JP3894795B2 - ヒト細胞株における組換え血液凝固因子の製造 - Google Patents

Description

【０００１】
序論
本発明はウイルス転写アクチベータータンパク質を安定的に発現し、血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーター（ただし該プロモーターは該ウイルス転写アクチベータータンパク質により刺激されるウイルスプロモーターではない）を有するベクターを保持する不死化ヒト細胞株を利用する、組換えヒト血液凝固因子、特に第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を製造するための改良された方法；該ベクターを保持する不死化ヒト細胞株；特に前記の製造方法に適した第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質；かかる第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質を含む医薬用組成物および血友病を治療するための医薬を調製するためのかかる第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質の使用に関する。
【０００２】
関連技術についての要旨
血友病は血液凝固カスケードのタンパク質成分の機能障害により引き起こされる出血性の疾患である。影響される凝固因子により、血友病は２つの型に分類される。両者とも共通して可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンクロットへの変換が阻害される。これらは主に男性が羅患する、劣性Ｘ染色体に関連する遺伝性疾患である。
【０００３】
男性１００００人あたり１から２人の個体が血友病Ａを羅患する。これは非常に大きな糖タンパク質（分子量約３３０ｋＤａ（フリエＢ．、フリエＢ．Ｃ．、Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：５０５〜５１８））であり、血液凝固カスケードの重要な要素である第ＶＩＩＩ因子の不足あるいは欠失により引き起こされる。ポリペプチド配列は３領域、すなわち、いわゆるＡ１およびＡ２ドメインからなるＮ末端領域、中央のＢドメイン領域、およびＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインからなるＣ末端領域に再分類できる。血液凝固において第ＶＩＩＩ因子は不活性前駆体として存在する。これは安定化キャリヤタンパク質として作用するフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）に強固にかつ非共有結合的に結合する。トロンビンによる第ＶＩＩＩ因子の３つの特定の位置（７４０、３７２、１６８９）におけるタンパク質分解的切断により、第ＶＩＩＩ因子がｖＷＦから解離し、カスケード内での凝固促進作用を発揮する。その活性形態では第ＶＩＩＩ因子は第ＩＸａのコファクターとして機能し、それによりいくつかのオーダーで第Ｘ因子のタンパク質分解による活性化が促進される。
【０００４】
男性２５０００人あたり約１人に血友病Ｂが発生する。これはセリンプロテアーゼである第ＩＸ因子（クリスマス因子）の欠損によって特徴づけられる。この４１５個のアミノ酸ポリペプチドは肝臓で５６ｋＤａの糖タンパク質として合成される。その適切な機能を果たすため、ビタミンＫの存在下でのみ生じる翻訳後カルボキシル化のステップが必要である。
両方の型の出血性障害の治療として伝統的に第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のヒト血漿由来タンパク質濃縮物の投与が行われてきた。この方法は血友病患者の有効な治療法であるが、種々の感染性因子、例えば肝炎またはＡＩＤＳを引き起こすウイルス、あるいは血栓塞栓性因子の感染の危険性を伴う。また、凝固因子の製造のためのいくつかの組換え体ＤＮＡ技術が記載されている。このために、野生型第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の対応するｃＤＮＡが単離され、適当な発現ベクターにクローン化されている（欧州特許第−Ａ−１６０４５７号；国際公開公報第Ａ−８６／０１９６１号、米国特許第４７７０９９９号、第５５２１０７０号および第５５２１０７０号）。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子の場合、凝固活性を示す複合体を製造するためのサブユニットの組換え体発現が当該分野で既知である（例えば欧州特許第Ａ−１５０７３５号、欧州特許第Ａ−２３２１１２号、欧州特許第Ａ−０５００７３４号、国際公開公報第９１／０７４９０号、国際公開公報第９５／１３３００号、米国特許第５０４５４５５号および第５７８９２０３号）。さらに、高度にグリコシル化されたＢドメインをコードする配列を部分的または全体的に欠く、トランケートされたｃＤＮＡ体の発現について記載されている（例えば国際公開公報第８６／０６１０１号、国際公開公報第８７／０４１８７号、国際公開公報第８７／０７１４４号、国際公開公報第８８／００３８１号、欧州特許第Ａ−２５１８４３号、欧州特許第Ａ−２５３４５５号、欧州特許第Ａ−２５４０７６号、米国特許第４８６８１１２号および第４９８０４５６号、欧州特許第Ａ−２９４９１０号、欧州特許第Ａ−２６５７７８号、欧州特許第Ａ−３０３５４０号並びに国際公開公報第９１／０９１２２号）。ごく最近、活性化タンパク質Ｃによる第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解性不活性化作用を阻害するか、または治療された患者による阻害抗体の形成をもたらす免疫原性を低減するために、種々の選択された点変異が導入されている（例えば米国特許第５８５９２０４号、第５４２２２６９号および第５４５１５２１号、国際公開公報第９７／４９７２５号並びに国際公開公報第９９／２９８４８号）。
【０００６】
組換え凝固因子は通常、安定的にトランスフェクトされた真核細胞、および好ましくは哺乳動物細胞株の培地から単離された。しかしながら、これはヒト細胞が保持し、発現され得るいくつかの感染性因子を同時に精製する危険性を排除するために、本明細書以前に記載された参考文献にて開示された生産方法において非ヒト細胞株で用いられる一般的な方法であった。
しかしながら、特に第ＶＩＩＩ因子に関しては、非ヒト細胞株の使用によりある種の不利益に遭遇する。例えば培地に発現されたタンパク質の分泌レベルが満足できるものではないことが報告されている。これはタンパク質翻訳および修飾の細胞内経路に関する、発現されたポリペプチドの生物学的活性にも影響する異なる型の哺乳動物細胞内でのわずかな差異によるものである。これとは別に、非ヒト発現系から精製された治療用タンパク質が患者での抗原性反応を生じ得る細胞内成分と夾雑するという懸念があった。
【０００７】
さらに、非ヒト発現系により発現されたタンパク質は、患者において抗原性反応を生じる非ヒトグリコシル化パターンを有するかもしれない。しかしながら、凝固因子の生物学的安定性および有効性は実質的にＮ−グリコシル化のパターンにより影響を受ける。特に、末梢かつ末端の単糖類が重要である。それは、分解に関与する細胞の特異的レセプターにより検出されるからである。凝固因子は末端単糖類としてシアル酸残基を保持する。例えば凝固因子としての糖タンパク質のアンテナにおけるシアル酸組成の修飾により不均質のグリコシル化パターンとなり得る。それゆえ生物学的安定性および有効性は修飾を生じた場合に重大な影響を受ける。従って、組換え凝集因子の製造においてヒト細胞株に対する非ヒト生産細胞株のグリコシル化の影響を評価することは重要な考察となる。一般的に、ヒト細胞株は非ヒト細胞株よりも組換え凝固因子の製造に関してより適切であることは妥当であると思われる。この仮説の理由は、組換え因子の合成中に恐らく外来のオリゴ糖がオリゴ糖部分に組み込まれないということである。
【０００８】
一方、ウイルス転写アクチベータータンパク質を発現する、不死化され、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞株を含有する望みの遺伝子を高レベルでタンパク質発現させるための一般的方法がここしばらくの間利用可能となっている（例えば米国特許第５７１２１１９号）。さらにこれらの細胞株は、適当なウイルス転写プロモーターが目的の遺伝子を定義しているＤＮＡ配列に作用するように結合しているベクター構築物で形質転換され、転写アクチベータータンパク質はウイルス転写プロモーターを活性化し、その結果目的の遺伝子発現が開始される。その上これらの細胞株により発現された転写アクチベータータンパク質は標的の治療用タンパク質において夾雑物を生じるという懸念がある。
前記に鑑み、ヒト血液凝固因子に関する有効な製造方法が依然必要である。
