADAMTS13 서열 내 N-연결 글리코실화 부위의 위치와 비교하여 상위 또는 하위로 이동한다. 바람직한 실시예에서, 상기 N-연결 글리코실화 부위는 1 또는 2 개의 아미노산 잔기가 이동하고, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산 잔기가 이동한다. N-연결 글리코실화 부위의 이동은 N-연결 글리코실화 부위가 이동하도록 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 돌연변이를 아미노산 서열에 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삭제, 또는 이것들의 조합을 통해 야생형 ADAMTS13 서열에서의 N-연결 글리코실화 부위의 위치 대비 N-연결 글리코실화 부위의 위치가 이동하도록 함으로써 가능하다. 바람직한 일 실시예에서, N-연결 글리코실화 부위는 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 이동한다. 구체적으로 아무 아미노산 잔기라도 아스파라긴 잔기로 대체되어 여기 설명된 N-연결 글리코실화 부위 NXS 또는 NXT의 첫 번째 잔기로서 아스파라긴이 도입될 수 있고, 여기 설명된 N-연결 글리코실화 부위 NXS 또는 NXT에서 두번째 잔기로서 잠재적인 프롤린이 제거되도록 프롤린이 다른 임의의 아미노산으로 치환될 수 있고, 여기 설명된 N-연결 글리코실화 부위 NXS 또는 NXT의 세번째 잔기로서 세린 또는 트레오닌이 도입되도록 세린과 트레오닌이 아닌 다른 아미노산이 세린이나 트레오닌으로 대체될 수 있으며, 그것들의 조합도 가능하다. 이와 달리 또는 추가적으로, 야생형 ADAMTS13에 존재하는 N-연결 글리코실화 부위를 제거하기 위해 아스파라긴이 임의의 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 예를 들면, 여기 실시예에서 설명되는 ADAMTS13 변형체 NGLY8에서는 667번 위치의 아스파라긴을 류신으로, 668번 위치의 류신을 아스파라긴으로, 669번 위치의 트레오닌을 발린으로, 670번 위치의 아르기닌을 트레오닌으로 대체함으로써 N-연결 글리코실화 부위가 아미노산 잔기 667-669로부터 아미노산 잔기 668-670으로 이동한다(667NLTR670에서 667LNVT670으로). 추가적으로, 671번 위치의 프롤린은 알라닌으로 대체되었고 그것이 N-글리칸의 부착 가능성을 상당히 높였다(667NLTRP671에서 667LNVTA671로). 당업자라면 ADAMTS13 서열에서 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위를 이동시키기 위한 적절한 돌연변이를 설계할 수 있을 것이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 금속단백질분해효소 도메인, 디스인테그린양(disintegrin-like) 도메인, TSP(트롬보스폰딘(thrombospondin)) 1형 1 도메인, TSP 1형 2 도메인, TSP 1형 3 도메인, TSP 1형 4 도메인, TSP 1형 5 도메인, TSP 1형 6 도메인, TSP 1형 7 도메인, TSP 1형 8 도메인, 시스테인 풍부 도메인, 스페이서 도메인, CUB 1(Complement component Clr/Cls, Uegf, and Bone morphogenic protein 1) 도메인, CUB 2 도메인, 상기 도메인 2개 사이의 구역 또는 그들의 조합으로 구성된 모둠에서 선택되는 도메인으로 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는, 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. 더욱 바람직하게는 금속단백질분해효소 도메인, 디스인테그린양 도메인, TSP 1형 1 도메인, TSP 1형 2 도메인, TSP 1형 3 도메인, TSP 1형 4 도메인, TSP 1형 5 도메인, TSP 1형 6 도메인, TSP 1형 7 도메인, TSP 1형 8 도메인, 스페이서 도메인, CUB 1 도메인, CUB 2 도메인, 상기 도메인 2개 사이의 구역 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 도메인으로 추가 및/또는 이동한다. 각 도메인에 대한 아미노산 잔기는 표 5의 첫 번째 칼럼에 표시했는데, 여기서 숫자는 도 1에 나타낸 야생형 ADAMTS13 서열의 아미노산 잔기 번호를 가리킨다. "상기 도메인 2개 사이의 구역"은 2개의 인접한 도메인 사이의 구역을 가리키며, 바람직하게는 금속단백질분해효소 도메인과 디스인테그린-양 도메인 사이, 디스인테그린-양 도메인과 TSP 1형 1 도메인 사이, TSP 1형 2와 TSP 1형 3 도메인 사이, TSP 1형 3과 TSP 1형 4 도메인사이, TSP 1형 4와 TSP 1형 5 도메인 사이, TSP 1형 7과 TSP 1형 8 도메인 사이, 그리고 TSP 1형 8과 CUB1 도메인 사이이다.

본 발명에서 제공되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 아미노산 잔기 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541에는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다. 바람직하게는 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 아미노산 잔기 440-553 또는 464-539에는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되지 않고, 상기 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다. 더욱 바람직하게는, ADAMTS13의 아미노산 잔기 440-556로 구성된 시스테인 풍부 도메인으로는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서, 도 1의 ADAMTS13 서열 잔기 S556 내지 A685을 포함하는 스페이서 도메인 및/또는 표 5에 나타낸 임의의 아미노산 서열의 잔기에 N-글리코실화 부위(NXT 또는 NXS, 여기서 X는 P가 아닌 임의의 아미노산임)를 도입하거나, 표 5에 나타낸 임의의 아미노산 서열로 N-글리코실화 부위를 이동시킴으로써 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 이동한다. 본 발명에서 제공되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 아미노산 잔기 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541로는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 상기 하나 이상의 기존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 또는 이동하는데, 금속단백질분해효소 도메인으로, 바람직하게는 도 1에 도시된 ADAMTS13 서열의 L80 내지 P226를 포함하는 도메인으로 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 또는 상기 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. 금속단백질분해효소 도메인의 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위의 추가 또는 이동은 바람직하게는 표 5의 번호 1 내지 9로 표시된 도메인으로 추가되거나 이동한다.

바람직한 일 실시예에서, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 추가 또는 이동하는데, CUB 도메인으로, 바람직하게는 도 1의 ADAMTS13 서열의 잔기 C1192 내지 T1427를 포함하는 위치로 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 상기 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. CUB 도메인의 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위는 바람직하게는 표 5의 59-89번으로 표시된 도메인으로 추가되거나 이동한다.

바람직한 일 실시예에서, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 추가되거나 이동하는데, TSP1-2-8 도메인으로, 바람직하게는 도 1의 ADAMTS13 서열의 잔기 P682 내지 P1131를 포함하는 위치로 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 상기 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. TSP1-2-8 도메인의 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위는 바람직하게는 표 5의 32 내지 56번으로 표시된 도메인으로 추가되거나 이동한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에서 추가 및/또는 이동하는데, 도 1의 ADAMTS13 서열의 잔기 S556 내지 A685를 포함하는 스페이서 도메인으로 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다. 스페이서 도메인은 130개 아미노산 길이를 가지며, ADAMTS13의 단백질 분해효소 활성에 필요한 몇 가지 필수적인 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. 또한, 스페이서 도메인까지의 아미노산과 스페이서 도메인을 포함하는, 즉, 아미노산 1-685를 포함하는 ADAMTS13의 절단된 변형체가 단백질 분해 활성을 보인다고 보고되었다(E.g. Xiao et al. 2011 and De Maeyer et al. 2010). 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 ADAMTS13 단백질 변형체는 적어도 ADAMTS13의 잔기 1-685를 포함하고, 거기에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-글리코실화 부위가 추가되거나 및/또는 기 존재하는 하나 이상의 N-글리코실화 부위가 이동하며, 추가로 선택적으로 여기 설명된 돌연변이가 도입된다. 스페이서 도메인은 표면이 노출된 잔기를 포함하며, 그것이 항-ADAMTS13 자가항체에 의해 인식되는 주요 에피토프를 형성한다. 이 잔기들은 또한 엑소사이트(exosite)-3 도메인으로도 불린다. 이 도메인은 아미노산 잔기 R568, F592, R660, Y661 및 Y665를 포함한다. R660, Y661 및 Y665의 알라닌 돌연변이는 ADAMTS13가 VWF에 의해 인식되지 못하게 한다 (Pos et al. 2010; Pos et al. 2011). 그러나, 엑소사이트-3 잔기의 보존적 아미노산 치환을 통해 ADAMTS13의 기능획득 변형체를 만들 수 있다는 것이 보고되었다(Jian et al. 2012). 처음에는 이 변형체가 자가 항체에도 저항성을 가진다고 믿어졌지만 후속 실험을 통해 그것이 여전히 환자 유래 자가 항체의 표적이 된다는 것이 밝혀졌다(Graca et al., 2019). 이론에 얽매임이 없이, 스페이서 도메인에 있는 아스파라긴 잔기에 부착된 N-글리칸이 엑소사이트-3 도메인을 차폐하여 이 부위로의 자가항체의 결합을 줄이거나 막을 수 있다고 여겨진다.

더욱 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 도 1의 ADAMTS13 서열의 잔기 S556 내지 A685를 포함하는 스페이서 도메인에 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한다.

도 1의 ADAMTS13 서열의 잔기 R568 내지 R670을 포함하는 스페이서 도메인의 일부에 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 및/또는 상기 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하는 것이 더욱 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른, 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13 단백질이 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대해 갖는 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 갖는다. 임상적으로 중요한 수준의 마지노선은 적어도 10%로 정해졌다 (e.g. Hie et al. 2014). 여기 쓰인 "VWF에 대한 단백질 분해 활성"은 ADAMTS13 또는 ADAMTS13 단백질 변형체가 VWF를 절단하는 능력을 가리킨다. 여기 쓰인 "야생형 ADAMTS13 단백질의 VWF에 대한 단백질 분해 활성의 x%"는 동일 조건에서 재조합 야생형 ADAMTS13과 비교한 VWF에 대한 단백질 분해활성의 x%를 가리킨다. 즉 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체의 VWF에 대한 단백질 분해 활성은, 동일한 분석법을 사용하여 측정되고 동일한 시간 동안 동일한 단백질 농도를 사용하는 것 등을 포함하는 동일 조건에서 재조합 야생형 ADAMTS13 단백질의 VWF에 대한 단백질 분해 활성과 비교된다. 당업자라면 야생형 ADAMTS13과 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체의 단백질 분해 활성을 측정하기 위해 상기 효능을 비교할 수 있는 동일한 조건에서 잘 측정할 수 있을 것이다. VWF에 대한 단백질 분해 활성은, 예를 들면, 여기 실시예에서 설명된 바와 같이 FRETS-VWF73(Kokame et al. 2005 참조) 및 VWF 멀티머 분석법(Graca et al. 2019 참조)을 이용하여 측정할 수 있다. VWF에 대한 단백질 분해 활성은 예를 들어 일반적으로 활용가능한 FRETS-VWF73 기질(AnaSpec, Fremont, Ca, USA)을 이용하여, 예를 들면 실시예 2에 설명된 FRETS-VWF73 기질 분석 프로토콜에 따라 측정할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 재조합 ADAMTS13 단백질이 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대해 갖는 단백질 분해 활성의 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%의 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 갖는다. 더욱 바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13 단백질이 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대해 갖는 단백질 분해 활성의 적어도 70%의 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13보다 높은 단백질 분해활성, 즉, 야생형 ADAMTS13 단백질의 VWF에 대한 단백질 분해 활성의 100%를 초과하는 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 가질 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13 대비 자가항체의 결합이 감소한다. 여기 쓰인 "자가항체의 결합이 감소"한다는 것은 야생형 ADAMTS13 대비 본 발명의 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체로의 ADAMTS13 특이적 자가항체의 결합이 줄어드는 것 의미한다. 여기 쓰인 "감소" 또는 "줄어드는"은 결합이 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%까지 줄어드는 것을 의미한다. 이와 같이, "야생형 ADAMTS13 대비 자가항체의 결합이 감소"한다는 것은 바람직하게는 자가항체의 결합이, 예를 들어, 하기 설명될 것처럼 iTTP 환자의 혈청을 가지고 수행한 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체의 반응성으로 증명된 바와 같이, 야생형 ADAMTS13 단백질로의 결합에 비해 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 줄어드는 것을 의미한다. 상기 자가항체는 바람직하게, 그러나 이에 한정되지는 않고 엑소사이트-3 도메인에 있는 에피토프, 더욱 바람직하게는 F592, R568, R660, Y661 및/또는 Y665 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 바람직하게는 상기 자가항체는 면역 매개 혈전성 혈소판 감소 자반증(immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura, iTTP)으로 고통받는 환자의 혈청에 존재하는 자가항체이다. iTTP 환자 혈청의 자가항체에 의한 결합 감소는 예를 들어 여기 실시예에 설명된 바와 같이 iTTP 환자의 혈청을 가지고 ADAMTS13 단백질 변형체의 반응성을 측정함으로써 확인될 수 있다. 짧게 말하자면, ADAMTS13에 대한 자가항체의 결합은 ADAMTS13를 직접 표면에 고정하거나 간접적으로 ADAMTS13에 대한 단클론 또는 다클론 항체(또는 V5-태그 또는 His-태그 또는 다른 적절한 태그로)를 고정함으로써 ADAMTS13를 고정하여 측정할 수 있다. 이어서 고정된 ADAMTS13을 환자 유래 생물학적 체액, 바람직하게는 혈장 또는 혈청과 함께 배양하여 항-ADAMTS13 면역글로불린이 고정된 ADAMTS13에 결합할 수 있게 한다. 그 다음 ADAMTS13와 반응하여 고정된 환자 유래 면역글로불린을 인간 면역글로불린을 특이적으로 인식하는 결합(conjugated) 또는 표지가 붙은(labelled) 항체를 사용하여 탐지할 수 있다. 이러한 분석법의 예는 실시예 3에 나타냈다. 환자 및 정상 개체로부터의 체액 속의 항원 특이적 항체를 탐지하는 다른 방법도 문헌에 잘 설명되어 있으며 ADAMTS13에 대한 항체를 탐지하는 데 쓰일 수 있다(예컨대, Burbelo PD and O'Hanlon TP, 2014). iTTP 환자의 혈청 속 자가항체가 외래이기 때문에 본 발명의 ADAMTS13 단백질 변형체에 대한 자가항체의 결합을 여러 iTTP 환자 혈청, 예를 들어 적어도 5명의 서로 다른 iTTP 환자의 혈청 또는 혈장 시료에서 측정하는 것이 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 ADAMTS13 상에 위치한 자가항체 결합 부위와 인접하거나 결합에 기여하는 아미노산 잔기에 적어도 하나의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. 즉, 야생형 ADAMTS13 대비 ADAMTS13 상에 위치한 자가항체 결합 부위와 인접하거나 결합에 기여하는 아미노산 잔기에 적어도 하나의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 이동한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 R568, L591, V604, V605, A606, G607, K608, M609, R636, L637, P638, R639, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 R568N, L591N, V604N, V605N, A606N, G607N, K608N, M609N, R636N, L637N, P638N, R639N, Y665N, L668N 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기 돌연변이에 N-글리칸을 포함한다. 즉, 이 모둠에서 선택되는 돌연변이를 도입함으로써 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가된다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 도 1의 568, 591, 608, 609, 636, 637, 665, 668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 아미노산 위치에 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. 더욱 바람직하게는 도 1의 591, 608, 609, 636, 665, 668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 아미노산 위치에, 더욱 바람직하게는 도 1의 608, 609, 665 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 아미노산 위치에 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 568REY570에서 568NET570으로(NGLY1), 591LFT593에서 591NFT593으로(NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4), 636RLPR639에서 636NLSR639로(NGLY5), 636RLPR639에서 636RNAS639로(NGLY6), 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7), 667NLTRP671에서 667LNVTA671로(NGLY8) 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함한다. 즉, 이 모둠에서 선택되는 돌연변이를 도입함으로써 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위기 추가 및/또는 이동한다. "NGLY1", "NGLY2" 등과 같은 괄호 안의 기호는 표 1 및 표 3에 기재된 변형체를 가리킨다. 여기서 기호 "N-glyx" 및 "NGLYx"는 "N-gly1" 및 "NGLY1" 또는 "N-gly2" 및 "NGLY2" 등과 같이 서로 교환가능하게 쓰인다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 591LFT593에서 591NFT593으로 (NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로 (NGLY4), 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7) 및 667NLTRP671에서 667LNVTA671로 (NGLY8)로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로 (NGLY4) 및 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7)로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하고, 가장 바람직하게는 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3)로의 돌연변이를 포함한다. 즉 이 모둠으로부터 선택되는 돌연변이를 도입함으로써 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 이동한다. 여기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 이 변형체들은 iTTP 환자의 혈청 내에 존재하는 자가항체에 의한 결합은 아주 강력하게 줄어들지만 VWF에 대한 단백질 분해 활성은 유지됨을 보여준다.

