CN105017410B - 一种b区部分缺失型重组人凝血因子ⅷ - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于治疗甲型血友病的基因重组人凝血因子Ⅷ。通过对全长凝血因子Ⅷ进行B区部分缺失性突变，得到的新型基因重组人凝血因子Ⅷ产品具有结构更稳定的特性。

Description

一种B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ

技术领域

本发明属于基因工程药物生产领域。通过对全长凝血因子Ⅷ(coagulationfactorⅧ，FⅧ)的改造，得到了B区部分缺失型的基因重组人凝血因子Ⅷ(recombinanthuman FⅧ，rhFⅧ)。实验证明，通过与B区完全缺失型的rhFⅧ进行比较，该B区部分缺失型产品具有结构更稳定的特性，有望被开发成为治疗甲型血友病的一种新型rhFⅧ产品。

背景技术

血友病(Hemophilia)，是由于血液中缺少某些凝血因子而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病。该病分为四种类型：甲型、乙型、丙型及后来发现的vWF因子(vonwillibrand factor)缺乏的血管性假血友病。其中甲型血友病又称凝血因子Ⅷ缺乏症，发病率为80％，其首选治疗药物为FⅧ。

(一)FⅧ的分子结构。

FⅧmRNA长9kb，编码一条由2351个氨基酸组成的前体多肽.去除N端19个残基的信号肽后，成熟蛋白质由2332个氨基酸组成，分子量为280kDa。FⅧ蛋白含有3个结构区：

A区：由3个片段组成，在FⅧ氨基末端出现2次，在羧基末端出现1次，每个A区均含有约330个氨基酸；

B区：为含有908个氨基酸的中间片段，在凝血激活过程中无需B区的活化；

C区：2个片段，在FⅧ的羧端部分出现2次，每一C结构域含有约150个氨基酸。

3个区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2，FⅧ蛋白由两条肽链组成，A1-A2-B或A1-A2组成重链，分子量为90～200kDa不等；A3-C1-C2组成轻链，分子量为80kDa。

(二)FⅧ的生产技术。

FⅧ的生产技术目前有两种：血浆提纯以及基因工程方法制备。

1.血源性凝血因子Ⅷ。

血浆提纯的产品存在血浆制品带来的感染严重致病微生物的可能性、危险性。

目前我国生产的均为血浆提纯的血源性FⅧ(plasma-derived FⅧ，pd FⅧ)，而由于受到原料血浆供应的限制和血浆提纯技术的限制，国内FⅧ年产仅约6000～7000万单位，导致国内FⅧ供应持续紧张，连抢救用药都无法满足。

2.基因重组人凝血因子Ⅷ。

基因工程方法制备的rhFⅧ从培养的真核细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中表达，是无菌、稳定、高纯度的生物制品，其效果与pdFⅧ相同，且无血源污染的危险，目前在西方国家应用越来越广泛。

目前已上市的rhFⅧ分为全长野生型以及B区缺失型两类。全长野生型产品分子较大，分子量为280kDa，表达率低，在特异活性及使用成本等方面均不能满足人们的需要；进一步研究发现，B区的缺失对FⅧ的体内外活性均无影响，且B区缺失型rhFⅧ的的分子量为170kDa，其表达水平较全长型高5-10倍，稳定性亦显著提高，极大降低了制备难度和成本。目前我国已进口的rh FⅧ有三个产品：拜科奇—Kogenate FS(Bayer)、百因止—Advate(Baxter公司)以及任捷—Xyntha(Wyeth)，其中Xyntha为B区完全缺失型rhFⅧ。

本发明人在研究中发现，B区完全缺失型rhFⅧ产品在超过100倍稀释时，会出现活性降低，活性约损失30％，收率只有50％～70％，而全长rh FⅧ产品的稀释过程不存在此问题。考虑B区可能在增强rh FⅧ产品水溶液的稳定性方面有一定作用，我们在研究中，经过筛选保留B区的部分氨基酸得到一种新型的B区部分缺失型rh FⅧ，结果显示，本品的目的蛋白表达率、结构稳定性以及水溶液中稀释稳定性均有明显提高，能进一步降低制备rhFⅧ的难度，提高收率，降低生产成本。

