CN110129275A - 一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用，属于基因工程药物技术领域，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。所述制备方法包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞；所述重组的脂肪干细胞能够安全、持久的表达凝血因子VIII，对于血友病A的治疗具有较高的应用前景。

Description

一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程药物技术领域，尤其涉及一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
血友病A是临床上最常见的遗传性出血性疾病，由于编码凝血因子Ⅷ(FⅧ)的基因缺陷或功能异常所致。重型血友病A患者血浆中凝血因子活性水平小于1％(正常范围50％～150％)，极易出现自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血等。出血部位以深部肌肉及负重关节为主，治疗不彻底，易形成慢性疼痛及关节畸形。若发生中枢神经系统出血，死亡率极高。血友病A发病率约1/10000，中国人口基数大，据不完全统计，血友病发病人数已超过10,0000人，其中儿童及青中年患者所占比例极高，是儿童辍学率及青中年患者无业的重要原因。因此，血友病因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。在发达国家，目前血友病A的治疗为基因工程制品凝血因子Ⅷ预防性静脉输注，将血浆中FⅧ活性水平维持在1％以上，可以有效减少自发性出血频率，维持在5％以上即可使重型转为轻型。但无论是血浆中提取的或者是基因工程合成的重组凝血因子半衰期短，需频繁输注，其价格昂贵，给患者家庭及政府带来很大负担。在发展中国家，治疗主要为按需输注。血友病患者长期反复输注凝血因子替代治疗最大的副作用即是产生不可逆的抑制物，抑制物形成后替代治疗效率显著下降，出血风险再次增加。基于替代治疗是非治愈性方法，需终身用药，经济负担巨大，全世界超过70％的血友病病人无力承担使用凝血因子的巨额费用。因此，基因治疗是有望治愈血友病A的唯一途径。血友病A作为X染色体单基因遗传性出血性疾病，占血友病总数的80％～85％。当前的凝血因子替代治疗“治标不治本”且有局限性，只有从基因水平上矫正FⅧ基因缺陷才能彻底治愈血友病A。回顾国内外文献发现，血友病B基因治疗相对成熟，成功应用于临床，但血友病A基因治疗进展较慢，病毒载体及靶细胞选择尚未确定。血友病A较血友病B发病率高，临床出血严重，亟待基因治疗彻底改善症状。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用，所述表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞具有能够安全、持久的表达凝血因子VIII的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。
优选的，所述脂肪干细胞来源于腹股沟脂肪组织。
优选的，所述腺病毒载体为AD5型腺病毒载体。
本发明提供了所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：
构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；
提取脂肪干细胞；
将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。
优选的，所述提取脂肪干细胞采用胶原酶消化法。
优选的，所述脂肪干细胞提取自SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织。
优选的，所述胶原酶消化的温度为36～38℃；所述胶原酶消化的时间为1～1.5h。
优选的，所述提取脂肪干细胞之后还包括对提取获得的脂肪肝干细胞进行鉴定。
优选的，所述感染的感染复数值为300～400。
本发明还提供了所述的重组脂肪干细胞在制备防治血友病A的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。所述重组的脂肪干细胞能够安全、持久、有效的表达凝血因子VIII，对于血友病A的治疗具有较好的应用前景。
