CN108324727B - miR-1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域,公开了一种miR‑1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。本发明的实施例首次发现了miR‑1307与口蹄疫病毒复制的关系,即通过上调miR‑1307的表达能够达到抑制口蹄疫病毒复制的目的;根据miR‑1307的功能,可将其应用于制备预防和/或治疗口蹄疫的药物,具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物领域,特别涉及miR-1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染所引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病,主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快,曾在世界范围内造成巨大经济损失,被世界动物卫生组织列为A类动物疫病之首(Sobrino,F.等,Foot-and-mouth disease virus:along known virus,but a current threat.Vet Res.2001,32:1-30)。
口蹄疫病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。全世界范围内共发现7种血清型,包括O型、A型、C型、亚洲1型(Asian1)、南非1型(SAT1)、南非2型(SAT2)和南非3型(SAT3),各血清型之间无交叉保护(Domingo,E.等,Foot-and-mouthdisease virus evolution:exploring pathways towards virus extinction.Curr TopMicrobiol Immunol.2005,288:149-173)。目前我国境内的流行毒株主要属于O型和A型。口蹄疫病毒是正义单链RNA病毒,其基因组为长约8.5kb的正义RNA单链,由5′非翻译区(5′UTR)、3′非翻译区(3′UTR)和一个开放阅读框(ORF)构成。病毒基因组释放到宿主细胞后,可以直接翻译产生一个多聚蛋白前体,后者进一步被切割加工成为4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和10个非结构蛋白(Lpro、2A、2B、2C、3A、3B1–3、3Cpro和3Dpol)。4个结构蛋白各60份拷贝可以自我组装成直径约30nm的二十面体病毒衣壳,其中VP1、VP2和VP3在衣壳外面,而VP4在衣壳里面与病毒基因组相联系,口蹄疫病毒的非结构蛋白在病毒增殖、免疫逃逸或免疫抑制方面发挥着重要作用(Gao,Y.等,Biological function of Foot-and-mouthdisease virus non-structural proteins and non-coding elements.Virol J.2016,13:107)。
目前对于该病的防控以疫苗免疫预防为主,而且传统灭活疫苗仍占据市场主导地位。然而,传统疫苗在许多方面仍亟待改进,如存在安全风险、疫苗研发周期较长、免疫反应滞后、免疫保护时间较短等,针对疫苗免疫反应相对滞后的缺陷,因此目前亟需提供一种高效控制口蹄疫病毒的新型药物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种miR-1307对口蹄疫病毒的调控作用,本发明提供了miR-1307有效抗口蹄疫病毒的新用途。
本发明的目的通过如下方案实现:MicroRNAs(miRNAs)是长约21-bp的非编码RNA,它们可以在转录后水平调控基因的表达。miRNAs基因首先是由RNA聚合酶Ⅱ转录产生带有颈环结构的初级转录本(pri-miRNAs),然后由Drosha复合体切割成为约70-bp的前体miRNAs(pre-miRNAs),后者运送到细胞质中并进一步被Dicer复合体加工成为约21-bp的miRNA/miRNA*双螺旋结构。双螺旋中的miRNA*链被降解,而成熟miRNA则与AGO蛋白(主要是AGO2)结合并形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)。作为miRISC的关键组分,miRNA通过碱基配对的方式与含有互补序列的靶mRNA结合,使其翻译受阻或导致其降解。研究表明miRNAs在病毒与宿主细胞相互作用的过程中发挥着非常重要的调节作用。具体地,miRNAs既可以直接靶向病毒基因组,也可以靶向宿主因子,既可以起到抑制病毒复制的作用,也可以起到促进病毒复制的作用,具体情况因特定病毒及miRNA而异。因此,通过操控miRNAs的作用可以达到控制病毒病的目的(Laqtom,N.N.和Buck,A.H.,microRNA manipulation as a host-targeted antiviral therapeuticstrategy.European Pharmaceutical Review.2011,16:52-55;Bruscella,P.等,Virusesand miRNAs:More Friends than Foes.Front Microbiol.2017,8:824)。