하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 이동되는 것에 더해, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 돌연변이는 상기 단백질 변형체에서 글리고실화 부위를 도입하지 않는다. 상기 돌연변이는 바람직하게는 야생형 ADAMTS13 단백질의 아미노산 서열과 비교했을 때의 상기 단백질 변형체의 아미노산 서열에서의 돌연변이다. 예를 들어, ADAMTS13 단백질 변형체로의 자가항체의 결합을 더 줄이는 하나 이상의 돌연변이, VWF에 대한 단백질 분해 활성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 ADAMTS13 단백질 변형체의 안정성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다.

돌연변이는 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 하나 이상의 아미노산의 삭제일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가적인 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환이다. 이러한 돌연변이는 단백질 변형체 서열 전체에 걸쳐 도입될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 하나 이상의 돌연변이가, 바람직하게는 치환이, 자가항체의 표적이 되는 ADAMTS13의 여러 도메인 내의 위치에 도입될 수 있다. 더욱 바람직한 실시예에서, 도 1의 잔기 S556 내지 A685를 포함하는 스페이서 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이, 바람직하게는 치환이 도입될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체가 R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 돌연변이, 바람직하게는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 알려진 기능획득 돌연변이체에서 돌연변이된 하나 이상의 아미노산이, 즉, R568, F592, R660, Y661 및 Y665가, R660, Y661 및 Y665; 또는 R568, F592, R660 및 Y661; 또는 R568, F592, R660, Y661 및 Y665와 같이 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체에서 돌연변이될 수 있다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예 및 예를 들어 Jian et al. 2012, Pos et al. 2010 그리고 Graca et al. 2019.에서 설명되는 바와 같이, 이러한 돌연변이는 ADAMTS13의 단백질 분해 활성을 보존하거나 또는 증가시킨다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 R568A 및 Y665A를 포함한다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 L591A, R636A, L637A, 및 L668A를 포함한다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 R568A 및 Y665A; 또는 돌연변이 L591A, R636A, L637A 및 L668A를 포함한다.

또 다른 바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 R660K, R660A 또는 R660N; Y661F, Y661A 또는 Y661N; 및 Y665F, Y665A 또는 Y665N을 포함한다.

또 다른 바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 R568K, R568A 또는 R568N; F592Y, F592A 또는 F592N; R660K, R660A 또는 R660N; 및 Y661F, Y661A 또는 Y661N을 포함한다.

또 다른 바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는ADAMTS13 단백질 변형체는 돌연변이 R568K, R568A 또는 R568N; F592Y, F592A 또는 F592N; R660K, R660A 또는 R660N; Y661F, Y661A 또는 Y661N; 및 Y665F, Y665A 또는 Y665N를 포함한다.

바람직한 일 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는ADAMTS13 단백질 변형체는 도 1의 ADAMTS13 서열의 608번 아미노산 잔기에 N-글리코실화 부위를 포함하고, 바람직하게는 ADAMTS13 단백질 변형체는 607GNMSI611 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 상기 돌연변이를 더 포함한다.

본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에 도입된 돌연변이는 야생형 ADAMTS13과 비교했을 때 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위의 추가 및/또는 이동을 일으키는 돌연변이를 모두 포함하고 여기 설명된 야생형 ADAMTS13 대비 추가적인 돌연변이를 포함하는데, 바람직하게는 ADAMTS13 단백질 변형체가 야생형 ADAMTS13의 대응하는 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 포함하도록 한다. 여기 쓰인 용어 "% 서열 상동성(또는 일치)"는 아미노산 서열 중, 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 서열 상동성 퍼센티지를 얻기 위해 선택적으로 간격을 도입한 후에 기준 아미노산 서열 또는 관심있는 아미노산 서열과 일치하는 아미노산의 비율을 의미한다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자라면 한 아미노산 서열의 연속되는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 서열의 연속적인 아미노산 잔기와 비교되는 것을 잘 이해할 것이다. ADAMTS13 단백질 변형체의 전체서열에 대해서 대응하는 야생형 ADAMTS13의 서열 상동성이 계산된다. 즉 ADAMTS13의 1-685 잔기로 구성되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13의 1-685 잔기의 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 갖고; 전장 ADAMTS13 단백질 변형체는 바람직하게 야생형 ADAMTS13의 전장 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 가지며; ADAMTS13의 1-900 잔기로 구성되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13의 1-900 아미노산 잔기 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 등이다. 상기 서열 상동성은 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되고 거기에 N-연결 글리칸을 포함하거나 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하고 거기에 N-연결 글리칸을 포함하는 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체를 제공한다. 상기 단백질 변형체는 바람직하게는야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해활성을 가진다. 더욱 바람직하게는 야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%를 갖는다. 여기 쓰인 용어 "N-연결 글리칸"은 N-글리코실화 부위에서 질소 결합을 통해 단백질 또는 단백질 변형체에 연결된 탄수화물 부분을 가리킨다. 다양한 N-연결 글리칸이 존재하며, 상기 N-연결 글리칸은 여기 설명된 바와 같은 N-연결 글리코실화 부위에 붙을 수 있는 아무 글리칸이라도 가능하다. 당업자는 N-연결 글리코실화 부위에 붙을 수 있는 글리칸에 대해 잘 알고 있다. 도 2는 적당한 보편적인 여러 구조의 N-연결 글리칸을 보여준다. 바람직한 실시예에서, N-연결 글리칸은 도 2에 나타낸 N-연결 글리칸 중에서 선택되는 N-연결 글리칸이다. 여기 설명된 바와 같은 ADAMTS13 단백질 변형체로의 N-연결 글리칸의 결합은 당업계에 알려진 방법으로 달성 가능한데, N-연결 글리칸을 포함하는 당단백질을 생산할 수 있는 적당한 숙주 세포에서 상기 단백질 변형체를 재조합 생산하는 것을 포함한다. 적절한 숙주세포는 진핵 숙주세포, 특히 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, PERC.6 세포 또는 HEK293 세포와 같은 포유류 세포를 포함한다. 대안적으로, 글리코실화 형태의 시험관 내 (in vitro) 변형도 가능하다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해활성을 가진다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체는 전장 ADAMTS13 변형체, 즉 도 1의 아미노산 1-1427을 가지는 변형체이다. 바람직하게는, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체가, 상기 하나 이상의 추가된 N-연결 글리코실화 부위 및/또는 상기 하나 이상의 이동한 기 존재 N-연결 글리코실화 부위에 N-연결 글리칸을 포함하고, 야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해활성을 가진다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체가 S556 내지 A685 잔기를 포함하는 스페이서 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 포함하는데, 더욱 바람직하게는 R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 이루어지는 모둠에서 선택되는 아미노산에 돌연변이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 S556 내지 A685 잔기를 포함하는 스페이서 도메인에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되거나 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하고, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체는 야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체가 상기 하나 이상의 추가된 N-연결 글리코실화 부위에 N-연결 글리칸을 포함하고 및/또는 상기 하나 이상의 이동한 기 존재 N-연결 글리코실화 부위에 N-연결 글리칸을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체는 전장 ADAMTS13 변형체, 즉 도 1의 아미노산 1-1427을 가지는 변형체이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체가 S556 내지 A685 잔기를 포함하는 스페이서 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 포함하는데, 더욱 바람직하게는 R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되는데, 568REY570에서 568NET570으로 (NGLY1), 591LFT593에서 591NFT593로(NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4), 636RLPR639에서 636NLSR639로(NGLY5), 636RLPL639에서 636RNAS639로(NGLY6), 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7), 667NLTRP671에서 667LNVTA671로(NGLY8)의 돌연변이 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 도입함으로써, 더욱 바람직하게는 591LFT593에서 591NFT593으로(NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4), 636RLPR639에서 636NLSR639로(NGLY5)의 돌연변이로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 도입함으로써 추가된다. 바람직하게는, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체는 상기 하나 이상의 추가된 N-연결 글리코실화 부위에 N-글리칸을 포함 및/또는 상기 하나 이상의 이동한 기존재 N-연결 글리코실화 부위에 N-글리칸을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체는 전장 ADAMTS13 변형체, 즉 도 1의 아미노산 1-1427을 가지는 변형체이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체가 S556 내지 A685 잔기를 포함하는 스페이서 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 포함하는데, 더욱 바람직하게는 R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에는, 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 또는 이동되는데, 표 5에 나타낸 아미노산 서열 중 임의의 것에 N-글리코실화 부위 (NXT 또는 NXS, 여기서 X는 P가 아닌 임의의 아미노산)를 도입함으로써 또는 표 5에 나타낸 아미노산 서열 중 임의의 것에 N-글리코실화 부위를 이동함으로써 추가 또는 이동되고, 이 때, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체의 아미노산 잔기 464-466, 469-471, 476-478, 493-495, 511-513 및 539-541에는 상기 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가되지 않고, 상기 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동하지 않는다. 바람직하게는, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체는 상기 하나 이상의 추가된 N-연결 글리코실화 부위에 N-글리칸을 포함 및/또는 상기 하나 이상의 이동한 기존재 N-연결 글리코실화 부위에 N-글리칸을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체는 전장 ADAMTS13 변형체, 즉 도 1의 아미노산 1-1427을 가지는 변형체이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 변형체는 ADAMTS13의 아미노산 잔기에 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형체가 S556 내지 A685 잔기를 포함하는 스페이서 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 포함하는데, 더욱 바람직하게는 R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 더욱 바람직하게는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체에는 야생형 ADAMTS13 대비 N-연결 글리코실화 부위가 추가되는데, 591LFT593에서 591NFT593으로(NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4) 및 636RLPR639에서 636NLSR639로(NGLY5)로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 도입함으로써 추가되고, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체는 추가된 상기 N-연결 글리코실화 부위에 N-연결 글리칸을 포함하며, 상기 변형체는 R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 추가로 포함한다. 바람직하게는 상기 변형체가 R568K, R568A 또는 R568N; F592Y, F592A 또는 F592N; R660K, R660A 또는 R660N; Y661F, Y661A 또는 Y661N; 및 Y665F, Y665A 또는 Y665N 돌연변이를 추가로 포함한다.

특히 바람직한 ADAMTS13 단백질 변형체는 여기 NGLY1, NGLY2, NGLY3, NGLY4, NGLY5, NGLY6, NGLY7, NGLY8, NGLY3 + NGLY7, NGLY3 + NGLY8, NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A, NGLY3 + R568A/Y665A 및 NGLY3 + R568A/Y665A + L591A/R636A/L637A/L668A로 표시하여 설명한 변형체이다. 더욱 바람직한 변형체는 여기 NGLY2, NGLY3, NGLY4, NGLY5, NGLY7, NGLY8, NGLY3 + NGLY7, NGLY3 + NGLY8, NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A 및 NGLY3 + R568A/Y665A로 표시하여 설명하였다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 추가로 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산 서열 및 구성체는 모두 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 제조하는 것 뿐 아니라 치료적 응용에 유용하다.

여기 쓰인 "핵산"이라는 용어는 mRNA 또는 cDNA를 포함하는 DNA 및 RNA와 그것들의 합성 변형체를 지칭한다. 상기 핵산은 재조합 또는 합성 핵산일 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 구성체는 바람직하게는 발현 벡터와 같은 벡터 안에 존재한다. 발현 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다. 적절한 발현 벡터의 비제한적인 예로 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스 벡터, 비바이러스 벡터 및 유전공학적 벡터(engineered vector)를 포함한다. 비바이러스 발현 벡터는 나체(nude) DNA, 및 리포좀, 중합체, 나노입자 및 분자 결합체(molecular conjugate)와 같은 합성 또는 유전공학적 조성물에 싸인 핵산을 포함한다. 이러한 비바이러스 발현 벡터를 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 CMV 또는 SV40 프로모터와 같은 강력한 프로모터/인핸서, 리보솜 부착 부위 및 시작 코돈과 같은 적절한 전사 시작 서열, 및/또는 단백질이 진핵세포에서 발현된다면 폴리(A) 신호를 포함하는 전사 종결 서열을 포함한다. 당업자라면 사용될 발현 벡터가 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체, 바람직하게는 N-연결 글리칸 포함 단백질 변형체의 발현에 사용될 숙주세포에 따른다는 것을 이해할 것이다. 발현 벡터는 바람직하게는 진핵 숙주세포, 더욱 바람직하게는 포유류 숙주세포, 더욱 바람직하게는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, PERC.6 세포 및/또는 HEK293 세포에서의 본 발명의 핵산 분자의 발현에 적합하다.

대안적으로, 본 발명에 따라 사용되는 핵산 서열이, 외생적 프로모터와 함께 또는 없이, 특정 위치에 수용체 이식유전자(transgene)를 삽입하기 위해 CRISPR/Cas, 징크핑커 뉴클레아제, 및 전사 활성인자양 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)를 포함하는 유전자 편집 기술을 통해 개체에게 제공될 수도 있다. 바람직한 게놈 위치는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, AAVS1 자리 및 PD-1 자리를 포함한다.

본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬번트, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. "약학적으로 허용가능한" 것이란 보조제, 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 공존해야만 하며 그것의 수용자에게 해가 없는, 예를 들어 독성이 없어야 함을 의미한다. 통상, 활성 약물의 효능을 방해하지 않는 약학적으로 적합한 임의의 첨가제가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 사람용으로 적합하다.

