CN111808858A - 一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了两个siRNA序列及其靶标基因序列，通过siRNA对Vero‑E6培养细胞内si‑LNC_002015基因的两个靶点进行干扰，使得Vero‑E6培养细胞内PEDV RNA拷贝数和蛋白表达量与对照相比明显升高，毒价提升。

Description

一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是α冠状病毒属中一种可感染猪各年龄段的病毒，能引起猪产生急性、高传染性和破坏性肠道疾病，尤其是1-2周龄仔猪的发病率高达100％，死亡率可高达80％–100％，给包括我国在内的全球养猪业造成严重经济损失，推高肉价，影响人们的生活水平。而有效的PEDV疫苗的使用对于阻断该病毒的传播具有重要意义，Vero细胞系是规模化生产PEDV商业疫苗的理想细胞系，PEDV在Vero细胞复制的滴度高低将直接关系到疫苗生产的成本高低，因此提高Vero细胞中PEDV的增殖滴度对于节省成本、提升经济效益具有重要价值。
病毒复制需要宿主提供大量的物质和能量以完成病毒的生命周期，而宿主LncRNA可以影响病毒复制。研究表明，宿主LncRNA可以参与能量代谢反应途径影响病毒在细胞内复制，又可以作为先天性免疫负调节因子或正调节因子，调节天然免疫途径的抗病毒反应，因此，LncRNA在病毒增殖的调控过程中发挥着十分重要的作用。
但由于LncRNA结构复杂，下游信号通路繁琐，对LncRNA的调节会产生一系列复杂的连锁反应，使得现有技术还未能实现，通过调节Vero细胞的LncRNA来提高PEDV在Vero细胞中的毒价，此构想在本领域还属于空白。
因此，如何找到一种与PEVD毒价有关LncRNA，并提供一种通过调节LncRNA表达量来提高PEDV的毒价是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种siRNA序列及其靶标通过干扰宿主细胞的LncRNA来提高PEDV毒价的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种LNC_002015基因在提高PEDV毒价中的应用，所述LNC_002015序列如SEQ IDNO5所示；
LNC_002015基因的siRNA序列，其特征在于，包括：
si-LNC_002015_1U：GCAGUUUACAUUAUGGCUA；SEQ ID NO1；
si-LNC_002015_1D：UAGCCAUAAUGUAAACUGC；SEQ ID NO2；
或
si-LNC_002015_3U：CCUGGUAAGAGGCUAGCUU；SEQ ID NO3；
si-LNC_002015_3D：AAGCUAGCCUCUUACCAGG；SEQ ID NO4；
使用时si-LNC_002015_1U、si-LNC_002015_1D、si-LNC_002015_3U和si-LNC_002015_3D序列的3’端添加dTdT修饰；
所述dT为胸腺嘧啶；
小干扰RNA(siRNA)有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类长度为20-25个碱基对的具有5′-磷酸、3′-羟基和1～2个核苷酸的3′-粘性末端的双链RNA分子小片段，它可以与对应的靶RNA特异结合，从而对特定基因功能的发挥产生具专一性的削弱效应，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。
在设计siRNA序列时需要考虑：siRNA序列的特异性、siRNA序列在靶基因中的位置、siRNA序列的起始碱基与长度、siRNA3′端的突出碱基、siRNA序列中G/C含量、siRNA中单一碱基和反向重复序列、siRNA双链的内在稳定性、siRNA正义链的碱基偏爱性、mRNA的二、三级结构；mRNA的丰度、半衰期等问题。
长链非编码RNA(LncRNA)是由细胞基因组DNA转录生成、与mRNA结构相似的、没有潜在的编码蛋白质的能力、并且长度大于200bp的转录本RNA。与编码蛋白质的RNA相比，LncRNA表达的丰度远不及mRNA，且易受外界环境刺激发生较大变化。LncRNA具有较强的组织和细胞特异性，在同一物种不同组织或细胞的表达量有差异，甚至同一组织不同部位的LncRNA都有不同的作用方式。LncRNA在细胞质和细胞核均可分布，甚至在细胞器中也有发现，它在细胞核中主要发挥调节基因表达的作用，而在细胞质中则发挥信号转导或吸收microRNA作用，在细胞生长发育、细胞分化及死亡、肿瘤的发生发展、抗病毒感染等生命活动中发挥巨大的作用。
一种增加Vero-E6培养细胞内PEDV毒价的方法，包括：
1)利用si-LNC_002015_1U/si-LNC_002015_1D或si-LNC_002015_3U/si-LNC_002015_3D序列构建siRNA干扰载体；
2)待培养细胞生长至70-90％汇合度时进行siRNA转染；
优选的，汇合度为70-80％；
3)转染12h后接种病毒；
步骤2)中所述接种细胞为Vero-E6培养细胞；
骤3)中所述病毒为PEDV；
所述PEDV为CV777株。
综上所述，本发明涉及的LNC_002015则是一种长链非编码RNA，本发明根据LNC_002015序列筛选到两个siRNA序列，可通过干扰LNC_002015基因的不同靶点来提高Vero-E6培养细胞中PEDV的毒价，此方法操作简单、节省成本，并且为通过调节LncRNA来提高PEDV的培养毒价的途径提供了一个范例。
附图说明
图1.LNC_002015、LNC_002016和LNC_002965在PEDV感染Vero-E6细胞不同时间段的表达情况(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图2.PEDV和PEDV+UV感染Vero-E6细胞在36h或者48h时三个LncRNAs的表达情况(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图3.A.在荧光显微镜绿色背景下观察转染绿色荧光蛋白质粒的Vero-E6细胞；B.在荧光显微镜绿色背景下观察未转染的Vero-E6细胞；C.在荧光显微镜白光下观察未转染的Vero-E6细胞