我国的研究者们已经尝试人工设计miRNAs靶向口蹄疫病毒基因组3Dpol或位于5′UTR的内部核糖体结合位点,发现能够有效抑制病毒复制(Du,J.等,Effective inhibitionof foot-and-mouth disease virus(FMDV)replication in vitro by vector-deliveredmicroRNAs targeting the 3D gene.Virol J.2011,8:292;Chang,Y.等,MultiplemicroRNAs targeted to internal ribosome entry site against foot-and-mouthdisease virus infection in vitro and in vivo.Virol J.2013,11:1-12)。然而,内源性宿主miRNAs在口蹄疫病毒感染过程中的作用仍然了解很少。口蹄疫病毒感染猪肾细胞系PK-15后,共有244个miRNAs的表达受到差异调控,但具体作用并不清楚(Zhang,K.S.等,Identification and analysis of differential miRNAs in PK-15 cells after foot-and-mouth disease virus infection.PLoS One.2014,9:e90865)。为了鉴定受口蹄疫病毒感染调控的miRNAs,我们收集了PK-15细胞对照样品和口蹄疫病毒感染后2h的样品,通过Affymetrix miRNA芯片鉴定差异表达的miRNAs。芯片杂交及数据分析委托北京博奥晶典生物技术有限公司完成。对鉴定到的差异表达miRNAs,我们再用RT-qPCR法对其表达量进行验证,最终鉴定到miR-1307,其表达量受到口蹄疫病毒感染的明显诱导。
另外,我们还通过实验验证了miR-1307的模拟物以及miR-1307的表达载体对口蹄疫病毒复制有抑制作用。
基于上述结果,本发明提供的miR-1307在预防和/或治疗口蹄疫病毒感
染的组合物中的应用如下:
miR-1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
miR-1307的模拟物在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
miR-1307的表达载体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
本发明的实施例首次发现了miR-1307与口蹄疫病毒复制的关系,即通过上调miR-1307的表达能够达到控制口蹄疫的目的。根据miR-1307的功能,可将其应用于制备抗口蹄疫的药物,为开发新的抗口蹄疫疾病的药物提供了重要的基础。
附图说明
图1显示了通过高通量筛选寻找受口蹄疫病毒感染差异调控的宿主miRNAs。PK-15细胞对照样品和口蹄疫病毒感染后2h的样品通过miRNAs微阵列芯片寻找差异表达的miRNAs。其中,图中红点表示口蹄疫病毒感染后显著上调的miRNAs,绿点表示显著下调的miRNAs。
图2显示了口蹄疫病毒感染显著诱导miR-1307的表达。口蹄疫病毒(MOI=1)感染PK-15和IBRS-2细胞后不同时间点收集细胞样品,提取miRNA并用RT-qPCR法对miR-1307进行定量。其中,miR-16作为内参。
图3显示了转染miR-1307的模拟物能够显著抑制口蹄疫病毒的复制。PK-15细胞转染对照模拟物(NC)或miR-1307的模拟物(mimics)36h后接毒(MOI=1),病毒感染后不同时间收集样品提取总RNA,并利用基于TaqMan探针的RT-qPCR法对病毒RNA进行定量。
图4显示了过表达miR-1307明显抑制口蹄疫病毒的增殖。
图4a显示了口蹄疫病毒感染后病毒RNA在miR-1307过表达的2个细胞株(miR-1307-11,miR-1307-12)中相比对照细胞株(NC)中明显降低。不同细胞株用1MOI的口蹄疫病毒感染8h后收集样品,利用基于TaqMan探针的RT-qPCR法对病毒RNA进行定量。
图4b显示了口蹄疫病毒感染后miR-1307过表达细胞株中VP1的蛋白水平明显降低。不同细胞株用1MOI的口蹄疫病毒感染8h后收集样品,用Western blot检测VP1的蛋白水平,β-Actin作为内参对照。
图4c显示了口蹄疫病毒感染后病毒滴度在miR-1307过表达细胞株中明显降低。5MOI的口蹄疫病毒感染不同细胞株12h后收集样品,用TCID50法测定病毒滴度。