적절한 담체의 예에는 용액, 유당, 전분, 셀룰로스 유도체 및 유사체, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 실시예에서, 상기 적절한 담체는 용액, 예를 들면 식염수이다. 예를 들어 정제와 같은 투약 단위를 만들기 위해서, 충전제, 색소, 중합체 결합제 등과 같은 전통적인 첨가제의 사용이 고려된다. 정제, 캡슐 등과 같은 것에 들어갈 수 있는 부형제의 예는 다음과 같다: 트라가칸트 검, 아카시아 검, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 미세결정 셀룰로스와 같은 부형제; 옥수수 전분, 호화(pregelatinized) 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘과 같은 활택제; 설탕, 유당, 사카린과 같은 감미제.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 적합하거나 또는 비경구 투여용으로 맞춰진다. 이러한 투여는 바람직하게는 정맥 내, 동맥 내, 피하 및/또는 근육 내 투여이다. 주사로 또는 주입으로 투여될 수 있다. 주사용 조성물, 예를 들어 정맥 주사용은, 예를 들어 등장성 완충 수용액과 같은 멸균 수용액, 유용액(oily solution), 분산액, 유액 및/또는 현탁액 내의 본 발명의 ADAMTS13 단백질 변형체를 포함하는 용액일 수 있고, 바람직하게는 수용액이다. 예를 들어 정맥 주사용 조성물은 예를 들어 가용화제, 안정제 및/또는 주사 또는 주입 부위의 통증을 덜어줄 국소 마취제를 포함할 수 있다.

치료해야 할 상황이나 원하는 효과(예를 들어 단기 효과 또는 장기 치료)에 따라 적당한 투약 방법, 즉, 용량, 투여 간격을 결정하는 것은 당업자의 능력 범위 내이다. 이 화합물과 그것의 조성물의 정확한 용량 및 투여방법은 또한 ADAMTS13 단백질 변형체의 생물학적 활성, 개체의 나이, 체중, 성별, 약물이 투여될 개체의 필요사항, 고통이나 필요의 정도와 임상의의 판단에 따른다. 적당한 용량의 예는 본 발명의 ADAMTS13 단백질 변형체 0.1 mg 내지 15 g 범위, 예를 들어 ADAMTS13 단백질 변형체 1 내지 10g 범위이다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 하나 이상의 약학적 조성물로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 키트 또는 약학적 키트 부속이 제공된다. 이런 용기와 함께 사용 설명서, 또는 약학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 정해진 양식의 공지로서 당국에 의한 인간 또는 동물 투여용 생산, 사용 또는 판매의 승인을 나타낼 수 있는 공지와 같은 여러 문서가 제공될 수 있다. 바람직하게는, 약학적 키트 또는 키트의 부속은 사용 설명서를 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 ADAMTS13 단백질 변형체는 여러 경로로 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질 변형체는, 임의의 적절한 비경구 또는 비주사적(nonparenteral) 경로, 예를 들어 경피(예: 크림, 연고, 안약) 또는 비강으로(예: 용액, 현탁액) 투여될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 관절 내, 근육 내, 정맥 내, 심실 내, 동맥 내, 척수 내, 피하, 또는 복강 내 투여를 포함할 수 있다. 정맥 내 및 피하 투여가 가장 좋다. 또한 단백질 변형체는 건강관리 전문가에 의해 병원에서 주입 또는 주사를 통해 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체는 당업계에 잘 알려지고 활용가능한 방법으로 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 당업자는 통상적으로 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명에 따른 단백질 변형체의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 어떻게 생성하고 상기 DNA 서열의 핵산분자를 어떻게 제작하고 분리할지 이해할 것이다. 핵산 분자의 서열은 적당한 숙주세포에서 발현되도록 코돈 최적화될 수 있다.

핵산 분자는 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 여기 상기 언급한 바와 같은 발현 벡터에 도입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 맥락에서 발현 벡터는, 여기 설명된 바와 같은 적당한 숙주세포에서 본 발명에 따른 단백질 변형체를 발현을 이끈다. 대안적으로, 상기 설명된 바와 같은 적절한 유전자 편집 기술을 사용하여 핵산 분자를 숙주세포의 게놈에 삽입할 수 있다. 숙주세포에서 본 발명의 핵산 분자의 발현을 보장하는 자리 또는 구역에 삽입되는 것이 바람직하다.

여기 쓰인 "숙주세포"라는 용어는 외생적 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 세포를 가리킨다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 숙주세포는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 N-연결 글리칸을 붙일 수 있다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 진핵 숙주세포이고, 더욱 바람직하게는포유류 세포, 더욱 바람직하게는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, PERC.6 세포 및 HEK293 세포로 구성되는 모둠에서 선택된다. 적당한 세포감염(transfection) 기술은 당업계에 예를 들어 Green & Sambrook., 2012. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4^th Edition, CSHL Press; Cold Spring Harbor Protocols, www.cshprotocols.cshlp.org를 통해 알려져 있다.

여기 개시된 단백질 변형체는 VWF 단백질 분해 활성을 가지고, 그래서 병적인 VWF 활성 및/또는 VWF 처리과정을 특징으로 하는 질병, 및/또는 혈전성 질병을 치료하는 데 특히 유용하다.

이와 같이, 본 발명은 ADAMTS13의 1 내지 685번 잔기를 포함하고, 거기에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체를 치료용으로 제공한다. 또한 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 이런 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체가 항혈전제로 사용되도록 제공한다. 여기 쓰인 용어 "항혈전제"는 혈전의 형성을 예방하고, 혈전의 생성을 줄이거나 늦추거나 및/또는 기존재 혈전을 부수는 화합물을 가리킨다.

본 발명은 또한 ADAMTS13의 1 내지 685번 잔기를 포함하고, 거기에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는, 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체를 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 가공과정을 특징으로 하는 질병의 치료용으로 제공한다. 또한, 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 가공과정을 특징으로 하는 질병의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 ADAMTS13의 1 내지 685번 잔기를 포함하고 거기에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 여기 쓰인 용어 "폰 빌레브란트 인자" 또는 "VWF"는 혈소판의 부착 및 응집을 매개하는 한 혈장 당단백질을 지칭한다. VWF는 내피세포 및 거핵세포(megakaryocyte)에서 합성되고, 20,000 kDa이 넘는 분자량을 가지는 긴 다량체(멀티머)이다. 혈중 VWF의 대부분은 내피세포에서 합성된다. 분비된 VWF의 대부분은 초대형 VWF (ultra-large VWF, ULVWF) 멀티머로 구성되어 있으며, 프로트롬빈성(prothrombotic)이다. 상기 설명했다시피, VWF의 프로트롬빈성 활성은 정상적인 지혈과정에서 ADAMTS13에 의한 제한적 절단을 통해 조절된다. 여기 쓰인 "병적인 VWF 활성"은 VWF 활성, 특히 VWF의 프로트롬빈성 활성이 건강한 개체에서의 VWF 활성으로부터 벗어난 것을 의미하는데, 바람직하게는 건강한 개체에서의 VWF 활성보다 증가한 것을 의미한다. 상기 벗어남 또는 증가는 특히 건강에 나쁜 영향, 즉, 질병 또는 장애를 초래하게 된다. 여기 쓰인 "병적인 VWF 가공과정"은 VWF의 가공과정이, 특히 VWF의 절단 시, 구체적으로 VWF 멀티머의 절단 시 건강한 개체에서의 VWF의 가공과정에서 벗어남, 특히 건강한 개체에서의 VWF의 가공과정에 비해 감소함을 의미한다. 당업자라면, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체가 개체의 ADAMTS13 결핍을 교정하기 위해 쓰일 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, 기본적으로 VWF 활성 또는 가공과정이 망가진 어떠한 질병이라도 여기 개시된 ADAMTS13 단백질 변형체로 치료될 수 있다. 여기 쓰인 용어 "ADAMTS13 결핍"은 지혈시 ADAMTS13가 건강한 개체에서처럼 자신의 역할(절단을 통해 VWF 멀티머 크기를 조절함)을 하지 않음을 의미한다. 이것은 ADAMTS13 단백질 값이 낮기 때문일 수도 있고, 그것의 기질인 VWF가 너무 많거나 ADAMTS13에 대한 자가항체가 존재하기 때문일 수도 있다. 바람직하게는, ADAMTS13 결핍은 개체 내의 자가항체의 존재로 인한 것이다.

바람직한 일 실시예에서, ADAMTS13의 1 내지 685번 잔기를 포함하고, 거기서 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체를, 후천성 또는 선천성 혈전 질병의 치료에 쓰이도록 제공한다. 또한, 후천성 또는 선천성 혈전 질병의 치료 방법이 제공되는데, 상기 방법은 ADAMTS13의 1 내지 685번 잔기를 포함하고 거기에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 구성체를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 ADAMTS13 단백질 변형체가 VWF를 절단하고 그럼으로써 VWF의 활성을 줄일 수 있기 때문에, VWF의 프로트롬빈성 활성이 줄어든다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 질병은 혈전성 미세혈관증(thrombotic microangiopathy)이다. 더욱 바람직하게는, 상기 질병은 혈전성 혈소판 감소 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP), 용혈성-요독 증후군(hemolytic-uremic syndrome, HUS), 허혈성 뇌졸중, 전신성 혈전증, COVID19, 항인지질 증후군, 자간전증/HELLP 증후군(pre-eclampsia/HELLP syndrome), 패혈증 및 낫모양 적혈구병(겸상 적혈구증)으로 구성되는 모둠에서 선택된다.

예를 들면 Chauhan et al. (2006)에 의해 설명된 바와 같이, ADAMTS13은 전신적인 항트롬빈 효과를 가지는 것으로 알려져 있는데, 거기서 Adamts13^-/- 마우스에서 저절로 혈전이 생김을 보여줬고, ADAMTS13이 강력한 천연 항혈전 활성을 가지며 재조합 ADAMTS13이 항혈전제로로 쓰일 수 있다고 결론 내렸다. 따라서 여기 개시된 바와 같은 ADAMTS13 단백질 변형체는 전신성 혈전증의 치료에 유용하게 쓰일 수 있다.

혈전성 미세혈관증은 혈전성 혈소판 감소 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)을 포함한다. TTP는 면역매개 TTP (iTTP) 및 선천성 TTP (cTTP) 모두를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 혈전성 미세혈관증은은 TTP이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 TTP는 iTTP이다. iTTP 및 선천성 TTP 모두에서 ADAMTS13 값이 매우 낮다. 재조합 야생형 ADAMTS13이 현재 cTTP 및 iTTP 의 치료를 위한 임상시험에서 평가되고 있다(Scully et al, 2019; Clinical Trial Identifier: NCT03922308). 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체는 따라서 iTTP 및 선천성 TTP의 치료를 위해 쓰일 수 있다. iTTP 환자 안에 존재하는 자가항체가 인간 혈장에 존재하는 것과 같은 야생형 ADAMTS13, 또는 진핵세포 발현 시스템에서 만들어진 야생형 재조합 ADAMTS13 치료의 효과를 제한한다. 자가항체 저항성 ADAMTS13 변형체가 기능하는 ADAMTS13의 값을 즉각적으로 복원할 수 있고, 그를 통해 iTTP 및 다른 혈전성 질병 환자에서 보이는 심각한 혈전 후유증을 경감시킬 수 있다.

HUS는 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 전신성 혈전성 미세혈관증(thrombotic microangiopathy, TMA) 및 신부전을 특징으로 한다. 부분적인 ADAMTS13 결핍이 HUS 환자에게서 발견될 수 있다. 따라서 여기 설명된 바와 같은 ADAMTS13 단백질 변형체가 HUS의 치료에, 특히, HUS 연관 부분적 ADAMTS13 결핍증에 유용하게 쓰일 수 있다.

혈전은 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic stroke, AIS)의 두드러진 기저 기전이다. 몇몇 연구에서 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자에서의 ADAMTS13 값이 현저히 감소함을 밝혀냈고, 급성 뇌졸중으로 고통받는 환자에서 가장 낮은 ADAMTS13 값을 보였다. Chen et al. (2019)의 리뷰에서 설명된 바와 같이, 나와 있는 증거들이 ADAMTS13가 허혈성 뇌졸중의 발생, 발달, 및 예후와 밀접하게 연관되고, 허혈성 재관류 손상으로부터 뇌를 보호함을 보여준다. VWF:ADAMTS13 비율은 뇌졸중의 위험과 강한 상관관계를 갖는다. ADAMTS13의 활성과 수치는 허혈성 뇌졸중의 발생과 예후에 대한 좋은 예측값이다. 또한, AIS의 치료에서의 ADAMTS13에 대한 동물실험에서 뚜렷한 개선이 나타났다: 재조합 ADAMTS13를 뇌졸중 발생 후 7일째에 야생형 마우스에 주사하자 신생혈관의 생성과 혈관의 복구가 늘어났고, 뇌졸중 후 14일 예후가 상당히 개선되었다. ADAMTS13가 허혈성 뇌졸중에 대한 새로운 치료약물으로 기대된다는 결론이 내려졌다. 그러므로 여기 설명된 바와 같은 ADAMTS13 단백질 변형체가 허혈성 뇌졸중의 치료에 유익하게 쓰일 수 있다.

패혈증은 응고 장애가 관찰되는 질병이고, 혈전성 미세혈관증이 그것의 일부일 수 있다. 패혈증에서의 혈전성 미세혈관증은 ADAMTS-13 값이 낮은 것과 연관이 있다. Ramsi and Al Ali (2018)는 패혈증과 관련된 혈소판 감소증-연관 다발성 장기 부전(thrombocytopenia-associated multiple-organ failure, TAMOF) 사례에 대해 설명했는데, 그것이 ADAMTS13 활성이 복원되는 혈장 교환을 통해 극적으로 개선되었고, 병리적 과정과 장기 부전은 중지되었다. 따라서 여기 설명된 바와 같은 ADAMTS13 단백질 변형체가 패혈증의 치료에, 특히 패혈증으로 고통받는 개체의 혈전성 미세혈관증의 치료에 유용하게 쓰일 수 있다.

낫 모양 적혈구병에서 ADAMTS13/VWF 비율이 낮고, 급성 흉통을 발달시킨 환자에서 ADAMTS13 활성이 낮음이 확인되었는데, ADAMTS-13 값이 양적으로 감소했고, 재조합 ADAMTS-13를 투여하면 좋은 효과를 가질 수 있음을 암시한다(Sins et al. 2017). 이는 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체가 낫 모양 적혈구병의 치료에 유익하게 쓰일 수 있음을 가리킨다.

통상 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2, SARS-CoV-2) 감염에 의한 중증 COVID19 (코로나바이러스 질병 2019)일 때 혈전이 폐 및 전신 혈관계에 영향을 미친다. Turecek et al. (2020)은 VWF 조절 프로테아제 ADAMTS13의 부분적인 감소와 함께 혈장 VWF 값이 현저히 증가함을 보여줬다. 중증 COVID-19 환자의 혈장 시료를 재조합 ADAMTS13 (rADAMTS13)와 함께 배양하자 비정상적으로 높은 VWF 활성이 상당히 줄었고, 전체 멀티머 크기가 줄고 시간 및 농도 의존적인 방식으로 UHMW VWF 멀티머가 사라져서, rADAMTS13이 COVID-19 환자에서의 지혈 균형을 회복하는 것을 돕는 치료적인 역할을 가질 수 있음을 암시한다. 이것은 이와 같이 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체가 COVID-19 및/또는 SARS-CoV-2 감염의 치료에 유용하게 쓰일 수 있음을 보여준다.

