CN109680000B - 利用树鼩骨髓间充干细胞建立hcv细胞模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，属于生物医药技术领域。该方法先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR‑122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到HCV细胞模型，该细胞具有骨髓间充质干细胞的基本特性和分化潜能，并对HCV易感，支持HCV入胞、复制和产出具有感染性的病毒颗粒，为研究HCV的致病机制及药物筛选提供了新的细胞模型资源。

Description

利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法。
背景技术
丙型肝炎病毒（HCV）是一种正在严重危害人类健康的病毒，目前，全球HCV感染者已达1.7-2.0亿人，每年感染者还在不断递增。HCV感染后，仅有少数（15-25%）的感染者通过自身免疫反应清除病毒，而大多数（75-85%）的感染者发展为慢性感染，其中10-20%感染者发展成肝硬化，肝硬化中约5%患者最后发展为肝癌直至死亡。目前仍然没有疫苗可以预防，尽管已有HCV治疗药物，但其价格极其昂贵，普通患者难于支付。研究HCV的治疗药物、疫苗及发生机制需要适宜的细胞模型和动物模型。
目前HCV细胞模型主要有：淋巴细胞模型、原代肝细胞模型、肝癌细胞系模型和iPS起源的肝样细胞模型。由于HCV在淋巴细胞模型中的复制水平低，细胞系维持时间短，加上这些细胞与肝细胞具有较大的差异，而限制了其应用。原代肝细胞主要有黑猩猩、人胚胎和树鼩原代肝细胞。黑猩猩和人胚胎肝细胞来源有限并受伦理道德影响，重要的是原代肝细胞体外分离繁琐耗时且不能传代培养，培养时间有限，细胞质量和病毒血清质量不易控制，导致其应用受限。
最常用的肝癌细胞模型是基于HCV2a-JFH1-Huh7的细胞模型。尽管利用该模型可以大量复制并产生具有感染性的HCV病毒，但Huh7细胞系是一种肝细胞瘤的衍生细胞株，用其研究的实验结果还需在原代肝细胞和体内进一步验证。由iPS分化的肝样细胞（HLCs）支持1a、1b和2a型HCV感染，有完整的病毒生活周期并产生先天炎症反应（TNF-α和IL-28B分泌），且支持分离自临床病人的1a和1b型HCV感染。但是其产生的具有感染性的病毒颗粒远比Huh-7细胞产生的要低很多，而能分化为支持HCV感染的HLCs的iPS数量也非常少，到目前为止不超过8个细胞系。这些局限性也在一定程度上限制了其应用。所以亟需寻找一种能在体外传代而且能使其产生大量具有感染性HCV病毒颗粒的细胞。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，该方法选用树鼩骨髓间充质干细胞作为研究细胞，利用骨髓间充质干细胞易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能；能够与各种病毒载体结合，进行各种基因的转染，既能保持本身基因的稳定性，还能高效表达所转染基因的特性，将既能促进干细胞向肝细胞分化，又能促进HCV在细胞内感染的miR-122和HCV入胞的两个最为关键的受体CD81和Occludin（OCLN）导入骨髓间充质干细胞，解决了原代肝细胞不能传代和肝癌细胞系研究HCV不足的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR-122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；之后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型；
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
进一步，优选的是，所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
先向树鼩骨髓间充干细胞中加入OCLN慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h后，再加入CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h后，最后再加入miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时，之后再加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
进一步，优选的是，所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
进一步，优选的是，所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
进一步，优选的是，所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
进一步，优选的是，所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为50-70%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=15-30，将7.5-15μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h；
之后，取出该细胞再加入15-30μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h；
最后再加入7.5-15μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
进一步，优选的是，复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入37℃-42℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
进一步，优选的是，取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞在24孔板中长至汇合度为60-70%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的HCVcc病毒滴度，按照MOI为0.5-1接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5%CO2 孵箱中培养，15-20min轻摇24孔板一次，共2次，孵育8-16h后补充新鲜培养基250μL；病毒接种第2天，收集细胞和上清，PBS洗涤细胞，之后向每孔细胞中加入含40-60ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养，得到HCV细胞模型。
本发明还提供上述利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法制得的HCV细胞模型。