附图说明
图1为倒置显微镜下ADSCs的形态(×100)，其中A：原代培养48h；B：原代培养7d；C：3代ADSCs；
图2为第三代ADSCs生长曲线；
图3为倒置显微镜下ADSCs诱导鉴定(×100)，其中A：成骨诱导7d后ALP染色；B：成脂诱导14d后油红O染色；C：成骨诱导30d后茜素红染色；
图4为流式检测第3代细胞表面标志结果；
图5为倒置荧光显微镜观察感染后ADSCs细胞形态(×100)，其中A:正常ADSCs24h；B:Ad-BDDhFVIII-GFP感染24h；C:正常ADSCs48h；D:Ad-BDDhFVIII-GFP感染48h；E:正常ADSCs72h；F:Ad-BDDhFVIII-GFP感染72h；
图6为实施例1中三组感染后对ADSCs增值影响；
图7为实施例1中感染ADSCs72小时后hFVIIIAg水平；
图8为实施例1中三组感染ADSCs后BDDhFVIII基因表达；
图9为感染ADSCs72小时后hFVIII蛋白水平。
具体实施方式
本发明提供了一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。
在本发明中，所述脂肪干细胞优选的来源于SD大鼠，更优选的来源于SD大鼠腹股沟脂肪组织。在本发明中，所述腺病毒载体优选为AD5型腺病毒载体；所述腺病毒载体优选的表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体。本发明对所述腺病毒载体的来源没有特殊限定，采用本领域常规方法制备获得或者采用市售的限定度载体均可。
本发明提供了所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。
在本发明中，所述构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体优选的用腺病毒载体将BDDhFVIII基因包装获得表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体。在本发明中，所述BDDhFVIII基因为B区缺失的人凝血因子VIII的基因，为缺失基因FVIII的2657-5141后的序列；所述BDDhFVIII基因的活性与功能均与未缺失B区的人凝血因子VIII基因一致。在本发明中，所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体的构建方法参见汉恒生物科技(上海)有限公司的HB-infusion无缝克隆试剂盒；在本发明具体实施过程中，优选的委托汉恒生物科技(上海)有限公司构建。
在本发明中，所述提取脂肪干细胞优选的采用胶原酶消化法；在本发明中，所述脂肪干细胞优选的提取自SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织。在本发明具体实施过程中，包括以下步骤：S1)SD大鼠腹腔麻醉、消毒后，分离两侧的腹股沟脂肪组织；S2)将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞；S3)将所述消化后的细胞进行筛网过滤、离心后收集固相组分即为脂肪干细胞。
在本发明中，将SD大鼠腹腔麻醉、消毒后，分离两侧的腹股沟脂肪组织，本发明选择腹股沟脂肪组织分离的原因是腹股沟脂肪组织容易获取、产量大、来源充足；而其他地方的脂肪量少，不易获取或是提取过程中容易污染。本发明对所述腹腔麻醉的方法没有特殊要求，采用本领域常规的SD大鼠腹腔麻醉方法即可。在本发明中，所述消毒优选的采用酒精消毒，所述消毒具体为将SD大鼠浸泡于酒精中5～10min；所述酒精优选为体积分数75％的酒精。本发明在所述消毒后，采用镊子分离两侧的腹股沟脂肪组织。
本发明在分离获得所述脂肪组织后，将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞。在本发明中，所述清洗的清洗液优选的为含体积分数1％双抗的PBS溶液(双抗为青霉素、链霉素)，所述清洗的次数优选为3～4次，所述清洗优选的在培养皿中进行；在本发明具体实施过程中，所述清洗尽量将所述脂肪组织中的血管及残留物质洗净。本发明在所述清洗结束后，将清洗后的脂肪组织进行剪碎。在本发明中，将所述清洗后的脂肪组织转移至新的容器中，将所述脂肪组织剪碎；本发明对所述剪碎的方法没有特殊要求，采用本领域常规的组织剪碎方法即可；在本发明具体实施过程中，采用人工剪刀剪碎的方法，所述剪碎的时间优选为30～40min；本发明优选的将所述脂肪组织剪碎至糊状为止。