KR20160145814A - 세포 생산성을 향상시키는 마이크로rna - Google Patents

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KR20160145814A
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사이먼 피셔
르네 핸드릭
커스틴 오테
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호흐슐레 비베라흐
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Abstract

본 발명은 적어도 다른 두 개의 다른 영역을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것으로, 상기 영역은 세포에서 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 적어도 하나의 miRNA을 암호화하는 제1 영역, 세포 사멸을 억제하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제2 영역, 및 세포 증식을 조절하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제3 영역으로부터 선택되는 것이다. 또한 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 단계, 세포 사멸을 감소시키는 단계, 및 세포의 증식을 조절하는 단계로부터 선택되는 적어도 두 단계를 포함한다.

Description

세포 생산성을 향상시키는 마이크로RNA{miRNA enhancing cell productivity}
본 발명은 적어도 두 개의 다른 영역을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것으로 각 영역은 생체분자의 세포 수준의 생산(cellular production)을 자극하고, 세포 생존을 조절하고 및/또는 증식을 조절하는 것과 같은 특유의 기능을 가지는 적어도 하나의 miRNA 또는 miRNA-억제제를 암호화하는 것이다. 더 나아가 본 발명은 그와 같은 핵산 구조물을 포함하는 세포에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인슐린과 같은 최초의 의약품은 생명공학적으로, 즉 살아있는 세포에서 생산되었기 때문에 생물 약제학적 제조 분야는 엄청나게 성장해왔다. 최근 많은 약제학적 화합물이 생명공학적인 방법을 사용하여 생산되었다. 상기 화합물은 항체, 사이토카인, 항응고제뿐만 아니라 호르몬을 포함한다. 대부분은 화합물은 세균 및 효모와 같은 하등 생명체에서 생산되나, 흥미로운 의약품의 수의 증가, 특히 크고 복잡한 단백질은 포유류와 같은 고등 생물에서 유래한 세포에서 발현될 필요가 있다. 이는 원하는 화합물의 합성에 관여하는 특이적인 효소 또는 그 외 분자들의 필요성 때문이고, 이들은 대개 진화 중에 늦게 발달된 것이다. 예를 들어, 대부분의 단백질의 번역 후 변형은 효소에 의해 매개되고, 이는 대부분의 포유류 세포에 의해 발견되나 세균 또는 효모에서는 발현되지 않는다. 따라서, 최근 생물의약품은 점차적으로 포유류세포 공장에서 생산된다. 점차적으로 증가하는 생물의약품, 특히 재조합 단백질에 대한 수요 때문에 더 높은 생산물 역가(titer)를 달성하면서도 생산물의 질을 최대한으로 유지하는 다양한 전략들이 대두되고 있다. 그러나, 생물반응기에서 중간 생산물 역가 및 스트레스에 대한 낮은 내성은 원핵 생물 발현 시스템과 비교하면 여전히 상당한 도전과제로 남아있다.
포유류의 생산 세포주의 한계를 극복하는 것은 다른 세포주 공학의 접근법에 의해 다루어졌고 이에 따라 점차적으로 생산 효율이 증가되었다(Kramer et al., 2010). 구체적으로 징크 핑거 핵산분해효소(nuclease), 메가 핵산분해효소 또는 보다 최근에는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 매개되는 유전자 녹아웃과 별개로 Bcl-XL 또는 AVEN과 같은 유익한 유전자의 도입이 엔지니어 포유류 세포 공장에서 이루어졌다. 그러나 이러한 기술의 대부분은 복잡하고, 노동 집약적이거나 완성에 실질적으로 많은 시간을 요구하는 것이다. 게다가 전통적인 세포 공학 전략은 대개 하나 또는 소수의 분비 향상 유전자의 과발현에 의존한다. 그러나 구성성분의 과발현은 생산 세포에 추가적인 번역의 부담을 지우고, 따라서 관심있는 생물의약품을 생산하는 능력을 저하시킨다.