图4.qPCR检测si-LNC_002015_1、si-LNC_002015_2、si-LNC_002015_3和NC分别转染Vero-E6细胞后LNC_002015相对表达情况(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图5.A：转染NC、si-LNC_002015_1、si-LNC_002015_3后Vero-E6细胞内PEDV RNA拷贝数变化(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；B:转染NC、si-LNC_002015_1、si-LNC_002015_3后Vero-E6细胞内PEDV N蛋白表达水平变化；
图6.qPCR检测si-LNC_002016_1、si-LNC_002016_2、si-LNC_002016_3和NC分别转染Vero-E6细胞后LNC_002016相对表达情况(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图7.转染NC、si-LNC_002016_1、si-LNC_002016_2后Vero-E6细胞内PEDV RNA拷贝数变化(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；B:转染NC、si-LNC_002016_1、si-LNC_002016_2后Vero-E6细胞内PEDV N蛋白表达水平变化；
图8.qPCR检测si-LNC_002965_1、si-LNC_002965_2、si-LNC_002965_3和NC分别转染Vero-E6细胞后LNC_002016相对表达情况(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；
图9.转染NC、si-LNC_002965_1、si-LNC_002965_2后Vero-E6细胞内PEDV RNA拷贝数变化(*表示P<0.05，**表示P<0.01)；B:转染NC、si-LNC_002965_1、si-LNC_002965_2后Vero-E6细胞内PEDV N蛋白表达水平变化。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验方法：
RNA提取步骤：
a，将细胞六孔板用PBS清洗后，弃去上清液，加入500μL TRIzol试剂(sigma)于每孔裂解细胞，混合均匀后将其置于1.5mL RNase-free的EP管，4℃静置5min；
b，加入200μL的三氯甲烷，用力摇晃，室温静置2-3min后，以12000rpm在4℃离心机离心15min；
c，取离心后的上清液750μL于新的1.5mL RNase-free的EP管，再加入750μL的异丙醇，轻轻混匀，4℃静置10min后，以10000rpm在4℃离心机离心10min；
d，弃去离心后上清液，加入800μL的75％的乙醇溶液，以8000rpm在4℃离心机离心5min；
e，轻轻弃去离心后上清液，放置于4℃离心机以8000rpm离心5min，用RNase-free的枪头吸掉液体，室温静置2min后加入50μL RNase-free的ddH2O
RNA的反转录步骤：
将2μL的4xDNA Master Mix(含gDNA Remover)和400ng RNA样品，加Nuclease-free Water，补齐8μL，反应液轻轻地搅拌均匀后，在37℃条件下温育5min；
b，在冰上将(1)中的反应液加入2μL的5xRT Maste rMix II配置为10μL反应液，轻轻地搅拌均匀后，依次按照下面温度进行反应，首先在37℃反应15min，然后在50℃反应5min，其次在98℃反应5min，最后收集保存在-20℃待用(参考ReverTra Ace qPCR RTMaster Mix with gDNA Remover)。
PCR反应体系
50μL反应体系：25μL PrimeSTAR Max Premix(2×)，1.5μL上游引物(50μM)，1.5μL下游引物(50μM)，4μL cDNA和18μL RNase-free ddH2O补齐(参照Takara P
Figure BDA0002579382900000051
MaxDNA Polymerase)；仪器：Bio-Rad PCR扩增仪器，每个PCR反应设置三个重复，并设置阴性对照；反应条件：98℃10s，55℃10s，72℃40个循环。
qPCR反应体系：
20μL反应体系：3.6μLRNase-free的ddH2O，10μL
Figure BDA0002579382900000052
Green Realtime PCRMaster Mix-Plus，2μLPlus Solution，1.2μL上游引物(10μM)，1.2μL下游引物(10μM)，2μL样品溶液cDNA，总计为20μL(参照
Figure BDA0002579382900000053
Green Realtime PCR Master Mix-Plus)；仪器：Bio-Rad CFX Manager荧光定量PCR仪器，每个PCR反应设置三个重复，并设置阴性对照；反应条件：首先在95℃反应30s，然后以95℃ 5s，55℃ 10s，72℃ 15s的40个PCR循环，最后加上熔解曲线。
qRT-PCR反应体系：
25μL反应体系：12.5μL的2×One Step RT-PCR BufferⅢPrimeScript、0.5μL的PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、0.5μL的TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、1μL上游引物(10μM)、1μL下游引物(10μM)、0.5μL探针(10μM)、1μL病毒RNA/DNA，RNase-free ddH2O补齐，总体积为25μL；仪器：Bio-Rad CFX Manager荧光定量PCR仪器，每个PCR反应设置三个重复，并设置阴性对照；反应条件：42℃5min，95℃10min，然后进行95℃5s，60℃31s的40个循环。
PEDV的蛋白免疫印迹实验(Western Blot)：