发明内容

本发明涉及一种重组人凝血因子Ⅷ的制备。

从已知高表达人FⅧ(hFⅧ)的人胎儿肝脏cDNA Lambda噬菌体文库中扩增hFⅧ基因，并以此作为模板，以其特异引物进行PCR扩增获得全长的hFⅧ的基因片段；通过引物设计和PCR的方法，获得B区完全缺失的rh FⅧ目的基因和B区部分缺失的rh FⅧ目的基因。

以上目的基因与pMSG载体分别经限制性内切酶NheI和XhoI双酶切后进行连接，从而获得重组质粒pMSG-BDDhFVIII。

将该重组质粒与pDCH1P表达质粒共转染到CHO细胞中，经过条件培养基筛选获得rhFⅧ高表达细胞株，然后在5L细胞培养罐连续培养7天，经过离心，采用一步抗体亲和层析、以及离子交换层析的方法最终获得纯度大于98％的目的蛋白。

经测试，本发明的B区部分缺失型rhFⅧ的生物学活性同B区完全缺失型rhFⅧ基本一致，并且稀释稳定性和冻融稳定性有了明显提高。

附图说明

图1是B区完全缺失的rhFⅧ引物设计图；

图2是B区部分缺失的rhFⅧ引物设计图。

具体实施方式

以下实例仅是对本发明的说明，而不会对本发明产生任何限制。

(一)生产细胞株的获得和培养。

1.CHO-DG44细胞。

中国仓鼠细胞-二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷性突变体DG44与二十世纪八十年代早期使用的DXB11突变细胞系类似。该细胞的生长需要次黄嘌呤(或腺嘌呤)、甘氨酸和胸腺嘧啶，而且与所有CHO细胞一样，它们生长也需要脯氨酸。它的优点在于不含有内源性dhfr序列，可被dhfr基因转化，便于阳性转化子的筛选。转化了dhfr基因的细胞株，通常会用不含核苷酸和脱氧核苷酸的-MEM培养基筛选出dhfr阳性转化子。由于DG44是双缺失突变体，其中不含有仓鼠的dhfr基因，因而该细胞被导入dhfr基因时不存在背景干扰。其培养方法如下。

CHO-DG44细胞使用含有10％cFBS的α-MEM培养基(含核苷酸和脱氧核苷酸)接种于6-孔板中培养，细胞密度达到2×106/孔后，再按照3×105/孔的细胞密度进行传代培养。

2.B区完全缺失型重组人凝血因子Ⅷ表达质粒构建。

本项目采用pMSG载体作为重组人凝血因子Ⅷ的表达载体。通过三次PCR获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因片段。采用限制性内切酶NheI和XhoI分别将B区缺失的hFⅧcDNA片段与pMSG真核表达载体进行双酶切，T4连接酶将其连接后，转化至克隆菌株JM109中，再对经筛选的单克隆重组质粒进行目的基因测序，目的基因测序结果与理论序列一致，完成B区缺失型pMSG-hFⅧ重组真核表达载体的构建。具体构建方法如下。

B区缺失的hFⅧ目的基因获得。

2.1.1引物设计。

1)首先在全长的hFⅧcDNA两端设计两条引物primer-1和primer-2；然后分别在重链两端设计了两条引物primer-3(含有NheI酶切位点)和primer-4，在轻链的两端设计了两条引物primer-5和primer-6(含有XhoI酶切位点)；primer-4和primer-5基因设计重叠区域。具体位置如图1所示。

2)为了提高外源基因的表达量，在基因起始密码子前面，即引物3的序列上设置了Kozak序列(GCCACC)。

3)所用到的引物序列如下：

primer-1：5'-ATG CAA ATA GAG CTC TCC ACC-3',

primer-2：5'-TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'

primer-3：5'-CTA GCT AGC CAC CAT GCA AAT AGA GCT CTC CAC C-3'(划线部分为NheI酶切位点，粗体部分为Kozak序列)

primer-4：5'-GGC GTT TCA AGA CTG GTG GAT TCT GGG AGA AGC-3'

primer-5：5'-CCA TTG AAC CAA GAA GCT TCT CCC AGA AT-3'

primer-6：5'-CCG CTC GAG TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'(划线部分为XhoI酶切位点)。

