CN102321668A

CN102321668A - 一种表达重组人凝血因子ⅶ的方法及其专用载体

Info

Publication number: CN102321668A
Application number: CN 201110187960
Authority: CN
Inventors: 吕茂民; 章金刚; 王卓; 冯晶晶; 唐倩; 赵雄; 马玉媛; 尹惠琼; 杨姝
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明公开了一种高效表达重组人凝血因子VII的方法及其专用载体。该载体自上游至下游顺次包含人延伸因子1α亚基启动子EF-1α或巨细胞病毒即刻早期启动子CMV-IE，人凝血因子VII的cDNA基因，人工合成的内含子，内部核糖体进入位点IRES，谷氨酰胺合成酶基因GS或二氢叶酸还原酶基因DHFR，牛生长激素poly A信号序列和质粒的复制结构域。对表达样品的检测结果证明，转染有本发明4种重组载体的CHO细胞能稳定、高效表达重组人凝血因子VII，平均表达量约为5-13mg/L，而且表达样品具有较高的促凝活性，表达产物能缩短血浆的凝血时间，通过活性计算，活性最高者相当于524％血浆FVII的活性。本发明将在重组人凝血因子VII的高效表达中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种表达重组人凝血因子Ⅶ的方法及其专用载体

技术领域

本发明属于基因工程技术领域中蛋白的重组表达方法，特别是涉及一种高效表达重组人凝血因子VII的方法及其专用载体。

背景技术

凝血过程是机体的重要保护机制之一，是一系列凝血因子相继酶解激活的过程，最终结果是凝血酶和纤维蛋白凝块的形成。这一过程包括内源性凝血途径和外源性凝血途径，这两条途径的主要区别是启动方式和参加的凝血因子不完全相同，但参与两条凝血途径的某些凝血因子能够相互激活，将两条途径联系起来。其中，凝血因子VII发挥了重要作用。

凝血因子VII(coagulation factor VII，FVII)是形成凝血块起始的关键分子之一，在凝血过程中发挥着极其重要的作用。它主要通过与暴露的组织因子(tissue factor，TF)结合，形成TF-FVII复合物而启动外源性凝血途径，同时对内源性凝血途径的启动也具有特殊的调控作用。

人FVII主要由肝脏合成，是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族成员。其基因含9个外显子，全长12.8kb，定位于染色体13q34。人FVII的cDNA(GenBank号：NM 019616)由1335bp组成，编码406个氨基酸残基，分子量约为45.5kDa，经过翻译后修饰，加上侧链的糖基，分子量可达50kDa。

人血浆中FVII主要以酶原形式存在，而活性形式的FVII含量仅占约1％。当FVII的Arg152-Ile153之间的肽键裂解后，由单肽链形式转变为双肽链形式，即形成有酶活性的FVIIa。其中1-152位的氨基酸残基组成FVIIa的轻链，分子量为20kDa；153-406位的残基组成FVIIa的重链，分子量为30kDa。轻链与重链由原第135位和262位氨基酸残基之间的单个二硫键连接。轻链始端约38个氨基酸残基构成γ-羧基谷氨酸区，亦称“Gla”区，其后有两段氨基酸残基的排列顺序与上皮生长因子相似的区域，称为“EGF”区；重链部分氨基酸残基的排列顺序与丝氨酸蛋白酶家族有显著同源性，是FVIIa具有催化作用的功能区，称为丝氨酸蛋白酶区。

FVII在合成过程中所经历的翻译后修饰包括：Asn145和Asn322的N-糖基化，Ser52和Ser60的0-糖基化以及Gla区内多处谷氨酸残基(第6、7、14、16、19、20、25、26、29、35位)的γ-羧基化。

在正常生理条件下，人体内只有大约1％的FVII具有酶活性，而血浆中FVII的水平非常的低，应用放免法测定大约为200-400ng/mL，而且随个体和人种有比较大的波动。人FVII的半衰期非常短，GE Rivard等(Rivard GE，Kovac I，Kunschak M，et al.Clinical study of recovery and half-life of vapor-heated factor VII concentrate.Transfusion.1994，34(11)：975-981.)证明FVII在血浆中的半衰期大约在5小时到7小时之间。