Aurnhammer, C., Haase, M., Muether, N., Hausl, M., Rauschhuber, C., Huber, I., Nitschko, H., Busch, U., Sing, A., Ehrhardt, A., Baiker, A., (2012) Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods 23, 18-28. Ebert MS, Sharp PA; MicroRNA sponges: progress and possibilities; RNA. 2010 Nov;16(11):2043-50. Fischer S, Wagner A, Kos A, Aschrafi A, Handrick R, Hannemann J, Otte K. Breaking limitations of complex culture media: functional non-viral miRNA delivery into pharmaceutical production cell lines. J Biotechnol. 2013 Dec;168(4):589-600. Kramer O, Klausing S, Noll T; Methods in mammalian cell line engineering: from random mutagenesis to sequence-specific approaches; Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Sep;88(2):425-36. Mayginnes, J.P., Reed, S.E., Berg, H.G., Staley, E.M., Pintel, D.J., Tullis, G.E., (2006) Quantitation of encapsidated recombinant adeno-associated virus DNA in crude cell lysates and tissue culture medium by quantitative, real-time PCR. J Virol Methods 137, 193-204. van Rooij E; The art of microRNA research; Circ Res. 2011 Jan 21;108(2):219-34.
따라서, 생물의약품 제조에 대한 생산 효율의 증가, 특히 관심있는 화합물만을 생산하는 것이 아니라 에너지 및 영양분의 세포 소모를 유지하거나 심지어 감소시키면서 생산성을 증가시키는 도구 및 방법을 제공하는 기술에 대한 필요성이 존재한다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 두 개의 다른 영역을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것으로, 상기 영역은 세포에서 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 적어도 하나의 miRNA을 암호화하는 제1 영역이고, 상기 miRNA는 그룹 1으로부터 선택되는 것이며, 세포 사멸을 억제하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제2 영역이고, 상기 miRNA는 그룹 2로부터 선택되는 것이고 상기 miRNA-억제제는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 것이며, 및 세포 증식을 조절하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제3 영역으로부터 선택되는 것이며, 상기 miRNA는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 것이며 상기 miRNA-억제제는 그룹 4 또는 5로부터 선택된 miRNA를 억제하는 것이고, 상기 그룹 1은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고; 상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있으며; 상기 그룹 3은 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고; 상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있으며; 및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606으로 구성되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 발명의 핵산 구조물을 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 세포에서 그룹 1로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시켜 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 단계, 세포에서 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 3으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 세포 사멸을 감소시키는 단계, 및 세포에서 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 세포의 증식을 조절하는 단계로부터 선택되는 적어도 두 단계를 포함하는 방법으로, 상기 그룹 1은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고; 상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있으며; 상기 그룹 3은 서열번호 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고; 상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있으며; 및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606으로 구성되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 생체분자를 생산하는 방법에 관한 것으로, 세포 배양에서 세포를 번식(propagate)시키는 단계, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20으로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시키는 단계, 및 세포 배양액으로부터 생체분자를 분리시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 생체분자를 생산할 때의 그룹 1로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA, 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제, 및 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제의 조합의 용도에 관한 것으로, 상기 그룹 1은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고; 상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있으며; 상기 그룹 3은 서열번호 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고; 상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있으며; 및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606으로 구성되어 있다.
도 1은 73개의 모든 스크린 플레이트에 대하여 기능적인 항-SEAP 대조군 siRNA로 형질주입된 CHO-SEAP 대조군 세포의 표준화된 특이적 SEAP 생산성을 나타낸다. 각 칼럼은 표시된 스크린 플레이트의 평균값을 나타낸다. 자료는 각각의 비-표적 대조군 miRNA의 평균값에 대하여 표준화하였다. 오류 바(bar)는 3개의 독립적인 형질주입의 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 2는 miRNA 라이브러리의의 백분율로서, CHO-SEAP 세포에서 제1 스크린으로부터 유의성 있는 변화를 유도한(p<0.05) miRNAs 모방체의 수에 대한 개요를 나타낸다. 케이크 차트는 각각 고려되는 생물학적 과정과 관련있는 파라미터로 나타내었다.
도 3은 전체 miR-30 패밀리가 CHO-SEAP 세포의 향상된 배양 성과에 기여함을 나타낸다. (A) 제1 miRNA 스크린(A)에서 및 제2 (검증) miRNA 스크린(B)에서 증가된 SEAP 생산성을 나타내는 모든 miR-30 miRNA에 대한 표준화된 용적 SEAP 생산성. 교반된 배양 조건 하에서 증가된 SEAP를 나타내는 모든 miR-30 miRNA의 표준화된 생존 세포 농도(C). 교반된 배양 조건에서 세포자멸 및 괴사에 대한 miR-30 miRNA의 영향. 오류 바(bar)는 3개의 독립적인 형질주입의 SD를 나타낸다. 통계적인 분석을 위하여, 독립 양측(two-tailed) t-테스트를 수행하였다(** p<0.01; *** p<0.001). 특이적 SEAP 생산성(x-축)에 대한 용적(y-축)에서 표준화된 증가는 양 파라미터에 유의하게 영향을 미치는 miRNA를 나타낸다. (E) 특이적인 SEAP 생산성(x-축)에서의 증가에 대한 세포자멸(y-축)에서 표준화된 감소는 양 파라미터에 유의하게 영향을 주는 miRNA를 나타낸다(F). 각각의 miR-30 패밀리 멤버를 나타내었다.