本发明同时还保护HCV细胞模型在筛选抗HCV药物中的应用。
本发明中树鼩骨髓间充质干细胞为现有产品，其制备方法可以参考树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导，陆彩霞等，中国比较医学杂志.2014.24(3):10-13，但不限于此。
本发明中，感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mLpolybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，此处新鲜培养基不含polybrene。其中，polybrene是指溴化己二甲铵吗，也叫聚凝胺。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明为解决现有技术的不足进行了深入研究，结果发现在向树鼩骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）转染miR-122和HCV受体CD81/OCLN后，得到带OCLN/CD81/miR-122的树鼩骨髓间充质干细胞，该细胞具有骨髓间充质干细胞的基本特性和分化潜能，并对HCV易感，支持HCV入胞、复制和产出具有感染性的病毒颗粒。HCV原代肝细胞模型中，原代肝细胞分离繁琐耗时，且不能传代，而树鼩骨髓间充干细胞HCV细胞模型中，BM-MSCs易于获得和扩增，可以连续传代和冷冻保存，解决了原代肝细胞不能传代的局限性。基于HCV2a-JFH1- Huh7的细胞模型，尽管是目前应用最为广泛的HCV细胞模型，但该模型中的细胞是一种肝细胞瘤的衍生细胞株，与正常肝细胞毕竟不同，用其研究的实验结果还需在原代肝细胞和体内进一步的验证，也不支持临床分离的其他型别的HCV感染。而我们的树鼩骨髓间充质干细胞模型中，其BM-MSCs是来源于骨髓组织中的非造血细胞，具有自我更新和多向分化潜能，能与各种病毒载体结合进行基因的转染并高效表达所转染的基因，目前建立的OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs，该细胞可以支持HCVcc的复制，产生较高的病毒载量（＞105copies/mL），进一步的研究发现其产生的病毒颗粒具备感染性，证明可以在该细胞上完成HCV的生活史。这在利用骨髓间充质干细胞建立HCV细胞模型上尚属首次。
通过本发明提供一种新的HCV细胞模型，在该细胞模型上可以完成HCV生活史，产生具有感染性的病毒颗粒，为研究HCV的致病机制及药物筛选提供了新的细胞模型资源。
附图说明
图1为RT-PCR检测HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs后miR-122基因mRNA表达；
图2为RT-PCR检测HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs后OCLN/CD81基因mRNA表达；
图3为巢式PCR检测HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs细胞中HCV RNA 正负链；A ：正链；B：负链；
图4为巢式PCR检测HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs后上清中HCV RNA 正负链；A：正链；B：负链；
图5为HCVcc感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs后病毒载量；
图6为HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs细胞后的上清接种Huh7.5.1细胞后HCV core免疫荧光检测结果（400x）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中OCLN慢病毒载体、miR-122慢病毒载体购买与上海恒圆生物科技有限公司，CD81慢病毒载体购买与汉恒生物科技（上海）有限公司。其中，CD81(NM_004356.3)、Occludin(U53823.1)和hsa-mir-122（NR_029667.1）
本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数。
下面具体实施方式中，新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
实施例1
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR-122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含2μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；之后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型；
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
实施例2
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
先向树鼩骨髓间充干细胞中加入OCLN慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5h后，再加入CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5h后，最后再加入miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时，之后再加入体积是当前培养基体积1/2的含6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
实施例3
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为50%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含6μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=15，将7.5μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染1h；
之后，取出该细胞再加入15μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染1h；
最后再加入7.5μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入37℃℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
实施例4