重组人凝血因子VII是指应用基因工程的方法将人FVII的cDNA基因导入哺乳动物细胞中进行体外表达，从而获得重组凝血因子VII。

Thim L等(Thim L，Bjoern S，Christensen M.Amino acid sequence andposttranslational modifications of human factor VIIa from plasma andtransfected baby hamster kidney cells.Biochemistry.1988，27：7785-7791.)比较了人FVII重组样品(rFVIIa)与血浆纯化样品(pd-FVIIa)的区别，发现两者的氨基酸序列完全相同，均与cDNA推测的结果一致，并且在N端均有一段长达60个氨基酸残基的信号肽序列。然而，两者在翻译后的修饰方面存在较大区别：①γ-羧基化：比较两者Gla区谷氨酸γ-羧基化发现，在pdFVHa中，所有10个可能的Gla残基全部γ-羧基化，而rFVIIa只有9个Gla残基完全γ-羧基化，1个部分γ-羧基化。但这个差别与功能似乎并无联系。②0-糖基化：pd-FVII含两个0-糖基化位点：Ser52和Ser60。在rFVIIa中也发现了这两个位点。Ser52有三种不同的葡聚糖结构：葡萄糖单体、葡萄糖-木糖和葡萄糖-(木糖)2。这三种结构在两种蛋白样品中的数量稍有不同。在Ser60位点，两者都发现了岩藻糖。位点特异性突变研究发现，0-糖基化与FVII同TF的结合有关。③N-糖基化：两者都发现在Asn145和Ash322完全N-糖基化，区别是rFVIIa具有比较高的岩藻糖含量和较低的唾液酸含量。

尽管存在结构上的不同点，Hedner U等(Hedner U，Ljundberg J，Lund-HansenT.Comparison of the effect of plasma-derived and recombinant human FVIIa invitro and in a rabbit model.Blood Coagul Fibrinolysis.1990，1(2)：145-153.)证明，两者的生物学功能是完全一样的。

重组产品的作用机制与人体内的正常凝血机制稍有不同。体外实验证明，rFVIIa会和FVII竞争TF受体。大剂量注射rFVIIa后，在启动凝血瀑布阶段，血浆高水平的rFVIIa克服了FVII的干扰，使TF与rFVIIa饱和，从而确保其发挥最大的生理作用，产生足够的活化血小板。在放大阶段，rFVIIa与血小板低亲和，并且不依赖TF产生FXa，因而比pd-FVII更加有效。低亲和性说明了治疗中rFVIIa高剂量的必要性。rFVIIa不与休眠的血小板结合，因而只有当发生损伤，TF暴露并且血小板被活化后才可以发挥凝血作用。

由于血浆中FVII含量比较少，纯化比较困难，对其适应症的研究仅限于FVII缺乏症。后来随着基因工程技术的发展，rhFVII成为了带抑制物的血友病人的主要替代疗法。最近的临床研究表明，FVII对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的止血具有令人满意的治疗效果。目前，其主要的临床适应症包括：带有凝血因子VIII抑制剂的血友病人、凝血酶产生障碍的病人、外科手术和严重创伤引发的大出血、先天性和获得性FVII缺陷等。

发明内容

本发明的目的是通过表达元件的优化，构建新型的重组人凝血因子VII表达载体，并建立完善的表达体系，利用加压筛选的方法使筛选基因获得扩增，该筛选基因加压扩增的同时又可以带动其侧翼目的基因的拷贝数增加，从而实现重组人FVII在哺乳动物细胞中的高效表达。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体，自上游至下游顺次包含以下表达元件：

1)启动子，选用人延伸因子1α亚基启动子(EF-1α)或巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV-IE)，优选为EF-1α启动子，该启动子不受细胞周期的限制，可以在细胞高密度培养时，持续地使目的基因表达；

2)人凝血因子VII的cDNA基因；

3)pIRESneo载体中的人工合成的内含子(IVS)，用于增强目的基因转录后mRNA的稳定性，从而提高目的基因的表达效率；

4)内部核糖体进入位点(IRES)，用于连接并启动筛选基因的表达，这样目的基因和筛选基因共用一个启动子，更有利于通过筛选基因的扩增使得人凝血因子VII基因得到扩增；

5)筛选基因，选用谷氨酰胺合成酶基因(GS)或二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，优选为GS基因；