도 4는 CHO-SEAP 세포에서 스크린 검증을 위한 miR-30 패밀리 멤버의 대규모 형질주입의 결과를 나타낸다. 일시적인 도입 72시간 후에 단일 miR-30a-5p 및 miR-30c-5p 모방체 또는 양 miRNA의 조합의 도입에 따른 표준화된 용적 SEAP 생산성(A) 및 살아있는 세포 농도(VCD) 및 세포 생존(B)에 대한 효과. 값은 miR-NT 대조군으로 표준화되고 오류 바는 3개의 독립적인 형질주입의 SD를 나타낸다. 통계적인 분석을 위하여 독립 양측 t-테스트를 수행하였다(* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001).
도 5는 안정한 miR-30을 과발현하는 CHO-SEAP 세포 풀의 특징을 나타낸다. 안정한 세포 풀에서 miRNA 과발현(A). 성숙 miR-30 수준은 U6 snoRNA에 대하여 표시된다. miRNA 과발현은 pEGP-MIR-Null 대조군 풀에 의해 나타나는 내생의 miRNA 수준에 대하여 배수-변화 값으로 나타내었다. 음성 대조군 및 부(parental) CHO-SEAP 세포와 비교하여 MIR30a, MIR30c 및 MIR30e가 과발현된 세포풀의 배치 배양 동안 용적 SEAP 생산성(B), 생존 세포 농도/세포 생존(C) 및 특이적 SEAP 생산성(D)의 측정. 오류 바는 3개의 복사체의 SD를 나타낸다. 통계적인 분석: 각 miR-30 과발현 풀과 부 CHO-SEAP 세포주(* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001)를 비교하여 독립 양측 t-테스트.
도 6은 (A) CHO-SEAP 세포의 배치 배양 동안 내생의 miR-30a-5p(다이아몬드) 및 miR-30c-5p(삼각형) 발현 수준 분석을 나타낸다. miRNA 발현 수준 및 생존 세포 농도(점선)의 분석은 시딩 후 나타낸 날에 수행하였고 miRNA 발현에서 변화는 48시간에서의 수준에 대하여 계산되었다. (B) Nicoletii 염색으로 miR-30c-5p 모방체/안타고미르(항-miR-30c-5p) 형질주입 후에 CHO-SEAP 세포에서 세포자멸 분석. 형질주입된 세포에서 DNA 함량은 유세포 검출기를 사용하여 결정하고 2n(Sub-G1/0)보다 작은 DNA 함량을 나타내는 세포는 전체 세포에 대한 퍼센트로 나타내었다. 오류 바는 3개의 독립적인 형질주입의 SD를 나타내었다. (C) miR-30c-5p 모방체/안타고미르(항-miR-30c-5p) 형질주입 후 CHO-SEAP 세포에서 성숙한 miR-30c-5p 상대적인 풍부도. miRNA 발현은 miR-NT 형질주입된 대조군 세포(블랙 칼럼)에 의해 나타나는 내생의 miRNA 수준에 대한 배수-변화로 나타난다. 전체 RNA는 형질주입 72시간 후에 분리하고 3회 반복한 형질주입의 RNA 표본은 역 전사를 위하여 풀(pool)되었다. 성숙 miR-30c-5p 수준은 U6 snoRNA에 대해 표시되었고 오류 바는 3개의 기술적인 복제에 대한 SD로 나타내었다. 표준화된 (D) 특이적 SEAP 생산성 및 (E) 다음의 miR-30c-5p 모방체/안타고미르(항-miR-30c-5p) 도입 72시간 후 CHO-SEAP의 생존 세포 농도. 자료는 miR-NT 형질주입된 대조군 세포(블랙 칼럼)의 값으로 표준화되었고 오류 바는 3개의 독립적인 형질주입의 SD를 나타낸다. 통계적인 분석을 위하여, 독립 양측 t-테스트가 적용되었다(** p<0.01; *** p<0.001).