本发明在所述剪碎后进行胶原酶消化；将胶原酶溶液与剪碎后的脂肪组织混合进行胶原酶消化；所述胶原酶容液的体积与剪碎后的脂肪组织的体积比优选为(1.5～2.5):1，更优选为2:1；所述胶原酶溶液的浓度优选为0.5％～1.5％(v/v)，更优选为1％(v/v)。在本发明中，所述胶原酶优选为I型胶原酶。在本发明中，所述胶原酶消化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述胶原酶消化的时间优选为1～1.5h，更优选为1.1～1.4h。本发明在所述消化的过程中，优选的进行手动震荡3-4次，每次手动震荡的时间优选为10～15min。本发明在所述胶原酶消化结束后，优选的进行消化的终止。在本发明中，所述消化的终止优选的为将所述消化的组织中添加等体积的10％FBS的DMEM/F12完全培养基。
本发明将所述消化后的细胞进行筛网过滤、离心后收集固相组分即为脂肪干细胞。在本发明中，所述筛网过滤的孔径优选为200目；所述离心的转速优选的为800～1200rpm，更优选为1000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在所述离心后，收集固相组分获得脂肪干细胞；所述获得的脂肪干细胞优选的用完全培养基重悬进行培养；所述培养优选为接种至培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。本发明在所述提取脂肪干细胞之后还包括对提取获得的脂肪肝干细胞进行鉴定。在本发明中所述鉴定的目的在于确定提取获得的脂肪干细胞是否具有干细胞的特性；所述鉴定优选的包括成骨和成脂的鉴定；本发明对所述鉴定的方法没有摊位数限定，采用本领域常规的方法即可。
本发明在获得所述脂肪干细胞后，将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。在本发明中，所述脂肪干细胞优选为培养传代至第三代的脂肪干细胞；所述第三代的脂肪干细胞的浓度优选为(0.1～5)×105个/ml，更优选为0.5～2×105个/ml，最优选为1×105个/ml。在本发明具体实施过程中，优选的将所述浓度的脂肪干细胞接种于细胞培养板上进行培养，待所述细胞长至70～80％时进行病毒感染。在本发明中，所述病毒感染的感染复数(MOI)值优选为300～400，更优选为350。本发明中，所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体的添加量优选为(1～5)×1010pfu/mL，更优选为1.26×1010pfu/mL；本发明加入病毒体积计算方式为：MOI＝病毒量(ml)×病毒滴度(pfu/mL)÷细胞数(个)。本发明在所述感染细胞15～20min后，优选的摇晃细胞培养板，使所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体与脂肪干细胞充分接触，在所述感染细胞24h更换完全培养基继续培养。本发明优选的在所述感染细胞24、48h、72h后在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达，确定腺病毒携带的BDDhFVIII可成功感染脂肪干细胞。
本发明还提供了所述的重组脂肪干细胞在制备防治血友病A的药物中的应用。本发明中，所述重组脂肪干细胞能够表达人凝血因子VIII的基因。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
脂肪组织干细胞的提取
取2只市售SD大鼠，雌雄不限，称重约120g。对所述SD大鼠进行腹腔麻醉。将大鼠颈部以下置于75％酒精中浸泡消毒10min消毒。消毒后将SD大鼠移入生物安全柜内；小心的用镊子分离SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织，将分离好的脂肪放至含1％双抗的PBS的培养皿中清洗3-4遍，尽量将其中的血管及残留物质洗净，再将脂肪组织移入小烧杯中，充分剪碎(剪成糊状为止)，时间约35min。将剪碎的脂肪组织移入50ml离心管中，向其加入2倍体积的0.1％(v/v)Ⅰ型胶原酶，封口膜封管后放入37℃水浴箱中消化1.3h，消化期间适当拿出手动震荡4次，每次13min。待脂肪组织消化完全后(观察无块状组织即可)加入等量10％FBS的DMEM/F12完全培养基终止消化。200目筛网过滤，1000rpm离心10min，加入5ml完全培养基重悬，接种于25cm2培养瓶内，在37℃5％CO2培养箱中培养。