用细胞刮将细胞板6孔板的细胞刮下，置于1.5mL的EP管中，加入50μL的蛋白裂解液，用Pierce Rapid Gold BCA快速蛋白定量试剂盒说明进行细胞蛋白浓度测定，然后将所有样品的细胞蛋白统一定量。定量的细胞蛋白按1：5的比例加入5×蛋白上样缓冲液。将蛋白样品煮沸10min后，经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶电泳后，在200mA恒流、2h湿转电转仪上将蛋白胶转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上。用TBST溶液(含0.05％Tween20)稀释的5％脱脂奶粉封闭膜2h，用含有2％脱脂奶粉的TBST溶液稀释的鼠抗PEDV N蛋白的单克隆抗体(美国Medgene公司)(1∶2000)在室温下孵育NC膜2h。用T BST溶液将NC膜洗涤3次，每次10min。用含2％脱脂奶粉的TBST溶液稀释的含辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(上海生工)(1:5000)在室温轻摇孵育NC膜1h。再用TBST溶液洗涤3次，每次10min。最后用ECL显色并在Bio-Rad全能型成像系统曝光。同样，用鼠抗β-actin单克隆抗体作一抗，用山羊抗小鼠IgG抗体为二抗(1:5000)，以上述同样的方法检测β-actin的表达作为对照。
实施例1：
1.不同感染时间段Vero-E6细胞的LNC_002015的表达
以MOI＝0.01的PEDV感染的Vero-E6细胞为模型，选择胞内病毒滴度最高的时间段细胞作为实验组，未感染的同时间段细胞作为空白对照，进行二代全转录组高通量测序，测序数据进行分析处理后，筛选出Vero-E6细胞显著上调表达LNC_002015，并检测不同时间段的表达情况(检测LNC_002015的引物如表1所示)。
表1.检测引物和探针
Figure BDA0002579382900000061
实验组为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞的对照组，分别在接种后12、24、36、48、60、72h，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL的EP管，混合均匀后，取出500μL于RNase-free的EP管中，进行RNA的提取、RNA反转录和qPCR实验验证，PCR实验扩增出LNC_002015的条带进行回收测序。(具体实验操作如上，检测LNC_002015引物见附表1)。
结果表明，与对照组相比(图1)PEDV感染Vero-E6细胞12h、24h、36h、48h、60h、72h后，LNC_002015的表达呈现上升趋势。PCR的扩增产物的测序结果显示LNC_002015序列与测序结果的序列相同，BLAST比对结果说明LNC_002015是Vero-E6细胞基因组转录而来。
2.细胞培养的PEDV病毒液各组分对LNC_002015表达的影响
检测细胞培养PEDV病毒液各组分对LncRNA表达的影响，实验组1为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，实验组2为接种紫外灭活CV777(PEDV+UV)的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞，分别感染36h和48h后，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL RNase-free的EP管，混合均匀后，取出500μL放置于RNase-free的EP管中，按RNA的提取、RNA反转录和qPCR进行实验验证。(具体实验操作如上，检测LNC_002015引物见附表1)。
结果表明，与空白对照组相比PEDV(CV777)感染后，Vero-E6细胞的LNC_002015在36h和48h均显著上调表达，而PEDV CV777+UV组的LNC_002015几乎无变化，这也说明细胞培养PEDV病毒液中病毒引起Vero-E6细胞中的LNC_002015上调表达，而其他组分对其表达没有影响(如图2)。
3.干扰LNC_002015功能的siRNA的设计
为了研究Vero-E6细胞上调表达LNC_002015对PEDV增殖的影响，使用SVM RNAi等软件对LNC_002015的siRNA靶点预测，最终预测三个siRNA靶点符合要求，并进行序列设计和合成(表2)。
表2.靶向LNC_002015的siRNA序列
Figure BDA0002579382900000071
4.Vero-E6细胞转染效率测定
为确定脂质体转染Vero-E6细胞效率，待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，按照
Figure BDA0002579382900000072
3000的说明书，将2.5μg绿色荧光蛋白质粒(Greenfluorescent protein，GFP)在7.5μL
Figure BDA0002579382900000073
3000和10μL P3000TM作用下转染Vero-E6细胞，转染12h后，用荧光显微镜观察转染与未转染细胞的变化。
结果表明，转染组与未转染对照组相比，转染组的细胞在荧光显微镜下大面积呈现绿色，比例超过75％，这也说明Vero-E6细胞是可以被
Figure BDA0002579382900000074
3000转染的且转染效率较高，可用于后续试验(图3)。
5.LNC_002015的siRNA筛选
待细胞六孔板每孔中的Vero-E6细胞长至70-80％时，用3.75μL
Figure BDA0002579382900000075
3000将siRNA及NC转染于Vero-E6细胞中(参照
Figure BDA0002579382900000076
3000)，转染12h后，接种MOI＝0.01的CV777，30h后，收集细胞沉淀并用提取细胞RNA并反转录，然后以cDNA为模板，并进行qPCR检测Vero-E6细胞LNC_002015的表达，筛选出感染效果高的siRNA用于后续实验研究。
结果表明，与NC组相比较，QPCR实验分别检测si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3转染Vero-E6细胞后，LNC_002015的表达能均有下降，结果也表明干扰效率在75％以上，可以用于后续实验(图4)。而si-LNC_002015_2干扰效率不明显，不能用于后续实验(图4)。
6.Vero-E6细胞的LNC_002015对PEDV在Vero-E6细胞上增殖的影响