항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome) 및 자간전증(pre-eclampsia, PEcl)은, ADAMTS13 값이 감소하고 ADAMTS13 항체가 늘어나며 ADAMTS13 활성과 활성:항원 비율이 낮은 것과 연관이 있다(Bitsatze et al. 2021). 또한, 혈소판감소증과 미세혈관 용혈성 빈혈(microangiopathic hemolytic anemia, TMA)이 HELLP 증후군에서 나타났다. 그리고, Austin et al. (2008)은 ADAMTS13 자가항체 및 ADAMTS13 기능장애가 항인지질 증후군에서 생길 수 있다는 것을 보여줬다. 따라서 이것은 본 발명에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체가 항인지질 증후군 및 자간전증/HELLP 증후군의 치료에, 특히 ADAMTS13 기능장애와 연관된 항인지질 증후군 및 자간전증/HELLP 증후군의 치료에 유익하게 쓰일 수 있음을 보여준다.

여기 쓰인 "개체"라는 용어는 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 본 발명에 따른 인코딩 핵산의 수여자를 가리키며, 인간과 동물을 아우른다. 상기 개체는 바람직하게는 포유동물이고, 더욱 바람직하게는 인간이다.

여기 쓰인 용어 "치료적으로 유효한 양"은 치료할 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시키기에 충분한 ADAMTS13 단백질 변형체의 투여량을 지칭한다. 이것은 증상의 감소 또는 완화, 질병 또는 상태의 원인의 감소 또는 경감, 또는 다른 바람직한 치료적 효과일 수 있다.

여기 쓰인 용어 "치료"는 질환의 억제, 즉 질병 또는 상태의 적어도 하나의 임상 증상의 발달을 막거나 줄이는 것, 및/또는 질병이나 상태의 증상을 완화시키는 것을 의미한다.

본 발명의 실시예와 동일한 또는 다른 측면의 일부로서의 특징들이 여기서 명확함과 명료한 설명의 목적으로 설명되었다. 당업자라면 여기 설명된 것과 동일한 또는 다른 실시예의 일부로서 이러한 특징들 전부 또는 일부의 조합을 포함하는 구현예가 본 발명의 범위에 포함됨을 이해할 것이다.

본 발명은 아래의 비제한적인 실시예에서 더욱 자세히 설명될 것이다.

본 발명에 의해 자가항체 결합은 덜 되고 단백질 분해 활성은 유지하는 개선된 ADAMTS13 변형체가 제공된다.

도 1: ADAMTS13 아미노산 서열. 유니프롯 접근 번호(UniProt accession number) Q76LX8.
도 2: ADAMTS13 상에서 확인된 N-연결 글리칸 (출처: Verbij et al. 2016).

:GlcNAc,

: 만노오즈;

: 갈락토오스;

: 푸코오스;

: 시알산.
도 3: 스페이서 도메인 안 R568, F592, R660, Y661 및 Y665를 포함하는 ADAMTS13 엑소사이트-3 잔기를 보여주는 ADAMTS13 모델. 엑소사이트-3을 둘러싼 잔기 L591, R636, L637, K608 및 M609도 역시 표시되었다.
도 4: FRETS-VWF73 분석법으로 측정한 야생형 ADAMTS13 대비 ADAMTS13 변형체의 활성.
도 5: VWF 멀티머 분석법에서의 야생형 ADAMTS13 및 ADAMTS13 변형체가 VWF 를 절단하는 효능.
도 6: 야생형 ADATMS13 및 ADAMTS13 변형체의 TTP 환자의 자가항체에 대한 반응성을 보여주는 히트맵.
도 7: FRETS-VWF73로 측정한 TTP 환자 혈청 존재 하의 ADAMTS13 변형체의 활성.
도 8: 흐르는 상태에서 WT- 및 NGLY3 ADAMTS13의 단백질 분해 활성. VWF 줄의 길이를 양 시점 사이에 수동으로 측정했고, 그것의 길이가 줄어든 것을 계산했다. 결과는 각 변형체(오른쪽)에 대한 VWF 줄 크기의 감소에 기초해서 WT-ADAMTS13 (왼쪽)과 비교한 상대적인 활성으로 나타냈다. WT-ADAMTS13 및 NGLY3 변형체 모두 이 분석법에서 활성이 있는 것으로 확인되었다.
도 9a: 소위 보텍스 분석법(Zhang et al., 2007)인 난류 조건 하에서 측정한 VWF 멀티머에 대한 ADAMTS13 변형체의 단백질 분해 활성. 야생형 ADAMTS13 및 ADAMTS13 변형체에 의한 VWF 가공과정을 고분자량 멀티머의 분해로 평가했다. 레인 1, 11: VWF만; 레인 2,12: 야생형 ADAMTS13 + EDTA; 레인 3,13: 야생형 ADAMTS13; 레인 4: MDCTS 도메인 ADAMTS13 + EDTA, 레인 5: MDCTS 야생형; 레인 6: MDCTS 5xAla + EDTA; 레인 7: MDTCS 5xAla; 레인 8: ADAMTS13 5xAla + EDTA; 레인 9: ADAMTS13 5xAla; 레인 10, 20: ExpiCHO 상층액 (ADAMTS13 없이); 레인 14: NGLY3 + EDTA; 레인 15: NGLY3; 레인 16: ADAMTS13 Multi-Ala + EDTA; 레인 17: ADAMTS13 Multi-Ala; 레인 18: NGLY3 + MultiAla + EDTA; 레인 19: NGLY3 + Multi-Ala. MDCTS: 절단된 ADAMTS13 변형체 (잔기 1-685). 5xAla는 R568A/F592A/R660A/Y661A/Y665A에 해당한다. MultiAla는 L591A/R636A/L637A/L668A에 해당한다.
도 9b: 소위 보텍스 분석법(Zhang et al., 2007)인 난류 조건 하에서 측정한 VWF 멀티머에 대한 ADAMTS13 변형체의 단백질 분해 활성. 야생형 ADAMTS13 및 ADAMTS13 변형체에 의한 VWF 가공과정을 고분자량 멀티머의 분해로 평가했다. 레인 1, 11: VWF만; 레인 2,12: 야생형 ADAMTS13 + EDTA, 레인 3,13: 야생형 ADAMTS13; 레인 4: ADAMTS13 + AA + EDTA; 레인 5: ADAMTS13 + AA; 레인 6: NGLY3 + AA + EDTA; 레인 7: NGLY3 + AA; 레인 8: NGLY7 + EDTA; 레인 9: NGLY7; 레인 10, 20: ExpiCHO 상층액 (ADAMTS13 없이); 레인 14: NGLY3 + NGLY7 + EDTA; 레인 15: NGLY3 + NGLY7; 레인 16: NGLY8 + EDTA; 레인 17: NGLY8; 레인 18: NGLY3 + NGLY8 + EDTA; 레인 19: NGLY3 + NGLY8. AA는 R568A/Y665A에 해당한다.
도 10: 10μl의 환자의 혈청 또는 혈장이 있을 때 FRETS-VWF73을 기질로 하여 측정한 야생형 ADAMTS13(WT)에 대한 NGLY3 변형체의 상대적 활성. 또한 4명의 환자의 혈청(TTP-007, TTP-041, TTP-042 및 TTP-076) 20 μl를 추가하여 측정했다. 환자의 혈청 또는 혈장이 없을 때 얻어진 야생형 ADAMTS13의 활성을 100%로 설정했다. 검은 막대는 여러 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 야생형 ADAMTS13의 반응성을 나타낸다. 회색 막대는 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 NGLY3 변형체의 활성을 보여준다.
도 11: 높은 역가의 억제 항체 환자 자가항체에 대해 NGLY3가 저항성을 나타냈다. 이 도면에서 야생형 ADAMTS13을 적어도 50% 억제하는 환자의 혈청과 혈장 하위 모둠을 선택했다. 10 μl의 환자 혈청 또는 혈장의 존재 하에 FRETS-VWF73을 기질로 하여 측정한 야생형 ADAMTS13 (WT)에 대한 NGLY3 변형체의 상대적 활성을 도시하였다. 환자의 혈청 또는 혈장이 없을 때 얻어진 야생형 ADAMTS13의 활성을 100%로 설정했다. 검은 막대는 여러 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 야생형 ADAMTS13의 반응성을 나타낸다. 회색 막대는 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 NGLY3 변형체의 활성을 보여준다. 별표는 야생형 ADAMTS13 대비 NGLY3가 적어도 5배 이상 활성을 보인 환자 시료를 가리킨다.
도 12: 두 명의 높은 역가를 가진 억제 항체 환자 유래 혈장에서 NGLY3, NGLY7, NGLY3+NGLY6, NGLY8, NGLY3+8가 자가항체에 저항성을 나타냈다. 이 도면에서 야생형 ADAMTS13를 적어도 95% 억제하는 두 환자의 혈장을 선택했다. 10 μl의 환자 혈청 또는 혈장의 존재 하에 FRETS-VWF73을 기질로 하여 측정한 야생형 ADAMTS13 (WT) 대비 NGLY3, NGLY7, NGLY3+NGLY7, NGLY8, NGLY3+8 변형체의 상대적 활성을 도시했다. 환자의 혈청 또는 혈장이 없을 때 얻어진 야생형 ADAMTS13의 활성을 100%로 설정했다.
도 13: 10 μl의 환자 혈청 또는 혈장의 존재 하에 FRETS-VWF73을 기질로 하여 측정한 NGLY3+NGLY7 변형체의 야생형 ADAMTS13 (WT) 대비 상대적 활성. 총 23명의 환자 시료에서 분석했다. 환자의 혈청 또는 혈장이 없을 때 얻어진 야생형 ADAMTS13의 활성을 100%로 설정했다. 검은 막대는 여러 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 야생형 ADAMTS13의 반응성을 나타낸다. 회색 막대는 환자의 혈장 및 혈청이 존재할 때의 NGLY3+NGLY7 변형체의 활성을 보여준다.
도 14: 강력한 억제 항체를 갖는 환자 시료에서 NGLY3, NGLY3+Multi-Ala, NGLY3+AA의 자가항체 저항성이 관찰되었다. 10 μl의 환자 혈청 또는 혈장의 존재 하에 FRETS-VWF73을 기질로 하여 측정한 NGLY3, NGLY3+Multi-Ala, NGLY3-AA 변형체의 야생형 ADAMTS13 (WT) 대비 상대적 활성이 도시되었다. 환자의 혈청 또는 혈장이 없을 때 얻어진 야생형 ADAMTS13의 활성을 100%로 설정했다. NGLY3+MultiAla는 L591A/R636A/L637A/L668A와 조합된 NGLY3에 해당하고; NGLY3+AA는 R568A/Y665A와 조합된 NGLY3에 해당한다.
도 15: N-글리칸 변형된 ADAMTS13의 질량분석법에 의한 확인.

실시예 1: ADAMTS13 N-글리칸 변형체의 설계

면역성 TTP(iTTP) 환자에서 발달되는 자가항체는 자주 R568, F592, R660, Y661 및 Y665 잔기로 구성되는 스페이서 도메인의 면역우세(immunodominant) 구역을 표적으로 한다(도 3 참조). 이전 연구에서 본 발명자들은 보존적(Y↔F), 반-보존적(Y/F↔L), 비보존적(Y/F→N, N-글리코실화 추정 부위의 추가 없음) 또는 알라닌 치환(Y/F/R→A)을 포함하는 많은 수의 ADAMTS13 변형체를 만들었다. F568, R592, R660, Y661 및 Y665가 모두 보존적 잔기로 치환된 이전의 기능 획득 변형체도 포함한다(RFRYY→KYKFF)(Graca et al., 2019). 결과로 나온 변형체 패널의 iTTP 환자 18명의 혈청에 존재하는 자가항체에 대한 반응성을 시험했다. 우리의 결과는 스페이서 도메인 내의 비보존적 또는 알라닌 돌연변이가 자가항체의 결합을 강력하게 줄이는 데 비해 반-보존적 및 보존적 돌연변이를 포함하는 ADAMTS13 스페이서 도메인 변형체의 자가항체와의 결합은 비보존적 변형체와 비교할 때 덜 강력하게 영향받음을 보여줬다(Graca et al., 2019). 잔기 R568, F592, R660, Y661 및 Y665는 ADAMTS13의 최적의 VWF 절단 활성을 위해 필수적이다(Pos et al., 2010; Jian et al., 2012). 이런 자료와 함께 하여, 우리는 비보존적 또는 알라닌 치환이 활성을 잃게 하지만 반면에 보존적 및 반-보존적 치환은 더 많은 잔류의 또는 심지어 정상적인 활성을 보존하는 경향이 있음을 관찰했다. 우리의 결과를 종합하면, 환자의 자가항체 결합에 대한 저항성과 단백질 분해 활성 사이에서 "거래(trade-off)" 해야함을 암시한다. 이 연구의 결과는 상당한 단백질 분해 활성을 유지하는 자가항체 저항성 ADAMTS13 변형체의 설계가 R568, F592, R660, Y661 및 Y665 잔기, 특히 F592, R660 및 Y661의 조합의 전체적인 치환을 통해서는 불가능하다는 것을 가리킨다(Graca et al., 2019). 따라서, 우리는 잔기 R568, F592, R660, Y661 및 Y665 자체를 바꾸지 않아 접히지 않은 VWF A2 도메인이 ADAMTS13 스페이서 도메인의 이 구역에 결합할 수 있도록 하는 혁신적인 접근법을 택했다(Pos et al., 2010; Crawley et al., 2011; Ercig et al., 2018a). 지금까지 이용가능한 자료들에 기초해서 우리는 접히지 않은 A2 도메인의 E1660-R1668 잔기가 스페이서 도메인 내의 R568, F592, R660, Y661 및 Y665 잔기를 포함하는 ADAMTS13 엑소사이트-3(도 3)에 결합하는 모델을 구성했다. 이 모델에 기초해서, 우리는 선택적으로 스페이서 도메인 내에 N-글리칸 부착을 위한 공통 부위(NXS 또는 NXT)를 도입함으로써 추가적인 N-글리칸을 삽입하기 위한, 스페이서 도메인 내의 ADAMTS13 엑소사이트-3 바로 안 또는 주변 잔기 몇 개를 골랐다. 도 3에 나타낸 모델에 기초해서 N-글리칸을 아미노산 위치 568 (NGLY1), 591 (NGLY2), 608 (NGLY3), 609 (NGLY4), 636 (NGLY5) 및 637 (NGLY6)에 삽입했다. 이 부위에 N-글리칸을 삽입하기 위한 아미노산 치환은 표 1에 나타냈다.