重组腺病毒载体
携带基因为B区缺失的人凝血因子VIII(BDDFVIII)，(基因FVIII2657-5141序列为B区)；腺病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司，为AD5型，重组腺病毒载体Ad-BDDhFVIII-GFP委托汉恒生物科技(上海)有限公司构建。
重组腺病毒载体感染脂肪组织干细胞
取脂肪组织干细胞的P3代细胞，制成单细胞悬液，调整密度为1×105/ml接种于6孔板上。待细胞长至70～80％，取感染复数(MOI)值为350。向细胞中加入重组腺病毒载体Ad-BDDhFVIII-GFP(1.26×1010pfu/mL)。加入病毒体积计算方式为：MOI＝病毒量(ml)×病毒滴度(pfu/mL)÷细胞数(个)。感染细胞后15～20min后轻轻摇晃6孔板使病毒液与细胞充分接触，24h更换完全培养基继续培养。病毒感染细胞24、48h、72h后在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达。
采用CCK-8法检测转染后细胞增殖情况，CCK-8法检测转染后细胞增殖情况如图6所示，结果显示：3组细胞均于培养3d时进入对数生长期，6d后细胞生长进入平台期，三组细胞均呈倒“S”型曲线生长；三组间在7d内的OD值比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明A、B组感染后对细胞增殖有影响。
其中：A组：将一BDDhFⅧ基因并表达GFP的重组腺病毒载体Ad-BDDhFⅧ-GFP感染至SD大鼠的ADSCs中观察ADSCs中BDDhFⅧ表达情况。
B组：将仅表达GFP的腺病毒载体Ad-GFP感染至SD大鼠的ADSCs中观察ADSCs中BDDhFⅧ表达情况。
C组：正常培养的ADSCs，不做任何处理。
RT-PCR检测感染后各组细胞内BDDhFVIII基因
RT-PCR步骤
用TRIZOL法提取三组细胞总RNA。
提取RNA过程具体操作如下
①用PBS溶液冲洗培养瓶2-3次，吸尽里面液体，向瓶内加入1mL TRIZOL，放置在冰上20min，同时摇动培养瓶使液体与细胞充分接触，吹打细胞，使细胞脱落下来与TRIZOL液体混合均匀，转入1.5ml无酶EP管中。
②向EP管中加入200μL氯仿，手动上下颠倒15s使其混匀，室温下静置3-5min。
③12000rpm4℃离心15min。
④离心后，EP管中液体分为3层，最上层无色水样为RNA，取其中400-500μL移至一新的无酶EP管中(注意千万不要吸入中间一层，避免RNA降解或污染)。
⑤向其中加入等体积预冷的异丙醇(量要大于或等于吸入量)，上下颠倒混匀3次，室温下静置10min。
⑥12000rpm4℃离心15min，同时配制1mL 75％冰乙醇放置4℃冰箱预冷(无水乙醇750μl+DEPC250μl)。
⑦离心后室温下放置5min，使RNA完全沉淀，弃上清，加1mL 75％冰乙醇颠倒数次，洗涤RNA沉淀。
⑧弃掉上清液，室温下干燥约8min(保证管内无残余乙醇、避免不要使RNA过度干燥)，将RNA溶于10μL无酶的DEPC处理水中。
⑨所有RNA样本用微量移液枪吸取1μL，用Q5000软件测定RNA浓度及260/280nm的OD值，以A260/280在1.8-2.0之间视为达标，上机检测细胞总RNA浓度。测定RNA浓度后按照Takara逆转录试剂盒(美国Takara公司，货号：RR037A)将RNA逆转录成cDNA。以大鼠GAPDH(250bp)为内参，设计一对跨越B区结构域的人凝血因子Ⅷ(179bp)的基因序列特异性引物(表1)，引物合成由上海英俊生物工程公司完成，再行PCR扩增特异序列具体操作如下。
表1引物序列
①稀释上游引物：将装有上游引物的EP管以4000rpm离心4-5min，缓慢打开管盖，加入78μLDEPC水，盖上盖后充分震荡混匀。取5μL装入另一EP管中，加入45μLDEPC水备用。
②稀释下游引物：将装有下游引物的EP管以4000rpm离心4-5min，缓慢打开管盖，加入98μLDEPC水，盖上盖后充分震荡混匀。取5μL装入另一EP管中，加入45μLDEPC水备用。③三组以cRNA为模板作PCR，每组3个复孔，构建25μL总反应体系。④25μL反应体系：cDNA2μL,PrimeOne1μL，PrimerTwo1μL，2×MasterMix12.5μL,ddH2O补至25μL。⑤反应条件：94℃3min，94℃30s，60℃45s，72℃1min，72℃5min，30个循环。产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下