2.1.2PCR扩增B区缺失的hFⅧcDNA。

(1)第一次PCR。

利用Lambda Preps DNA纯化试剂盒提取Lambda噬菌体DNA。以提取的Lambda噬菌体DNA作为模板，以primer-1和primer-2为引物，采用DNA聚合酶，进行第一次PCR反应，扩增条件为:35循环,94℃,30s,60℃,1min；72℃,7min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离，获得7.1kb的hFⅧ基因全长片段。并进行凝胶回收。

(2)第二次PCR获得B结构域两端的两个基因片段。

以第一次PCR扩增后回收的FⅧ全长DNA为模板，分别采用primer-3和primer-4为一对引物；及采用primer-5和primer-6为一对引物分别进行PCR，扩增条件为:30循环,94℃,1min,62℃,1min；72℃,2min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，分别获得了2.3kb和2.1kb的两个DNA片段。并分别进行凝胶回收。

(3)第三次PCR获得B区缺失的hFⅧ的基因片段。

以第二次PCR扩增后回收的两个DNA片段为模板，以primer-3和primer-6为引物进行PCR，扩增条件为:35循环,94℃,1min,60℃,1min；72℃,4min。经过1％琼脂糖凝胶电泳，获得4.4kb的目的基因片段，并进行凝胶回收，即获得B区完全缺失的hFⅧ目的基因。

2.2重组表达质粒构建。

将B区完全缺失型hFⅧ的目的基因片段和表达载体pMSG分别经限制性内切酶NheI和XhoI双酶切37℃过夜，并分别进行胶回收，然后用T4连接酶4℃过夜连接，将连接产物转化到克隆菌株JM109中，从转化的氨苄青霉素抗性平板上挑取单菌落提取质粒进行鉴定，最后获得含有重组质粒的单克隆菌株，进而对目的基因核苷酸序列测定，测序结果和理论序列一致，证明重组质粒构建成功。

3.B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ表达质粒构建。

本项目采用pMSG载体作为重组人凝血因子Ⅷ的表达载体。通过两次PCR获得B区部分缺失的人凝血因子Ⅷ基因片段。经过限制性内切酶NheI和XhoI双酶切目的基因片段和pMSG载体，连接后转化至克隆菌株JM109中筛选，获得B区部分缺失型pMSG-hFⅧ重组真核表达载体。重组质粒测序结果显示，目的基因序列与理论序列一致。具体构建方法如下。

B区部分缺失的hFⅧ目的基因获得。

3.1引物设计。

目的基因序列为B区中间区域缺失的hFⅧ片段，且左右两片段以接头连接、目的基因两端有NheI和XhoI限制性内切酶酶切位点。

全长两端设计引物primer-1F和primer-2R，B区缺失区域两端设计带有接头的引物primer-1R和primer-2F。其中primer-1F和primer-1R用于片段1的合成，primer-2F和primer-2R用于片段2的合成。

目的基因两端设计引物primer-3和primer-6，用于目的基因全序列的获得。其中primer-3含有NheI酶切位点和提高外源基因表达量的Kozak序列(GCCACC)，primer-6含有XhoI酶切位点。具体位置如图2所示。

引物序列如下。

primer1-F：5'-ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCC-3',

primer1-R：5'-GGAGTAGGCG TCGGCTTGGC AGCCGCCTCT TTTGCGGGATAGCCCATGTGGAGTA-3'(划线部分为接头序列)

primer2-F：5'-CGCAAAAGAG GCGGCTGCCA AGCCGACGCC TACTCCCACCAATCATGCAATAGCAGCAAT-3'(划线部分为接头序列)

primer2-R：5'-TCAGTAGAGG TCCTGTGCCT CGCAGCCCAG AACCTCCATCCTCAGGGCAATCTGGTGCAC-3'

primer-3：5'-CTA GCT AGC CAC CAT GCA AAT AGA GCT CTC CAC C-3'(划线部分为NheI酶切位点，粗体部分为Kozak序列)

primer-6：5'-CCG CTC GAG TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'(划线部分为XhoI酶切位点)