6)牛生长激素poly A信号序列，作用是为转录后的mRNA加尾，使转录后的mRNA结构完整；

7)质粒的复制结构域。

在上述载体中，所述载体还可再包括抗生素筛选基因，如氨苄青霉素抗性基因，作用是载体复制过程中的筛选，位于载体中质粒复制起点的下游。

用于构建高效表达重组人凝血因子VII专用载体的出发载体可为任意的可在哺乳动物细胞表达外源基因的真核载体，如pIRESneo、pCIneo、pcDNA3或pcDNA5等，优选为pIRESneo。

具体来讲，有以下四种载体：

以pIRESneo为出发载体构建的携带EF-1α启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-GS-FVII；

以pIRESneo为出发载体构建的携带EF-1α启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-DHFR-FVII；

以pIRESneo为出发载体构建的携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-GS-FVII；

以pIRESneo为出发载体构建的携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-DHFR-FVII。

上述用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体可按照基因工程领域中的常规方法构建。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达重组人凝血因子VII的方法。

本发明所提供的高效表达重组人凝血因子VII的方法，是将上述专用表达载体转染哺乳动物细胞，然后通过MSX或MTX加压筛选获得阳性细胞克隆，进而通过增加MSX或MTX的浓度进行持续压力筛选，从而使人凝血因子VII基因随筛选基因扩增的同时获得拷贝数的增加，人凝血因子VII基因拷贝数的增加又可以使表达量增加，使得重组人凝血因子VII得以高效表达。

在上述高效表达重组人凝血因子VII的方法中，所述哺乳动物细胞可为CHO细胞、BHK细胞、HEK293细胞或Vero细胞等，优选为BHK细胞和CHO细胞。

可通过常用的细胞转染方法(如脂质体转染法、电击转染法或磷酸钙转染法等)将上述专用表达载体转染哺乳动物细胞。

所述MSX或MTX加压筛选阳性细胞克隆的方法为：将转染细胞用含有300-500μg/mL MSX或MTX的选择性培养基进行培养，间隔2-3天换液一次，待对照细胞全部死亡时，得到具有MSX或MTX抗性的哺乳动物细胞。

通过增加MSX或MTX的浓度对转染细胞进行持续压力筛选的方法为：将转染细胞继续用含有600-800μg/mL MSX或MTX的选择性培养基进行培养，间隔2-3天换液一次，从而使人凝血因子VII基因随筛选基因扩增的同时获得拷贝数的增加。

本发明提供了一种高效表达重组人凝血因子VII的方法及其专用载体。检测结果证明，转染有本发明重组载体的哺乳动物细胞不仅能稳定、高效表达重组人凝血因子VII，且具有较高的促凝活性，表达产物激活后能缩短血浆的凝血时间，通过活性计算，活性最高者相当于524％血浆FVII的活性。根据促凝活性估算表达量平均约为正常人血浆含量的2-5倍。本发明具有以下优点：

1)通过内部核糖体进入位点(IRES)使目的基因与筛选标记基因处于同一个开放读码框中，易于阳性细胞的筛选和克隆；

2)本发明中所采用的筛选基因(GS/DHFR)具有随筛选压力增大使得筛选基因拷贝数扩增的能力；

3)筛选基因拷贝数扩增的同时可以带动其侧翼的目的基因获得拷贝数的扩增，从而可以提高目的基因在细胞基因组中的拷贝数，达到提高表达效率的目的；

4)常用的哺乳动物细胞如CHO细胞、BHK细胞、HEK293细胞等均可以用作宿主细胞，易于培养和筛选。

综上所述，本发明将在重组人凝血因子VII的高效表达中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体的结构示意图

图2A为CHO抗性细胞中β-actin基因的拷贝数的SYBR GREEN Real Time Q-PCR检测结果的标准曲线

图2B为CHO抗性细胞中人凝血因子VII基因的拷贝数的SYBR GREEN Real TimeQ-PCR检测结果的标准曲线

图3为CHO抗性细胞表达上清中的重组人凝血因子VII的Western Blotting鉴定结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、构建用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-GS-FVII

以pIRESneo(GenBank号：U89673)为出发载体构建携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-GS-FVII(载体的结构示意图见图1)，具体方法包括以下步骤：

一、用于扩增人凝血因子VII基因cDNA序列的引物的设计与合成

根据已克隆的人凝血因子VII的cDNA序列(吕茂民等，人凝血因子VIIcDNA基因的克隆与鉴定.生物技术通报.2007，(4)：132-134.)，设计并合成了两条引物，分别在引物的两端引入EcoR V和EcoR I酶切位点，引物序列为：f7f：5′-CGG GAT ATC ATG GTCTCC CAG GCC CTC AG-3′和f7r：5′-GCG AAT TCC TAG GGA AAT GGG GCT CGC-3′。