待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，使用Lipofectamine3000Transfection Rea gent分别将si-LNC_002015_1、si-LNC_002015_3及NC转染于Vero-E6细胞中，转染12h后感染PEDV(MOI＝0.01)，感染30h后收集细胞沉淀，提取RNA作为模板，进行靶向N基因的探针法qRT-PCR(检测PEDV探针引物见表1)和Western Blot实验，分析PEDV病毒拷贝数和蛋白水平的变化。为了检测转染si-LNC_002015_1、si-LNC_002015_3后细胞内PEDV的病毒滴度变化。将si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3转染Vero-E6细胞12h，再接种MOI＝0.01的PEDV36h时，分别收集细胞病毒液于EP管待用。用MEM培养基将转染si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3后的收集细胞病毒液倍比稀释8个梯度后，分别添加到预铺满Vero-E6细胞的96孔细胞板中，每个梯度做8个细胞孔重复，同时设立未接毒的空白对照组，放在37℃细胞培养箱中孵育，随后观察细胞96h，记录病变细胞孔数并用Karber法计算各组的TCID50。
结果表明，与NC组相比较，si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3转染Vero-E6的细胞组内PEDV N基因的拷贝数(copies)均有上升(图5A)；si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3转染Vero-E6细胞组内PEDV N蛋白的表达均增加(图5B)。PEDV CV777感染Vero-E6细胞的TCID50＝10-3.5/100μL，而将转染si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3的Vero-E6细胞的病毒液感染Vero-E6细胞的TCID50＝10-4.0/100μL，这进一步说明转染si-LNC_002015_1和si-LNC_002015_3后细胞内病毒滴度上升3倍(TCID50＝10-3.5/100μL上升到TCID50＝10-4.0/100μL)以上。
对比例1
1.不同感染时间段Vero-E6细胞的LNC_002016的表达
以MOI＝0.01的PEDV感染的Vero-E6细胞为模型，选择胞内病毒滴度最高的时间段细胞作为实验组，未感染的同时间段细胞作为空白对照，进行二代全转录组高通量测序，测序数据进行分析处理后，筛选出Vero-E6细胞显著上调表达LNC_002016，并检测不同时间段的表达情况。检测LNC_002016的引物如表1所示。
实验组为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞的对照组，分别在接种后12、24、36、48、60、72h，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL的EP管，混合均匀后，取出500μL于RNase-free的EP管中，进行RNA的提取、RNA反转录和qPCR实验验证胞内LNC_002016的表达情况，PCR实验扩增出LNC_002016的条带进行回收测序。(具体实验操作如上，检测LNC_002016引物见附表1)。
结果表明，与对照组相比，PEDV感染Vero-E6细胞12h、24h、36h、48h、60h、72h后，LNC_002016的表达呈现上升趋势(图1)，PCR的扩增产物的测序结果显示LncRNA序列与测序结果的序列相同，BALSAT比对结果说明
LNC_002016是Vero-E6细胞基因组转录而来。
2.细胞培养的PEDV病毒液各组分对LNC_002016表达的影响
检测细胞培养PEDV病毒液各组分对LncRNA表达的影响，实验组1为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，实验组2为接种紫外灭活CV777(PEDV+UV)的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞，分别感染36h和48h后，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL RNase-free的EP管，混合均匀后，取出500μL放置于RNase-free的EP管中，按RNA的提取、RNA反转录和QPCR进行实验验证(具体实验操作如上，检测LNC_002016引物见表1)。
结果表明，与空白对照组相比PEDV(CV777)感染后，Vero-E6细胞的LNC_002016在36h和48h均显著上调表达，而PEDV CV777+UV组的LNC_002016几乎无变化，这也说明细胞培养PEDV病毒液中病毒引起Vero-E6细胞中的LNC_002016上调表达，而其他组分对其表达没有影响(如图2)。
干扰LNC_002016功能的siRNA的设计
为了研究Vero-E6细胞上调表达LNC_002015对PEDV增殖的影响，使用多个软件对LNC_002015的siRNA靶点预测，最终预测三个siRNA靶点符合要求，并进行序列设计和合成(表3)。
表3.靶向LNC_002016的siRNA序列
Figure BDA0002579382900000091
Vero-E6细胞转染效率测定
为确定脂质体转染Vero-E6细胞效率，待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，按照
Figure BDA0002579382900000102
3000的说明书，将2.5μg绿色荧光蛋白质粒(Greenfluorescent protein，GFP)在7.5μL
Figure BDA0002579382900000101
3000和10μL P3000TM作用下转染Vero-E6细胞，转染12h后，用荧光显微镜观察转染与未转染细胞的变化。
结果表明，转染组与未转染对照组相比，转染组的细胞在荧光显微镜下大面积呈现绿色，比例超过75％，这也说明Vero-E6细胞是可以被
Figure BDA0002579382900000103
3000转染的且转染效率较高，可用于后续试验(图3)。
LNC_002016的siRNA筛选
待细胞六孔板每孔中的Vero-E6细胞长至70％～80％时，用3.75μL
Figure BDA0002579382900000105
3000将siRNA及NC转染于Vero-E6细胞中(参照
Figure BDA0002579382900000104
3000)，转染12h后，接种MOI＝0.01的CV777，30h后，收集细胞沉淀并用提取细胞RNA并反转录，然后以cDNA为模板，并进行qPCR检测Vero-E6细胞LNC_002016的表达，筛选出干染效果高的siRNA用于后续实验研究。