图5显示了过表达miR-1307特异性地降低VP1和VP3的蛋白表达水平。表达N端标记FLAG标签的不同口蹄疫病毒蛋白的质粒与对照质粒(NC)或miR-1307过表达质粒(pmiR-1307)共同转染BHK-21,细胞转染36h后收集样品,Western blot检测FLAG融合蛋白的表达水平,β-Actin作为内参对照。
图6显示了miR-1307降低VP1和VP3的RNA稳定性。
图6a显示了转染miR-1307模拟物显著降低FLAG-VP1和FLAG-VP3的蛋白表达水平。BHK-21细胞共转染表达质粒和NC或mimics后36h收集样品用Western blot进行检测,β-Actin作为内参对照。
图6b显示了转染miR-1307模拟物显著降低FLAG-VP1和FLAG-VP3的RNA水平。细胞转染36h后收集样品,RT-qPCR检测VP1或VP3的相对表达量,β-Actin作为内参对照。
图6c和6d显示了miR-1307在RNA水平调控VP1和VP3的编码序列。pLUC-VP1或pLUC-VP3质粒与不同量的miR-1307模拟物(10,15,20pmol)共同转染BHK-21细胞后36h收集样品,利用Promega双荧光素酶检测试剂盒检测双荧光素酶活性。
图7显示了注射miR-1307激动剂(agomir)能够延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。3日龄乳鼠(Balb/c)颈部皮下注射0.6OD(100μl)的miR-1307 agomir或对照(NC),1h后用相同方法在邻近部位注射口蹄疫病毒稀释液(100LD50,100μl),攻毒12h后用相同方法重复注射NC或agomir 1次。每隔2小时统计乳鼠死亡率。n=10。该实验重复3次得到类似结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而,本领域的普通技术人员可以理解,在本发明各实施例中,为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是,即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改,也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明的发明人经过深入研究发现,口蹄疫病毒感染的猪肾细胞中miR-1307表达会显著上调,从而证实了猪肾细胞中miR-1307是口蹄疫病毒感染的应答基因。在此基础上,本发明的发明人经过深入的研究发现:miR-1307可有效抑制口蹄疫病毒的增殖,从而发现了其抗口蹄疫病毒的作用。由此,发现了miR-1307在抗口蹄疫病毒中的新用途。
本发明实施例所用的口蹄疫病毒为近些年我国流行毒株FMDV/O/BY/2010,常用细胞系为猪肾细胞系PK-15和幼仓鼠肾传代细胞BHK-21,PK-15(猪肾细胞系)和BHK-21(幼仓鼠肾传代细胞)都是口蹄疫病毒能够感染的细胞系,在实验室中经常用于口蹄疫病毒相关研究。虽然本发明实施例使用的是猪源和鼠源细胞,但是本发明并不以此为限,还可以适用于其他动物,比如牛、羊等,本发明在此不一一举例。PK-15(猪源)是口蹄疫病毒天然宿主细胞系,BHK-21是口蹄疫疫苗生产所用细胞系。在评价抗病毒表型时多用PK-15细胞系,但其生长速率较慢、转染效率较低,因此在研究生化分子机制时,也常用生长速率更快、转染效率更高的BHK-21。细胞培养在5%CO2培养箱中,温度为37℃,DMEM培养基中添加有10%胎牛血清和1%抗生素(penicilin-streptomycin)。
实施例1:鉴定受口蹄疫病毒感染差异调控的miRNAs
大致鉴定流程为:首先收集PK-15细胞对照样品和口蹄疫病毒感染后2h的样品,通过Affymetrix miRNA芯片鉴定差异表达的miRNAs。芯片杂交及数据分析委托北京博奥晶典生物技术有限公司完成。对鉴定到的差异表达miRNAs,用RT-qPCR法对其表达量进行验证,最终鉴定到miR-1307,其表达量受到口蹄疫病毒感染的明显诱导。其中,miR-1307是指包含SEQ ID NO:1所示序列或同源序列的miRNA,其中,SEQ ID NO:1:ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG。本领域中已知各种来源的miR-1307,例如猪、牛、羊等等,这些同源序列都包括在本发明的miR-1307。本发明的miR-1307还包括上述天然存在miR-1307序列中经过生物化学修饰,仍具有抗口蹄疫病毒的衍生miR-1307。
具体鉴定流程为:
病毒感染实验(接毒):
PK-15细胞在60mm的细胞培养皿中培养到大约80%的汇合度时,吸掉培养基,加入2mL PBS洗两次细胞后吸干净PBS,加入1mL DMEM(对照)或稀释至MOI=1的FMDV,在培养箱中孵育1h,吸掉病毒液,加入2mL PBS洗两次细胞后吸干净PBS,加入3mL DMEM培养基。分别在1h、2h和6h吸掉培养基,收集细胞样品。