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为70%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含3μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=30，将15μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染0.6h；
之后，取出该细胞再加入30μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.7h；
最后再加入15μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含5μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞在24孔板中长至汇合度为60%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的HCVcc病毒滴度，按照MOI为0.5接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5%CO2 孵箱中培养，15min轻摇24孔板一次，共2次，孵育8h后补充新鲜培养基250μL；病毒接种第2天，收集细胞和上清，PBS洗涤细胞，之后向每孔细胞中加入含40ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养，得到HCV细胞模型。
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入42℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
实施例5
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为60%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=20，将10μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染0.75h；
之后，取出该细胞再加入20μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.8h；
最后再加入10μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞在24孔板中长至汇合度为70%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的HCVcc病毒滴度，按照MOI为0.75接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5%CO2 孵箱中培养，18min轻摇24孔板一次，共2次，孵育10h后补充新鲜培养基250μL；病毒接种第2天，收集细胞和上清，PBS洗涤细胞，之后向每孔细胞中加入含50ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养，得到HCV细胞模型。
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入40℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
实施例6
利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为60%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=25，将12μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染0.8h；
之后，取出该细胞再加入25μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.6h；
最后再加入10μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞在24孔板中长至汇合度为65%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的HCVcc病毒滴度，按照MOI为0.7接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5%CO2 孵箱中培养，18min轻摇24孔板一次，共2次，孵育10h后补充新鲜培养基250μL；病毒接种第2天，收集细胞和上清，PBS洗涤细胞，之后向每孔细胞中加入含50ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养，得到HCV细胞模型。
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入40℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
应用实例
1.BM-MSCs的复苏
取出保存在液氮中的BM-MSCs细胞，迅速放入37℃-42℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至T25的细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养。次日，待BM-MSCs细胞贴壁后更换新鲜培养基。
2.BM-MSCs的传代铺板
当细胞生长汇合达90%左右时进行细胞传代，倒掉旧培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次；加入0.25%的胰蛋白酶溶液，静止2-3min，显微镜下观察细胞呈现圆粒状或肉眼观察瓶底出现毛玻璃状时，吸走0.25%胰蛋白酶溶液，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入新鲜培养基，用吸管或1mL的枪头吹打数次以打散细胞团，细胞混合均匀后，取10μL细胞与台盼蓝染液按1:1混匀后，再取10μL加入到细胞计数板，将细胞计数板插入到伯乐细胞计数仪上计数，按5-6×104/mL浓度接种到6孔细胞培养板中，每孔2mL。将细胞板置于37℃、5% CO2孵箱中培养。
3.含人OCLN、CD81和miR-122基因慢病毒转染树鼩BM-MSCs
Figure DEST_PATH_IMAGE002
吸去BM-MSCs细胞原有培养基，加入体积是原有培养基1/2的含4μg/mLpolybrene的新鲜培养基，按感染复数（Multiplicity of infection, MOI）=30进行相应的慢病毒转染（MOI值换算为病毒原液体积按如下计算公式进行：病毒原液体积=（细胞数×MOI）/慢病病毒滴度）。MOI为30时，相应的病毒原液体积换算如下：
CD81病毒原液体积=1.0×105×30/1×108/mL=30μL
OCLN病毒原液体积=1.0×105×30/2×108/mL=15μL
miR-122病毒原液体积=1.0×105×30/2×108/mL=15μL