结果表明，与NC组相比较，qPCR实验分别检测si-LNC_002016_1和si-LNC_002016_2转染Vero-E6细胞后，LNC_002016的表达能均有下降，结果也表明干扰效率在75％以上，可以用于后续实验(图6)。而si-LNC_002016_3干扰效率不明显，不能用于后续实验。
Vero-E6细胞的LNC_002016对PEDV在Vero-E6细胞上增殖的影响
待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，使用Lipofectamine3000Transfection Rea gent分别将si-LNC_002016_1、si-LNC_002016_2及NC转染于Vero-E6细胞中，转染12h后感染PEDV(MOI＝0.01)，感染30h后收集细胞沉淀，提取RNA作为模板，进行靶向N基因的探针法qRT-PCR(检测PEDV探针引物见表1)和Western Blot实验，分析PEDV病毒拷贝数和蛋白水平的变化。
结果表明，Vero-E6细胞中LNC_002016被干扰后，PEDV在基因水平和蛋白水平并没有显著变化，因此LNC_002016与病毒增殖并不相关(图7)。
对比例2
1.不同感染时间段Vero-E6细胞的LNC_002965的表达
以MOI＝0.01的PEDV感染的Vero-E6细胞为模型，选择胞内病毒滴度最高的时间段细胞作为实验组，未感染的同时间段细胞作为空白对照，进行二代全转录组高通量测序，测序数据进行分析处理后，筛选出Vero-E6细胞显著上调表达LNC_002965，并检测不同时间段的表达情况(检测LNC_002965的引物如表1所示)。
实验组为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞的对照组，分别在接种后12、24、36、48、60、72h，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL的EP管，混合均匀后，取出500μL于RNase-free的EP管中，进行RNA的提取、RNA反转录和qPCR实验验证，PCR实验扩增出LNC_002965的条带进行回收测序。(具体实验操作如上，检测LNC_002965引物见表1)。
结果表明，LNC_002965在PEDV感染PEDV 36h前表达呈上升趋势，随后开始下降(如图1)。RT-PCR的扩增产物的测序结果显示LNC_002965序列与测序结果的序列相同，BLAST比对结果说明LNC_002965是Vero-E6细胞基因组转录而来。
2.细胞培养的PEDV病毒液各组分对LNC_002965表达的影响
检测细胞培养PEDV病毒液各组分对LncRNA表达的影响，实验组1为接种感染复数MOI＝0.01的CV777的Vero-E6细胞，实验组2为接种紫外灭活CV777(PEDV+UV)的Vero-E6细胞，空白对照组为未接种CV777的Vero-E6细胞，分别感染36h和48h后，弃去上清液，PBS清洗三遍，1mL TRIzol试剂裂解细胞后，收集于1.5mL RNase-free的EP管，混合均匀后，取出500μL放置于RNase-free的EP管中，按RNA的提取、RNA反转录和qPCR进行实验验证(具体实验操作如上，检测LNC_002965引物见表1)。
结果表明，与空白对照组相比PEDV(CV777)感染后，Vero-E6细胞的LNC_002965在36h和48h均显著上调表达，而PEDV CV777+UV组的LNC_002965几乎无变化，说明细胞培养PEDV病毒液中病毒引起Vero-E6细胞中的LNC_002965上调表达，而其他组分对其表达没有影响(如图2)。
3.干扰LNC_002965功能的siRNA的设计
为了研究Vero-E6细胞上调表达LNC_002965对PEDV增殖的影响，对LNC_002965三个靶点进行siRNA序列设计(表4)。
表4.靶向LNC_002965的siRNA序列
Figure BDA0002579382900000111
Vero-E6细胞转染效率测定
为确定脂质体转染Vero-E6细胞效率，待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，按照
Figure BDA0002579382900000122
3000的说明书，将2.5μg绿色荧光蛋白质粒(Greenfluorescent protein，GFP)在7.5μL
Figure BDA0002579382900000121
3000和10μL P3000TM作用下转染Vero-E6细胞，转染12h后，用荧光显微镜观察转染与未转染细胞的变化。
结果表明，转染组与未转染对照组相比，转染组的细胞在荧光显微镜下大面积呈现绿色，比例超过75％，这也说明Vero-E6细胞是可以被
Figure BDA0002579382900000123
3000转染的且转染效率较高，可用于后续试验(图3)。
LNC_002965的siRNA筛选
待细胞六孔板每孔中的Vero-E6细胞长至70％～80％时，用3.75μL
Figure BDA0002579382900000124
3000将siRNA及NC转染于Vero-E6细胞中(参照
Figure BDA0002579382900000125
3000)，转染12h后，接种MOI＝0.01的CV777，30h后，收集细胞沉淀并用提取细胞RNA并反转录，然后以cDNA为模板，并进行qPCR检测Vero-E6细胞LNC_002965的表达，筛选出干染效果高的siRNA用于后续实验研究。
结果表明，与NC组相比较，qPCR实验分别检测si-LNC_002016_1和si-LNC_002016_2转染Vero-E6细胞后，LNC_002016的表达能均有下降，结果也表明干扰效率在75％以上，可以用于后续实验(图8)。而si-LNC_002016_3干扰效率不明显，不能用于后续实验。
Vero-E6细胞的LNC_002965对PEDV在Vero-E6细胞上增殖的影响
待细胞六孔板每孔中的细胞长至70％～80％时，使用Lipofectamine3000Transfection Rea gent分别将si-LNC_002965_1、si-LNC_002965_2及NC转染于Vero-E6细胞中，转染12h后感染PEDV(MOI＝0.01)，感染30h后收集细胞沉淀，提取RNA作为模板，进行靶向N基因的探针法QRT-PCR(表1)和Western Blot实验，分析PEDV病毒拷贝数和蛋白水平的变化。