miRNAs的提取及定量:
接毒实验得到的细胞样品用于提取miRNAs,详细操作步骤严格按照试剂盒操作手册(mirVanaTM miRNA Isolation Kit,Invitrogen,)。提取到的miRNAs用Thermo nanodrop2000测定浓度之后每个样品大约取500ng用Qiagen公司试剂盒(miScript II RT kit)进行反转录,并进一步利用Qiagen公司的定量试剂盒(miScript SYBR Green PCR kit)进行RT-qPCR分析(stratagene Mx3005P,Agilent)。用于检测miR-1307的特异引物为SEQ ID NO:2:ACTCGGCGTGGCGTCGGTCG,内参miR-16的特异引物为SEQ ID NO:3:TAGCAGCACGTAAATATTGGCG。
实验结果:口蹄疫病毒感染显著诱导miR-1307的表达
为了鉴定受口蹄疫病毒感染差异调控的miRNAs,前期用口蹄疫病毒(FMDV/O/BY/2010)感染PK-15细胞后收集样品做了miRNAs的微阵列芯片(图1)。以此为基础,我们用RT-qPCR方法对差异表达的miRNAs进行了验证,并成功鉴定到了miR-1307。如图2所示,口蹄疫病毒感染PK-15细胞后1h miR-1307的表达量升高了10多倍;2h时达到最大值,是对照的将近20倍。而在IBRS-2细胞中,病毒感染后1h时miR-1307的表达量即达到最大值,随后诱导倍数逐渐降低。miR-1307能够在口蹄疫病毒感染后受到快速且非常明显的诱导,说明它可能在口蹄疫病毒感染过程中发挥着非常重要的调控作用。
本发明实施例证明了miR-1307在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的作用,具体地,该组合物可以为药物组合物或疫苗组合物。为了进一步研究miR-1307模拟物、miR-1307表达载体与口蹄疫病毒复制的关系,接下来的实施例将对miR-1307模拟物、miR-1307表达载体与口蹄疫病毒复制的关系进行研究。
实施例2:研究miR-1307模拟物对口蹄疫病毒复制的影响
为了测试miR-1307是否会影响口蹄疫病毒的复制,我们委托上海吉玛制药技术有限公司合成了miR-1307的模拟物(mimics)和对照模拟物(NC),mimics的序列为SEQ ID NO:4:ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG,NC的序列为SEQ ID NO:5:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。PK-15细胞转染NC或mimics后36h接毒(具体步骤同上),病毒感染后不同时间点收集样品用RT-qPCR检测病毒RNA的相对表达量。
Mimics转染以及病毒感染的详细操作步骤如下:
细胞准备:PK-15细胞在六孔板中培养到大约80%的汇合度时,吸掉培养基,加入2mL PBS洗两次细胞后吸干净PBS,加入500uL Optit-MEM,置于细胞培养箱中备用。
体系配制:无RNA酶的1.5mL的离心管中加200uL Optit-MEM,加入2uL lip2000,室温静置5分钟,再加入大约60pM(0.8ug)的NC或mimics,混匀并低速离心,室温静置20-30min后将此转染体系加入上述已经准备好的细胞中。在培养箱中孵育4-6h后将培养基换为细胞生长所需正常培养基,培养36h后接毒。
接毒:接毒方法及步骤与上述相同,病毒MOI为0.1,分别在感染后4h、8h和12h时将细胞连同培养基一起冻存于-70℃冰箱。
RNA提取与反转录:冻存的细胞经反复冻融3次裂解之后吸取350uL用于提取RNA。RNA提取的详细操作步骤严格按照试剂盒的操作手册(RNeasy Mini Kit,Qiagen)。提取的RNA测定浓度之后取相同体积RNA进行反转录反应,最大反转录量为500ng。RNA反转录的详细操作步骤严格按照试剂盒(SuperScript®;III First-Strand Synthesis System,Invitrogen)的使用说明。反转录体系总体积为20uL,反转录完成之后加入80uL的ddH2O稀释后备用。
基于TaqMan探针的RT-qPCR法检测病毒RNA的相对表达量:RT-qPCR使用Invitrogen公司的10×master mix。取1.5uL稀释后的cDNA作为反应模板,配制成20uL的定量体系,通过定量3D基因片段(
引物序列SEQ ID NO:6:ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA;
SEQ ID NO:7:GCGAGCCCTGCCACGGA;
探针序列为:SEQ ID NO:8:TCCTTTGCACGCCGTGGGAC)来检测不同样品中病毒的复制情况。
实验结果:转染miR-1307的模拟物显著抑制口蹄疫病毒的复制