도 7 및 9는 특이적인 SEAP 생산성(7), 용적 SEAP 생산성(8) 및 증식(9)에 대한 제2 (검증) miRNA 스크린의 결과를 나타낸다. 자료는 miR-NT로 형질주입된 대조군 세포의 값으로 표준화되었고 오류 바는 3개의 독립적인 형질주입의 SD로 나타낸다. 통계적인 분석을 위하여 독립 양측 t-테스트가 적용되었다(** p<0.01; *** p<0.001)
도 10은 다른 인간 세포주, 즉 SKOV 3, T98G, HCT 116 및 SGBS에서 3개의 세포자멸 촉진 miRNA인, miRNAs, miR-134-5p, miR-378-5p 및 let-7d-3p의 활성을 나타낸다(n=3 +/- SD; 비 표적 대조군 miR-NT에 대하여 +p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001).
도 11은 miR-483의 형질주입에서 헬라 세포 내 재조합 아데노-관련 벡터(rAAVs)의 증가된 생산을 나타낸다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 두 개의 다른 영역을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것으로, 상기 영역은 세포에서 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 적어도 하나의 miRNA을 암호화하는 제1 영역이고, 상기 miRNA는 그룹 1으로부터 선택되는 것이며, 세포 사멸을 억제하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제2 영역이고, 상기 miRNA는 그룹 2로부터 선택되는 것이고 miRNA-억제제는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 것이며, 및 세포 증식을 조절하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제3 영역으로부터 선택되는 것이며, 상기 miRNA는 그룹 4 또는 5로부터 선택되며 상기 miRNA-억제제는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 것이다.
마이크로 RNA(miRNAs)는 약 22개의 뉴클레오티드의 내인성 작은 논-코딩 RNA 분자로 번역 후 변형이 진핵 세포에서 전체적인 유전자 발현을 조절하고 여러 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있다. 단일 miRNA는 대개 백개까지 다른 메신저 RNA(mRNA)를 조절하고, 대부분의 mRNA는 다양한 miRNA에 의해 표적화 될 것으로 예상된다. miRNA 유전자는 RNA 중합효소-Ⅱ에 의하여 전사되고 연속적으로 가공되어 RNA-유도형 사일런싱 복합체(RISC)로 병합되는 단일 가닥의 성숙한 miRNAs가 된다. RISC 복합체의 주요 부분으로써, miRNA는 RISC를 해당 mRNA 표적으로 안내하고, 그 곳에서 miRNA는 부분적으로 상보적인 염기쌍 형성에 의해 mRNA 전사체의 3'-미해독 영역(3'UTR)에 결합한다. 유전자 사일런싱은 아르고호(argonaute)-2(AGO2)-매개 mRNA 분해 또는 AGO1 내지 4에 의해 촉진된 번역 억제에 의해 발생하고, 양 방법은 결국 상응하는 단백질의 수준을 감소시킨다(van Rooij, 2011). 작은 방해 RNAs(siRNAs)와 대조적으로, miRNAs는 오직 표적 전사체의 3'UTR 내 결합 부위에 부분적으로 결합하여, 특이성이 다소 떨어지고, 따라서, 가능성 있는 표적 유전자의 풀(pool)이 증가한다. 완전한 왓슨-크릭 염기쌍은 miRNA "시드(seed)" 영역에서 콘포지토리(conpository)이고, 상기 영역은 성숙 miRNA의 5-말단에서 뉴클레오티드 2 내지 7/8 사이의 서열을 포함한다. miR-30 멤버와 같이 동일한 "시드" 서열을 가진 miRNA는 패밀리로 그룹화된다. 생물정보학 표적 예상 도구에 따라, 동일한 패밀리의 멤버는 다수의 표적 mRNAs를 공유하는 것으로 예상된다.
본 발명자들은 단일 miRNA의 다수의 표적에도 불구하고, 몇몇 miRNA는 특정 세포 수준의 과정에 특이적인 효과를 나타냄을 밝혀내었다. 기능적인 고-함량 miRNA 스크린을 수행하여, 1139개의 miRNAs를 포함하는 전체 쥐과의(murine) miRNA 모방체를 사용하여, 재조합 CHO-SEAP 현탁 세포주에서, 본 발명자들은 특정 세포 수준의 기능을 개선시키는 데 적합한 특정 miRNA를 밝혀냈다. 특히, 그룹 1(표 1)의 miRNAs는 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 본 명세서에 사용되는 용어 "생체분자의 세포 수준의 생산(cellular production of a biomolecule)"은 세포 당 생산되는 생체분자의 양을 나타낸다. 세포수준의 생산은 또한 전체 배양의 "용적 생산성(volumetric productivity)"과 대조적으로 "특이적인 생산성(specific productivity)"을 나타내는 것으로, 배양으로부터 수득할 수 있는 생체분자의 생산량을 나타낸다. 세포 수준의 생산 수준은 예를 들어 단백질 번역 속도와 같은 하나의 세포에 의해 시간당 합성할 수 있는 생체분자의 양에 주로 의존하는데, 이는 효율성에 적용가능하고, 상기 생체분자는 세포로부터 분비되는 것이다. 따라서 그룹 1의 miRNA는 하나 또는 심지어 양 과정에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 그룹 1에서, 서열번호 1, 3, 6, 8, 10, 29, 39, 40, 47, 49, 51, 55, 91, 103, 115, 132, 137, 171, 211 및 294으로 구성되어 있는 그룹 9의 miRNA는 세포 수준의 생산에 가장 현저한 효과를 나타냄을 밝혀냈다. 따라서, 제1 영역은 바람직하게는 그룹 9로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화한다.