结果表明，与NC组相比较，Vero-E6细胞中LNC_002965被干扰后，
PEDV在基因水平和蛋白水平并没有显著变化(图9)，因此LNC_002965与病毒增殖并不相关。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaguuuaca uuauggcua 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uagccauaau guaaacugc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccugguaaga ggcuagcuu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcuagccu cuuaccagg 19
<210> 5
<211> 2556
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttatcata atctccagga aacatcttag aacctctgag aacttaaaga ccttaaggcc 60
cccagaccca tttcaacaga gggaaactct tgcctttctt aagaccaccc tctgaaggag 120
caattgatga aaacaaacag ggatggtggt ggttgggagg gggaagaaat gaaacaaaac 180
actcacgact taagatttgg ctcaatgata tatttgccag ttattttatt tttttctaaa 240
aacaatagaa aaaaaaatca actttaaaaa gcaaaatgta cttaaataaa aaaaaattag 300
agtttatagt acctgtaata ctaggtacta tatactagga ttgaaattcc gtgtggctgc 360
tataaacgtt ttattaaagt tatttacatt taatggcaat atttacagag aaaaattgtg 420
taaatcttaa aattttttaa aaacaattct taaatacaaa tctgttaaag aaaaaaaaaa 480
aaagatggta agcataaaaa agttctttta tgcccaaagt ccaatttgag gcagtttaca 540
ttatggctaa atctttcagt ctcaagactc agccaaggtt gtgaggttgc atttgatcat 600
gcatttgaaa caagttcata ggtgactgat tgggacagct ctgttagaag gaatcttttt 660
ccttactttt ccttatgcac aagagttccg tagctgttca agtttgtgtt tcaactgttc 720
tcgtcgtttc cgcaacaaat ccttttcaga aatgagcttt tgctcctctg cttggacgga 780
caggatgtat gctgtggctt ttttaaggat aactaccttg ggggcctttt cattgttttc 840
caactccggg atctggtcac gcagggcaaa aaagctccgt tttagctcgt tcctcctctg 900
gcgctccaag acgttgtgtg ttcgcctctt gacattctcc tcggtgtccg aggacctggg 960
gctggtgcat tttcggttgt tgctgatctg tctcaggact ctgacactgt ccaacttgac 1020
cctcttggca gcaggatagt ccttccgagt ggagggaggc gctgcgtagt tgtgctgatg 1080
tgtggagacg tggcacctct tgaggaccag tgggctgtga ggaggtttgc tgtggcctcc 1140
agcggaaggt gatcccgact ctgacctttt gccaggggcc tgcctctttt ccacagaaac 1200
aacatcgatt tcttcctcat cttcttgttc ctcctcagaa tcgctgctgg tggtgggcgg 1260
tgtctcctca tggagtacca ggggctctgg gctggcctgc ggggaggact ccgtcgagga 1320
gagcagagaa tccgaggacg gtgagaaggc gctggagtcc ggtgaggcgc aggacttggg 1380
cgagctgctg tcgttgagag ggtagggaaa gaccactgag gggtcgatgc actccgaggc 1440
ggcggcgctc agatcctgca ggtacaagct ggaggtggag cagacgctgt ggccgcgggc 1500
agggttcggg ctgccgctgt ctttgcgcgc agcctggtaa gaggctagct tctctgagac 1560
gagcttggcg gcggccgaga agccgctcca catacagtcc tggatgatga tatttttgat 1620
gaaggtctcg tcgtccgggt cgcagatgaa gctctggttc accatgtctc ctcccagcag 1680
ctcggtcacc atctccagct ggtcggccgt ggagaagctc ccgccaccgc cgtcgttgtc 1740
tccccgaggg gagaagggcg tgaccgcaac gtaggagggc gagcagagcc cggagcggcg 1800
gctaggggac aggggcgggg tgggcagcag ctcgaatttc ttccagatat cctcgctggg 1860
cgccggcggc tgcagctcgc tctgctgttg ctgctggtag aagttctcct cctcgtcgca 1920
gtagaaatac ggctgtaccg agtcgtagtc gaggtcatag ttcctgttgg tgaagctaac 1980
gttgaggggc atcgtcgcgg gaggctgctg gttttccact accggaaaaa aatccagcgt 2040