실시예 1에서 생성된 전장 ADAMTS13 NGLY 변형체 목록

돌연변이	원 서열	돌연변이 서열
NGLY1	567A REY V571	567A NET V571
NGLY2	590P LFT H594	590P NFT H594
NGLY3	607G KMS I611	607G NMS I611
NGLY4	608K MSI S612	608K NST S612
NGLY5	635D RLP R639	635D NLS R639
NGLY6	636R LPR L640	636R NAS L640

실시예 2: N-글리칸 변형체의 발현 및 기능적 특징

표 1에 기술된 N-글리칸 변형체를 QMCF 기술(유럽특허 EP1851319B1; www.icosagen.com에 설명됨)을 이용하여 CHO 세포에서 발현시켰다. 전장 야생형 ADAMTS13 (아미노산 1427개), 및 R568A/F592A/R660A/Y661A/Y665A(ADAMTS13-AAAAA로 부름) 치환을 포함하는 전장 ADAMTS13 변형체를 대조군으로 사용했다. 스페이서 도메인 뒤로 자른 야생형 ADAMTS13 변형체(아미노산 서열 1-685 포함)를 추가적인 대조군으로 사용했다. 이 ADAMTS13 변형체는 MDTCS로 부른다. MDCTS R568A/F592A/R660/Y661A/Y665A 치환이 있는 추가적인 MDCTS 변형체 또한 우리 연구의 대조군으로 사용했다. 이 변형체는 MDTCS-AAAAA로 부른다. 이 구성체는 예전에 설명된 바 있고 모두 플라스미드 발현 벡터 pQMCF3 (Icosagen Cell Factory OU)에서 복제했다(Graca et al., 2019). 모든 cDNAs는 6xHis-태그가 이어져있는 카르복시 말단 V5 에피토프를 포함했다(Graca et al., 2019).

NGLY 변형체는 다음과 같이 구성되었다: NGLY 치환이 도입될 잔기 M509 내지 W688를 인코딩하는 합성 DNA 단편(540 bp)을 설계했고 제네위즈사(Genewiz) (Leipzig, Germany)에 주문했다. 상기 합성 단편은 5' 말단 측부(flank)로 XmaI 부위가, 3' 말단 측부로 HindIII 부위가 있다. 상기 XmaI 부위는 야생형 ADAMTS13 cDNA 서열에 원래 있는 것이다. HindIII 부위는 Q684(CAG에서 CAA로) 및 A685(GCC에서 GCT로)를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 잠재돌연변이(silent mutations) 시킴으로써 도입되었고, 결과적으로 5'-CAGGCCT-3' 에서 5'-CAAGCTT-3'로 전체적인 변화가 일어났다. 플라스미드 pUC57_mut1.1을 맞춤 설계했고, 제네위즈사(Genewiz) (Leipzig, Germany)에서 구했다. 이 플라스미드에서는 F494부터 C908까지 코딩하는 더 큰 ADAMTS13 단편(1245 bp)을 복제했고, 원 부위인 PagI 를 5' 말단 측부로 그리고 Esp3I 를 3'말단 측부로 만들었다. pUC57_mut1.1에서, L621을 인코딩하는 뉴클레오타이드의 잠재돌연변이로써(CTG에서 CTC로) 추가적인 인공 XhoI 부위가 도입되어, 전체적으로 5'-CTGGAG-3'에서 5'CTCGAG-3'로 바뀌었다(Graca et al, 2019). NGLY1 내지 NGLY6를 인코딩하는 합성 DNA 단편(540bp)을 pUC57_mut1.1에서 대응하는 XmaI-HindIII 단편을 대체하기 위해 처음으로 사용했고, 거기서 그것들이 pUC57_NGLY1 - 6을 생성하도록 개별적으로 끼워졌다. 그 다음, 각 pUC57_NGLY에 원래의 PagI-Esp3I가 측부인 더 큰 1245bp 단편을 pQMCF3의 각 야생형 ADAMTS13 단편을 대체하기 위해 사용했다. 결과로 만들어진 pQMCF3_ADAMTS13-NGLY1~6 변형체를 이어서 예전에 설명된 바와 같이 CHO 세포에 발현시켰다(Graca et al, 2019). 트랜스펙션 후 10-12일에 상층액을 모으고, 원심분리하여 정제 후 추가 사용시까지 -30°C에서 보관했다.

배양 상층액 내의 ADAMTS13 값을 이전에 확립된 분석법을 사용하여 ELISA로 정량했다(Alwan et al., 2017; Graca et al., 2019). 여러 단백질에 대한 ADAMTS13 항원값을 측정했고, 약 1.0-2.5 μg/ml 범위였으며(표 2 참조), 배양 상층액의 야생형 ADAMTS13의 값과 유사했다. 이전 결과와 동일하게 MDCTS 및 MDCTS-AAAAA가 높은 값으로 발현했다(표 2). 이 자료는 트랜스펙션된 CHO 세포에서 ADAMTS13-NGLY1-6가 야생형 ADAMTS13과 비슷한 수준으로 분비된다는 것을 보여준다.

ADAMTS13 NGLY 변형체 및 대조군의 항원값

변형체	항원값 (μg/mL)
전장 ADAMTS13 야생형	1.44
전장 AAAAA	1.22
MDTCS (야생형)	12.94
MDTCS-AAAAA	10.78
NGLY1	1.83
NGLY2	2.36
NGLY3	2.33
NGLY4	2.21
NGLY5	2.31
NGLY6	1.88

우리는 또한 VWF의 A2 도메인 Tyr1605-Met1606의 잘라지는 결합(scissile bond)을 가지고 있는, ADAMTS13 활성 측정을 위해 사용되는 최소 펩타이드 대표체인 FRETS-VWF73로 명명된 저분자 플루오로젠 기질을 처리하는 여러 가지 ADAMTS13-NGLY 변형체의 효능을 시험했다(Kokame et al., 2005 참조). ADAMTS13 NGLY 변형체를 1.05 nM (0.2 μg/ml) 농도로 포함하는 희석된 배양 상층액을 이 분석을 위해 사용했다. 우선 ADAMTS13을 20 mM HEPES, 20 mM Bis-Tris, 20 mM Tris-HCl, 25 mM CaCl₂ (pH 6.0)로 구성되고 0.005% Tween20가 추가된 활성 완충액에 희석하여 100 μl 부피 안에서 2.10 nM가 되게 했다. 그 다음, FRETS-VWF73 기질을 추가해서(100 μl, 4 μM), ADAMTS13을 1.05 nM까지 더 희석하고 반응을 시작시켰다. 병행해서, 0.13125 - 2.10 nM의 농도 범위로 희석한 야생형 ADAMTS13를 사용하여 유사한 방식으로 표준화곡선을 그렸다. 활성값을 내삽(interpolate)하고 100%로 설정한 최종 농도 1.05 nM의 야생형 ADAMTS13의 것과 비교했다. 이 분석의 결과는 도 4에 나타냈다. NGLY6는 야생형 ADAMTS13에 비해 줄어든 활성을 보였다. NGLY5의 활성은 야생형 ADAMTS13과 비교했을 때 약간 줄었다. NGLY 1, 2, 3 및 4의 효능은 야생형 ADAMTS13과 비슷하거나 높았다(도 4).

이어서, 우리는 ADAMTS13-NGLY1-6 변형체의 활성을 이전에 설명된 바와 같이 추가적인 생리적 VWF 멀티머 분석으로 시험했다(Graca et al., 2019 참조). ADAMTS13 변형체를 20 mM Bis-Tris, 20 mM Tris-HCl, 20 mM HEPES, 25 mM CaCl2 (pH 7.5), 0.005% Tween20로 구성되고 2% 소혈청 알부민 분획 V (Merck)가 보충된 활성화 완충액에서 0.2 μg의 농도로 37°C에서 30분간 배양했다(ADAMTS13 = 3.8 nM). 병행하여, HEK293 세포에서 생산된 인간 재조합 VWF를 3 M 요소와 함께 최종 농도 80 nM로 37°C에서 30분간 배양했다. 변성된 재조합 VWF 멀티머를 그 다음 ADAMTS13 함유 혼합액에 1 대 1 비율로 넣었다(최종 ADAMTS13 = 1.9 nM; 최종 VWF = 40 nM). 이 조건에서 VWF를 절단하는 효능은, 젤의 상단에서 고분자량(HMW) 멀티머가 사라지고 위성 밴드가 나타나며, 젤의 하단에 잘려진 산물이 쌓인 높은 강도의 밴드를 통해 시각화되었다. 여러 ADAMTS13-NGLY1-6 변형체가 VWF를 가공하는 효능을 측정하기 위해 시료를 모으고 0분, 30분 및 24시에 부하 완충액 (조성: 요소 9.6 M, 4% SDS m/v, Tris-base 0.035 M, EDTA 25 mM, 브로모페놀블루 7.5 μM, pH 조절 안 함)으로 반응을 종료시켰다. 결과는 도 5에 나타냈다. 이 실험 조건 하에서, NGLY2 및 NGLY5의 VWF 가공처리 활성은 줄어든 것이 관찰되었지만 NGLY3 및 NGLY4의 가공처리 활성은 야생형 ADAMTS13의 것과 유사했다(도 5).

종합하면, 이 결과들은 NGLY2, 3, 4 및 5가 멀티머 및 FRETSVWF73 분석에서 활성을 보였다는 것을 나타낸다.

실시예 3: ADAMTS13 NGLY 변형체에 대한 TTP 환자 유래의 병적인 자가항체의 결합

iTTP 환자들로부터 모은 시료 내에 존재하는 자가 항체의 결합. iTTP 환자들의 13개의 시료 패널(미세혈관 혈전증 연구 센터(Centre de Reference des Microangiopathies Thrombotiques, CNR-MAT)(AP-HP, Paris France)의 폴 코포(Paul Coppo) 교수와 아그네스 베이라디에(Agnes Veyradier) 교수로부터 감사히 제공받음)의 결합을 평가하기 위해 기 개발된 ELISA를 사용했다. 환자 유래 자가항체의 평가를 위한 프로토콜은 예전에 공개되었다(Graca et al., 2019 참조). 1 μg/ml 농도의 100 μl의 단클론 항체 3H9(벨기에 KU 뢰번(Leuven)의 반호렐베케(Vanhoorelbeke) 교수로부터 감사히 제공받음)로 플레이트를 밤새 코팅했다. 그 다음 2% BSA를 보충한 인산 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 막았다. 1.05 nmol/웰(전장 ADAMTS13은 200 ng/웰, 그리고 MDTCS 변형체는 78.75 ng/웰)의 ADAMTS13과 함께 플레이트를 배양했다. 이어서, 100 μl의 각 환자 시료의 여러 희석액으로 각 ADAMTS13 변형체와의 반응성을 시험했다. 그리고나서, 고정한 ADAMTS13 변형체에 대한 환자 IgG의 결합을 평가하기 위해 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 표적으로 하는, 겨자무과산화효소가 결합되고 1:10000으로 희석된 단클론 항체액 100 μl(Sanquin, The Netherlands)을 기본적으로 예전에 설명된 바와 같이 배양했다(Graca et al., 2019 참조). 환자 시료에 존재하는 항-ADAMTS13 항체의 양과 결합력에 따라 30x부터 400x까지의 범위로 희석된 여러 환자 시료가 사용되었다. 환자 시료는 450 nm 에서 1.6의 최적 표적 광학농도를 맞추도록 희석되었다(540 nm를 기준으로 삼음). 분석 간 잠재적인 변이를 교정하기 위해, 이전에 설명된 바와 같이 데이터 내삽(interpolation)을 위해 인간 단클론 항-ADAMTS13 항체 II-1의 희석곡선을 모든 실험에 포함시켰다(Graca et al., 2019 참조). 각 환자 시료 내 자가항체의 ADAMTS13 NGLY-변형체와의 반응성을 야생형 ADAMTS13에서 관찰된 반응성과 비교했다. 환자 자가항체의 결합은 야생형 ADAMTS13에 대한 환자 자가항체의 결합에 대한 퍼센티지로 나타냈다. 이 분석의 결과는 도 6에 나타냈다. 100%로 설정한 야생형 ADAMTS13와의 반응성을 기준으로 하여 환자 시료에 존재하는 자가항체와의 반응성을 히트맵으로 표현했다. 우리는 또한 절단 MDTCS 변형체들과 여러 환자 시료의 반응성을 측정했다. 13개의 시료 중 3개에서(TTP-049, TTP-080 및 TTP-085) 야생형 ADAMTS13에 비해 낮은 신호를 보였다. 이 결과는 근위의 TSP2-8 및 CUB1/2 도메인을 향하는 항체 또한 이 시료들 안에 있다는 것을 가리킨다. ADAMTS13-AAAAA와는 반응성이 강력하게 줄었음이 관찰되었고 녹색 코드로 표시했다. 13개의 환자 시료 중 10개에 존재하는 자가항체는 ADAMTS13-AAAAA에 결합하지 않았다. ADAMTS13-AAAAA에 결합하는 것이 관찰된 나머지가 TTP-049, TTP-080 및 TTP-085이다. MDTCS-AAAAA에 대한 환자 시료 안의 자가항체의 반응성은 13명의 환자 중 9명의 것에서 강력하게 줄었다. 환자 4명의 시료(TTP-017, TTP-042, TTP-079 및 TTP-080)에서는 MDTCS에 대한 결합력이 남았음이 여전히 관찰되었다(도 6; 레인 MDTCS AAAAA). 종합하면, 이 결과들은 본 연구에 포함된 환자 시료 대부분에서 자가항체가 스페이서 도메인 내의 R568, F592, R660, Y661 및 Y665로 이루어진 면역우세 에피토프의 잔기를 표적으로 한다는 것을 가리킨다. 우리는 이어서 ADAMTS13 NGLY1-6로 우리 환자 항체 패널에 존재하는 자가항체의 반응성을 확인했다(도 6). NGLY1, NGLY2 및 NGLY5에 대해서는 결합이 살짝 줄어든 것이 관찰되었다. NGLY4 및 NGLY6에 대해 좀 더 두드러진 결합 감소가 보였다. 흥미롭게도, NGLY3에 대해서는 13명 중 11명의 시료에서 자가항체의 결합이 강력하게 줄어들었다. 환자 시료 TTP-079 및 TTP-085에 있는 자가항체는 여전히 NLGY3와 강력하게 반응했다. 이것은 ADAMTS13의 스페이서 도메인 바깥에 결합하는 자가항체의 존재 때문인 것 같다. 대부분의 환자 유래 자가항체가 NGLY3와 반응하지 않는 것은 608 아미노산 위치에 도입한 N-연결 글리칸이 ADAMTS13 스페이서 도메인 내 면역우세 B 세포 에피토프에 대한 자가항체의 결합을 막는 것을 가리킨다.