驚くべきことに、夾雑物を含まない血液凝固因子が前記した不死化ヒト細胞株で得られることが発見された。特に、不死化細胞株は、血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターを有するベクターを保持する場合、プロモーターが該ウイルスアクチベータータンパク質により刺激されるウイルスプロモーターではないという事実にかかわらず、血液凝固因子を発現できる。適切なタンパク質精製およびウイルス不活性化プロトコールを組み合わせて、この方法はヒトに対して治療的な応用をするための安全で高活性な組換え血液凝固因子を製造する有効な方法を提供する。さらに、タンパク質分解性不活性化に対して例外的に安定であり、従って積極的なウイルス不活性化プロトコールに適用できる特定の第ＶＩＩＩ因子ムテインを発見した。
【０００９】
発明の要旨
本発明は：
（１）（ａ）少なくとも一つのウイルス転写アクチベータータンパク質を安定的に発現し、ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターを有するベクターを保持するヒト細胞株を培養すること、（ただし該プロモーターは少なくとも一つの該ウイルス転写アクチベータータンパク質により刺激されるウイルスプロモーターではない）；および
（ｂ）培養液から血液凝固因子を単離すること；
を特徴とする組換えヒト血液凝固因子の生産方法；
（２）前記の（１）に記載される方法の好ましい実施形態であって、ここでヒト血液凝固因子は第ＶＩＩＩ因子またはそのムテインである；
（３）前記の（２）に記載される方法の好ましい実施形態であって、ここで第ＶＩＩＩ因子は少なくとも一つの以下の変異を有するムテインである：
（ａ）１６２番目のＶａｌが他の中性アミノ酸残基により置換されている；
（ｂ）２０１１番目のＳｅｒが他の親水性アミノ酸残基により置換されている；
（ｃ）２２２３番目のＶａｌが酸性アミノ酸残基により置換されている；および
（ｄ）Ａｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間のＢドメインが１０から２５個、好ましくは１４から２０個のアミノ酸残基を含むＡｒｇリッチのリンカーペプチドにより置換され、ここで該第ＶＩＩＩ因子の位置の数字は配列番号：２に示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子に相当する；
（４）前記の（１）に記載される方法の好ましい実施形態であって、ここでヒト血液凝固因子は第ＩＸ因子またはそのムテインである；
（５）前記の（１）から（４）に記載されるヒト血液凝固因子をコードするベクターを保持する不死化ヒト細胞株；
（６）前記の（３）に記載される第ＶＩＩＩ因子ムテイン；
（７）前記の（６）に記載される第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードするＤＮＡ配列；
（８）前記の（７）に記載されるＤＮＡを含有するベクター；
（９）遺伝子トランスファーベクターである前記の（８）に記載されるベクター；
（１０）前記の（８）に記載されるベクターで形質転換され、および／または前記の（７）に記載されるＤＮＡ配列を含有する宿主細胞；
（１１）前記の（６）に記載される第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは前記の（９）に記載される遺伝子トランスファーベクターを含有する医薬組成物；
（１２）血友病の治療用医薬品を製造するための前記の（６）に記載される第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは前記の（９）に記載される遺伝子トランスファーベクターの使用；および
（１３）前記の（６）に記載される第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは前記の（９）に記載される遺伝子トランスファーベクターをヒト血友病患者に投与することを特徴とする血友病の治療方法；
を提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
「機能的に連結された」とは、プロモーターがヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列の転写を刺激できるような様式でベクター内に配置されるベクターの配置を意味する。「非機能的に連結された」とは、プロモーターが血液凝固因子の発現された遺伝子配列から非常に遠くに位置するのでその転写を刺激できない配置を意味する。
「遺伝子」とは、リーダーおよび付随する配列並びにイントロンおよびエクソンを任意に含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、コスミド等の遺伝子構築物のいずれかを意味し、適当な調節エレメントと結合した場合、複製可能である。この用語にはクローニングおよび発現ベヒクルが含まれる。「ベクターを保持する」とは、宿主細胞への機能的ＤＮＡセグメントの安定的および一過性の両方の組み込みを意味する。しかしながら安定的な組み込みが好ましい。
「遺伝子トランスファーベクター」とは、本発明によれば、遺伝子治療に適したベクターを意味する。かかるベクターは当業者には既知の、望ましい目的のための機能的配列を含む。
「成熟」なる用語は、その細胞内分泌の直後の規定のタンパク質の分子構造（すなわちそのＮ末端輸送シグナルポリペプチドを欠如すること）を意味する。
「プロモーター」とはＲＮＡポリメラーゼが結合する遺伝子の転写を制御するための調節ＤＮＡ配列の領域を意味する。
本発明の医薬組成物の「治療上有効な用量」とは治療または予防に有効な用量、例えば血友病の症状の有効な治療または低減をもたらす用量を意味する。治療上有効な用量の決定は当業者の範囲内である。
「コード（暗号化）する」または「コード（暗号）化」とは適当な制御配列の調節下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）または翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列の特性を意味する。
本願の目的のために、「発現する」、「発現すること」または「発現」とはタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳を意味する。
【００１１】
前記の（１）から（１３）に記載される本発明を以後より詳細に記載する。本願発明の実施態様（１）によれば、ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結されるプロモーターは不死化ヒト細胞株により発現される少なくとも一つのウイルス転写アクチベータータンパク質により刺激されるウイルスプロモーターではない。
不死化ヒト細胞株は、好ましくは不死化された腎臓、膀胱、肝臓、肺、心筋、平滑筋、卵巣または胃腸細胞である。さらに好ましくは、不死化ヒト細胞株はヒト胎児腎臓細胞に由来し、最も好ましくは２９３Ｔ細胞株である（ＥＣＡＣＣ：ｔｓａ２０１、ｒｅｆ．９６１２１２２９；ＤＳＭ ＡＣＣ２４９４）。
不死化細胞株により発現される少なくとも一つの転写アクチベータータンパク質にはシミアンウイルスＴ抗原、アデノウイルスＥ１ＡまたはＥ１Ｂタンパク質、ウシパピローマウイルス初期領域ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質およびヘルペスウイルスＩＥタンパク質などがある。好ましくは、不死化細胞は少なくとも二つのウイルス転写アクチベータータンパク質、例えば温度感受性ＳＶ４０Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ａタンパク質（例えば前記の２９３Ｔ細胞株）を発現する。
【００１２】
ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したプロモーターには、好ましくは
（ｉ）前記で定義した不死化細胞（例えばＳＶ４０およびＣＭＶ）により発現されるアクチベータータンパク質により刺激されないウイルスプロモーター；
（ｉｉ）ハウスキーピング宿主プロモーター（アルブミン）；および
（ｉｉｉ）組織特異的プロモーター（例えば肝臓のα抗トリプシン）、
を含む。本発明によれば、最も好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーターである（一方、不死化細胞により発現された転写アクチベータータンパク質は該プロモーターを刺激しない）。
本発明によれば、ベクターは該ウイルス転写アクチベータータンパク質により刺激されるが、血液凝固因子には機能的に連結していない別のウイルスプロモーターを保持することができる。かかるウイルスプロモーターはアデノウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するプロモーターから選択される。ベクターはさらに一つまたはそれ以上の、下記の機能的配列：選択マーカー、調節配列（例えばＰＲＥ）等を含むことができる。