二、重组表达表达载体pCMIR-GS-FVII的获得

以质粒pT-FVII(吕茂民等，人凝血因子VII cDNA基因的克隆与鉴定.生物技术通报.2007，(4)：132-134.)为模板，在引物f7f和f7r的引导下用PCR的方法扩增人凝血因子VII的cDNA序列。扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了约1335bp的DNA片段，与预期结果相符。用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR扩增的约1335bp的DNA片段，对其用限制性内切酶EcoR V和EcoR I双酶切后，将其定向克隆入同样经EcoR V和EcoR I双酶切的真核表达载体pIRESneo(购自CLONTECH公司)中，得到携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII cDNA基因的重组载体，命名为pCMIR-FVII。

然后，用内切酶Sma I和Xba I从质粒pGSRK-1(购自美国ATCC，No.63067)中酶切得到GS基因；同样，将载体pCMIR-FVII用内切酶Sma I和Xba I进行双酶切，回收含目的基因的载体大片段；再将GS基因与回收的载体大片段用T₄DNA连接酶连接，得到携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子(指存在于pIRESneo载体中的那段人工合成的内含子)、GS基因、牛生长激素poly A信号序列(存在于pIRESneo载体中)、氨苄青霉素抗性基因(存在于pIRESneo载体中)和质粒复制结构域(存在于pIRESneo载体中)的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-GS-FVII。

实施例2、构建用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-DHFR-FVII

以pIRESneo(GenBank号：U89673)为出发载体构建携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-DHFR-FVII(载体的结构示意图见图1)，具体方法包括以下步骤：

用内切酶Sma I和Xba I从质粒pSV2-dhfr(购自美国ATCC，No.37146)中酶切得到DHFR基因；同样，将载体pCMIR-FVII用内切酶Sma I和Xba I进行双酶切，回收含目的基因的载体大片段；再将DHFR基因与回收的载体大片段用T₄DNA连接酶连接，得到携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子(存在于pIRESneo载体中)、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列(存在于pIRESneo载体中)、氨苄青霉素抗性基因(存在于pIRESneo载体中)和质粒复制结构域(存在于pIRESneo载体中)的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pCMIR-DHFR-FVII。

实施例3、构建用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-GS-FVII

以pIRESneo(GenBank号：U89673)为出发载体构建携带EF-1α启动子(存在于pEF/bsd载体中，购自美国Invitrogen公司)、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-GS-FVII(载体的结构示意图见图1)，具体方法包括以下步骤：

以质粒pEF/bsd(购自美国Invitrogen公司)为模板，在引物EFF：5’-TCG CGACGT GAG GCT CCG GTG CCC GTC-3’和EFR：5’-ATC GAT CCG AGC TCG TCA CGA CAC CTGAAA TGG AAG-3’的引导下用PCR的方法扩增EF-1α启动子，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了约1.2kb的DNA片段，与预期结果相符，用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR扩增的约1.2kb的DNA片段，对其用限制性内切酶Nru I和Cla I双酶切后，回收EF-1α启动子DNA片段；同样，将载体pCMIR-GS-FVII(实施例1构建)经Nru I和Cla I双酶切，回收含目的基因的载体大片段；再将EF-1α启动子与回收的载体大片段用T4DNA连接酶连接，得到携带EF-1α启动子、人凝血因子VII cDNA基因、人工合成的内含子(存在于pIRESneo载体中)、GS基因、牛生长激素poly A信号序列(存在于pIRESneo载体中)、氨苄青霉素抗性基因(存在于pIRESneo载体中)和质粒复制结构域(存在于pIRESneo载体中)的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体的重组载体，命名为pEFIR-GS-FVII。

实施例4、构建用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-DHFR-FVII

以pIRESneo(GenBank号：U89673)为出发载体构建携带EF-1α启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体pEFIR-DHFR-FVII(载体的结构示意图见图1)，具体方法包括以下步骤：