세포 수준의 생산을 자극하는 miRNA(그룹 1)
서열번호 miRNA
1 mmu-miR-99b-3p
2 mmu-miR-767
3 mmu-miR-30a-5p
4 mmu-miR-3062-5p
6 mmu-miR-200a-5p
8 mmu-miR-135a-1-3p
9 mmu-miR-743a-5p
10 mmu-miR-694
11 mmu-miR-674-3p
12 mmu-miR-669d-3p
13 mmu-miR-301b-5p
14 mmu-miR-212-5p
15 mmu-miR-203-5p
16 mmu-miR-200b-5p
17 mmu-miR-200a-3p
18 mmu-miR-1968-5p
19 mmu-miR-150-3p
20 mmu-miR-30d-5p
21 mmu-miR-92b-5p
25 mmu-miR-871-3p
26 mmu-miR-760-5p
27 mmu-miR-741-3p
28 mmu-miR-713
29 mmu-miR-700-5p
32 mmu-miR-669d-2-3p
34 mmu-miR-666-5p
37 mmu-miR-5623-5p
39 mmu-miR-5134
40 mmu-miR-5132
41 mmu-miR-5127
42 mmu-miR-5124
44 mmu-miR-5117-3p
45 mmu-miR-5111-3p
46 mmu-miR-5099
47 mmu-miR-504-5p
48 mmu-miR-497-3p
49 mmu-miR-484
51 mmu-miR-466f-3p
52 mmu-miR-463-5p
53 mmu-miR-3971
55 mmu-miR-370-3p
56 mmu-miR-344g-5p
57 mmu-miR-344d-3p
58 mmu-miR-341-5p
62 mmu-miR-3113-3p
63 mmu-miR-3107-3p
66 mmu-miR-3094-5p
67 mmu-miR-3083-5p
69 mmu-miR-3074-5p
70 mmu-miR-3065-3p
75 mmu-miR-218-1-3p
76 mmu-miR-215-3p
77 mmu-miR-20b-5p
80 mmu-miR-1b-3p
81 mmu-miR-1956
82 mmu-miR-1953
83 mmu-miR-193b-3p
86 mmu-miR-1898
88 mmu-miR-155-5p
90 mmu-miR-149-5p
91 mmu-miR-143-5p
93 mmu-miR-136-5p
98 mmu-let-7a-1-3p
99 mmu-miR-875-5p
100 mmu-miR-802-5p
101 mmu-miR-708-3p
102 mmu-miR-681
103 mmu-miR-677-5p
104 mmu-miR-675-3p
106 mmu-miR-669e-5p
109 mmu-miR-5115
110 mmu-miR-5105
111 mmu-miR-5104
112 mmu-miR-503-3p
113 mmu-miR-489-5p
114 mmu-miR-485-3p
115 mmu-miR-483-3p
116 mmu-miR-467c-3p
117 mmu-miR-3970
118 mmu-miR-3969
120 mmu-miR-376c-5p
121 mmu-miR-375-5p
128 mmu-miR-30b-5p
130 mmu-miR-3057-3p
132 mmu-miR-20a-5p
134 mmu-miR-1942
136 mmu-miR-1903
137 mmu-miR-1901
138 mmu-miR-1843b-3p
141 mmu-miR-1264-3p
142 mmu-miR-1194
143 mmu-miR-1188-3p
147 mmu-miR-30c-1-3p
151 mmu-miR-92b-3p
152 mmu-miR-879-3p
155 mmu-miR-764-5p
158 mmu-miR-720
163 mmu-miR-702
165 mmu-miR-669d-5p
171 mmu-miR-568
174 mmu-miR-5621-5p
182 mmu-miR-5114
183 mmu-miR-5106
185 mmu-miR-5097
186 mmu-miR-5046
188 mmu-miR-488-5p
190 mmu-miR-467d-5p
201 mmu-miR-351-3p
203 mmu-miR-344d-1-5p
207 mmu-miR-330-5p
211 mmu-miR-3104-3p
212 mmu-miR-3102-3p.2-3p
214 mmu-miR-3100-3p
217 mmu-miR-3093-3p
222 mmu-miR-3075-3p
223 mmu-miR-3073b-3p
228 mmu-miR-3065-5p
230 mmu-miR-3061-5p
233 mmu-miR-302a-5p
238 mmu-miR-29a-3p
239 mmu-miR-299-3p
240 mmu-miR-294-5p
254 mmu-miR-1966
255 mmu-miR-1963
269 mmu-miR-132-5p