①1％琼脂糖凝胶的配制：称量0.25g琼脂糖粉末溶于25ml混合液(超纯水20mL+TBE溶液5mL)放置于三角锥瓶中备用。②将配制好的缓冲液放入三角锥瓶中，在微波炉中加热溶解，当溶液沸腾后，请小心晃动锥瓶，使琼脂糖完全均匀溶解，此步骤重复数次，直至琼脂糖完全溶解。③待溶液冷却至60℃时，加入4μLEB替代物，充分混匀。将琼脂糖溶液倒入制胶膜中，然后在适当位置插入梳子，凝胶厚度在3-5mm之间，在4℃下使胶凝固，大约60min左右。④取5μL左右样品加入依次样品槽中。⑤加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源，控制起始电压保持在90v，当条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳，观察图像拍照保存。
检测结果如图8所示，结果显示：三组感染ADSCs后72h均可见内参基因的表达，A组结果符合扩增片段长度，有BDDhFⅧ基因表达；B、C组未见任何目的条带，无BDDhFⅧ基因表达。
ELISA法检测细胞上清中FVIII抗原表达水平
ELISA试剂盒购自北京安迪华泰科技有限公司，具体方法参见试剂盒说明书，检测结果如图7所示，A、B、C三组感染细胞上清中hFVIIIAg水平结果显示：三组感染ADSCs后72h内在细胞上清中均可检出hFⅧAg表达，A组最多，C组最少，三组间hFⅧAg表达相比差异具有统计学意义(P<0.001)
Western blot分别检测感染后各组细胞内BDDhFVIII基因表达蛋白的情况
取P3代细胞进行实验，按A、B、C三组感染细胞，感染成功72h后提取总蛋白。
蛋白提取过程如下(过程全程在冰上操作)
①将感染后细胞从培养箱中拿出，倒掉培养基。②预先配制蛋白裂解液：RIPA裂解液：1％的PMSF＝1:100。③向各培养瓶中加入2-3mLPBS溶液，轻轻摇晃冲洗细胞3-4次，最后一次用1mL枪吸干残留PBS，防止裂解液加入后被稀释影响效果。④按120μL的量向细胞培养瓶中加入配制好的裂解液，平放培养瓶于冰上使细胞充分裂解40min。⑤用细胞刮将裂解的细胞刮至瓶底，用1mL枪将液体吸入1.5mlEP管中。⑥在4℃下12000rpm离心15min。⑦离心后将上清转移至新的1.5EP管中，进行BCA蛋白定量后，按比例加入(蛋白样本：5×上样缓冲液＝4:1)，充分混匀后用金属浴加热变性100℃10min，变性后蛋白样本冷却后移入-80℃保存。
(2)准备制胶(过程如下，常温进行)
①将玻璃板用清水清洗后用细流水冲净，再用超纯水冲洗后于支架上晾干，按凝胶配置说明书配置分离胶。②将玻璃板的长板与短板对齐后(短板向内)放入电泳夹中夹紧并置于制胶器上夹紧，用10mL注射器抽取分离胶溶液沿玻璃板推注到长板与短板的间隙中，待胶面上升至距顶端1.5cm时停止，同样方法灌注另一面。用1mL枪吸取1mL无水乙醇加入分离胶顶端压胶，30～40min后，两者间出现一条明亮的折线说明分离胶已充分凝固，此时按凝胶配置说明书配制浓缩胶，将无水乙醇沿板壁倒去滤纸吸干水分，同样方式灌注浓缩胶将剩余空间填满，并插入10个齿梳的梳子，避免气泡出现，20～30min后待浓缩胶完全凝固后备用。③向内槽中加满新制备的1×电泳液，双手捏住齿梳两侧轻轻拔出，放入电泳槽中，外槽中可加入1×电泳液至没过电阻丝，用10μL枪按顺序依次加入蛋白Marker及样本。④将电泳装置接入电源，先恒压90v电泳至溴酚蓝进入分离胶并出现红色Marker条带时将电压调至120V电泳至分离胶底部，停止电泳并断开电源。⑤预先裁好PVDF膜(将PVDF膜浸入甲醇中激活1min)，后置于盛有电转液的托盘中，按顺序依次为黑色支架-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-红色支架，将夹子放置于电转槽中，加满新配制的电转液，将电转槽放入冰水混合物的水盆中降温，接入电源，注意正负极，打开开关，220mA恒流电转约2h，停止电转并断开电源。⑥取出PVDF膜放入5％脱脂奶粉的孵育盒封闭孵育1.5-2h。⑦封闭后取出条带，TBST中漂洗1次后放入用TBST稀释的蛋白特异性抗体FactorⅧ(1:1000)，4℃孵育过夜(一抗过夜时膜正面朝下使抗体与膜接触充分)，次日用镊子小心夹取出PVDF膜，放入加有TBST孵育盒漂洗4次，每次10min。⑧放入TBST稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:5000)的孵育盒中，室温摇床孵育2h，完毕后将PVDF膜放入TBST孵育盒漂洗4次，每次10min，洗膜完毕后进行显色。⑨将PVDF膜上的TBST甩干，放置于显色托盘上，注意膜放置正反，将配置好的ECL显色液(60μL/条)平铺滴于PVDF膜上，将托盘放入凝胶成像仪自动曝光显影，保存图片。