【００１３】
本発明の実施態様（１）記載のヒト血液凝固因子には、これに限定されないが、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｖ因子、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）を含む。
本発明の好ましい実施態様（２）において、ベクターは第ＶＩＩＩ因子またはそのムテインをコードするＤＮＡ配列を含有する。組換え第ＩＸ因子は一般に構造的に血漿から単離された野生型タンパク質と同一であるが、いくつかの修飾第ＶＩＩＩ因子発現構築物が組換え体発現用に設計されている。機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメイン構造を考慮すると、ｖＷＦとの重要な相互作用部位がＡ３ドメイン（アミノ酸１６８０から１６８９）およびＣ２ドメインに位置する（カウフマンおよびパイプ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９８）４、３７０〜３７９）。ｖＷＦから第ＶＩＩＩ因子を遊離させ、第ＶＩＩＩ因子を荷電リン脂質と相互作用させるために１６８９番以降の切断が計画された。ｖＷＦ結合部位を欠如する組換え第ＶＩＩＩ因子構築物は、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスに注射された場合、タンパク質分解性消化を非常に受けやすくなることが示された。哺乳動物細胞培養物中のトランケートされた第ＶＩＩＩ因子構築物の組換え体発現により、Ｂドメインの完全な欠失が対応する第ＶＩＩＩ因子様タンパク質の生物学的活性を変化させないことが示された（イートンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５、８３４３〜８３４７）。加えて観察されたＢドメイン欠失構築物の発現速度は、細胞におけるｍＲＮＡのレベル上昇のために野生型第ＶＩＩＩ因子に比較して顕著に高い（ピットマンら、Ｂｌｏｏｄ（１９９３）８１、２９２５〜２９３５）。４つの組換え第ＶＩＩＩ因子製品（リコンビネート（登録商標）、バクスター・ヘルス・ケア；コグネート（登録商標）およびコグネートＦＳ（登録商標）、バイエル・コーポレーション；およびレファクト（登録商標）ワイス、ジェネティックス・インスティテュート）が現在市場に出ている。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様（３）では第ＶＩＩＩ因子ムテインが以下の変異（ａ）から（ｄ）の少なくとも一つを有する：
（ａ）１６２番目のＶａｌが他の中性アミノ酸残基により置換されている；
（ｂ）２０１１番目のＳｅｒが他の親水性アミノ酸残基により置換されている；
（ｃ）２２２３番目のＶａｌが酸性アミノ酸残基により置換されている；および
（ｄ）Ａｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間のＢドメインが１０から２５個、好ましくは１４から２０個のアミノ酸残基を含むＡｒｇリッチのリンカーペプチドにより置換され、ここで該第ＶＩＩＩ因子のナンバリングは配列番号：２に示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子に相当する（１９個のアミノ酸シグナルペプチドを含有しないが全Ｂドメインを含有する成熟ペプチドのアミノ酸配列である（国際公開公報第９９／２９８４８号））。
【００１５】
本発明による「他の中性アミノ酸残基」にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＰｒｏを、好ましくはＡｌａを含む。「他の親水性アミノ酸」にはＡｓｎ、Ｔｈｒ、およびＧｌｎを、好ましくはＡｓｎを含む。酸性アミノ酸残基はＧｌｕおよびＡｓｐから選択され、好ましくはＧｌｕである。
実施態様（３）の第ＶＩＩＩ因子のうち、第ＶＩＩＩ因子ムテインは変異（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも一つを有するのが好ましく、変異（ａ）および（ｂ）の少なくとも一つを有するのがより好ましく、前記で定義した（ａ）から（ｃ）の３つ全ての変異を有するのが最も好ましい。ムテインが変異体Ｖ１６２Ａ、Ｓ２０１１ＮおよびＶ２２２３Ｅの３つ全てを含むのが特に好ましい。
【００１６】
同様に本発明の実施態様（４）のベクターに含有されるＤＮＡ配列は、配列番号：１に示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡ配列に相対して変異体Ｔ４８５Ｃ、Ｇ６０３２ＡおよびＴ６６６８Ａを有する。好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は沈黙（すなわちサイレント）変異Ｔ６８１６Ｃをも含有する（さらに該番号は成熟野生型第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡ配列に相当する）。
また別に、実施態様（３）の第ＶＩＩＩ因子ムテインの中で、第ＶＩＩＩ因子ムテインは前記で定義した変異（ｄ）を有するのが好ましい。
本発明の好ましい発現系は、ここ以前に記載した点突然変異（ａ）から（ｃ）に加え、部分的または全体的にそのＢドメインを欠如する独特な第ＶＩＩＩ因子ムテイン、好ましくはＲ７４０とＥ１６４９の間のＢドメインが前記（ｄ）に記載の、Ａｒｇリッチの特徴的なアミノ酸スペーサーによって置換されるムテインを利用する。本発明によれば「Ａｒｇリッチ」とは該スペーサーが少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個のＡｒｇ残基を含有することを意味する。最も好ましい実施態様では、該スペーサーは可変ドメインの８個のアミノ酸に続く野生型Ｂドメインの８個のアミノ酸からなる（図５Ａ、配列番号：９参照）。ここ以前で論じたＢドメイン修飾を有するかかる構築物では、提示されたｖＷＦ結合部位は未変化のままで、細胞培養培地中、または後に治療した患者の血液中に分泌された第ＶＩＩＩ因子の即座のタンパク質分解性消化を防御する。トロンビン切断による特異的活性化の後のみ、第ＶＩＩＩ因子がｖＷＦから放出される。好ましい第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡは、例えば実施例１に記載される４個のＤＮＡ断片を集合させることにより構築した。
【００１７】
本発明の実施態様（３）のタンパク質は、これに限定されないが、天然輸送シグナルペプチド（配列番号：４、１３および１５に示すタンパク質の−１９から−１のアミノ酸残基に相当する）またはその断片もしくは類似体、人工ペプチド（例えば高度なアフィニティー精製のためのオリゴ−Ｈｉｓ−タグ）を含む別のＮまたはＣ末端配列を含んでよい。
第ＶＩＩＩ因子の発現のための最も好ましいベクターは図２に示すベクターｐＴＧＦ８−１である。該ベクターのＤＮＡ配列を配列番号：３に示し、これ以前に扱った５個の変異（変異Ｔ４８５Ｃ、Ｇ６０３２ＡおよびＴ６８１６Ｃ（ここで；Ｔ１２１７Ｃ、Ｇ４０８８Ａ、Ｔ４７２４ＡおよびＴ４８７２Ｃ）および配列番号：９のＢドメインリンカーをコードするＤＮＡ配列）全てを包含し、配列番号：４に表される第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードする。
さらに最も好ましいベクターは、その共通する分子構造を図６に示したｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓおよびｐＴＧＦ８−３である。
【００１８】
配列番号：１２に示すｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓはサイレント変異Ｔ６８１６Ｃのみを含み、配列番号：９のリンカーペプチドによるＢドメインの置換を有するが、配列番号：２の野生型配列と比較して１次タンパク質構造にさらなる変化はない第ＶＩＩＩ因子ムテインを生ずる。
配列番号：１４に示すｐＴＧＦ８−３は変異Ｔ４８５Ｃ、Ｔ６６８ＡおよびＴ６８１６Ｃを含み、前記のＢドメインの置換に加えて、配列番号：２と比較してアミノ酸置換Ｖ１６２ＡおよびＶ２２２３Ｅを示す第ＶＩＩＩ因子ムテインである。
【００１９】
第ＶＩＩＩ因子の製造の場合、フォンビルブラント因子の存在下で培養を実施する。フォンビルブラント因子は第ＶＩＩＩ因子のモルあたり好ましくは１０から１００、より好ましくは５０から６０モルのｖＷＦの量で用いられる（精製手順の間の培養液中および／または第ＶＩＩＩ因子溶液中（以下を参照））。