276 mmu-miR-1231-5p
278 mmu-miR-1196-5p
279 mmu-miR-1193-5p
285 mmu-let-7e-5p
294 mmu-miR-30c-5p
그룹 2(표 2) 및 그룹 3(표 3)의 miRNA는 세포 사멸을 억제(그룹 2)하거나 세포자멸 및 괴사를 촉진(그룹 3)하여 세포 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 배양에서 세포 사멸은 생산 세포 수를 감소시킬 뿐 아니라 전체 배양에서 현저한 부담을 지운다. 사멸한 세포는 배양액에서 잔해물로 남아, 세포 스트레스를 증가시키고 심지어 높은 농도에서 악독화(toxic)될 수 있다. 따라서, 세포 잔해물은 배양액으로부터 제거될 필요가 있고, 상기 잔해물은 배양 조건을 방해하고 세포에 물리적인 스트레스를 제공하고, 상기의 모든 것은 결국 생산력의 감소를 야기한다. 따라서, 세포 사멸을 억제하기 위해, 상기 핵산 구조물은 직접적으로 세포자멸을 억제하는 그룹 2의 miRNA를 암호화한다. 이들 miRNA 중에서, 서열번호 3, 7, 20, 54, 59, 73, 94, 145, 159, 175, 176, 178, 179, 199, 206, 248, 251, 252, 266 및 272로 구성되어 있는 그룹 10의 miRNA는 세포 생존에 가장 현저한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제2 영역은 바람직하게는 그룹 10으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화한다. 그룹 3의 miRNA(표 3)는 세포 사멸, 특히 세포자멸(그룹 6; 표 6) 또는 괴사(그룹 7; 표 7)를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 miRNA의 억제는 세포 사멸을 억제하는 데 적합하다. 그룹 3에서, 서열번호 297, 305, 607, 311, 312, 313, 321, 330, 331, 335, 336, 340, 345, 351, 359, 405, 412, 458, 510 및 608로 구성되어 있는 그룹 11의 miRNA는 가장 현저한 세포 사멸 유도 효과를 가지는 것으로 밝혀졌고, 따라서 상기 miRNA의 억제가 보다 바람직하다. 따라서, 제2 영역은 바람직하게는 그룹 11로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제를 암호화한다.
세포자멸을 억제하는 miRNA
서열번호 miRNA
1 mmu-miR-99b-3p
2 mmu-miR-767
3 mmu-miR-30a-5p
4 mmu-miR-3062-5p
5 mmu-miR-291b-3p
6 mmu-miR-200a-5p
7 mmu-miR-1a-3p
8 mmu-miR-135a-1-3p
9 mmu-miR-743a-5p
20 mmu-miR-30d-5p
24 mmu-miR-878-3p
31 mmu-miR-669f-3p
33 mmu-miR-669a-3-3p
50 mmu-miR-466f-5p
52 mmu-miR-463-5p
54 mmu-miR-382-5p
59 mmu-miR-329-3p
60 mmu-miR-323-5p
61 mmu-miR-322-3p
64 mmu-miR-30e-5p
68 mmu-miR-3076-3p
71 mmu-miR-3058-5p
73 mmu-miR-2861
74 mmu-miR-219-1-3p
79 mmu-miR-205-5p
85 mmu-miR-1899
87 mmu-miR-1896
89 mmu-miR-155-3p
92 mmu-miR-141-5p
94 mmu-miR-136-3p
95 mmu-miR-1247-5p
97 mmu-miR-106a-3p
98 mmu-let-7a-1-3p
145 mmu-miR-126-3p
153 mmu-miR-872-5p
154 mmu-miR-871-5p
156 mmu-miR-760-3p
159 mmu-miR-717
161 mmu-miR-711
166 mmu-miR-669c-5p
167 mmu-miR-592-5p
168 mmu-miR-590-5p
169 mmu-miR-590-3p
170 mmu-miR-574-5p
172 mmu-miR-5626-5p
175 mmu-miR-551b-5p
176 mmu-miR-551b-3p
178 mmu-miR-543-3p
179 mmu-miR-542-5p
180 mmu-miR-5136
181 mmu-miR-5117-5p
184 mmu-miR-5100
191 mmu-miR-453
192 mmu-miR-452-5p
194 mmu-miR-429-3p
195 mmu-miR-423-5p
196 mmu-miR-421-3p
197 mmu-miR-379-3p