为了测试miR-1307是否会影响口蹄疫病毒的复制,我们合成了miR-1307的模拟物(mimics),转染PK-15细胞36h后接毒。病毒感染后不同时间对病毒RNA进行定量,如图3所示,转染了mimics的样品中病毒RNA的量显著低于对照样品,而且随着感染时间的延长,差异变得更明显。病毒感染后12h时,抑制率达到50%左右。这说明miR-1307能够抑制口蹄疫病毒的复制。
实施例3:过表达miR-1307对口蹄疫病毒复制的影响
首先以PK-15为基础构建miR-1307过表达的细胞株,然后用口蹄疫病毒感染对照细胞株(NC)和miR-1307过表达细胞株,最后从病毒RNA的相对表达量、VP1的蛋白表达水平和病毒滴度等多个方面评价miR-1307过表达对口蹄疫病毒复制的影响。
miR-1307过表达细胞株的构建:
为了进一步证实miR-1307对口蹄疫病毒复制的抑制作用,我们委托上海吉玛制药技术有限公司构建了miR-1307过表达的质粒(pmiR-1307,靶序列为SEQ ID NO:9:ACTCGGCGTGGCGTCGGTCGTG)和阴性对照质粒(NC,靶序列为SEQ ID NO:10:AAATGTACTGCGCGTGGAGAC)。构建的过表达载体转染PK-15细胞,利用杀稻瘟菌素(Blasticidin,Invitrigen)筛选抗性细胞,并用克隆环法挑取单克隆细胞进行培养。提取细胞miRNAs并用RT-qPCR法对miR-1307的表达量进行鉴定(miRNAs提取、反转录和定量的具体操作同上)。选择miR-1307过表达的两个独立的细胞克隆进行扩大培养后接毒,检测miR-1307过表达对口蹄疫病毒复制的影响。病毒感染及病毒RNA相对表达量的RT-qPCR检测同上。
Western blot检测VP1的蛋白表达水平:
蛋白样品制备:PK-15细胞的病毒感染操作同上,分别在接毒后4h、8h和12h吸掉培养基,收集细胞样品。加入170μl细胞裂解液(Pierce),待细胞充分裂解之后离心除去细胞碎片收集上清液,用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)定量总蛋白。剩余部分加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀,煮沸5分钟,室温静置冷却。利用定量结果确定上样体积,上样量一般为20-40μg。
电泳:蛋白样品冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,我们使用了预染蛋白质分子量标准(Bio-Rad)。浓缩胶电泳时使用80V恒压,大约30min之后溴酚蓝进入分离胶时使用120V恒压电泳。根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
转膜:选用PVDF膜,用Bio-Rad标准湿式转膜装置,冰浴中90V恒压转膜120min。
封闭:用TBST配制的5%脱脂奶粉覆盖蛋白膜,在室温摇床上封闭60min。
一抗孵育:我们在Western blot实验中选用β-Actin作为内参。用5%脱脂奶粉将β-Actin抗体1:6000倍稀释(Santa Cruz),将VP1的抗体1:1000倍稀释(由本所郑海学实验室提供)。用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,4℃缓慢摇动孵育过夜。吸掉一抗稀释液,再加入洗涤液(TBST)洗涤10分钟,共洗涤3次。
二抗孵育:辣根过氧化物酶(HRP)标记的对应二抗(Goat-Anti-mouse或Goat-Anti-Rabbit,Biorad)用5%脱脂奶粉1:4000倍稀释。用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温缓慢摇动孵育1h。吸掉二抗,加入洗涤液洗涤10分钟,共洗涤3次。
蛋白检测:用Thermo公司的显色试剂盒(PierceTM ECL Western BlottingSubstrate)进行检测,洗片时使用X光片自动洗片机。
病毒滴度的测定:
BHK-21细胞在96孔微量培养板中生长到汇合度大约为70%时备用。首先在1.5mL离心管中将待检测病毒液分别作连续10倍的梯度稀释,细胞用100μl PBS洗两遍之后,将稀释好的病毒液接种到96孔板中,每一稀释度接种一排共8孔,每孔接种100μl。在培养箱中孵育1h,吸掉病毒液,用100μl PBS洗两次细胞后吸干净PBS,加入含有1%FBS的维持培养基,培养箱中继续培养。逐日观察并记录细胞病变结果,连续观察5-7天后根据Reed-Muench两氏法计算TCID50值。
实验结果:过表达miR-1307明显抑制口蹄疫病毒的复制