本発明の好ましい実施態様（４）では、ヒト血液凝固因子は第ＩＸ因子またはそのムテインであり、好ましくは配列番号：５に示す野生型第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子の適当なムテインには第ＩＸ因子の点突然変異および不完全形態などがある。最も好ましい第ＩＸ因子の発現のためのベクターは各々図３および図４に示すベクターｐＴＧＦＧ３６およびｐＴＧ３６ｈｙｇである。
第ＩＸ因子の製造の場合、ビタミンＫの存在下で培養を実施するのが好ましく、ビタミンＫは好ましくは培養液１ｍｌあたり０．１から１００μｇ、より好ましくは培養液１ｍｌあたり１から２０μｇの量で存在できる。
【００２０】
本発明の実施態様（１）記載の方法は、
（ｃ）ステップ（ｂ）で単離された血液凝固因子を精製するステップ；および／または
（ｄ）ステップ（ｂ）で単離された、またはステップ（ｃ）で精製された血液凝固因子をウイルス不活性化処置に当てるステップ；
をさらに含む。
適当な精製ステップは純粋で、安定的かつ高活性の産物の収量を最大にする当業界で既知の方法を含み、免疫アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等およびその組み合わせから選択される。特にヒト血漿からの凝固因子の詳細な精製プロトコールは例えば国際公開公報第９３／１５１０５号、欧州特許第０８１３５９７号、国際公開公報第９６／４０８８３号および国際公開公報第９６／１５１４０／５０号に開示されている。組換え第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を単離するのに必要な特異的な要件にこれらを容易に適合させることができる。第ＩＸ因子については、硫酸アンモニウム沈殿ステップ、続いてＤＥＡＥおよびＨＩＣテンタクルクロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを含む有効なプロトコールが紹介されている（米国特許第５９１９９０９号）。精製手順の間および後の精製されたタンパク質量および活性をＥＬＩＳＡおよび凝固アッセイによりモニターできる。
【００２１】
精製されたタンパク質試料中または選択した分泌組換えタンパク質を含む細胞培養上清から直接得られる産物中の可能な感染性夾雑物の問題を打破するために、試料および／または培養上清を熱処理（乾燥または液体状態で、プロテアーゼインヒビターなどの化学物質を添加して、または添加せずに）などのウイルス不活性化の手順で処理できる。ウイルス不活性化の後、化学物質を除去するためのさらなる精製ステップが必要である。特に血漿から単離された第ＶＩＩＩ因子の場合、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーによる高純度のウイルス不活性化タンパク質の収集が記載されている（国際公開公報第９３／１５１０５号）。加えて、血漿または他の生物学的資源から高純度の非感染性凝固因子を製造するためのいくつかの方法が報告されている。潜在的な感染性物質を２相系を形成する疎水性相で処理し、続いてそこから水不溶性部分を除去することにより、脂質コーティングされたウイルスは効果的に不活性化される。さらなる利点は非イオン性生体適合性界面活性剤およびジアルキルまたはトリアルキルホスフェートでの処置と同時にまたは引き続いて疎水相処置を補足することであることが解明された（国際公開公報第９６３６３６９号、欧州特許第０１３１７４０号、米国特許第６００７９７９号）。非脂質コーティングウイルスには非イオン性界面活性剤で処理し、続いて数時間の加熱ステップ（６０から６５℃）からなる不活性化プロトコールが必要である（国際公開公報第９４／１７８３４号）。
【００２２】
前記の結果に鑑み、ヒト細胞株に基づく有効なタンパク質発現系と潜在する危険性を有する感染性因子を不活性化するための改善された方法との組み合わせが、組換え凝集因子の製造のために安全で容易に使用される方法として提供される。
さらに、本発明の実施態様（６）によれば、優れた第ＶＩＩＩ因子変異体が提供される。該第ＶＩＩＩ因子変異体を医薬組成物の一部にでき、血友病を治療するための医薬品の調製のために使用でき、血友病の治療のための方法に応用できる（本発明の実施態様（１１）から（１３））。前記の医薬組成物および上記医薬品は治療上有効量、例えば５０から５００μｇ（国際単位（ＩＵ）に対応する第ＶＩＩＩ因子２００ｎｇを含む）の第ＶＩＩＩ因子を含有する。血友病の型により、患者は第ＶＩＩＩ因子を年間用量２０００００ＩＵまで投与され、通常週１回または週２回投与される。
【００２３】
実施態様（１１）から（１３）の血友病を治療する方法に適用される医薬組成物、医薬品または調製物は治療上有効量の実施態様（６）の第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは実施態様（９）の遺伝子トランスファーベクターを含有する。前者の場合、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ溶液）；無機塩例えばＣａＣｌ₂（好ましくは２から５ｍＭ）；アミノ酸例えばグリシン、リジン、およびヒスチジン（好ましくはアミノ酸あたり０．１から１Ｍ）；二糖類例えばスクロースおよび／またはトレハロース（好ましくは０．４から１Ｍ）；有機塩例えばクエン酸ナトリウム（好ましくは５０ｍＭまで）；等の医薬上許容し得る添加剤を含有してよい。調製物は水性または非水性でよい。後者の場合、主要成分はグリセロールおよび／またはポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−３００）である。調製物は乾燥形態でもよい（投与前に望ましい溶媒に溶解すべきである）。
前記したように、本発明の実施態様（９）記載の遺伝子トランスファーベクターを医薬組成物の一部にでき、血友病を治療するための医薬品の調製のために使用でき、血友病の治療のための方法に適用できる（本発明の実施態様（１１）から（１３））。該医薬組成物および医薬品はさらに適当なマトリックス処方、例えば国際公開公報第００／４９１４７号（その開示は参考文献として本明細書に組み込まれる）で論じられる脂質またはホルモンを含有してよい。遺伝子トランスファーベクターまたは本発明の遺伝子トランスファーベクターを含む医薬組成物または医薬品を経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経粘膜（バッカル、鼻腔用スプレイなど）により、または遺伝子ガンにより投与できる。経口投与（例えば微粉化ホルモン分散物にて）が好ましい。
【００２４】
本発明の実施態様（６）の第ＶＩＩＩ因子ムテインは前記の実施態様（３）に記載されるとおりであるのが好ましい。該第ＦＶＩＩＩ因子ムテインをさらに標準的な組換え技術、例えば：
（ａ）実施態様（８）のベクターで形質転換された、および／または実施態様（７）のＤＮＡを含有する宿主細胞を培養すること（これはまた少なくとも一つのウイルス転写アクチベータータンパク質を安定的に発現し、ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結したウイルス転写プロモーターを有するベクターを保持する不死化ヒト細胞株を培養することも含む）；および
（ｂ）培養液から血液凝固因子を単離すること；
を特徴とする方法により調製することができる。適当な不死化ヒト細胞株、転写アクチベータータンパク質およびウイルスプロモーターはこれ以前に記載されたものである。該方法において利用される不死化ヒト細胞株は好ましくは二つのウイルス転写アクチベータータンパク質、最も好ましくは温度感受性ＳＶ４０Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ａタンパク質を発現する。この方法はさらに前記した精製およびウイルス不活性化ステップ（ｃ）および（ｄ）を含有してよい。
市販の細胞株２９３Ｔ（ＥＣＡＣＣ：ｔｓａ２０１、ｒｅｆ．９６１２１２２９）は２００１年２月２０日、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２４９４でＤＭＳＺ（ドイッツェ・サムルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ゼルクルツレン・ＧｍｂＨ、マッシェルオーダー・ウェグ １ｂ、３８１２４ ブラウンシュバイッヒ、ドイツ）に寄託された。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【００２５】
【実施例】
実施例１−第ＶＩＩＩ因子のクローニング：