以质粒pEF/bsd(购自美国Invitrogen公司)为模板，用与实施例3中相同的方法扩增EF-1α启动子，扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了约1.2kb的DNA片段，与预期结果相符，用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR扩增的约1.2kb的DNA片段，对其用限制性内切酶Nru I和Cla I双酶切后，回收EF-1α启动子DNA片段；同样，将载体pCMIR-DHFR-FVII(实施例2构建)经NruI和Cla I双酶切，回收含目的基因的载体大片段；再将EF-1α启动子与回收的载体大片段用T₄DNA连接酶连接，得到携带EF-1α启动子、人凝血因子VII cDNA基因、人工合成的内含子(存在于pIRESneo载体中)、GS基因、牛生长激素poly A信号序列(存在于pIRESneo载体中)、氨苄青霉素抗性基因(存在于pIRESneo载体中)和质粒复制结构域(存在于pIRESneo载体中)的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体的重组载体，命名为pEFIR-DHFR-FVII。

实施例5、CHO细胞的转染、筛选及克隆化

一、CHO细胞转染

用Invitragen公司的脂质体转染试剂盒将实施例1构建的重组表达载体pCMIR-GS-FVII(实施例5中以实施例1构建的pCMIR-GS-FVII为例，实施例2-4构建的载体也用相同的方法进行细胞的转染、筛选及克隆化)转染CHO细胞(购自美国Invitrogen公司，其它哺乳动物细胞如BHK细胞、HEK293细胞或Vero细胞也可)，具体方法包括以下步骤：

1、细胞的准备：用25cm²细胞培养瓶将CHO细胞按1∶4传代，37℃、5％CO₂饱和湿度中培养24-36h，待细胞长成50％-70％单层时倾去细胞培养液，用无血清DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司)洗涤细胞两次，即为备用细胞。

2、脂质体/DNA的准备：

a.将20μL Lipofectine溶入200μl无血清培养基中，轻轻混匀，室温放置40min；

b.将2μl(约2μg)经除菌的重组质粒DNA pCMIR-GS-FVII溶入200μ1无血清DMEM培养基中，混匀后，置于室温备用；

c.将制备好的DNA与脂质体轻轻混合均匀，室温放置10-15min；

d.然后加入2.6mL无血清DMEM培养基，轻轻混合，得到包裹好的脂质体/DNA。

3、细胞的转染：

a.将制备好的脂质体/DNA混合物小心滴加至备用细胞表面，于37℃、5％CO₂饱和湿度中孵育12h；

b.弃去混合液，加入含10％小牛血清的DMEM培养基继续培养48-72h，视细胞生长情况进行传代。

二、CHO抗性细胞的筛选及克隆化

1、抗性细胞的筛选

将步骤一获得的转染细胞进行传代，生长24h后，更换为选择性培养基(含5％新生牛血清和400μg/mL的MSX(300-500μg/mL均可)MSX(转染细胞中携带GS基因的用MSX筛选，携带DHFR基因的用MTX筛选)的DMEM培养基继续培养，间隔2-3d换液一次，待对照细胞全部死亡时，得到具有MSX抗性的CHO细胞。

2、抗性细胞的克隆化

利用有限稀释法对获得的MSX抗性的CHO细胞进行克隆化培养，具体方法如下：

1)待抗性细胞处于对数生长期时，用适量的0.25％胰酶消化细胞，待细胞收缩变圆，用吸管充分吹打细胞，将细胞分散为单个细胞悬液；

2)取少量细胞悬液，用台盼蓝染色并计数活细胞；

3)细胞悬液进行连续倍数稀释后，将制备好的细胞悬液接种于96孔培养板，使细胞浓度在每孔有1-2个细胞的水平，每孔加入0.1mL含10％新生牛血清的普通DMEM培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养；

4)每日观察培养板各孔细胞情况，孵育4-5d，挑选含单个细胞的孔，继续培养，同时增加MSX)的浓度至600μg/mL(600μg/mL-800μg/mL均可)继续加压，以使目的基因获得扩增；