실시예 4: iTTP 환자 유래 병적인 자가항체의 존재 하에서 ADAMTS13 N-글리칸 변형체가 활성을 보유함

실시예 2에서 우리는, NGLY2, NGLY3, NGLY4 및 NGLY5가 저분자 펩타이드 기질 FRETS-VWF73은 물론이고 VWF 멀티머를 단백질 분해 가공처리할 수 있음을 보여주었다. 실시예 3에서 우리는, NGLY3이 iTTP 환자의 시료에 있는 병적인 자가항체에 의해 잘 인식되지 않음을 보여주었다. 이것은 우리가 iTTP 환자 유래 혈장 시료가 있을 때 NGLY3가 여전히 FRETS-VWF73를 가공처리할 수 있는지 평가하도록 이끌었다. 이것을 시험하기 위해서 우리는 도 7에 표시한 데이터에 기초하여 2개의 환자 시료를 택했다: NGLY3와 제한된 반응성을 보인 시료 TTP-008; 및 NGLY3와 여전히 98%의 반응성을 보인 시료 TTP-085(ADAMTS13의 TSP2-8 및/또는 CUB1/2 도메인의 카르복시 말단을 표적으로 하는 자가항체 때문인 듯함). NGLY3가 이 자가항체들이 있을 때도 활성을 보유하는지 확인하기 위해 우리는 실시예 2에 설명된 바와 같이 FRETS-VWF73 분석을 이용하여 활성을 평가했고, FRETS-VWF73 기질을 넣기 전에 ADAMTS13 변형체(2.10 nM)를 각각 10 μl의 환자 시료 또는 PBS의 존재 하에 30분간 37 °C에서 배양했다. 최종 부피 210 μl 중에서 10 μl는 첨가된 환자 혈장 또는 PBS(대조군)였다. 환자 시료가 없을 때 배양한 야생형 ADAMTS13 1.05 nM의 활성값을 100%로 설정했다. 이 실험의 결과는 도 7에 나타냈다. 시료 TTP-008와 함께 야생형 ADAMTS13을 배양하자 50%까지 활성이 줄었다. 시료 TTP-085와 함께 야생형 ADAMTS13를 배양하자 75%까지 활성 감소가 일어났다. 이 결과는 시료 TTP-008 및 TTP-085에 존재하는 자가항체가 ADAMTS13의 가공처리 활성을 억제할 수 있음을 보여준다. 그 다음 우리는 이 시료가 NGLY3 변형체의 활성 또한 억제할 수 있는지 평가했다. TTP-008 및 TTP-085와 함께 배양하자 두 개에 대한 효능이 125%에서 75%까지 활성이 줄어들었다(도 7).

우리는 여러 유속 또는 전단율(shear rate)에서 NGLY3가 VWF를 가공처리하는 효능을 추가분석했다. 첫 번째로, 우리는 내피 세포 표면 상에서 흐름이 있을 때 NGLY3가 VWF 줄기를 처리하는 능력을 평가했다. 심기 전에 1% 젤라틴으로 코팅한 이비디 μ-슬라이드 VI 관(Ibidi μ-Slide VI channel)에서 내피세포를 키웠다. 관 당 50,000개의 HUVEC (Promocell, passage 3) 세포를 심었다. 관 배지는 하루 두 번 혼합 보충제(Supplement Mix)(2% v/v) (Promocell) 및 페니실린/스트렙토마이신(1% v/v) (Sigma)이 들어간 EGM-18 배지(Promocell)로 갈아주었다. 공배양(confluency) 후 4일 째에 측정했다. 약 2.5 dynes/cm²의 전단응력에 해당하는 2 mL/min의 유속으로 유체 실험을 했다. 측정 전에, 세포를 0.2% BSA로 보충한 M199 배지(Gibco)로 5분간 절식(starve)시켰다. 이어서, 세포를 0.2% BSA로 보충한 M199 배지에서 100 μM 의 히스타민으로 10분간 자극했다. 그런 다음, AlexaFluor-488로 표지한 항-VWF 다클론항체(DAKO)를 사용하여 1:2000으로 희석하여 VWF 줄기를 5분간 염색했다. ADAMTS13 변형체를 0.2% BSA를 보충한 M199 배지에 최종 농도 0.1 μg/mL가 되도록 희석했다. ADAMTS13 함유 배지를 세포 위에 10분간 흘렸고, 그동안 3개의 분리된 지점에서 자이스 악시오 옵저버(Zeiss Axio Observer) Z1 현미경을 사용하여 10초 간격으로 사진찍었다. 각 지점의 첫 번째 및 마지막 사진을 ImageJ로 분석했다. 각 VWF 줄기의 길이를 수동으로 쟀고, 단백질의 활성을 판정하기 위해 ADAMTS13 배양 전과 후의 전체 길이 차이를 이용했다. 대조군으로는, 아무런 ADAMTS13을 생산하지 않는 ExpiCHO와 접촉한 배지를 사용했다(도 8).

우리는 또한 소위 보텍스 분석법을 활용하여 난류가 있을 때 NGLY3가 VWF 멀티머를 처리하는 능력을 평가했다(Zhang et al., 2007 참조). 40 nM의 VWF를 25 mM CaCl₂; 20 mM Bis-Tris; 20 mM HEPES; 20 mM Tris-HCl; 트윈 20 0.005% v/v;로 구성되고 pH 7.5인 반응 완충액에서(반응 최종 부피 = 200 μL) 3000 rpm의 난류 하에 30분간 1.0 ug/ml의 recADAMTS13와 함께 배양하니 시료로부터 고분자량 멀티머가 사라졌다(도 9a: 레인 3, 13). 50 mM EDTA를 넣어 야생형 ADAMTS13에 의한 고분자량 멀티머의 절단을 막았다(도 9a; 레인 2, 128). 그 뒤에 우리는 이 보텍스 분석법을 사용하여 난류 하에서 NGLY3가 VWF 멀티머를 처리하는 능력을 평가했다. 야생형 ADAMTS13과 유사하게 NGLY3가 난류 하에서 VWF 멀티머를 효율적으로 처리할 수 있었다(도 9a: 레인 15). 야생형 ADAMTS13과 유사하게 50 mM EDTA를 넣자 VWF 멀티머가 NGLY3에 의해 처리되는 것이 중단되었다(도 9a: 레인 14). 이 결과들을 종합해보면, 여러 조건 하에서 NGLY3가 VWF 기질을 절단하는 효능이 야생형 ADAMTS13의 것과 동일하다는 것을 보여준다.

이 결과들은 ADAMTS13을 표적으로 하는 자가항체의 존재 하에도 NGLY3 변형체가 상당한 단백질 분해 활성을 유지함을 보여준다.

그 다음 우리는 28명의 환자 혈장으로 확장한 패널에 대해 NGLY3 변형체를 시험했다(도 10). 전체적으로, NGLY3 변형체는 분석한 28명의 환자 시료 중 18개에서 더 활성이 있었다. 저역가의 억제항체를 가지는 제한된 수의 환자 시료에서 NGLY3가 야생형 ADAMTS13에 비해 약간 더 활성이 높은 걸로 보였다. 8명의 환자 시료에서 NGLY3에 대한 억제 수준이 야생형 ADAMTS13에 대해 관찰된 것과 유사했다. 이 환자 시료 중 2개에서, NGLY3가 더 활성이 좋은, 작지만 뚜렷하게 의미있는 차이가 있었다. 중요한 것은, 야생형 ADAMTS13와 비교했을 때 NGLY3 변형체가 늘 더, 또는 동일하게 효과가 있었다는 것이다.

우리는 높은 역가의 억제항체를 가지는 혈장 시료 하위세트 분석을 수행했다. 고역가 억제항체는 야생형 ADAMTS13을 적어도 50% 저해하는 억제항체 값으로 정의했다(도 11). 선택된 17명의 환자 시료 중 13개의 시료에서 야생형 ADAMTS13와 비교했을 때 NGLY3 변형체가 더 뛰어났다. 네 환자의 시료에서는 야생형 ADAMTS13와 비교했을 때 NGLY3 변형체가 비슷하게 효과가 있었다. 뚜렷하게, 17명 환자 중 7명의 시료에서는 야생형 ADAMTS13와 비교했을 때 NGLY3 변형체가 5배 이상 더 효과를 보였다(도 11: 해당 시료는 별표로 표시함).

이러한 관찰결과는 재조합 형태든 혈장 유래 ADAMTS13이든 야생형 ADAMTS13를 투여했을 때에 비해, "글리칸 차폐" ADAMTS13 변형체를 치료를 위해 투여하는 것이 순수한 형태로 투여하든 또는 혈장 교환을 통해 투여하든 iTTP 환자의 치료를 위한 더 효율적인 치료 방법일 수 있음을 암시한다.

실시예 5: 확대된 패널에서의 N-글리칸 변형체의 자가항체 저항성

도 6에 나타낸 히트맵에서 확인되는 바와 같이, 실시예 3에서 NGLY3은 환자들의 자가항체와 덜 반응했다. 또한, 도 7과 실시예 4에 나타낸 바와 같이 NGLY3은 자가항체가 있을 때 단백질 분해 활성을 유지한다. 이 실시예에서 본 발명자들은 추가적으로 자연적으로 N667에 붙은 N-글리칸을 Y665로 이동시킨 NGLY-변형체(NGLY7) 또는 L668로 이동시킨 NGLY-변형체(NGLY8)를 보여준다. 하나 이상의 N-글리칸 변형체의 조합이 더 효과적일 수 있다. 그래서 우리는 NGLY3과 NGLY7의 조합과 NGLY3과 NGLY8의 조합을 설계했다(표 3 참조). 이 변형체들은 실시예 1에 설명된 바와 같은 방식으로 만들어졌다.

적어도 하나의 새로 도입되거나 이동한 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸 차폐 ADAMTS13 변형체에 추가로 병적인 자가항체의 결합을 줄이는 개별적인 아미노산 치환을 결합할 수 있다. 따라서, 우리는 NGLY3에 알라닌 돌연변이(대부분 엑소사이트-3 바깥에)를 조합하고 엑소사이트-3 주변에 다른 NGLY 변형을 추가하는 조합을 만드는 것을 목표로 했다(표 3). 이 구역에 다른 잠재적인 N-글리코실화 서열이 없기 때문에, 우리는 ADAMTS13 스페이서 도메인에 자연적으로 존재하는 N-글리칸, 즉 N667에 존재하는 N-글리칸을 양 방향으로(N- 또는 C-말단) 1-2 잔기씩 이동시키는 전략을 찾았다.

추가적인 돌연변이를 갖는 ADAMTS13 NGLY3 변형체

돌연변이	원 서열	돌연변이 서열
NGLY3	607GKMSI611	607GNMSI611
NGLY7 (글리칸이 N667에서 Y665로 이동)	664EYGNLT669	664ENVTLT669
NGLY8 (글리칸이 N667에서 L668로 이동)	667NLTRP671	667LNVTA671
NGLY3 + NGLY7	607GKMSI611 / 664EYGNLT669	607GNMSI611 / 664ENVTLT669
NGLY3+ NGLY8	607GKMSI611 /667NLTRP671	607GNMSI611 / 667LNVTA671
NGLY3 + L591A/R636A/L637A/ L668A	607GKMSI611 + L591,R636,L637,L668	607GNMSI611 + 591A, 636A, 637A, 668A
NGLY3 + R568A/Y665A	607GKMSI611 + R568, Y665	607GNMSI611 + 568A, 665A
NGLY3 + R568A/Y665A + L591A/R636A/L637A/ L668A	607GKMSI611 + R568, L591, R636, L637, Y665, L668	607GNMSI611 + 568A, 591A, 636A, 637A, 665A, 668A

이 변형체들은 실시예 1에 설명된 바와 같이 설계되었다. 새로운 NGLY 변형체가 도입된 잔기 M509 내지 W688를 인코딩하는 합성 DNA 단편 (540 bp)을 설계했고 제네위즈사(Leipzig, Germany)에 주문했다. 이 합성 단편은 단편의 5' 말단 측부로 XmaI 부위가, 3' 말단 측부로 HindIII 부위가 있다. 이 합성 DNA를 먼저 플라스미드 pUC57_mut1.1의 XmaI-HindIII 부위로 복제시켰고(실시예 1 참조), PagI-Esp3I 측부가 있는 더 큰 단편에 심었다. 그 다음 이 큰 단편을 pcDNA3.1ADAMTS13에 존재하는 야생형 ADAMTS13의 대응 단편을 대체하기 위해 사용했다.

결과로 만들어진 NGLY-변형체를 제조사(Thermo Fisher Scientific)의 설명서에 따라 Expi-CHO 세포에서 발현시켰다. 트랜스펙션 4일 후 상층액을 거둬서 원심분리로 정제한 후 10 mM 벤자미딘을 넣고 추후 사용을 위해 -30°C로 보관했다.

배양 상층액의 ADAMTS13 값을 기존에 확립된 분석법을 사용하여 ELISA로 정량했다(Alwan et al., 2017; Graca et al., 2019). ADAMTS13 항원값은 1.43 내지 5.27 μg/ml 범위였다(표 4).

그 다음 우리는 FRETS-VWF73 플루오로젠 기질을 사용해서 새로운 NGLY 변형체의 활성을 측정했다(표 4). NGLY7은 야생형과 비교했을 때 125%의 활성을 가졌고, NGLY8은 야생형 ADAMTS13 대비 활성이 75%였다. NGLY3 + NGLY7은 야생형과 비교했을 때 125%의 활성을 가졌고, NGLY3 + NGLY8은 야생형 ADAMTS13 대비 활성이 75%였다. R568A/Y665A는 야생형과 비교했을 때 120%의 활성을 가졌으며, L591A/R636A/L637A/L668A는 야생형 대비 활성이 90%였다. NGLY3 + R568A/Y665A는 야생형과 비교했을 때 120%의 활성을 가졌고, NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A는 야생형 ADAMTS13 대비 활성이 95%였다. NGLY3 + R568A/Y665A + L591A/R636A/L637A/L668A는 야생형 ADAMTS13 대비 활성이 40%였다.

이 결과들을 종합해보면, NGLY3과 NGLY7, NGLY3과 NGLY8, 그리고 NGLY7과 NGLY8의 조합은 FRETS-VWF73 기질 변환 효능을 유지한다는 것을 보여준다. NGLY3을 R568A/Y665A 및/또는 L591A/R636A/L637A/L668A과 조합한 것도 역시 FRETS-VWF73 기질의 변환 활성을 유지했다.

우리는 또한 보텍스 분석을 채용하여 새로운 변형체들이 전단응력 하에 VWF 멀티머를 가공처리하는 활성을 측정했다. 이 조건 하에서, NGLY3는 완전하게 활성이 있었다. 또한 NGLY7도 확실하게 거대 VWF 멀티머를 가공처리할 수 있었다(도 9b). NGLY8은 NGLY3 및 NGLY7에 비해 VWF 멀티머를 처리하는 능력이 떨어짐을 보였다(도 9b). NGLY3/NGLY8의 조합 역시 이 실험 조건 하에서 VWF 멀티머를 가공처리하는 활성이 줄어든 것이 보였지만, NGLY3/NGLY7의 조합은 멀티머 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 유지했다(도 9b). NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A의 조합 및 NGLY3 + R568A/Y665A의 조합도 이 조건 하에서 효율적으로 VWF 멀티머를 가공처리했다(도 9a). 이런 관찰 결과와 동일 선상에서, R568A/Y665A 및 L591A/R636A/L637A/L668A 변형체의 단백질 분해 활성은 야생형 ADAMTS13에 비해 떨어졌다(도 9a).