組換え第ＶＩＩＩ因子の配列は完全なヒト肝細胞ＲＮＡプールを逆転写することにより得られた。その後、制限部位を含むように設計されたプライマーを用いて標準的なＰＣＲにより４つの断片（１／２、３／４、５／６、７／８）を増幅した。断片３／４および５／６組み合わせるために、プラスミドｐＢＳＦＶＩＩＩ３／４のＳｍａＩ／ＳａｌＩ断片をｐＢＳＦＶＩＩ５／６のＳａｌＩ部位にブラント挿入し、ｐＢＳＦＶＩＩＩ３／６を得た。次にｐＢＳＦＶＩＩＩ３／６をＸｈｏＩ／ＢｓｐＨＩ、および部分的にＡｌｗ４４Ｉで消化して断片３／６を得た。ｐＢＳＦＶＩＩＩ１／６を得るこの手段により、この断片およびｐＢＳＦＶＩＩＩ１／２のＰｓｔＩ／Ａｌｗ４４Ｉ断片をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＢＳＦＶＩＩＩ１／２のベクターバックボーンに１ステップで連結した。ｐＢＳＦＶＩＩＩ７／８をＳｍａＩおよび部分的にＭｖａ１２６９Ｉで消化することにより断片７／８が得られ、ＸｈｏＩおよびＭｖａ１２６９Ｉで切断したｐＢＳＦＶＩＩＩ１／６に連結し、ｐＢＳＦＶＩＩＩ１／８を生じた。最終的にｐＢＳＦＶＩＩＩ１／８のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片をオクタジーンベクターｐＴＧＦＧ６７（該ベクターの製造はＰＣＴ／欧州特許第００／０１３６８号に開示されている）のＳａｌＩ部位にブラント挿入し、ヒト第ＶＩＩＩ因子の真核細胞発現ベクターであるｐＴＧＦ８−１が得られた（図１および図２参照）。得られたベクターは変異Ｖ１６２Ａ、Ｓ２０１１ＮおよびＶ２２２３Ｅを有する第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードする。
【００２６】
実施例２−第ＩＸ因子のクローニング：
ベクターｐＵＣ１９（ＭＢＩファーメンタス）をＸｂａＩで消化し、クレノウ酵素で処置し、再連結した。このＸｂａＩ欠失ベクターをＥｃｏＲＩ部位を欠失させるために、次いでＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ酵素で処置し、再連結した。このベクターのＳａｃＩ部位にＸｂａＩ部位を挿入するために、ＳａｃＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処置し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ＸｂａＩリンカーＣＴＣＴＡＧＡＧ（バイオラブズ＃１０３２）と連結した。新規に作製したベクターをＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより別のＸｂａＩ部位を挿入し、それをクレノウで処置し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ＸｂａＩリンカーＣＴＣＴＡＧＡＧ（バイオラブズ＃１０３２）と連結した。このベクターをｐＵＣ１９／Ｘと命名した。
ベクターｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ（クロンテック）に存在するＸｂａＩ部位を破壊するために、このベクターをＸｂａＩで消化し、クレノウ酵素で処置し、再連結し、ベクターｐＧＦＰ／０を得た。ｐＧＦＰ／０をＭｌｕＩで消化し、それをクレノウ酵素で処置し、それをＢａｍＨＩで消化した後、ＧＦＰ遺伝子を含む２．３ｋｂの断片を単離した。この断片をＳａｌＩで消化し、クレノウ酵素で処置し、ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＵＣ１９／Ｘのマルチプルクローニング部位に挿入した。得られたベクターをｐＴＧＦＧ１と命名した。
オリゴヌクレオチド（メタビオン）ＰＲＥ−Ｓ（５‘−ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＣＧ ＴＡＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＧＴ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ−３’；配列番号：１０）およびＰＲＥ−ＡＳ（５‘−ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＴＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＡＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＴＣ ＴＡＧ ＣＴＡ ＣＧＡ ＡＧＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ−３’；配列番号：１１）
をハイブリダイズし、キナーゼ反応によりリン酸化し、インサートＰＲＥ（ｄｓ）を得た。
ベクターｐＴＧＦＧ１をＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、クレノウ酵素で処置し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これを次いでＰＲＥ（ｄｓ）インサートに連結し、ベクターｐＴＧＦＧ５を得た。
ベクターｐＵＣ１９（ＭＢＩファーメンタス）をＳａｌＩで消化し、クレノウ酵素で処置し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。これをＮｏｔＩ−リンカーＧＣＧＧＣＣＧＣ（バイオラブズ＃１０４５）に連結し、ベクターｐＵＣ１９／Ｎを得た。
第ＩＸ因子オープン・リーディング・フレームの開始および終止コドンに重なる２個のプライマーを用いてヒト肝臓ｃＤＮＡ（クロンテック）から第ＩＸ因子ｃＤＮＡを増幅し、完全なオープン・リーディング・フレームを含む１３８７ｂｐの断片を得た。クローニングを容易にするために、ＥｃｏＲＩ（上流）およびＢａｍＨＩ（下流）の制限部位を各プライマーの末端に含む。反応容量５０μｌ［１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．８５）、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄］でＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）を用いて、９６℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０サイクル、続いて７２℃で１０分間の最終伸長ステップで増幅を実施した。
反応生成物をＰＵＣ１９のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲートし、大腸菌ＤＨ５−αに形質転換した。陽性のクローンを選別した。標識プライマー（ＩＲ−７００）を用いる両方の末端からのサイクルシークエンシング（アマシャム）およびＬｉＣｏｒシークエンシングシステムの自動分析（ＭＷＧ、バイオテック）により配列を確認した。
以下のプライマーを使用した：
ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＡＡＧＧＴＴＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣ（上流；配列番号：１６）
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＴＣＣ（下流；配列番号：１７）。
ＰｓｔＩで消化し、Ｔ４−ポリメラーゼで処置し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した、前記で調製されたベクターｐＵＣ１９／ＮのＰｓｔＩ部位に、ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離したヒト凝固第ＩＸ因子のオープン・リーディング・フレームを含む１．４ｋｂの断片を挿入した。得られたベクターｐＵＣ１９／Ｎ−ＦＩＸからヒト凝固第ＩＸ因子のオープン・リーディング・フレームを含む１．４ｋｂの断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩの二重消化により切り出した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ二重消化したベクターｐＴＧＦＧ５の４．３ｋｂの断片に連結し、図３に示すベクターｐＴＧＦＧ３６を得た。このベクターは第ＩＸ因子をコードする発現カセットを細胞に分配するために好ましいベクターで、そのＤＮＡ配列を配列番号：６に示す。
【００２７】
実施例３−タンパク質発現のためのヒト細胞株