ccaaacagag gcaaggagag cctttcagag gagcgggtcc tggcagcggc ggggaagtgt 2100
ccccaaatag gcagaatagc ctccccgcgt cgggagagta gcgtccttgc tagggtgttg 2160
taagttccag tgcaaagtgt ccgccccctg ctatgggcaa agtttcgtgg atgcggcaag 2220
ggttgcggac cgctgtctgg ggggtcagcg ggagggctgg gccggaggcg aagccccctt 2280
ttcgctccgg atctcccttc ccacgacgcc cggagcgcag ctctgctcgc ccggatcttc 2340
caccctcgcc ggcccgcccg ctcgctccct ctgcctctcg ctggaattac tacagcgagt 2400
tagataaagc cccgaaaacc ggcttttata cctcagcgcg atccctccct ccgttctttt 2460
tcccgccaag cctctgagaa gccctgccct tctcgaggca ggaggggagc cagggactgc 2520
cgggagccgg cagtggcggc cgcgagcagc acagct 2556
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaguuuaca uuauggcuat t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uagccauaau guaaacugct t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccuugcuagg guguuguaat t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uuacaacacc cuagcaaggt t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccugguaaga ggcuagcuut t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagcuagccu cuuaccaggt t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccucucgcu ggaauuacut t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aguaauucca gcgagaggct t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
guccuggaug augauauuut t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaauaucauc auccaggact t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaguuuauag uaccuguaat t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
uuacagguac uauaaacuct t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccucucuug ccacaugaat t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uucauguggc aagagaggct t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcacuguccu ggaugcaaat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
uuugcaucca ggacagugct t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccacuuugca guuagauaut t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
auaucuaacu gcaaaguggt t 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgtggatgc ggcaaggg 18
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggttttcggg gctttatcta actcg 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agttcatagg tgactgattg gga 23
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aattccagcg agaggcagag 20
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagttcatag gtgactgatt ggga 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gttgcggaaa cgacgagaac 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcagccaagg ttgtgaggtt gca 23
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agccggtttt cggggcttta t 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
accgcttcca actcttagcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcagcgatgg acaaacagag 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccacgggtgt cctccaaag 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