3.2目的基因序列获得PCR扩增。

以7.1kb的hFⅧ基因全长片段为模板，分别以primer-1F、primer-1R和primer-2F、primer-2R为引物进行PCR扩增，扩增条件为：30循环,94℃,1min,65℃,1min；72℃,2min。获得2.5kb的片段1和2.2kb的片段2。

以片段1和片段2为模板，以primer-3和primer-6为引物进行PCR反应，扩增条件为:35循环,94℃,1min,60℃,1min；72℃,4min。获得4.7kb的B区部分缺失的hFⅧ目的基因片段。

3.3重组质粒构建。

将目的基因片段和载体pMSG分别经NheI和XhoI37℃双酶切过夜，胶回收后用T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化到克隆菌株JM109中，从转化的氨苄青霉素抗性平板上挑取单菌落提取质粒进行鉴定，获得含有B区缺失hFⅧ结构重组质粒的单克隆菌株。重组质粒测序结果显示，目的基因序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功。

4.转染。

(1)质粒准备。

过夜培养pMSG-hFⅧ/JM109，用质粒提取试剂盒提取pMSG-hFⅧ的质粒DNA，ScaI酶切使之线性化，酶切产物经PCR回收试剂盒回收，回收产物用于下一步细胞转染。

(2)细胞准备。

CHO DG44细胞经37℃复苏后，使用2mL含有10％胎牛血清的α-MEM培养基(含有核苷酸和脱氧核苷酸)悬浮细胞，以细胞密度2×105/孔接种于6-孔板，第二天用于细胞转染。

(3)细胞转染。

1)将准备用于转染的细胞用1×PBS漂洗两次，每孔加入1mLα-MEM培养基(含核苷酸和脱氧核苷酸)孵育1h。

2)取2ug重组质粒DNA和5.3μL Dosper，并与10.4ng DHFR表达质粒pDCH1P一起混匀，将混合物室温下孵育40min。

3)将复合物加入细胞中，放入37℃孵育6h，将培养基换用2mL新鲜的含10％胎牛血清的α-MEM培养基(含核苷酸和脱氧核苷酸)。

4)转染两天后，细胞经胰蛋白消化液消化后，用含10％胎牛血清的α-MEM培养基(不含核苷酸和脱氧核苷酸；0nM MTX)重悬细胞，按照细胞密度300/200μL接种于96-孔板继续培养。

5)转染三周后，初次筛选的细胞分别从96孔板到6-孔板中依次逐步扩大培养。

5.重组工程细胞克隆培养及筛选。

5.1MTX加压筛选。

为了获得rhFⅧ高表达的细胞株，最初筛选的细胞在传代过程中逐步提高筛选培养基中MTX的浓度。首先，使用含10％胎牛血清的α-MEM培养基(不含核苷酸和脱氧核苷酸；10nM MTX)培养细胞，按照细胞密度4×105/孔接种于6-孔板中。接下来，传代细胞过程中，筛选培养基的MTX浓度由10nM增加为100nM，接下来再增加为1μM MTX，最后，MTX浓度增加至5μM。在MTX逐步增加浓度的过程中，保存每步筛选适应的细胞。不同浓度的MTX筛选的细胞的rhFⅧ表达量采用ELISA法检测。根据ELISA检测结果，筛选出两个表达水平高的细胞。