考虑到转染效率可能会影响到miR-1307模拟物对口蹄疫病毒复制的抑制效果,为了更加客观地评价miR-1307对口蹄疫病毒复制的影响,我们构建了miR-1307过表达质粒,转染PK-15细胞后通过抗生素筛选结合梯度稀释,用克隆环法鉴定到了两个稳定过表达miR-1307的细胞株(miR-1307-11,miR-1307-12)。如图4所示,RT-qPCR的结果表明口蹄疫病毒感染后病毒RNA在miR-1307过表达的2个细胞株中明显降低,而且2个独立的细胞株得到了非常类似的结果(图4a)。Western blot的结果也表明相同条件下病毒结构蛋白VP1的表达量也同样明显降低(图4b)。病毒滴度测定的结果也表明口蹄疫病毒感染后miR-1307过表达细胞株中相比对照细胞株中病毒滴度明显降低(图4c)。这些结果充分说明miR-1307能够有效地抑制口蹄疫病毒的复制。
实施例4:miR-1307作用机制的研究
为了测试miR-1307对病毒自身蛋白的可能影响,我们构建了FLAG标记的所有病毒蛋白的表达载体,将其与miR-1307过表达载体(pmiR-1307)或miR-1307模拟物(mimics)共转染BHK-21(本研究中抗病毒相关表型实验在PK-15细胞中进行,因其源于口蹄疫病毒天然宿主(猪),更接近真实情况;而分子机制相关实验在BHK-21细胞中进行,因其生长速率快、易培养、转染效率高、实验结果重复性更好)后,用Western blot检测对病毒蛋白表达的影响,用RT-qPCR检测对VP1和VP3RNA水平的影响,用双荧光素酶报告系统(Promega)证实miR-1307对VP1和VP3RNA水平的调控。
FLAG标记病毒蛋白表达载体的构建与Western blot检测病毒蛋白表达:我们根据NCBI中FMDV/O/BY/2010的序列设计了可以扩增各个病毒蛋白的引物,扩增目的片段并将其构建到pcDNA3.1载体中,从而得到表达FLAG标签融合各个病毒蛋白的质粒(FLGA-VPs)。当BHK-21细胞在60mm的细胞培养皿中生长到大约40%汇合度时,将不同的FLGA-VPs质粒分别与NC或mimics共转染。质粒转染量为2μg,NC或mimics的转染量为240pM(3.2μg),转染方法同上。转染后36h吸掉细胞培养基,收集细胞样品利用Western blot检测miR-1307对病毒蛋白表达的影响。Western blot操作方法同上,一抗用FLAG抗体(Sigma)。
RT-qPCR检测VP1和VP3的RNA相对表达量:BHK-21细胞在60mm的细胞培养皿中生长到大约40%汇合度时进行转染,质粒转染量为2μg,NC或mimics的转染量为240pM(3.2μg),转染方法同上。转染后36h吸掉细胞培养基,收集细胞并利用Trizol法提取总RNA,利用Takara公司的反转录试剂盒进行反转录。以β-Actin作为内参基因,对VP1和VP3的相对表达水平进行定量。
具体地,检测VP1的引物序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示,其中,
SEQ ID NO:11:GACAACACCACCAACCCA;
SEQ ID NO:12:CCTTCTGAGCCAGCACTT
VP3的引物序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示,其中,
SEQ ID NO:13:CTGACGCTGCTGAGACCACAAATG;
SEQ ID NO:14:CAGCACTGGCCAGCACGACAA
内参β-Actin的引物序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示,其中,
SEQ ID NO:15:GCTGGCCGGGACCTGACAGACTACC;
SEQ ID NO:16:TCTCCAGGGAGGAAGAGGATGCGGC。
双荧光素酶报告实验:
首先我们利用购自武汉淼灵生物公司的pmir-GLO载体构建了VP1和VP3的双荧光素酶报告质粒。当BHK-21细胞在24孔细胞培养皿中生长到大约40%汇合度时进行转染,质粒转染量为0.5μg,NC或mimics的转染量为10-20pM,转染方法同上。转染后36h吸掉细胞培养基,利用promega公司的荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter AssaySystem)处理待检测的细胞样品,用酶标仪(VARIOSKAN LUX,Thermo)进行检测。
实验结果:
1、过表达miR-1307特异性地降低VP1和VP3的蛋白表达水平
宿主细胞miRNAs可以通过直接靶向病毒基因组或抑制宿主促病毒因子从而抑制病毒复制。为了测试miR-1307对口蹄疫病毒自身蛋白表达水平的可能影响,我们克隆了口蹄疫病毒所有结构蛋白和非结构蛋白的编码序列,并构建了其与FLAG标签融合表达质粒,将此质粒与miR-1307过表达质粒(pmiR-1307)或对照质粒(NC)共同转染BHK-21后用Western blot进行检测。如图5所示,转染pmiR-1307后FLAG-VP1和FLAG-VP3的蛋白表达水平受到了特异性地抑制,而且抑制作用非常明显,而FLAG标记的其它病毒蛋白的表达水平并未受到显著的影响。这说明miR-1307能够特异性地抑制VP1和VP3的蛋白表达。
2、miR-1307降低VP1和VP3的RNA稳定性