Figure DEST_PATH_IMAGE004
向BM-MSC细胞中加入OCLN病毒原液体积15μL，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5h后，再加入CD81病毒原液体积30μL，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5h后，再加入miR-122病毒原液体积15μL。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
轻轻混匀后，将细胞放回37℃、5% CO2 孵箱中感染4小时。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
37℃、5% CO2 孵箱中感染完毕，从孵箱中取出，直接往含病毒的培养基中加入体积是当前培养基体积1/2的含4μg/mL polybrene的新鲜培养基（含终浓度为4μg/mL的polybrene）。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
感染后第二天，吸去含病毒的培养基，换上新鲜的培养基（不含polybrene），继续37℃、5% CO2 孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
感染72小时后，荧光显微镜观察荧光表达情况，并消化细胞按6×105个/mL接种24孔板，每孔0.5mL。
4.所述的携带OCLN/CD81/miR-122的树鼩骨髓BM-MSCs采用实时荧光定量PCR鉴定OCLN/CD81/miR-122的mRNA表达：
（1）miR-122表达检测：
采用EXIQON 公司的miRCURYTM RNA Isolation Kit试剂盒提取细胞中的miRNA。
用Qiagen公司的 miRCURY™ LNA™ Universal RT microRNA PCR进行逆转录和PCR反应。
miR-122的表达检测PCR反应体系为：
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)，5µL；
has-miR-122-5p引物（Exiqon公司）1µL；该引物为miRCURY™ LNA™ UniversalRT microRNA PCR试剂盒里自带的引物。（目前Exiqon公司已被Qiagen公司收购）
Template cDNA，1µL；
Nuclease-freeWater，3µL；
总计，10µL。
PCR反应条件为：95℃预变性10min；然后95℃ 15 s；60℃ 60s；45个循环。
检测结果如图1所示，表示转入miR-122。
（2）OCLN表达检测：
采用Trizol法提取细胞总RNA。
按照复能公司的逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。
OCLN表达检测的PCR反应体系为：
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)，10µL；
OCLN 引物各0.16µL，浓度为20µM；其中，F：cggcaatgaaacaaaaggcag （SEQ IDNO.1）；R：ggctatggttatggctatggctac（SEQ ID NO.2）；
Template DNA，100µg；
Nuclease-freeWater，to 20µL；
Total volume，20µL。
PCR反应条件为：95℃预变性10 min；然后95℃ 15 s； 60℃ 20s；72℃延伸30s ，40个循环。
检测结果如图2所示，表示转入OCLN。
（3）CD81表达检测：
采用Trizol法提取细胞总RNA。
按照复能公司的逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。
OCLN表达检测的PCR反应体系为：
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)，10µL；
CD81 引物各0.16µL，浓度为20µM；其中，F：tgttcttgagcactgaggtggtc（SEQ IDNO.3）；R：tggtggatgatgacgccaac（SEQ ID NO.4）；
Template DNA，100µg；
Nuclease-freeWater，to 20µL；
Total volume，20µL。
PCR反应条件为：95℃预变性10 min；然后95℃ 15 s； 60℃ 20s；72℃延伸30s ，40个循环。
检测结果如图3所示，表示转入CD81。
5. HCVcc病毒接种树鼩骨髓间充质干细胞
5.1 HCVcc病毒接种
取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞长至汇合度为70%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的病毒滴度，按照MOI为0.5接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5% CO2 孵箱中培养，15-20min轻摇24孔板一次，共2次，孵育8-16h后补充新鲜培养基250μL。
（1）病毒接种第2天，收集细胞和上清（-80℃保存备用），PBS洗涤细胞5次，收集最后一次PBS洗涤液，用0.22μm膜过滤后作为洗液对照（-80℃保存备用）。
（2）向每孔细胞中加入含50ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5% CO2孵箱中继续培养，在接种病毒后的2d、3d、4d、5d分别收集细胞和上清，-80℃保存用于后续病毒定性和定量实验用。
5.2 HCVcc病毒感染树鼩骨髓间充质干细胞后定性检测
Figure 753460DEST_PATH_IMAGE002
HCVcc病毒感染后细胞样品RNA的提取：采用Trizol法.
Figure 139442DEST_PATH_IMAGE004
HCVcc病毒感染后上清样品RNA的提取：采用 QIAGEN公司的 QIAamp®ViralRNA Mini Kit试剂盒，按试剂盒说明书进行。
用巢式PCR对上清和细胞样本进行正负链定性检测，巢式PCR引物如下表1所示。
表1.巢式PCR引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE014
样品的正负链逆转录反应体系配制如表2所示。
表2.正负链逆转录反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE016
正负链逆转录反应条件：25℃，5min，42℃，60min，85℃，5min，冷却至4℃。
巢式PCR反应体系如表3所示：
表3.巢式PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE018
巢式PCR反应条件：95℃变性 5min，循环参数：95℃变性 30s，62℃退火 30s，72℃延伸1min，共40个循环；然后72℃作用10min后，冷却至4℃。