5.2单克隆筛选。

将筛选的两个单克隆细胞分别经胰酶消化后，采用含10％胎牛血清的α-MEM培养基(不含核苷酸和脱氧核苷酸；1μM或5μM的MTX)悬浮细胞，按照细胞密度0.5/200μL接种于96-孔板。培养四周后，34个单克隆细胞的被选出。每个单克隆细胞分别从96孔板到6孔板中依次逐步扩大培养。采用ELISA法检测各单克隆细胞的rhFⅧ的表达量，根据检测结果再次筛选出两个表达量较高的单克隆细胞。再次经过对筛选的两个表达水平较高细胞的生长情况和rhFⅧ表达量的比较，最终筛选的单克隆细胞并经过传代扩增，保存20管于液氮中冻存。

6.细胞库建立。

经过筛选获得的高表达细胞株，以细胞密度为5×105/mL接种于125mL摇瓶，在37℃、140rpm±10的CO2培养箱中培养两天后，同样按照细胞密度为5×105/mL接种于250mL摇瓶；两天后再次进行细胞传代扩增，以细胞密度为5×105/mL接种于500mL摇瓶；两天后，以细胞密度为5×105/mL接种于1L摇瓶(内含有400mL培养液)；两天后，收集细胞，按照3×107/mL/管进行细胞保存，最后将细胞作为主细胞库保存于液氮罐中。从主细胞库传代扩增建立工作细胞库，主细胞库和工作细胞库检定均应符合“生物制品检定规程”。

7.重组人凝血因子Ⅷ摇瓶表达和5L罐细胞培养。

细胞复苏后，每两天传代扩增培养，在第6代时开始进行表达培养，将细胞按照5×105/mL接种于125mL的摇瓶中，放入CO2培养箱中34℃、5％CO2、140rpm条件下连续培养8天，每天检测pH、细胞密度和细胞活力，并对表达产物进行活性测定。将第6代细胞接种于5L细胞培养罐连续培养7天，收集细胞液。

(二)纯化。

1.细胞培养液的处理。

将细胞培养液在3300rpm条件下离心15分钟,收集上清液约5kg，搅拌均匀并进行无菌过滤，2-8℃避光条件下保存。

2.抗体免疫亲和层析。

层析柱为能够与人凝血因子Ⅷ特异性结合的抗体亲和层析介质。首先用平衡液平衡5个柱体积，将处理后的培养液上样，再用平衡液平衡3个柱体积至基线后，采用清洗液进行清洗，最后用洗脱液洗脱目的蛋白11个柱体积，收集目的蛋白。

3.阳离子交换层析。

层析柱为阳离子交换层析柱。首先用平衡液平衡5个柱体积，将上一步层析收集液用B稀释后上样，再用3个柱体积的平衡液平衡至基线，先用5个柱体积清洗液清洗非目的蛋白，再用洗脱液洗脱目的蛋白5个柱体积，收集蛋白洗脱峰35ml。

4.阴离子交换层析。

层析柱为阴离子交换层析柱。首先用平衡液平衡10个柱体积，将上一步层析收集液用B稀释后上样，再用3个柱体积平衡液平衡至基线后，用5个柱体积的清洗液清洗杂蛋白洗脱液洗脱目的蛋白7个柱体积，收集蛋白洗脱峰25ml，即为目的蛋白原液。

(三)检测。

1.纯度测定。

得到的B区部分缺失型rhFⅧ(以下简称本品)及B区完全缺失型rhFⅧ通过SEC-HPLC检测，纯度均大于98％。

(1)材料。

快速聚醚砜过滤装置，1000ml，滤膜直径为90mm，孔径0.2μm；色谱柱为TSK gelG3000SWXL7.8×300；检测器：激发波长为285nm，发射波长为340nm。

流动相A：50mM L-组氨酸、600mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.7；流动相D：0.05％的叠氮化钠。

(2)方法。

100％A液平衡，至基线基本平衡后，上样100uL，流速为1ml/min。按表1流程进行洗脱。

时间	流速(mlmin)	A(％)	B(％)	C(％)	D(％)
						.	1.0	100	0	0	0
5.0	1.0	0	0	0	100
						59.9	1.0	0	0	0	100
60.0	0.0	0	0	0	100