为了验证miR-1307对VP1和VP3蛋白表达的调控,我们将miR-1307模拟物(mimics)或对照模拟物(NC)和FLAG-VP1、FLAG-VP3质粒共同转染BHK-21,Western blot结果表明转染mimics也能够非常明显地降低VP1和VP3的蛋白表达水平(图6a)。为了进一步分析miR-1307的这种调控作用是通过降低RNA稳定性、阻止蛋白翻译,还是降低了蛋白稳定性,我们用相同实验条件转染细胞后用RT-qPCR检测VP1或VP3RNA水平的变化。如图6b所示,共转染mimics后FLAG-VP1或FLAG-VP3在RNA水平就发生了非常明显的降低,这说明miR-1307降低了VP1或VP3编码序列的RNA稳定性。pmirGLO质粒(Promega)常被用来分析miRNAs对靶位点的调控,其多克隆位点位于报告基因Firefly luciferase终止密码子之后,将miRNA的靶位点序列或靶基因的3′UTR序列克隆进该载体后,就可以利用双荧光素酶报告实验分析miRNAs对靶位点的调控作用。如图6c和6d所示,将克隆有VP1或VP3编码序列的该质粒(pLUC-VP1,pLUC-VP3)和不同量的mimics共转染BHK-21后能够明显降低荧光素酶的相对活性,而且表现出明显的剂量效应,这也说明miR-1307对VP1和VP3的调控是发生在RNA水平上,很有可能miR-1307能够直接靶向VP1和VP3的编码序列。
实施例5:miR-1307对实验动物的保护效果
为了评价miR-1307对实验动物的保护效果,我们委托上海吉玛制药技术有限公司合成了miR-1307的激动剂(agomir)和对照样品(NC),agomir的序列为SEQ ID NO:17:ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG,NC的序列为SEQ ID NO:18:GGCGGUCGCGUGCGCUGUCUGA,该序列均在反义链进行了如下修饰:3′端进行胆固醇修饰、5′端两个硫代骨架修饰、3′端四个硫代骨架修饰、全链甲氧基修饰,可以增强其在实验动物体内的稳定性。我们从中国农业科学院兰州兽医研究所SPF实验动物中心购买了20只3日龄乳鼠(Balb/c)和对应母鼠,乳鼠分为对照组和实验组,10只/组。对照组和实验组乳鼠分别在颈部皮下注射0.6OD(100μl)的NC或agomir,1h后再用相同方法在邻近部位注射口蹄疫病毒稀释液(100LD50,100μl),攻毒12h后用相同方法重复注射NC或agomir 1次。处理后的乳鼠被母鼠正常饲喂,每隔2小时统计乳鼠死亡率。
实验结果:miR-1307能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应
口蹄疫病毒感染乳鼠后会造成致死现象,因此乳鼠常被用来作为研究口蹄疫的实验动物模型(Habiela,M.等,Laboratory animal models to study foot-and-mouthdisease:a review with emphasis on natural and vaccine-induced immunity.J GenVirol.2014,95:2329-2345)。miR-1307在细胞水平对口蹄疫病毒表现出非常明显的抑制效果,因此我们想进一步测试其在实验动物中的作用效果。3日龄乳鼠(Balb/c)颈部皮下注射miR-1307agomir或对照(NC)后1h攻毒,由于预实验表明agomir注射到乳鼠体内后7h即明显降解,所以我们在攻毒后12h重复注射NC或agomir 1次,每2h统计乳鼠死亡率。如图7所示,对照组乳鼠在攻毒后28h开始死亡,而实验组乳鼠在攻毒后38h才开始死亡;对照组乳鼠在36hpi时全部死亡,而此时实验组乳鼠仍全部存活;实验组乳鼠全部死亡时间为48hpi,与对照组乳鼠相比延迟了12h。由此可以看出,miR-1307能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应,说明其有被用于口蹄疫防控的潜能。
本发明实施例证明了miR-1307在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的作用,同时还通过研究发现miR-1307的前体、miR-1307模拟物以及miR-1307表达载体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物的作用,其中,该组合物可以为药物组合物或疫苗组合物。需要说明的是,本领域技术人员知晓获得miR-1307的前体、miR-1307模拟物以及miR-1307表达载体的方法和手段,本实施例在此不赘述。
与现有技术相比,本发明实施例具有以下有益效果:
1.转染miR-1307的模拟物(mimics)、构建miR-1307过表达细胞株或注射miR-1307的激动剂(agomir)都能够在宿主细胞或实验动物中明显抑制口蹄疫病毒的复制,从而提供了一种新的预防和/或治疗口蹄疫的思路,具有很好的临床应用前景;