5)待克隆长至孔底面积的1/3-1/2时，用适量的0.25％胰蛋自酶消化，转种至24孔培养板扩大培养；

6)按照同样的方法，待细胞长满孔底面积的1/3-1/2时，将细胞转种至6孔板，继而扩大培养直至转入25cm²细胞培养瓶，即可按常规方法培养、传代及冻存细胞。

实施例6、CHO抗性细胞中人凝血因子VII基因的拷贝数的SYBR GREEN Real TimeQ-PCR验证

提取实施例5获得的经不同压力(400、600μg/mL)筛选后的转染有pCMIR-GS-FVII的抗性CHO细胞的总RNA(用购自Invitrogen公司的TRIzol试剂获得)和基因组DNA(用购自promega公司的细胞基因组纯化试剂盒提取)，贮存于4℃或-20℃备用(转染有pCMIR-DHFR-FVII、pEFIR-GS-FVII、pEFIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞的总RNA和基因组DNA也分别按上述方法制备)。然后以此为模板，在待测基因-人凝血因子VII基因(简称F7)所用引物F7-QF(序列为：5’-GGT CCT GTT GTT GGT GAA TG-3’)和F7-QR(序列为：5’-CGA TGT CGT GGT TGG TGG-3’)的引导下用SYBR GREEN Real TimeQ-PCR的方法对CHO抗性细胞中人凝血因子VII的基因的拷贝数进行验证，检测内参基因β-actin所用引物为Q-ACTB1(序列为5’-GCC AAC CGT GAA AAG ATG-3’)和Q-ACTB2(序列为5’-AGA AGG AAG GCT GGA AAA-3’)。将合成的引物稀释到50pmol/μL。10μL反应体系如下：

本反应所用SYBR GREEN Real Time Q-PCR为两步法(裂解→延伸)，程序条件为：95℃5min，95℃10s，60℃35s，35个循环。用Rotor-Gene公司定量PCR仪(型号6000)进行实时荧光定量检测。

根据标准品检测的荧光值绘制标准曲线，如图2所示，结果内参β-actin(y＝-3.641x+42.85)和F7(y＝-3.734x+42.30)标准曲线的R值分别为0.99786、0.99883，标准品荧光曲线间隔均一，说明检测体系可靠。

经过SYBR GREEN Real Time Q-PCR定量分析，所筛选的转染有实施例1-4所构建的载体的不同抗性CHO细胞株中，目的基因的整合与转录水平呈现出一定的倍比关系，分别将目的基因(人凝血因子VII基因)与内参基因β-actin进行对比，以400μg/mL的MSX筛选的不同载体转染的阳性细胞基因组结果作为标准(设定值为1)对照，600μg/mL的MSX筛选的不同载体转染的阳性细胞基因组与之相比较得到如下结果：载体pCMIR-GS-FVII转染的抗性细胞基因组水平得比值为1.6791，cDNA水平比值为1.7359；载体pCMIR-DHFR-FVII转染的抗性细胞基因组水平得比值为1.6352，cDNA水平比值为1.7048；载体pEFIR-GS-FVII转染的抗性细胞基因组水平得比值为1.5983，cDNA水平比值为1.6974；载体pEFIR-DHFR-FVII转染的抗性细胞基因组水平得比值为1.6880，cDNA水平比值为1.7569。以上比值说明转染有实施例1-4所构建的载体的不同抗性CHO细胞经过持续加压筛选后目的基因在基因组水平和cDNA水平均有拷贝数增加的趋势。

实施例7、重组人凝血因子VII的表达与鉴定

一、表达样品收集

将实施例5获得的分别转染有pCMIR-GS-FVII的抗性CHO细胞克隆(1A5、1B3、1B8)、转染有pCMIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞克隆(2C2、2C4、2D5)、转染有pEFIR-GS-FVII的抗性CHO细胞克隆(3E3、3E4、3F2)、转染有pEFIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞克隆(4G5、4G6、4H2)进行表达样品收集，在24孔细胞培养板中待细胞长至80％-90％汇片，更换为含10μg/mL维生素K1的无血清DMEM/F12培养基(购自Invitrogen公司)，于37℃、5％CO₂饱和湿度中诱导培养24h后收液，-20℃储存备用。

二、表达上清的促凝活性测定

用购自四川协和生物技术有限责任公司的凝血因子VII促凝活性检测试剂盒对抗性CHO细胞的表达上清进行促凝活性测定，原理：以FVII缺陷血浆为基质，在组织凝血活酶和Ca²⁺参与下，受检血浆(样品)出现凝固所需的时间与其含量(FVII:C)水平有关，测定不同稀释度的参比血浆(参比血浆为标准正常人血浆，由试剂盒提供)的凝固时间，制作标准曲线，同时测定样品的凝固时间，将数据代入标准曲线回归方程，即可算出样品中FVII相当于正常水平的百分率。具体检测方法如下：