好ましい細胞株は、ＳＶ４０温度感受性Ｔ抗原を安定的に発現する、形質転換されたヒト胚性腎臓細胞株（２９３、ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）であるｔｓＡ２０１（ＥＣＡＣＣ Ｒｅｆ．：９６１２１２２９）である（Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１５２：３９（１９９６）；Ｇｅｎｅ １５６：２３５（１９９５）；ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：１２７８５（１９９４）；Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．４２７：１３６（１９９４）；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：５７（１９９４）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：９０６（１９９３））。この細胞株の他の名称には２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３７９（１９８７））および２９３Ｔなどがある。この上皮性様細胞株は種々の機能発現アッセイにおいて用いられており、高レベルの組換えタンパク質を生産することが報告されている。これらは２ｍＭ グルタミンおよび１０％ ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で培養できる。第ＩＸ因子を効果的に製造するために、ビタミンＫを１００μｇ／ｍｌまで添加することにより培地を改変することができる（米国特許第４７７０９９９号）。
発現されたポリペプチドの精製を簡単にするために、適当な補助剤を含む血清不含またはタンパク質不含培地で細胞を培養することができる。安定性の理由から、分泌された第ＶＩＩＩ因子は培地中にｖＷＦの存在が必要である（米国特許第５１９８３４９号）。リポタンパク質、リン脂質、ポリグリコール、微量金属、ヘパリン、非イオン性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加もまた報告されている（欧州特許第０２５４０７６号、米国特許第５６７９５４９号、米国特許第５１９８３４９号、米国特許第５２５０４２１号、米国特許第５５７６１９４号、欧州特許第０８７２４８７号、国際公開公報第９４／１１５２５号、米国特許第５３７８６１２号）。
【００２８】
実施例４−第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の一過性生産のための２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウムトランスフェクション：
トランスフェクションの前日に、密集成長させた２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュでＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ（ＦＩＸ用には１０μｇ／ｍｌ ビタミンＫ）６ｍｌ中に低密度でプレートする。チェンおよびオカヤマ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５（１９８７））におおよそ従って、トランスフェクションを実施した。第ＶＩＩＩ因子の製造用にはプラスミドｐＴＧＦ８−１ １２μｇを、第ＩＸ因子の製造用にはｐＴＧＦＧ３６をトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に培地を新鮮なものと交換し、トランスフェクションの３日後に上清を回収し、さらに精製するかあるいはさらに精製することなくＥＬＩＳＡまたはコアグロメトリーにより分析した（実施例５および６を参照）。
【００２９】
実施例５−ＥＬＩＳＡによるＦＩＸおよびＦＶＩＩＩ濃度の決定：
第ＩＸ因子：
捕獲抗体としてヤギポリクローナル抗ヒトＦＩＸ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ）を用いるＥＬＩＳＡにより、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清中のヒト組換え第ＩＸ因子のレベルを決定した。全インキュベーションは加湿チャンバー中２２℃で２時間実施した。プレート（ダイネックス、イムロン−４）を抗体８．８μｇ／ｍｌのコーティングバッファー１００μｌでコーティングした。記載した条件下ではブロッキングは必要ない。非特異的相互作用をブロックするためにはＰＢＳ・トゥイーン（登録商標）（０．１容量／容量％）でプレートを４回（エンコア２０００、メルク）洗浄するので十分である。
各々別の工程の後、未結合のタンパク質を除去するために洗浄が必要とされた。１０ｍＭ ＰＭＳＦ１０μｌで処置した上清１００μｌおよび０．１１Ｍ クエン酸ナトリウム１０μｌを各ウェルに加えた。希釈バッファー（ＨＢＳ−ＢＳＡ−ＥＤＴＡ−トゥイーン（登録商標））で試料および標準品（ヒト第ＩＸ因子、ハウス標準、オクタファルマ）の希釈を行い、１００μｌ／ウェルでインキュベートした。検出抗体は１μｇ抗体／ｍｌ希釈バッファー濃度のペルオキシダーゼ標識ヤギポリクローナル抗ＦＩＸ（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ）であり、１００μｌ／ウェルでインキュベートした。各ウェルに基質としてＡＢＴＳ（ロッシュ）１５０μｌを加え、１から２時間後４０５ｎｍで比色反応を検出した。標準濃度対標準吸収の直線回帰により結果を算出し、以下の表にまとめる：
【００３０】
【表１】
細胞数［／ｍｌ］ 第ＩＸ因子濃度［ｎｇ／ｍｌ］ 凝固時間［秒］
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
２．１×１０⁵ ３６ ４５
８．７×１０⁵ ２０ ７９
正常血漿：３７から３９秒
第ＩＸ欠損血漿：１３７から１４０秒
【００３１】
第ＶＩＩＩ因子：
捕獲抗体としてアフィニティー精製ポリクローナルヒツジ抗ＦＶＩＩＩ：Ｃ調製物（Ｆ８Ｃ−ＥＩＡ−Ｃ、アフィニティー・バイオロジカルズ）を用いてＥＬＩＳＡによりトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の培養濾液中のヒト組換え第ＶＩＩＩ因子のレベルを決定した。加湿チャンバー中２２℃で２時間コーティングを実施した。コーティングバッファー（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中１００倍希釈の抗体１００μｌでプレート（ダイネックス、イムロン−４）をコーティングした。非特異的相互作用をブロックするためにＰＢＳ・トゥイーン（登録商標）（０．１容量／容量％）でプレートを４回洗浄（エンコア２０００、メルク）で十分であった。
各々別の工程の後、未結合のタンパク質を除去するために洗浄が必要とされた。４８時間のインキュベーションの後ｐＴＧＦ８−３で安定的にトランスフェクトされた異なる２９３Ｔクローンから回収された培養濾液試料の各々１００μｌを各ウェルに加えた。希釈バッファー（ＨＢＳ−ＢＳＡ−ＥＤＴＡ−トゥイーン（登録商標））でＦＶＩＩＩ標準品（ハウススタンダード、オクタファルマ）の希釈を行い、１００μｌ／ウェルでインキュベートした。検出用にペルオキシダーゼ標識抗ＦＶＩＩＩ（Ｆ８Ｃ−ＥＩＡ−Ｄ、アフィニティー・バイオロジカルズ）の既製の希釈物をウェルあたり１００μｌで６０分間インキュベートした。比色反応用に使用の直前にＯ−フェニレンジアミン（Ｐ−６９１２、シグマ）５ｍｇ錠剤を基質バッファー１２ｍｌに溶解し、３０％ Ｈ₂Ｏ₂ １２μｌで充当した。この基質溶液１５０μｌを各ウェルに加え、暗闇、室温で１０分間インキュベートし、各ウェルに２．５Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄ ５０μｌを添加して反応を停止させた後、ＭＲＸリーダー（ダイネックス）で４９０ｎｍでの比色記録を行った。標準濃度対標準吸収の直線回帰により結果を算出し（図７Ａ）、図７Ｂにまとめる。
【００３２】
実施例６： ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子活性の検出：
細胞培養２９３Ｔ細胞（実施例４に記載されるようにｐＴＧＦ８−１を用いてリン酸カルシウム沈殿によりトランスフェクトされた）の上清中のヒト組換え第ＶＩＩＩ因子の凝固活性を以下のとおり決定した：
手動凝固装置（ＭＬ−２、インストラメンテーション・ラボラトリーズ）でセファリン（ホスファチジルエタノールアミン）活性化を用いる部分的トロンボプラスチン時間アッセイに基づいて凝固活性を検定した。実験のために、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の無希釈上清１００μｌ、欠損血漿（プロゲン）１００μｌおよびセファリン（インストラメンテーション・ラボラトリーズ）１００μｌを３７℃で５分間インキュベートした。ＣａＣｌ₂ １００μｌを添加することにより凝固を開始した。試料の凝固時間を正常血漿と比較した。結果を図５Ｂにまとめる。図５Ｂから示され得るように、ｐＴＧＦ８−１でトランスフェクトされた細胞からの細胞上清は正常血漿と比較して凝固活性を示すが、トランスフェクトされていない細胞では第ＶＩＩＩ因子を欠損する血漿と同等の値を呈する。