表1.洗脱流程

(3)结果。

本品和B区完全缺失型rhFVIII的纯度均大于98％。

2.浓度测定。

采用BCA法测定蛋白含量。

(1)材料。

WR工作液：将试剂盒中A液、B液、C液按25∶24∶1的比例混合成为WR工作液。

标准品：将标准品浓度依次稀释至100、75、50、12.5、6.25、3.13μg/mL。

样品：参照表2进行稀释。

表2.样品稀释过程

(2)方法。

分别吸取标准品、样品和空白对照各150uL加入96孔板中。向每孔中加入150μLWR，震荡96孔板30S。盖上封板膜后，于37℃恒温箱中孵育2小时。2小时后，取出96孔板平衡至室温后，于562nm检测吸收值。

以各浓度标准品的OD562绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白含量。

(3)结果。

本品蛋白含量测定结果为1.05mg/mL，B区完全缺失型rhFⅧ的蛋白含量为1.12mg/mL。

3.生物学活性检测。

采用比色法测定样品生物学活性。

(1)材料。

FⅧ因子缺陷血浆：用1ml去离子水溶解瓶中的物质使用前，在15-25℃条件下至少放置15分钟，然后小心的振摇混匀；S-2765+I-2581溶液：用6.0ml无菌水溶解S-2765+I-2581；因子试剂溶液：用3.0ml的无菌水溶解因子试剂；BRP标准品溶液：使用1.0ml无菌水溶解BRP标准品。

样品：用FⅧ缺陷血浆稀释至0.5-2IU/mL，再用工作缓冲溶液稀释到标准品范围(<1IU/mL)。

标准品：使用152μL FⅧ缺陷血浆稀释20μL BRP标准品(8.6IU/mL)。

BRP标准品的浓度为1IU/mL。

按表3进行预稀释和最终稀释。

表3.稀释方法

(2)方法。

在37℃预设适当体积(>50μL/孔)的因子试剂和S-2765+I-2581，微孔板中加入50μL稀释的标准品/空白，37℃孵育3-4分钟；加入37℃预热的因子试剂溶液50μL/孔，37℃孵育2分钟；加入37℃预热的S-2765+I-2581溶液50μL/孔，37℃孵育2分钟；加入20％的醋酸溶液50μL/孔，测定各孔的OD405。

通过SoftMax程序来反映线形图中标准品的吸光度(A)和FⅧ的浓度在曲线中的变化，Y轴为吸光度A，X轴为FⅧ浓度(单位为IU/mL)，使用最适合的线连接标准品的各点即得到标准曲线，样品的活性依据标准曲线计算得到。

(3)结果。

经测定，本品活性检测结果为9293.8IU/mL，比活为8851.2IU/mg(比活＝9293.8IU/mL÷1.05mg/mL＝8851.2IU/mg)。

B区完全缺失型rhFⅧ的样品活性检测结果为11035.6IU/mL，比活为9853.2IU/mg(比活＝11035.6IU/mL÷1.12mg/mL＝9853.2IU/mg)。

4.本产品与B区完全缺失型rhFⅧ的生物学活性及稳定性比较。

对本品和B区完全缺失型rhFⅧ进行比活性、冻融稳定性和稀释稳定性进行比较，结果如下。

(1)生物学活性。

经测定，本品活性为8851.2IU/mL；B区完全缺失型rhFⅧ比活性为9853.2IU/mL，二者基本一致。

(2)反复冻融稳定性。

将本品和B区完全缺失型rhFⅧ分别反复冻融10次，并于3、5、10次采用上述比色法测定生物学活性。

本品经反复冻融10次后，活性仍然保持了冻融前的89％，表明本产品的反复冻融稳定性良好；B区完全缺失型rhFⅧ经反复冻融5次后，活性为冻融前活性的72％，经10次反复冻融后，其活性降至冻融前的30％，具体见表4。