1)标准曲线的制作

将正常参比血浆用稀释液作1/5、1/10、1/20、1/40、1/80倍比稀释，其对应FVII:C百分比活性为200％、100％、50％、25％、12.5％。

2)将CaCl₂和复溶后的PT试剂(试剂盒提供)置于37℃保温。

3)取某一稀释度的正常参比血浆0.1mL、凝血因子VII缺陷血浆0.1mL、PT试剂0.1mL加入透明小试管中，混匀后置于37℃保温3min。

4)迅速加入保温的0.025mol/L CaCl₂溶液0.1mL，同时启动秒表，在水浴中以1-2次/秒的频率摇动小试管，当观察到出现凝固时立刻停表记录凝固时间。

5)以不同稀释度正常参比血浆FVII:C百分活性为X，对应的凝固时间(秒)为Y，按照统计学方法作直线回归方程(方程式为：logY＝blogX+a)，即得标准曲线。

参比血浆的凝固时间及标准曲线回归方程

按凝血因子VII促凝活性检测试剂盒的要求，测定参比血浆不同稀释倍数的促凝时间，结果如表1所示。

表1 不同稀释度的参比血浆的凝固时间

根据不同稀释度的参比血浆的凝固时间和相对比活求得直线回归方程为：

logY＝-0.24logX+2.1。

样品测定：

将样品按同样的方法测定并记录凝固时间。

将样品凝固时间(秒)代入标准曲线方程，计算X值，即得样品FVII:C百分活性水平。

样品的活性测定结果

在相同条件下，测定转染有实施例1-4所构建的重组载体对应的CHO细胞不同克隆细胞株表达上清液的促凝时间，根据直线回归方程计算样品的相对比活性，结果如表2所示。

表2 样品的活性测定结果

样品	1A5	1B3	1B8	2C2	2C4	2D5	3E3	3E4	3F2	4G5	4G6	4H2	CHO
														X-FVII:C(％)	317	356	317	404	524	481	404	200	481	356	404	317	-
Y-凝固时间(秒)	32	31	32	30	26	28	30	34	28	31	30	32	-

由表2可以看出，转染有本发明实施例1-4所构建的重组载体的CHO细胞均能表达具有促凝活性的重组人凝血因子VII，表达产物能缩短血浆的凝血时间，通过活性计算，活性最高者相当于524％血浆FVII的活性。

三、Western Blotting检测表达上清中的重组人凝血因子VII

用北京六一仪器厂的电泳和电转系统，以鼠抗人凝血因子VII单抗(购自美国ADI公司)为第一抗体，AP标记的山羊抗鼠IgG(购自promega公司)为第二抗体，以BCIP/NBT(购自promega公司)为显色底物，参照《分子克隆》中记载的WesternBlotting方法进一步对用本发明载体及方法表达的重组人凝血因子VII进行鉴定，具体方法为：将实施例7中收集的转染有pCMIR-GS-FVII、pCMIR-DHFR-FVII、pEFIR-GS-FVII、pEFIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞克隆株(每种载体取1个样品，即1B3、2C2、3E3和4G5)分别取30μL的表达上清，经常规10％SDS-PAGE分离，然后转印到硝酸纤维素膜上，其表达产物可被特异的鼠抗人凝血因子VII单抗识别，并经BCIP/NBT底物显色，产生不溶性的蓝紫色条带，并拍照留作实验记录。

结果如图3所示(a：1B3表达上清，b：2C2表达上清，c：3E3表达上清，d：4G5表达上清)，检测结果显示4株克隆细胞表达上清均能被鼠抗人凝血因子VII单抗识别，表明转染有4种载体的克隆细胞株均能够表达重组人凝血因子VII。

四、重组凝血因子VII的表达量分析

利用BandScan软件，以50ng凝血因子VII标准品为参照，通过显色目的条带的灰度分析，对转染有4种载体的CHO克隆细胞株表达样品进行Western-Blotting试验，通过对各样品中目的的蛋白显色条带进行灰度分析，并与标准品的灰度值进行对比，初步估算各克隆细胞株的重组凝血因子VII表达量。