第ＩＸ因子に関して類似のアッセイを実施した。結果を実施例５の表に示す。ビタミンＫの存在に対する発現の依存性については図１０を参照されたい。
【００３３】
実施例７− ウイルス不活性化：
米国特許第６００７９７９号の方法に従って、ウイルス不活性化を実施した。すなわち、潜在的感染性タンパク質溶液に以下の化合物を添加し、続いて攪拌した：
１．トゥイーン（登録商標）８０、０．２ｍｌおよびＴＮＢＰ、０．０６ｍｌを溶液１９．７４ｍｌに添加した；または
２．トリトン（登録商標）Ｘ−１００、０．２ｍｌおよびＴＮＢＰ、０．２ｍｌを溶液１９．６ｍｌに添加した。
ヒマシ油１ｍｌを調製物１および２に添加し、次いでこれを室温で１時間、激しく抽出した。
各々の場合で相分離のために遠心を行った。感染性対照に関しては、各１ｍｌの試料を水性分画から繰り返し採取した。
【００３４】
実施例８−第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を安定的に発現する細胞株の確立：
好ましいベクターｐＴＧＦ８−１およびｐＴＧＦＧ３６は各々哺乳動物細胞における第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の一過性発現のための構築物を含有する。安定的にトランスフェクトされた細胞クローンの選別方法を可能にするために、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフォトランスフェラーゼのカセット（ＴＫ−ＨｙｇからのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｍｖａ１２６０Ｉ断片、クロンテック）を両方のベクターに存在するＳｍａＩ部位にサブクローニングした。その結果得られた構築物（ｐＴＧＦ８−１−ｈｙｇおよびｐＴＧ３６ｈｙｇ）は、ＣＭＶ−プロモーターおよびＳＶ４０−ポリアデニル化シグナルを有するヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の発現カセット、並びにＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターおよびＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルを有するハイグロマイシン−Ｂ−ホスフォトランスフェラーゼ発現カセットをシスで含む（図４参照）。
ベクターｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓおよびｐＴＧＦ８−３（図６、配列番号：１２および１４）はｐＴＧＦ８−１ｈｙｇの誘導体であり、そこでは点突然変異Ｖ１６２Ａ、Ｓ２０１１ＮおよびＶ２２２３Ｅ（ｐＴＧＦ８−２ｈｙｇ−ｓ）およびＳ２０１１Ｎ（ｐＴＧＦ８−３）がクイックチェンジ（登録商標）プロトコール（ストラタジーン）を用いるＰＣＲ依存性の方法により野生型配列に復帰した。
凝固因子のコーディング配列を選択した他のいずれかの遺伝子配列と置換することができる。これらの構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクションおよび続くハイグロマイシン抵抗性に関する選別による安定的な発現をする細胞株の確立を可能にする。さらに、プラスミドはプロゲステロン応答性因子（ＰＲＥ）を含む。ｐＴＧ３６ｈｙｇを用いた一過性トランスフェクション実験では、ＥＬＩＳＡおよびコアグロメトリックアッセイにより培地１ｍｌあたり約４０ｎｇの活性第ＩＸ因子が製造されたことを示すことができた（実施例５および６参照）。
第ＩＸ因子の製造に関しては、１０％ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌビタミンＫを添加したＤＭＥＭ中で２９３Ｔ細胞を培養した（米国特許第４７７０９９９号、図１０をも参照）。まず、安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を有効に選別するための抗生物質の臨界濃度を確立しなければならなかった。このために、細胞を低希釈でプレートに播き、１０から８００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢの存在下で成育した。２００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度で２週間後、細胞は成長していなかったので、この濃度を安定的にトランスフェクトした細胞の選別のために選択した。
標準的なトランスフェクションを１０ｃｍディッシュで２９３Ｔ細胞を用いて分配前日に１：１５の比率で実施した。リン酸カルシウム沈殿法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６（７）：６３２−６３８）を用いて、ディッシュあたりプラスミド１２μｇをトランスフェクトし、２日後、培地を２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有する新鮮な培地と交換した。選別の２から３週後、ＥＬＩＳＡ（実施例５を参照）により第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の存在に関して培地を試験した。陽性クローンを単離し、２４ウェルプレートに移した。ＥＬＩＳＡおよび活性決定によるスクリーニングの後、陽性クローンをさらに２回のサブクローニングのラウンドに当て、次いで展開した後、そのアリコートをさらなる使用および特徴づけのために凍結した。
【００３５】
実施例９： 第ＶＩＩＩ因子発現のインサイチュー免疫蛍光検出による安定的にトランスフェクトされた細胞の表現型均一性の証明：
ＤＭＥＭ＋９．１％ ＦＢＳを用いた付着培養から、ｐＴＧＦ８−３で安定的にトランスフェクトした５ｘ１０⁷個の２９３Ｔ細胞（クローン４９／１９）およびトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞（陰性対照）の各々をトリプシン消化により培養ディッシュから剥離し、数回洗浄し、ＰＢＳバッファー５ｍｌに再懸濁した。
これらの細胞懸濁液２μｌを滅菌顕微鏡用ガラススライドに移し、全液体が蒸発するまで室温でインキュベートした。細胞を７０％エタノール中１０分間固定し、室温で５分間乾燥した。ＰＢＳバッファー中１０％希釈のＦＢＳ中でインキュベートすることにより、スライドを非特異的検出に対してブロックした。１次抗体（ｓｈ抗ＦＶＩＩＩ：Ｃ Ｆ８Ｃ−ＥＩＡ−Ｃ、アフィニティー・バイオロジカルズ）を１０％ＦＢＳおよび０．１％サポニンを含むＰＢＳバッファーで１００倍希釈し、加湿インキュベーションチャンバー中室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳでしっかり洗浄した後、１００倍希釈の２次抗体（ｒｂ抗ｓｈ ＣＹ３コンジュゲート３１３−１６５−００３、ジャクソン・イムノ・リサーチ）を調製し、前記の方法でインキュベートした。続いて顕微鏡用プレパラートをしっかり洗浄し、５０％グリセロール層およびカバーガラスにより被覆した。白色光、および蛍光顕微鏡（５７０ｎｍで放射）により可視化した。
結果を図８に表す。
【００３６】
実施例１０： 培養濾液中の組換え第ＩＸ因子における熱安定性試験：
１００μｇ／ｍｌビタミンＫの存在下、ｐＴＧＦＧ３６での一過性のトランスフェクションの４８時間後に２９３Ｔ細胞から回収し、−８０℃で７日間保存した培養濾液を迅速に解凍し、５００μｌのアリコート７個に分配し、次に続いてこれを以下の温度のインキュベーションに当てた：
【００３７】
【表２】
試料 温度（℃） 時間（分）
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１ ０ ２４０
２ ２０ ３０
３ ２０ ６０
４ ２０ ２４０
５ ３７ ３０
６ ３７ ６０
７ ３７ ２４０
【００３８】
サンプルを氷上で冷却し、実施例６で示す概要のとおりＦＩＸ活性を決定した（二重測定）。結果を図９に示す。３７℃で２４０分までのインキュベーション条件内で活性はほぼ安定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は欠失したＢドメイン有する第ＶＩＩＩ因子の構築に利用される断片を示す（実施例１）。
【図２】 図２は８７２０ｂｐの環状ＤＮＡであるベクターｐＴＧＦ８−１を示し、その正確なＤＮＡ配列は配列番号：３に示す（該ＤＮＡ配列によりコードされる第ＶＩＩＩ因子タンパク質に関しては配列番号：４を参照）。
【図３】 図３は５７５３ｂｐの環状ＤＮＡであるベクターｐＴＧＦＧ３６を示し、その正確なＤＮＡ配列は配列番号：６に示す（配列番号：６内の塩基６８９から２０７１は第ＩＸ因子タンパク質をコードする）。