表4.本品和B区完全缺失型rhFⅧ反复冻融稳定性的比较

结果表明，同B区完全缺失的rhFⅧ比较，本品的反复冻融稳定性更好。

(3)稀释稳定性。

稀释缓冲液：L-组氨酸，0.15％；氯化钠，0.9％；二水氯化钙，0.025％；蔗糖，0.3％； Tween-80,0.01％，pH7.0。

对B区部分缺失的本品和B区完全缺失的rhFⅧ使用稀释缓冲液进行100倍稀释，活性测定结果见表5。

表5.本品和B区完全缺失型rhFⅧ稀释100倍后活性的比较

结果表明，同B区完全缺失的rhFⅧ比较，B区部分缺失的本品的稀释稳定性更高，利于进行成品制备。

序列表

<110> 北京诺思兰德生物技术股份有限公司

<120>一种重组人凝血因子Ⅷ

<140>

<141>

<160> 1

<210> 1

<211> 1552

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp

1 5 10 15

Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe

20 25 30

Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

35 40 45

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn

50 55 60

Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr

65 70 75

Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn

80 85 90

Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr

95 100 105

Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln

110 115 120

Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr

125 130 135

Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp

140 145 150

Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val

155 160 165

Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg

170 175 180

Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe

185 190 195

Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser

200 205 210

Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala

215 220 225

Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp

245 250 255

His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe

260 265 270

Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

275 280 285

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu

290 295 300

Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His

305 310 315

Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro

320 325 330

Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp

335 340 345

Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe

350 355 360

Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala

365 370 375

Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu

380 385 390

Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg

395 400 405

Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly

410 415 420

Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr

425 430 435

Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly

440 445 450

Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe

455 460 465

Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val

485 490 495

Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys

500 505 510

Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

515 520 525

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu

530 535 540

Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr

545 550 555

Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys

560 565 570

Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp

575 580 585

Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly

590 595 600

Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His

605 610 615

Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys

620 625 630

Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln

635 640 645

Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His

650 655 660

Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly

665 670 675

Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu

680 685 690

Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu

695 700 705

Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn

725 730 735

Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser

740 745 750

Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

755 760 765

Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro

770 775 780

Lys Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg

785 790 795

Gln Ser Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr

800 805 810

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Pro Thr Pro Thr Pro

815 820 825

Thr Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro

830 835 840

Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu

845 850 855

Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile

860 865 870

Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp

875 880 885

Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr

890 895 900

Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr

905 910 915

Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly

920 925 930

Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly

935 940 945

Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp

950 955 960

Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

965 970 975

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn

980 985 990

Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe

995 1000 1005

Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala

1010 1015 1020

Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr

1025 1030 1035

Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe

1040 1045 1050

Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys

1055 1060 1065

Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr

1070 1075 1080

Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu

1085 1090 1095

Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr

1100 1105 1110

Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile

1115 1120 1125

Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala

1130 1135 1140

Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala

1145 1150 1155

Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn

1160 1165 1170

Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val

1175 1180 1185

Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro

1190 1195 1200

Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile

1205 1210 1215

Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met

1220 1225 1230

Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu

1235 1240 1245

Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser

1250 1255 1260

Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr

1265 1270 1275

Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp

1280 1285 1290

Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys

1295 1300 1305

Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln

1310 1315 1320

Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr

1325 1330 1335

Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val

1340 1345 1350

Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile

1355 1360 1365

Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser

1370 1375 1380

Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser

1385 1390 1395

Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile

1400 1405 1410

Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro

1415 1420 1425

Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg

1430 1435 1440

Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln

1445 1450 1455

Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser

1460 1465 1470

Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser

1475 1480 1485

Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val

1490 1495 1500

Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn

1505 1510 1515

Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro

1520 1525 1530

Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly

1535 1540 1545

Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1550

Claims (8)

1.一种B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ，其特征在于，所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ由1552个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ，其特征在于，所述的序列中包含序列为PTPTPTEAAAKEAAAKPTPTPT的接头。

3.根据权利要求1所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ，其特征在于，所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ是用基因工程方法制备。

4.一种接头，其特征在于，所述的接头的序列为PTPTPTEAAAKEAAAKPTPTPT，其用于连接权利要求1所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ中缺失的B区部分的两端的序列。

5.权利要求1-3中任一项所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，使用真核表达系统生产所述B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ。

7.权利要求1所述的B区部分缺失型重组人凝血因子Ⅷ在制备药物组合物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗甲型血友病。