199 mmu-miR-367-3p
200 mmu-miR-365-2-5p
204 mmu-miR-342-5p
205 mmu-miR-340-3p
206 mmu-miR-33-3p
208 mmu-miR-31-5p
209 mmu-miR-3110-3p
210 mmu-miR-3109-3p
213 mmu-miR-3100-5p
216 mmu-miR-3094-3p
219 mmu-miR-3088-3p
220 mmu-miR-3081-5p
221 mmu-miR-3076-5p
224 mmu-miR-3072-5p
225 mmu-miR-3071-3p
226 mmu-miR-3067-5p
227 mmu-miR-3066-3p
229 mmu-miR-3062-3p
231 mmu-miR-3059-5p
236 mmu-miR-300-5p
237 mmu-miR-29b-1-5p
241 mmu-miR-293-5p
242 mmu-miR-293-3p
243 mmu-miR-23a-5p
245 mmu-miR-223-3p
247 mmu-miR-217-3p
248 mmu-miR-211-3p
251 mmu-miR-200c-5p
252 mmu-miR-19a-3p
253 mmu-miR-196a-2-3p
256 mmu-miR-1952
257 mmu-miR-194-1-3p
258 mmu-miR-193b-5p
259 mmu-miR-1935
260 mmu-miR-1934-5p
262 mmu-miR-1902
265 mmu-miR-188-3p
266 mmu-miR-182-3p
268 mmu-miR-134-3p
271 mmu-miR-128-2-5p
272 mmu-miR-128-1-5p
273 mmu-miR-127-5p
274 mmu-miR-127-3p
277 mmu-miR-1197-5p
280 mmu-miR-1191
282 mmu-miR-101a-5p
284 mmu-let-7g-3p
289 mmu-miR-10b-5p
293 mmu-miR-221-3p
295 mmu-miR-346-3p
세포 사멸을 촉진하는 miRNAs
서열번호 miRNA
296 mmu-miR-9-5p
297 mmu-miR-133a-3p
298 mmu-miR-134-5p
299 mmu-miR-135a-5p
300 mmu-miR-137-3p
301 mmu-miR-154-5p
302 mmu-miR-183-5p
303 mmu-miR-185-5p
304 mmu-let-7d-3p
305 mmu-miR-29c-3p
306 mmu-miR-337-3p
307 mmu-miR-28-5p
308 mmu-miR-218-5p
309 mmu-miR-33-5p
310 mmu-miR-378-5p
311 mmu-miR-410-3p
312 mmu-miR-540-3p
313 mmu-miR-690
314 mmu-miR-133a-5p
315 mmu-miR-673-5p
316 mmu-miR-744-5p
317 mmu-miR-183-3p
318 mmu-miR-29a-5p
319 mmu-miR-338-5p
320 mmu-miR-466a-5p
321 mmu-miR-882
322 mmu-miR-466e-5p
323 mmu-miR-466g
324 mmu-miR-466j
325 mmu-miR-467g
326 mmu-miR-1906
327 mmu-miR-1904
328 mmu-miR-1943-5p
329 mmu-miR-1962
330 mmu-miR-1839-5p
331 mmu-miR-3064-5p
332 mmu-miR-3068-3p
333 mmu-miR-3073-3p
334 mmu-miR-3091-5p
335 mmu-miR-3098-5p
336 mmu-miR-344c-5p
337 mmu-miR-3102-3p
338 mmu-miR-3104-5p
339 mmu-miR-3112-3p
340 mmu-miR-192-3p
341 mmu-miR-103-1-5p
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343 mmu-miR-452-3p
344 mmu-miR-669f-5p
345 mmu-miR-1948-5p
346 mmu-miR-1964-5p
347 mmu-miR-3096b-3p
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354 mmu-let-7i-5p
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364 mmu-miR-135b-5p
365 mmu-miR-181c-5p
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373 mmu-miR-302c-5p
374 mmu-miR-302c-3p
375 mmu-miR-679-5p
376 mmu-miR-683
377 mmu-miR-686