우리는 또한 변성(denaturing) 조건을 채용하여 새로운 변형체들이 VWF 멀티머를 처리하는 활성을 평가했다. 이 조건 하에서 NGLY3는 완전하게 활성이 있었으나 반면 NGLY7 및 NGLY8는 활성이 감소했다(표 4). NGLY3/NGLY7 및 NGLY3/NGLY8 조합 또한 이런 실험 조건에서 VWF 멀티머를 처리하는 활성이 줄어드는 것이 발견되었다. NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A 조합과 NGLY3 + R568A/Y665A 조합 역시 이런 특이한 조건을 채용했을 때 VWF 멀티머를 처리하는 효율이 떨어졌다(표 4).

ADAMTS13 NGLY 변형체 및 대조군의 항원값 및 활성

변형체	항원값 (μg/ml)	VWFFRETS73처리 활성값(% 야생형ADAMTS13 대비)	변성 조건에서VWF 멀티머를 처리하는 활성
전장 야생형 ADAMTS13	5.27	100	++++++
NGLY3	4.60	125	++++++
NGLY7	3.45	125	+++++
NGLY8	1.43	76	++
NGLY3 + NGLY7	4.26	135	+++++
NGLY3 + NGLY8	2.49	120	++
NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A	4.42	95	++
NGLY3 + R568A/Y665A	4.36	120	++
NGLY3 + R568A/Y665A + L591A/R636A/L637A/L668A	2.32	40	시험 안 함
L591A/R636A/L637A/L668A	4.77	90	++
R568A/Y665A	3.78	120	++

그 다음 우리는 새로 설계한 ADAMTS13 변형체들이 면역성 TTP 환자에서 발달되거나 유래한 병적인 자가항체를 중화할 수 있는지 평가했다.

우리는 먼저 고역가 억제항체를 가지는 두 명의 환자 시료 상에서 NGLY7, NGLY8, 그리고 NGLY3 + NGLY7 및 NGLY3 + NGLY8 조합의 항체 저항성을 평가했다(도 12). NGLY7와 NGLY8는 야생형 ADAMTS13이 환자 혈장에 존재하는 자가항체에 의해 억제된 것과 유사하게 환자 자가항체에 의해 억제되었다. NGLY3는 야생형 ADAMTS13에 비해 제한적인 수준으로만 억제되었다. NGLY3과 NGLY7의 조합은 NGLY3 단독에 비해 좀 더 항체 저항성을 가졌다. NGLY3과 NGLY8의 조합은 NGLY3 그 자체와 비교할 때 동일하게 저항성을 가졌다. 우리는 이어서 23명의 환자 시료에서 NGLY3와 NGLY7의 조합을 시험했다(도 13). NGLY3과 NGLY7의 조합은 대부분의 환자 시료에서 자가항체에 대해 저항성을 보였다(도 13).

우리는 이어서 환자 시료에서의 NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A의 조합과 NGLY3 + R568A/Y665A의 조합의 자가항체 저항 효율을 실험했다. 시료 8개 중 8개에서 NGLY3 + R568A/Y665A 조합은 야생형 ADAMTS13에 비해 약간 더 활성을 가졌다(도 14). NGLY3 + R568A/Y665A의 활성 수준은 NGLY3 단독에 비해 약간 높았는데, ADAMTS13에 추가적인 알라닌-치환을 포함하는 것이 더 유익함을 암시한다. NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A의 조합도 역시 자가항체 저항성을 평가했다. 실험한 8개의 환자 시료 중 8개에서 NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A 조합이 야생형 ADAMTS13 대비 상당히 높은 활성을 보유했다(도 14). NGLY3 + L591A/R636A/L637A/L668A의 환자 혈장 또는 혈청 시료의 존재 하에서의 활성값은 NGLY3의 것과 비슷했다. 이 발견은 특정 아미노산을 알라닌으로 치환하는 것이 자가항체 저항성에 제한된 영향을 끼쳤음을 보여준다.

실시예 6: 또다른 ADAMTS13 N-글리칸 변형체

앞의 실시예에서는 면역성 TTP 환자에서 발달하는 병적인 자가항체의 주요 결합 부위를 포함하는 스페이서 도메인에 초점을 맞추었다. 자가항체들이 ADAMTS13 상의 다른 도메인도 또한 표적으로 할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다(Klaus et al., 2004; Thomas et al., 2015; Pos et al., 2011). 실시예 1-4에 설명된 방법과 유사하게 금속단백질분해효소, 디스인테그린 도메인, TSP-1 반복체, Cys-풍부 도메인, 스페이서 도메인 내의 R568, F592, R660, Y661 및 R665 바깥의 에피토프, TSP2-8 반복체 및 CUB1/2 도메인에 있는 항체 결합 부위를 표적으로 하는 자가항체의 결합을 막도록 N-글리칸 차폐 ADAMTS13 변형체를 설계할 수 있다. 또한, NGLY3 및/또는 다른 N-글리칸 차폐 ADAMTS13 변형체를 상기 언급한 도메인의 개별적인 또는 여러 아미노산 치환과 조합해서 자가항체의 결합은 줄이면서 적어도 부분적인 단백질 분해 활성은 보유하도록 할 수 있다.

잠재적인 N-글리코실화 부위를 고르기 위한 ADAMTS13의 표면 잔기를 선택하기 위해 ADAMTS13의 3D 구조를 이용했다. ADAMTS13 결정 구조 (PDB: 6qig)를 다음의 도메인에 대해 사용했다: 금속단백질분해효소, 디스인테그린-양 도메인, 트롬보스폰딘 1형 반복체 1 (TSP1-1), 시스테인 풍부 및 스페이서 도메인. 나머지 구조는 예전에 알려진 대로 TSP1-2부터 CUB2 도메인까지 상동 모델링으로 구축했다(Ercig et al., 2018b 참조). 표면 잔기를 수동으로 고르기 위해 SwissPDB 뷰어를 사용하여 ADAMTS13의 3D 구조를 탐색했다.

병적인 자가항체의 결합을 막기 위해 N-글리칸을 삽입하거나 이동시킬 수 있는 ADAMTS13의 노출 구역. 굵은 글씨로 표시한 잔기는 ADAMTS13의 (부분적인) 천연 글리코실화 부위이다. 밑줄 친 굵은 글씨의 잔기는 O-글리칸을 함유하는 것을 보인 잔기이다. 굵은 글씨의 이탤릭체로 나타낸 잔기는 O-푸코실화 Ser (S) 잔기 또는 C-만노실화 Trp (W) 잔기이다.

No.	도메인	아미노산 서열	잔기 번호 (도 1에 나타낸 번호)
1	금속단백질분해효소(80-286)	DVFQAHQEDTER	91-102
2	금속단백질분해효소(80-286)	ELLRDPSLGAQFR	113-125
3	금속단백질분해효소(80-286)	KMVILTEPEGAPNITANLTSSLL	130-152
4	금속단백질분해효소(80-286)	QTINPEDDTDP	159-169
5	금속단백질분해효소(80-286)	RFDLELPDGNRQ	180-191
6	금속단백질분해효소(80-286)	QLGGACSPTW	197-206
7	금속단백질분해효소(80-286)	EHDGAPGSGCGPS	233-245
8	금속단백질분해효소(80-286)	SDGAAPRAGL	251-260
9	금속단백질분해효소(80-286)/디스인테그린-양 도메인 (287-383)	PC S RRQLLSLLSAGRARCVWDPPRPQPGSAGHPPDAQ	264-300
10	디스인테그린-양 도메인 (287-383)	RVAFGPKAVACTFAREHLDMCQ	312-333
11	디스인테그린-양 도메인 (287-383)	TDPLDQSSCSRLL	339-351
12	디스인테그린-양 도메인 (287-383)	DGTECGVEK	356-364
13	디스인테그린-양 도메인 (287-383) / 디스인테그린-양 도메인 과 TSP 1형 1 (383-394)사이의 구역 / TSP 1형 1 (394-439)	KGRCRSLVEL T PIAAVHGR W SSWGPRSPCSR S	368-399
14	TSP 1형 1 (384-439)	RRRQ	407-410
15	TSP 1형 1 (384-439)	GGRACVGADLQAE	419-431
16	TSP 1형 1 (384-439) / 시스테인 풍부 (440-556)	NTQACEKTQLE	434-444
17	시스테인 풍부 (440-556)	QQCARTDGQPLRSSPGGA	448-465
18	시스테인 풍부 (440-556)	FYHWGAAVPHSQGDALCR	467-484
19	시스테인 풍부 (440-556)	RAIGESFIMKRGDSFL	488-502
20	시스테인 풍부 (440-556)	SGPRE	511-515
21	시스테인 풍부 (440-556)	SGSCR	524-528
22	시스테인 풍부 (440-556)	DGRMDSQQVWDR	533-544
23	시스테인 풍부 (440-556) / 스페이서 (556-685)	VCGGDNSTCSPRKGSFTAGRARE	547-569
24	스페이서 (556-685)	TFLTVTPN	572-579
25	스페이서 (556-685)	YIANHRPLF	584-592
26	스페이서 (556-685)	GGRYVVAGKMSISPN	600-614
27	스페이서 (556-685)	YPSLLED	617-623
28	스페이서 (556-685)	RVALTEDRLPR	629-639
29	스페이서 (556-685)	RIWGPLQED	644-652
30	스페이서 (556-685)	RRYGEEYGNLTR	659-670
31	스페이서 (556-685)	TFTYFQPK	674-681
32	TSP 1형 2 (682-730)	PRQAWVWAAVRGPCS	682-696
33	TSP 1형 2 (682-730) / TSP 1형 2 와 TSP 1형 3 사이의 구역 (730-742)	AGLRWVNYSCLDQARKELVE	701-720
34	TSP 1형 2 (682-730) / TSP 1형 2와 TSP 1형 3 사이의 구역 (730-742)	QGSQQPPAWPEACVLEP	725-741
35	TSP 1형 3 (742-805)	PPYWAVGDFGPCSA S CG	743-759
36	TSP 1형 3 (742-805)	LRERPVRCVEAQGSLL	762-777
37	TSP 1형 3 (742-805) / TSP 1형 3 과 TSP 1형 4 (806-807) 사이의 구역	PPARCRAGAQQPAVALETCNPQPCPAR	781-807
38	TSP 1형 4 (808-859)	WEVSEPSSCTSAGGAGL	808-824
39	TSP 1형 4 (808-859)	NETCVP	828-833
40	TSP 1형 4 (808-859)	LEAPVTEGPGSVDEK	838-852
41	TSP 1형 4 (808-859) /TSP 1형 4와 TSP 1형 5 사이의 구역 (859-896)	APEPCVGM S CPPG	855-867
42	TSP 1형 4와 TSP 1형 5 사이의 구역 (859-896)	LDATSAGEKAP	871-881
43	TSP 1형 4와 TSP 1형 5 사이의 구역 (859-896) / TSP 1형 5 (896-950)	SP W GSIRTGAQAAHVW	882-897
44	TSP 1형 5 (896-950)	V S CGR	906-910
45	TSP 1형 5 (896-950)	ELRFLCMDSALRVPVQEELCGL	915-936
46	TSP 1형 5 (896-950) / TSP 유형1 6(951-1011)	KPGSRRECPARWQYKLAACSV S CGR	939-968
47	TSP 1형 6 (951-1011)	RRILYCARAHGED	972-984
48	TSP 1형 6 (951-1011)	EEILLDTQCQGLPRPEPQEAC S LEP	987-1011
49	TSP 1형 7 (1012-1068)	CPPR W	1012-1016
50	TSP 1형 7 (1012-1068)	PCSA S CGLGTAR	1023-1034
51	TSP 1형 7 (1012-1068)	VQLDQGQDVEVDEAA	1040-1054
52	TSP 1형 7 (1012-1068) / TSP 1형 7과 TSP 1형 8 사이의 구역 (1069-1071)	LVRPEASVPCLIAD	1058-1071
53	TSP 1형 8 (1071-1131)	RWHVGTWMECSV S CGD	1075-1090
54	TSP 1형 8 (1071-1131)	T	1098
55	TSP 1형 8 (1071-1131)	AQAPVPADFCQHLP	1104-1117
56	TSP 1형 8 (1071-1131) /TSP 1형 8 과 CUB1 도메인 사이의 구역 (1132-1191)	RGCWAGPCVGQGTPSLVPHEEAAAPGR	1123-1149
57	TSP 1형 8과 CUB1 도메인 사이의 구역 (1132-1191)	PAGASLEW	1154-1161
58	TSP type-1 8과 CUB1 도메인 사이의 구역 (1132-1191)	RGLLF S PAPQPRRLLPGPQENS	1165-1186
59	CUB1 (1192-1298)	CGRQHLEPTGT	1192-1202
60	CUB1 (1192-1298)	DMRGPGQAD	1204-1212
61	CUB1 (1192-1298)	GRPLGE	1218-1223
62	CUB1 (1192-1298)	PGQAD	1208-1212
63	CUB1 (1192-1298)	PLG	1220-1222
64	CUB1 (1192-1298)	R	1228
65	CUB1 (1192-1298)	SSLNCSAGDMLLLWGRL	1232-1248
66	CUB1 (1192-1298)	NCSAGDMLL	1235-1243
67	CUB1 (1192-1298)	WGRLTWRKMCRKLLDM	1245-1260
68	CUB1 (1192-1298)	WRKMCRKLLDM	1250-1260
69	CUB1 (1192-1298)	TFSSKTNT	1261-1268
70	CUB1 (1192-1298)	KTNT	1265-1268
71	CUB1 (1192-1298)	RQRSGRPGGGV	1272-1282
72	CUB1 (1192-1298)	RCGRPG	1274-1279
73	CUB1 (1192-1298)	RYGSQLAPETFYRE	1285-1298
74	CUB1 (1192-1298)	QLAPETFYRE	1289-1298
75	CUB2 (1299-1427)	DMQLFGPWG	1300-1308
76	CUB2 (1299-1427)	DMQLFGPWGEIV S PSLSPATSNA	1300-1322
77	CUB2 (1299-1427)	S PSLSPATSNAGG	1312-1324
78	CUB2 (1299-1427)	RLFINVAPHARI	1326-1337
79	CUB2 (1299-1427)	APHAR	1332-1336
80	CUB2 (1299-1427)	LA	1342-1343
81	CUB2 (1299-1427)	TNMGAGTEGA N ASYIL	1344-1359
82	CUB2 (1299-1427)	AGTEGAN	1348-1354
83	CUB2 (1299-1427)	IRDTHSLRT	1360-1368
84	CUB2 (1299-1427)	RDTHSLRTTAF	1361-1371
85	CUB2 (1299-1427)	QQVLYWESESSQ	1374-1385
86	CUB2 (1299-1427)	WESESSQAE	1379-1387
87	CUB2 (1299-1427)	EFSEGFLKAQAS	1389-1400
88	CUB2 (1299-1427)	SEGFLKAQASLRGQY	1391-1405
89	CUB2 (1299-1427)	LQSWVPEMQDPQSWKGKEGT	1408-1427

실시예 7: 질량분석에 기초하여 N-글리칸 변형 ADAMTS13 확인

이 실시예에서 우리는 ADAMTS13 내 새로 만들어진 공통 부위(consensus-sites)의 성공적인 N-글리코실화에 대한 기본 증거를 찾기 위해 질량분석법을 이용했다. 우리는 이 분석을 위해 NGLY3 변형체를 골랐다. 앞선 실시예에 설명되었다시피 NGLY3에서 K608이 N608로 대체되어 N-글리칸의 추가를 위한 공통부위가 도입되었다(도 15 참조). 우리는 또한 K608이 알라닌으로 치환된 변형체(K608A)를 포함시켰다. 이것은 N-글리코실화를 위한 공통부위를 도입하지는 않는다(도 15). NGLY3, K608A 및 야생형 ADAMTS13 모두를 앞의 실시예에 설명한 바와 같이 CHO 세포에서 발현시켰다. 이 세 개의 ADAMTS13 변형체 각각을 자석 다이나비드(Dynabeads)에 결합된 마우스 항-V5 항체를 사용한 면역침강법으로 정제했다. 질량분석 전에, 이 돌연변이체들을 PNGaseF로 분해시켰고(또는 대조군으로 분해 없이) 그 다음 비드 상에서 트립신 분해했다. PNGaseF 처리는 N-글리칸이 아스파라긴 잔기에 붙었을 때 그 잔기를 탈아미드화(deamidation)한다. 질량분석 전에 ADAMTS13를 트립신 분해하기 위해 리신과 아르기닌 뒤를 자르는 트립신을 이용하였다.