Westernblot的结果如图9所示，结果显示：三组感染ADSCs后72h在细胞中均可检出hFⅧ蛋白表达，A组最多，C组最少，B、C两组hFⅧ蛋白表达与A组相比，差异具有统计学意义(P<0.001)
Ⅷ因子基因剔除SD大鼠动物实验
将Ⅷ因子基因剔除SD大鼠(血友病A大鼠)(购买至上海邦耀生物科技有限公司)随机编号1-9，取9张相同大小、材质卡片，标号1-9。卡片与大鼠相对应，即1号卡片对应1号大鼠，以此类推。采用抽签法，分为3组，每组3只。分别为血友病A大鼠1、2、3组。以正常SD大鼠为第4组。
病毒载体及靶细胞注射
将病毒载体经尾静脉直接输入血友病A1组大鼠体内；将含有目的基因载体的靶细胞，即感染了携带B区缺失的人凝血因子VIII的基因的腺病毒载体的重组脂肪干细胞经尾静脉输入血友病A2组体内；将未携带目的基因的空病毒转染的脂肪干细胞经尾静脉输入如血友病A3体内；将PBS缓冲液经尾静脉输入正常鼠体内。
表2组别以及注射剂量
静脉采血
病毒载体及靶细胞注入后1、2、7、14、21、28日尾静脉采血供功能性和免疫学检测之用，包括部分凝血活酶时间(APTT)，Ⅷ因子酶联免疫吸附反应(ELISA)，抗Ⅷ因子抗体分析等；上述检测委托检测机构进行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华北理工大学
<120> 一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcatcttc ttgtgcagtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccgttgat gaccagcttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattctgggg tgccacaact 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtgggtt ttgagagaag c 21

Claims (10)

1.一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。
2.根据权利要求1所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞来源于腹股沟脂肪组织。
3.根据权利要求1或2所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述腺病毒载体为AD5型腺病毒载体。
4.权利要求1～3任意一项所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：
构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；
提取脂肪干细胞；
将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述提取脂肪干细胞采用胶原酶消化法。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪干细胞提取自SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述胶原酶消化的温度为36～38℃；所述胶原酶消化的时间为1～1.5h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述提取脂肪干细胞之后还包括对提取获得的脂肪肝干细胞进行鉴定。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述感染的感染复数值为300～400。
10.权利要求1～3任意一项所述的重组脂肪干细胞在制备防治血友病A的药物中的应用。
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