【図４】 図４は８１２４ｂｐの環状ＤＮＡであるベクターｐＴＧ３６ｈｙｇを示す。
【図５】 図５Ａは本発明の好ましいリンカー配列（配列番号：９）を表す、図５Ｂは実施例６で決定される組換えｈＦＶＩＩＩの凝固時間を示す。
【図６】 図６は１０６９８ｂｐの環状ＤＮＡであるｐＴＦＧ８−２ｈｙｇ−５およびｐＴＧＦ８−３の共通する分子構造を示し、その正確なＤＮＡ配列は配列番号：１２および１４に示す（該ＤＮＡ配列によりコードされる第ＶＩＩＩ因子に関しては配列番号：１３および１５を参照）。
【図７】 図７Ａは実施例５に記載されるＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡの検量線を示し、図７Ｂは実施例５に記載される、異なる培養濾液における組換えＦＶＩＩＩ濃度の測定結果を表す。
【図８】 図８は実施例９に記載される第ＶＩＩＩ因子特異的免疫蛍光アッセイの結果を示す。上列：ｐＴＧＦ８−３、クローン４９／１９で安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞。下列：陰性対照：トランスフェクトされていない２９３Ｔ細胞。ＡおよびＣ：白色光、フィルターなし；ＢおよびＤ：フィルター５５０ｎｍでの蛍光による第ＶＩＩＩ因子検出。
【図９】 図９は実施例１０に記載される培養濾液におけるＦＩＸ活性に及ぼす熱処理の影響を示す。
【図１０】 図１０は、培地へのビタミンＫの添加に対する活性組換え第ＩＸ因子の発現の依存性を示す。
【配列表】

Claims (27)

1. Ａｒｇ７４０とＧｌｕ１６４９の間のＢドメインが、少なくとも３個のＡｒｇ残基を有し、１０から２５個のアミノ酸残基を含有してなるＡｒｇリッチのリンカーペプチドにより置換される第ＶＩＩＩ因子ムテインであって、前記第ＶＩＩＩ因子のナンバリングは配列番号：２で示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子の配列に対応する、前記ムテイン。
2. 第ＶＩＩＩ因子ムテインが以下の突然変異（ａ）１６２番目のＶａｌがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＰｒｏから選択される中性アミノ酸残基により置換される；
   （ｂ）２０１１番目のＳｅｒがＡｓｎ、ＴｈｒおよびＧｌｎから選択される親水性アミノ酸残基により置換される；
   （ｃ）２２２３番目のＶａｌがＧｌｕおよびＡｓｐから選択される酸性アミノ酸残基により置換される；
   の少なくとも一つを有する、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
3. 第ＶＩＩＩ因子ムテインが突然変異（ａ）および（ｂ）の少なくとも一つを有する、請求項２に記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
4. 第ＶＩＩＩ因子ムテインが突然変異（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の３種全てを有する、請求項２に記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
5. 突然変異（ａ）において、１６２番目のＶａｌがＡｌａに置換され、突然変異（ｂ）において、２０１１番目のＳｅｒがＡｓｎに置換され、および／または突然変異（ｃ）において、２２２３番目のＶａｌがＧｌｕに置換される、請求項２から４のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
6. Ａｒｇリッチのリンカーペプチドが１４から２０アミノ酸残基を有する、請求項１から５のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
7. リンカーがアミノ酸配列ＳＦＳＱＮＳＲＨ、および／または
   アミノ酸配列ＱＡＹＲＹＲＲＧを含有する、請求項１から６のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
8. リンカーが配列ＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ、を有する、請求項７に記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
9. 配列番号：４、１３または１５のアミノ酸１から１４４０番目を含有する、請求項１に記載の第ＶＩＩＩ因子ムテイン。
10. 請求項１から９のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードするＤＮＡ配列。
11. 配列番号：１に示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡ配列に関する、突然変異Ｔ４８５Ｃ、Ｇ６０３２ＡおよびＴ６６６８Ａの少なくとも一つを有する、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
12. 配列番号：１に示される成熟野生型第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡ配列に関する、突然変異Ｔ４８５Ｃ、Ｇ６０３２ＡおよびＴ６６６８Ａの３種全てを含有する、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
13. 請求項１０から１２のいずれか一つに記載のＤＮＡを含有するベクター。
14. ベクターがそれぞれ配列番号：３、１２および１４で示されるｐＴＧＦ８−１、ｐＴＧＴ８−２ｈｙｇ−ｓまたはｐＴＧＦ８−３である、請求項１３に記載のベクター。
15. 遺伝子トランスファーベクターである、請求項１３に記載のベクター。
16. 請求項１３に記載のベクターで形質転換された、および／または、請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含有する宿主細胞。
17. 請求項１から９のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは請求項１５に記載の遺伝子トランスファーベクターを含有してなる医薬組成物。
18. 血友病を治療するための医薬を製造するための、請求項１から９のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテインまたは請求項１５に記載の遺伝子トランスファーベクターの使用。
19. 前記血友病が血友病Ａである、請求項１８に記載の遺伝子トランスファーベクターの使用。
20. （ａ）請求項１６に記載の形質転換宿主細胞を培養し、
    （ｂ）培養液から第ＶＩＩＩ因子ムテインを単離することを含む、請求項１から９のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテインの生産方法。
21. （ａ）シミアンウイルスＴ抗原を安定に発現し、第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結するＣＭＶプロモーターを含有するベクターを有する不死化ヒト細胞株を培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 不死化ヒト細胞株が不死化された腎臓、膀胱、肝臓、肺、心筋、平滑筋、卵巣または胃腸細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 不死化ヒト細胞株がヒト胎児腎臓細胞に由来し、好ましくは２９３Ｔ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ２４９４）である、請求項２２に記載の方法。
24. ベクターがさらに選択マーカーおよび／または調節配列を含有する、請求項２１から２３のいずれか一つに記載の方法。
25. 培養が、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の存在下で行われる、請求項２１から２４のいずれか一つに記載の方法。
26. さらに、
    （ｃ）ステップ（ｂ）で単離された血液凝固因子を精製すること；および／または、
    （ｄ）ステップ（ｂ）で単離された、またはステップ（ｃ）で精製された血液凝固因子をウイルス不活性化処理に供すること、を特徴とする、請求項２０から２５のいずれか一つに記載の方法。
27. 少なくとも一つのウイルス転写アクチベータータンパク質を安定に発現し、請求項２１から２３の方法のいずれか一つに記載の第ＶＩＩＩ因子ムテインをコードするベクターを有する不死化ヒト細胞株。

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