우선 우리는 야생형 ADAMTS13의 질량분석 후에 어떤 펩타이드 서열이 회수되는지 분석했다. 트립신 분해 정제된 야생형 ADAMTS13는 전체적으로 66%를 포함했다. 아미노산 서열 599-629에 해당하는 펩타이드만 도 15에 나타냈다. 야생형 ADAMTS13의 트립신 분해 후에 I599-K608에 해당하는 펩타이드(펩타이드 1)가 확인되었다. M609 내지 R629를 포함하는 펩타이드(펩타이드 2)는 확인되지 않았는데, N614의 외래 글리칸의 존재가 이 펩타이드의 질량 기초 동정을 방해하기 때문이다. 이어서, 우리는 야생형 ADAMTS13을 PGNaseF로 처리했다. PNGaseF 처리를 통해 N-글리칸이 제거되고 추가적으로 아스파라긴의 탈아미드화가 일어나 1 달톤의 질량이 늘어난다. PGNaseF 처리 ADAMTS13의 분석을 통해 펩타이드 I599-K608와 펩타이드 M609-R629를 확인할 수 있었다. N614의 탈아미드화 때문에 펩타이드 M609-R629의 질량은 1 달톤 늘었다. 이러한 결과는 펩타이드 M609-R629가 N614 위치에 삽입된 N-글리칸을 포함하는 것을 나타낸다(도 15에 네모로 표시). 이것은 N614에서 N-글리칸을 확인한 이전 결과와 일치한다(도 2 참조).

그 다음 우리는 NGLY3을 비슷한 방식으로 분석했다. 트립신 분해 후에 I599-R629 구역에 해당하는 어떤 펩타이드도 회수되지 않았다. 이 결과는 NGLY3의 이 부분에 하나 이상의 N-글리칸이 존재할 것이라는 것을 보여준다. PGNaseF로 처리하자 하나의 펩타이드 Y603-R629가 확인되었다(펩타이드 3: 도 15). N608 및 N614가 탈아미드화된 것이 발견되었고 N608 및 N614에 N-글리칸이 있음과 일치한다. NGLY3에서 K608을 N으로 치환했기 때문에, 이 변형체는 아미노산 위치 608에서 트립신에 의해 더 이상 잘라질 수 없다(도 15에 네모로 표시). 이 결과들을 종합해보면, K608을 N608로 대체했기 때문에 N-글리칸이 성공적으로 아미노산 위치 608에 도입되었음을 보여준다.

추가적인 대조군으로 우리는 K608이 이 위치에서 알라닌으로 치환된 ADAMTS13 변형체를 분석했다. PGNaseF로 처리하지 않았을 때 이 구역에 해당하는 트립신 절단 펩타이드가 확인되지 않는 것은 이 구역에 N-연결 글리칸이 있음과 일치한다. PGNaseF로 분해한 후에 614 위치에 탈아미드화된 N이 있는 단일한 Y603-R629 펩타이드가 확인되었다(도 15에 네모로 표시). 이 분석결과는 이 변형체에서는 A608이 A608에 결합된 N-연결 글리칸을 포함하지 않고 오직 N614에 보통 있는 N-글리칸만 확인되었음을 보여준다.

전체적으로, 여기 설명된 분석방법을 통해 NGLY3의 아미노산 위치 608에 N-글리칸을 추가하기 위한 공통부위를 도입함으로써 이 위치에 N-글리칸이 부착되는 결과를 가져오는 것을 보여준다. 유사하게, NGLY1, 2, 4, 5, 6, 7, 8과 실시예 7에 나열된 것들을 포함하는 다른 글리칸 변형 ADAMTS13 변형체에서의 다른 N-연결 글리칸의 존재가 이 실시예에 설명된 프로토콜을 이용하여 성공적으로 확인될 수 있다.

참고문헌

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34 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu Gly Ala Gln Phe Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Lys Met Val Ile Leu Thr Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala 1 5 10 15 Asn Leu Thr Ser Ser Leu Leu 20 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gln Thr Ile Asn Pro Glu Asp Asp Thr Asp Pro 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Arg Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser Gly Cys Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Asp Gly Ala Ala Pro Arg Ala Gly Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala 1 5 10 15 Arg Cys Val Trp Asp Pro Pro Arg Pro Gln Pro Gly Ser Ala Gly His 20 25 30 Pro Pro Asp Ala Gln 35 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Arg Val Ala Phe Gly Pro Lys Ala Val Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu 1 5 10 15 His Leu Asp Met Cys Gln 20 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser Ser Cys Ser Arg Leu Leu 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Gly Thr Glu Cys Gly Val Glu Lys 1 5 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val 1 5 10 15 His Gly Arg Trp Ser Ser Trp Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser 20 25 30 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Arg Arg Arg Gln 1 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Gly Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asn Thr Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu 1 5 10 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gln Gln Cys Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ala <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Pro His Ser Gln Gly Asp Ala Leu 1 5 10 15 Cys Arg <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu 1 5 10 15 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ser Gly Pro Arg Glu 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ser Gly Ser Cys Arg 1 5 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln Val Trp Asp Arg 1 5 10 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe 1 5 10 15 Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu 20 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Thr Phe Leu Thr Val Thr Pro Asn 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Tyr Ile Ala Asn His Arg Pro Leu Phe 1 5 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys Met Ser Ile Ser Pro Asn 1 5 10 15 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp 1 5 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Arg Val Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Arg Ile Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp 1 5 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Arg Arg Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 10 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Thr Phe Thr Tyr Phe Gln Pro Lys 1 5 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp Ala Ala Val Arg Gly Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Ala Gly Leu Arg Trp Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys 1 5 10 15 Glu Leu Val Glu 20 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu Ala Cys Val Leu Glu 1 5 10 15 Pro <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Leu Arg Glu Arg Pro Val Arg Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu 1 5 10 15 <210> 69 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala Leu 1 5 10 15 Glu Thr Cys Asn Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg 20 25 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Trp Glu Val Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly 1 5 10 15 Leu <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asn Glu Thr Cys Val Pro 1 5 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Leu Glu Ala Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys 1 5 10 15 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ala Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro 1 5 10 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ser Pro Trp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val Trp 1 5 10 15 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Val Ser Cys Gly Arg 1 5 <210> 77 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Glu Leu Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val Gln 1 5 10 15 Glu Glu Leu Cys Gly Leu 20 <210> 78 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu 1 5 10 15 Ala Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg 20 25 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Arg Arg Ile Leu Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp 1 5 10 <210> 80 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Glu Ile Leu Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu 1 5 10 15 Pro Gln Glu Ala Cys Ser Leu Glu Pro 20 25 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Cys Pro Pro Arg Trp 1 5 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg 1 5 10 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val Asp Glu Ala Ala 1 5 10 15 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val Pro Cys Leu Ile Ala Asp 1 5 10 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Arg Trp His Val Gly Thr Trp Met Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp 1 5 10 15 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala Asp Phe Cys Gln His Leu Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Arg Gly Cys Trp Ala Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu 1 5 10 15 Val Pro His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg 20 25 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Pro Ala Gly Ala Ser Leu Glu Trp 1 5 <210> 89 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Gly Leu Leu Phe Ser Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro 1 5 10 15 Gly Pro Gln Glu Asn Ser 20 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr Gly Thr 1 5 10 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp 1 5 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gly Arg Pro Leu Gly Glu 1 5 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Pro Gly Gln Ala Asp 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp Gly Arg 1 5 10 15 Leu <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu 1 5 <210> 96 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Trp Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met 1 5 10 15 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met 1 5 10 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr 1 5 <210> 99 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Lys Thr Asn Thr 1 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Arg Gln Arg Ser Gly Arg Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Cys Gly Arg Pro Gly 1 5 <210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Arg Tyr Gly Ser Gln Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Gln Leu Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu 1 5 10 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly 1 5 <210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Asp Met Gln Leu Phe Gly Pro Trp Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala 20 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 107 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala Arg Ile 1 5 10 <210> 108 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Ala Pro His Ala Arg 1 5 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu 1 5 10 15 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Gly Thr Glu Gly Ala Asn 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Ile Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr 1 5 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Arg Asp Thr His Ser Leu Arg Thr Thr Ala Phe 1 5 10 <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu Ser Glu Ser Ser Gln 1 5 10 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Trp Glu Ser Glu Ser Ser Gln Ala Glu 1 5 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln Ala Ser 1 5 10 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Ser Glu Gly Phe Leu Lys Ala Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Leu Gln Ser Trp Val Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly 1 5 10 15 Lys Glu Gly Thr 20 <210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Arg Leu Pro Leu 1 <210> 119 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Tyr Gly Asn Leu 1 <210> 120 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NGLY7 <400> 120 Asn Val Thr Leu 1 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Asn Leu Thr Arg Pro 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NGLY8 <400> 122 Leu Asn Val Thr Ala 1 5

Claims

ADAMTS13의 잔기 1 내지 685를 포함하고, 여기서 도 1에 나타낸 ADAMTS13의 아미노산 잔기 S556 내지 A685를 포함하는 스페이서 도메인에 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항에 있어서, ADAMTS13의 잔기 1 내지 1427을 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 도 1에 나타낸 ADAMTS13 서열의 R568 내지 R670 잔기를 포함하는 스페이서 도메인의 일부로 야생형 ADAMTS13 대비 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위가 추가 및/또는 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위가 이동한 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 1에 나타낸 ADAMTS13 아미노산 잔기 568, 591, 608, 609, 636, 637, 665, 668 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 1에 나타낸 ADAMTS13 아미노산 잔기 608, 609, 665 및 이들의 조합으로 구성된 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 1에 나타낸 ADAMTS13의 아미노산 잔기 608에 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 ADAMTS13 단백질의 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 단백질 분해 활성의 적어도 10%의 VWF에 대한 단백질 분해 활성을 갖는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, R568, L591, V604, V605, A606, G607, K608, M609, R636, L637, P638, R639, Y665, L668 및 이들의 조합으로 이루어진 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기를 포함하는, 바람직하게는 R568N, L591N, V604N, V605N, A606N, G607N, K608N, M609N, R636N, L637N, P638N, R639N, Y665N, L668N 및 이들의 조합으로 구성된 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하는 N-연결 글리코실화 부위를 가지는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 568REY570에서 568NET570으로(NGLY1), 591LFT593에서 591NFT593으로(NGLY2), 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4), 636RLPR639에서 636NLSR639로(NGLY5), 636RLPL639에서 636RNAS639로(NGLY6), 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7), 667NLTRP671에서 667LNVTA671로(NGLY8)의 돌연변이 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 608KMSI611 에서 608NMSI611로(NGLY3), 608KMSI611에서 608KNST611로(NGLY4) 및 665YGNL668에서 665NVTL668로(NGLY7)의 돌연변이로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 608KMSI611에서 608NMSI611로(NGLY3)의 돌연변이를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가적인 돌연변이를 더 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 12 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이는 도 1에 나타낸 ADAMTS13의 잔기 S556 내지 A685를 포함하는 스페이서 도메인에 있는 것인 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, R568, L591, F592, R636, L637, L668, L591, F592, R636, L637, R660, Y661, Y665, L668 및 이들의 조합으로 구성된 모둠에서 선택되는 아미노산 잔기에 돌연변이를 추가로 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, R568K, R568A, R568N, L591A, F592Y, F592A, F592N, R636A, L637A, R660K, R660A, R660N, Y661F, Y661A, Y661N, Y665F, Y665A, Y665N, L668A 및 이들의 조합으로 구성되는 모둠에서 선택되는 돌연변이를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 R568A 및 Y665A; 또는 돌연변이 L591A, R636A, L637A, 및 L668A를 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가된 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위 및/또는 상기 이동한 하나 이상의 기 존재 N-연결 글리코실화 부위에 N-연결 글리칸을 포함하는 ADAMTS13 단백질 변형체.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 제 18 항에 따른 핵산 구성체; 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬번트, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
치료용으로 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 제 18 항에 따른 핵산 구성체.
항혈전제로 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 제 18 항에 따른 핵산 구성체.
병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 처리과정을 특징으로 하는 질병의 치료용으로 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 제 18 항에 따른 핵산 구성체.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체의 치료적 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 처리과정을 특징으로 하는 질병의 치료방법.
병적인 폰 빌레브란트 인자(VWF) 활성 및/또는 VWF 처리과정을 특징으로 하는 질병의 치료를 위한 약물 제조에 사용되는 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체의 용도.
상기 질병은 혈전성 질병인, 제 22 항에 따라 사용되기 위한 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체, 제 23 항에 따른 방법 또는 제 24 항에 따른 용도.
제 25 항에 있어서, 상기 혈전성 질병은 혈전성 미세혈관증인 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체, 방법 또는 용도.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 상기 혈전성 질병은 면역매개 혈전성 혈소판 감소 자반증(immune-mediated thrombotic thrombocytopenic purpura, iTTP)을 포함하는 혈전성 혈소판 감소 자반증(TTP), 용혈성 요독증(hemolytic-uremic syndrome, HUS), 허혈성 뇌졸중, 전신성 색전증, COVID19, 항인지질 증후군, 전자간증(pre-eclampsia)/HELLP 증후군, 패혈증, 낫모양 적혈구증(sickle cell disease)으로 구성되는 모둠에서 선택되는 질병인 ADAMTS13 단백질 변형체 또는 핵산 구성체, 방법 또는 용도.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 ADAMTS13 단백질 변형체의 생산방법으로서, 상기 방법은 제 18 항에 따른 핵산 분자를 N-연결 글리코실화를 할 수 있는 숙주세포, 바람직하게는 진핵 숙주세포에 도입하고, 상기 ADAMTS13 단백질 변형체가 발현되도록하는 조건 하에서 상기 숙주세포를 배양하는 것을 포함하며, 바람직하게는 여기서 상기 숙주세포는 포유류 세포이고, 바람직하게는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, PERC.6 세포 및 HEK293 세포로 구성되는 모둠에서 선택되는 것인 방법.