结果如表3所示，软件分析显示标准品的灰度值为84976321，30μL的1B3细胞表达上清的灰度值为39822230，约相当于标准品灰度值的0.47(39822230/84976321≈0.47)，根据标准品的含量推算出转染有pCMIR-GS-FVII的抗性CHO细胞的重组人凝血因子VII表达量平均约为7.8mg/L；30μL的2C2细胞表达上清的灰度值为57331552，约相当于标准品灰度值的0.67(57331552/84976321≈0.67)，根据标准品的含量推算出转染有pCMIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞的重组人凝血因子VII表达量平均约为11mg/L；30μL的3E3细胞表达上清的灰度值为68047200，约相当于标准品灰度值的0.8(68047200/84976321≈0.8)，根据标准品的含量推算出转染有pEFIR-GS-FVII的抗性CHO细胞的重组人凝血因子VII表达量平均约为13mg/L；30μL的4G5细胞表达上清的灰度值为24713411，约相当于标准品灰度值的0.29(24713411/84976321≈0.29)，根据标准品的含量推算出转染有pEFIR-DHFR-FVII的抗性CHO细胞的重组人凝血因子VII表达量平均约为4.8mg/L。上述检测结果表明转染有本发明重组载体的CHO细胞能稳定、高效表达具有促凝活性的重组人凝血因子VII，表达量平均约为5-13mg/L。

表3 1B3、2C2、3E3、4G5表达上清Western-Blotting检测结果中蛋白显色条带的灰度分析结果

	标准品	1B3	2C2	3E3	4G5
						灰度值	84976321	39822230	57331552	68047200	24713411

Claims

1.一种用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体，包含自上游至下游顺次排列的以下表达元件：

1)启动子，选用人延伸因子1α亚基启动子(EF-1α)或巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV-IE)，优选为EF-1α启动子；

2)人凝血因子VII的cDNA基因；

3)pIRESneo载体中的人工合成的内含子序列(IVS)；

4)内部核糖体进入位点(IRES)；

6)牛生长激素poly A信号序列；

7)质粒的复制结构域。

2.根据权利要求1所述的专用载体，其特征在于：所述载体还可再包括抗生素筛选基因，如氨苄青霉素抗性基因，位于载体中的质粒复制起点的下游。

3.根据权利要求1或2所述的专用载体，其特征在于：用于构建所述高效表达重组人凝血因子VII专用载体的出发载体为任意的可在哺乳动物细胞表达外源基因的真核载体，如pIRESneo、pCIneo、pcDNA3或pcDNA5等，优选为pIRESneo。

4.根据权利要求3所述的专用载体，其特征在于，为以下专用载体之一：

以pIRESneo为出发载体构建的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体为pEFIR-GS-FVII，其携带EF-1α启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域；

以pIRESneo为出发载体构建的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体为pEFIR-DHFR-FVII，其携带EF-1α启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域；

以pIRESneo为出发载体构建的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体为pCMIR-GS-FVII，其携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的内含子、GS基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域；

以pIRESneo为出发载体构建的用于高效表达重组人凝血因子VII的专用载体为pCMIR-DHFR-FVII，其携带CMV-IE启动子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的内含子、DHFR基因、牛生长激素poly A信号序列、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制结构域。

5.一种高效表达重组人凝血因子VII的方法，是将权利要求1-4任一项所述的专用表达载体转染哺乳动物细胞，然后通过MSX或MTX加压筛选获得阳性细胞克隆，进而通过增加MSX或MTX的浓度进行持续压力筛选，从而使人凝血因子VII基因随筛选基因扩增的同时获得拷贝数的增加，目的基因拷贝数的增加又可以使表达量增加，使得重组人凝血因子VII得以高效表达。

6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞为CHO细胞、BHK细胞、HEK293细胞或Vero细胞，优选为BHK细胞和CHO细胞。

7.根据权利要求5或6所述的表达方法，其特征在于：所述MSX或MTX加压筛选阳性细胞克隆的方法为：将转染细胞用含有300-500μg/mL MSX或MTX的选择性培养基进行培养，间隔2-3天换液一次，待对照细胞全部死亡时，得到具有MSX或MTX抗性的哺乳动物细胞。

8.根据权利要求5至7任一所述的表达方法，其特征在于：通过增加MSX或MTX的浓度对转染细胞进行持续压力筛选的方法为：将转染细胞继续用含有600-800μg/mLMSX或MTX的选择性培养基进行培养，间隔2-3天换液一次，从而使人凝血因子VII基因随筛选基因扩增的同时获得拷贝数的增加。