结果：在感染后第1天即可在细胞样品上检测到HCV RNA 正负链，如图3；在感染后第3天的上清样品中检测到HCV RNA 正负链，如图4。
5.3 HCVcc病毒感染树鼩骨髓间充质干细胞后定量检测
荧光定量PCR中的引物序列如表4所示：
表4. 荧光定量 PCR 引物及探针序列
Figure DEST_PATH_IMAGE020
定量反应体系：
样品的反应体系配制如表5所示：
表5.样品反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE022
将样品反应体系混匀，稍作振荡简短离心收集管壁管盖上液体，得到Real-TimeRT-PCR所需的mix反应液。每个PCR管中加入18μL制好的mix反应液，再加入样品RNA 2μL，盖上盖子，混匀，并简短离心集附着在管壁和管盖的试剂（防止气泡出现），放入实时荧光定量仪内。
PCR反应循环条件为：42℃ ，5min，95℃，10sec，95℃，5sec，58℃，45sec，45个循环。
定量检测结果显示，HCVcc感染树鼩骨髓间充质干细胞后HCV病毒载量可达105copies/mL，如图5。
6.HCVcc 感染OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs细胞后上清感染性检测
HCVcc感染OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs第3天，收集细胞上清，4000rpm离心10min去除细胞碎片，分装后保存在-80℃。Naive Huh-7.5.1 按5×104个/mL，加入96孔细胞板，200μL/孔，置于含5% CO2的37℃培养箱孵育至50%-60%融合。加入HCVcc感染后第3天收集的细胞上清，继续培养72h后以免疫荧光染色法检测感染细胞内HCV Core抗原，方法如下：
1）用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
2）每孔加入100μL加入4%多聚甲醛，常温固定30min；
3）30 min后，吸出多聚甲醛，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
4）每孔加入100μL的0.2% TritonX-100，常温30min；
5）吸出TritonX-100，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
6）向96孔板中加入3% BSA，常温封闭30min；
7）吸出BSA，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
8）向每孔中加入50μL HCV Core一抗（用抗体稀释液，按照1:50稀释一抗），37℃孵育2h（或4℃过夜）；
9）吸出一抗，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
10）在暗室中加入100μL二抗（羊抗鼠罗丹明标记，用抗体稀释液，按照1:200稀释二抗），锡箔纸包好，37℃孵育1h（不要超过1.5h）；
11）在暗室中吸走二抗，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次；
12）向每孔中加入100μL DAPI荧光染料进行核染（用PBS按照1:200稀释），用锡箔纸包好，37℃孵育2min；
13）在暗室中吸走DAPI，PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，加入100μL PBS缓冲液，荧光显微镜下拍照。
结果显示，OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs感染细胞上清接种Huh7.5.1细胞后，能表达HCV Core抗原（见图6）。说明靶细胞OCLN/CD81/miR-122/BM-MSCs可以支持HCVcc的复制，并能产生具有感染性的病毒颗粒。
早期研究发现，HCV可以感染人T/B淋巴细胞，但HCV在淋巴细胞模型中的复制水平低，细胞系维持时间短。原代肝细胞模型中，由于原代肝细胞分离繁琐耗时，且不能传代，也导致应用受限，而树鼩骨髓间充干细胞HCV细胞模型中，BM-MSCs易于获得和扩增，可以连续传代和冷冻保存，解决了原代肝细胞不能传代的局限性。尽管基于HCV2a-JFH1-Huh7的细胞模型是目前应用最广泛的HCV细胞模型，但该模型中的细胞是一种肝细胞瘤的衍生细胞株，与正常肝细胞毕竟不同，用其研究的实验结果还需在原代肝细胞和体内进一步的验证，也不支持临床分离的其他型别的HCV感染。而我们的树鼩骨髓间充质干细胞模型中，其BM-MSCs是来源于骨髓组织中的非造血细胞，具有自我更新和多向分化潜能，能与各种病毒载体结合进行基因的转染并高效表达所转染的基因，目前建立的基于向BM-MSCs转染人HCV受体OCLN/CD81及人miR-122后，该细胞可以支持HCVcc的复制，产生较高的病毒载量（＞105copies/mL），进一步的研究发现其产生的病毒颗粒具备感染性，说明可以在该细胞上完成HCV的生活史。这在利用骨髓间充质干细胞建立HCV细胞模型上尚属首次。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
cggcaatgaa acaaaaggca g 21
SEQIDNO.2
ggctatggtt atggctatgg ctac 24
SEQ ID NO.3
tgttcttgag cactgaggtg gtc 23
SEQ ID NO.4
tggtggatga tgacgccaac 20
SEQ ID NO.5
cactcccctg tgaggaacta ctgtct 26
SEQ ID NO.6
cggcaacaag tatactccgc caacg 25
SEQ ID NO.7
cacgcagaaa gcgcctagcc at 22
SEQ ID NO.8
cgccgcccgg gaacttaacg tct 23
SEQ ID NO.9
tgctcatgat gcacggtcta c 21
SEQ ID NO.10
tgcggaaccg gtgagtaca 19
SEQ ID NO.11
caccctatca ggcagtacca caaggcc 27