2.miR-1307是能够显著抑制口蹄疫病毒复制的猪源miRNA。与以往人工设计靶向病毒基因组的人工miRNA相比,这种内源宿主miRNA更天然;
3.miR-1307能够特异性地降低口蹄疫病毒VP1和VP3编码序列的RNA稳定性,这是目前报道的首个能够调控口蹄疫病毒自身蛋白表达的猪源miRNA。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施例是实现本发明的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> miR-1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用
<130> 180418
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acucggcgug gcgucggucg ug 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcggcgtg gcgtcggtcg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcagcacg taaatattgg cg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acucggcgug gcgucggucg ug 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgggtttt acaaacctgt ga 22
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgagccctg ccacgga 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcctttgcac gccgtgggac 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actcggcgtg gcgtcggtcg tg 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaatgtactg cgcgtggaga c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacaacacca ccaaccca 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttctgagc cagcactt 18
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgacgctgc tgagaccaca aatg 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagcactggc cagcacgaca a 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctggccggg acctgacaga ctacc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctccaggga ggaagaggat gcggc 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acucggcgug gcgucggucg ug 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcggucgcg ugcgcugucu ga 22
Claims (7)
1.miR-1307或其前体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-1307的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-1307的前体在对象体内经加工转化为miR-1307。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-1307或其前体来自于猪、牛、羊中的任一动物。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述组合物为药物组合物或疫苗组合物。
6.miR-1307的模拟物在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
7.miR-1307的表达载体在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的组合物中的应用。
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