caaacagagg caccgagttt 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaggattcat atgtgggcga tg 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctccatgtc gtcccagttg gt 22
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaattcccaa gggcgaaaat 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ttttcgacaa attccgcatc t 21
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgtagcagct tgcttcggac cca 23

Claims (7)

1.一种LNC_002015基因在提高PEDV毒价中的应用，所述LNC_002015序列如SEQ ID NO5所示。
2.LNC_002015基因的siRNA序列，其特征在于，包括：
si-LNC_002015_1U：GCAGUUUACAUUAUGGCUA；SEQ ID NO1；
si-LNC_002015_1D：UAGCCAUAAUGUAAACUGC；SEQ ID NO2；
或
si-LNC_002015_3U：CCUGGUAAGAGGCUAGCUU；SEQ ID NO3；
si-LNC_002015_3D：AAGCUAGCCUCUUACCAGG；SEQ ID NO4。
3.如权利要求2所述的LNC_002015基因的siRNA序列，其特征在于，使用时si-LNC_002015_1U、si-LNC_002015_1D、si-LNC_002015_3U和si-LNC_002015_3D序列的3’端添加dTdT修饰。
4.一种增加培养细胞内病毒毒价的方法，其特征在于，包括：
1)利用si-LNC_002015_1U/si-LNC_002015_1D或si-LNC_002015_3U/si-LNC_002015_3D序列构建siRNA干扰载体；
2)待培养细胞生长至70-90％汇合度时进行siRNA转染；
3)转染12h后接种病毒。
5.如权利要求4所述一种增加培养细胞内病毒毒价的方法，其特征在于，步骤2)中所述接种细胞为Vero-E6培养细胞。
6.如权利要求4所述一种增加培养细胞内病毒毒价的方法，其特征在于，步骤3)中所述病毒为PEDV。
7.如权利要求6所述一种增加培养细胞内病毒毒价的方法，其特征在于，所述PEDV为CV777株。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958763A (zh) * 2022-01-14 2022-08-30 江苏省农业科学院 一种构建DBN1基因敲除的Vero细胞株的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014043311A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compostions for the specific inhibition of myc by double-stranded rna
US20200188508A1 (en) * 2017-04-13 2020-06-18 Novo Biotech Corp. Porcine epidemic diarrhea virus s protein and subunit vaccine thereof as well as method for preparing subunit vaccine and application thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014043311A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compostions for the specific inhibition of myc by double-stranded rna
CN104968785A (zh) * 2012-09-14 2015-10-07 戴瑟纳制药公司 用于通过双链RNA特异性抑制myc的方法和组合物
US20200188508A1 (en) * 2017-04-13 2020-06-18 Novo Biotech Corp. Porcine epidemic diarrhea virus s protein and subunit vaccine thereof as well as method for preparing subunit vaccine and application thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNQIU LI 等: "Integrin αvβ3 enhances replication of porcine epidemic diarrhea virus on Vero E6 and porcine intestinal epithelial cells" *
JIANING CHEN等: "Porcine endemic diarrhea virus infection regulates long noncoding RNA expression" *
LINYANG YU 等: "Genome-wide analysis of long noncoding RNA profiles in Vero cells infected with porcine epidemic diarrhea virus" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958763A (zh) * 2022-01-14 2022-08-30 江苏省农业科学院 一种构建DBN1基因敲除的Vero细胞株的方法及其应用
CN114958763B (zh) * 2022-01-14 2023-02-14 江苏省农业科学院 一种构建DBN1基因敲除的Vero细胞株的方法及其应用

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