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cggcaatgaa acaaaaggca g 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggctatggtt atggctatgg ctac 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgttcttgag cactgaggtg gtc 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tggtggatga tgacgccaac 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cactcccctg tgaggaacta ctgtct 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cggcaacaag tatactccgc caacg 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cacgcagaaa gcgcctagcc at 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cgccgcccgg gaacttaacg tct 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tgctcatgat gcacggtcta c 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tgcggaaccg gtgagtaca 19
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
caccctatca ggcagtacca caaggcc 27

Claims (10)

1.利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
先采用OCLN慢病毒载体对树鼩骨髓间充干细胞进行感染，然后，加入CD81慢病毒载体继续进行感染，接着，再加入miR-122慢病毒载体进行感染，感染4h之后，再加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基继续培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；之后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型；
所述的新鲜培养基为DMEM/F12培养基+10%FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
2.根据权利要求1所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
先向树鼩骨髓间充干细胞中加入OCLN慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h后，再加入CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h后，最后再加入miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时，之后再加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
3.根据权利要求1或2所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，所述的OCLN慢病毒载体为pHBLV-OCLN-CMVIE-mcherry-T2A-Puro。
4.根据权利要求1或2所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，所述的CD81慢病毒载体为pHBLV-CD81-CMVIE-ZsGreen-Puro。
5.根据权利要求1或2所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，所述的miR-122慢病毒载体为pHBLV-miR-122-U6-Scramble-Puro。
6.根据权利要求1或2所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
复苏树鼩骨髓间充质干细胞，按5×105个/mL接种含新鲜培养基的6孔板中，每孔2mL，待次日细胞生长至汇合度为50-70%时，吸去原有培养基，加入体积是原有培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，按感染复数MOI=15-30，将7.5-15μL OCLN慢病毒载体加入到树鼩骨髓间充质干细胞中，混匀后37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h；
之后，取出该细胞再加入15-30μL CD81慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染0.5-1h；
最后再加入7.5-15μL miR-122慢病毒载体，混匀后放入37℃、5% CO2孵箱中感染4小时；
感染结束后，之后加入体积是当前培养基体积1/2的含2-6μg/mL polybrene的新鲜培养基，第二天，去除旧的培养基，换上新鲜培养基，继续在37℃、5% CO2孵箱中培养，得到OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs；
最后，将HCVcc病毒接种于OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs中，得到HCV细胞模型。
7.根据权利要求6所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，复苏树鼩骨髓间充质干细胞的具体步骤为：取出保存在液氮中的树鼩骨髓间充质干细胞，迅速放入37℃-42℃的温水中快速融化，将融化的细胞液转移至细胞培养瓶中，加10mL含10% FBS的DMEM/F12培养基，混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养；次日，待树鼩骨髓间充质干细胞贴壁后更换新鲜培养基，继续培养。
8.根据权利要求1所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法，其特征在于，取生长良好的OCLN/CD81/miR-122-BM-MSCs，待细胞在24孔板中长至汇合度为60-70%以上，用PBS轻轻洗涤细胞1次，每孔加入新鲜培养基250μL；根据测得的HCVcc病毒滴度，按照MOI为0.5-1接种病毒于24孔板中，轻晃24孔板使病毒稀释液覆盖细胞表面，放入37℃、5%CO2 孵箱中培养，15-20min轻摇24孔板一次，共2次，孵育8-16h后补充新鲜培养基250μL；病毒接种第2天，收集细胞和上清，PBS洗涤细胞，之后向每孔细胞中加入含40-60ng/mL VEGF的新鲜培养基500μL，放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养，得到HCV细胞模型。
9.权利要求1、2、7、8任意一项所述的利用树鼩骨髓间充干细胞建立HCV细胞模型的方法制得的HCV细胞模型。
10.权利要求9所述的HCV细胞模型在筛选抗HCV药物中的应用。
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