378 mmu-miR-146b-5p
379 mmu-miR-467b-3p
380 mmu-miR-455-5p
381 mmu-miR-698
382 mmu-miR-706
383 mmu-miR-707
384 mmu-miR-714
385 mmu-miR-501-3p
386 mmu-miR-450b-3p
387 mmu-miR-505-3p
388 mmu-miR-718
389 mmu-miR-675-5p
390 mmu-miR-374-3p
391 mmu-miR-665-3p
392 mmu-miR-758-3p
393 mmu-miR-763
394 mmu-miR-202-5p
395 mmu-miR-15a-3p
396 mmu-miR-20a-3p
397 mmu-miR-31-3p
398 mmu-miR-93-3p
399 mmu-miR-337-5p
400 mmu-miR-339-3p
401 mmu-miR-345-3p
402 mmu-miR-20b-3p
403 mmu-miR-666-3p
404 mmu-miR-743b-5p
405 mmu-miR-883a-3p
406 mmu-miR-876-3p
407 mmu-miR-327
408 mmu-miR-466b-3p // mmu-miR-466c-3p // mmu-miR-466p-3p
409 mmu-miR-467c-5p
410 mmu-miR-493-3p
411 mmu-miR-509-5p
412 mmu-miR-654-5p
413 mmu-miR-449b
414 mmu-miR-669k-3p
415 mmu-miR-1186
416 mmu-miR-1187
417 mmu-miR-669h-5p
418 mmu-miR-1195
419 mmu-miR-1198-5p
420 mmu-miR-1897-5p
421 mmu-miR-1905
422 mmu-miR-1907
423 mmu-miR-1894-3p
424 mmu-miR-1933-5p
425 mmu-miR-1947-5p
426 mmu-miR-1948-3p
427 mmu-miR-1960
428 mmu-miR-1946b
429 mmu-miR-1970
430 mmu-miR-1971
431 mmu-miR-1982-5p
432 mmu-miR-2139
433 mmu-miR-1249-5p
434 mmu-miR-3099-3p
435 mmu-miR-3106-5p
436 mmu-miR-3106-3p
437 mmu-miR-3057-5p
438 mmu-miR-3061-3p
439 mmu-miR-3063-3p
440 mmu-miR-3069-5p
441 mmu-miR-3073-5p
442 mmu-miR-3079-5p
443 mmu-miR-3082-3p
444 mmu-miR-3084-5p
445 mmu-miR-466m-3p
446 mmu-miR-466n-5p
447 mmu-miR-466n-3p
448 mmu-miR-3092-5p
449 mmu-miR-3092-3p
450 mmu-miR-3096-5p
451 mmu-miR-3097-5p
452 mmu-miR-3097-3p
453 mmu-miR-3102-5p
454 mmu-miR-3102-5p.2-5p
455 mmu-miR-3108-5p
456 mmu-miR-3109-5p
457 mmu-miR-374c-5p
458 mmu-miR-1912-3p
459 mmu-miR-3471
460 mmu-miR-1186b
461 mmu-miR-3474
462 mmu-miR-137-5p
463 mmu-miR-146a-3p
464 mmu-miR-153-5p
465 mmu-miR-196a-1-3p
466 mmu-miR-1a-2-5p
467 mmu-miR-25-5p
468 mmu-miR-29b-2-5p
469 mmu-miR-92a-1-5p
470 mmu-miR-181b-1-3p
471 mmu-miR-133b-5p
472 mmu-miR-448-5p
473 mmu-miR-471-3p
474 mmu-miR-541-3p
475 mmu-miR-367-5p
476 mmu-miR-487b-5p
477 mmu-miR-669c-3p
478 mmu-miR-499-3p
479 mmu-miR-701-3p
480 mmu-miR-181d-3p
481 mmu-miR-466h-3p
482 mmu-miR-493-5p
483 mmu-miR-653-3p
484 mmu-miR-669e-3p
485 mmu-miR-1199-3p
486 mmu-miR-1947-3p
487 mmu-miR-1955-3p
488 mmu-miR-664-5p
489 mmu-miR-3964
490 mmu-miR-3473b
491 mmu-miR-3473c
492 mmu-miR-5109
493 mmu-miR-5118
494 mmu-miR-5120
495 mmu-miR-5121
496 mmu-miR-3544-3p
497 mmu-miR-5615-3p
498 mmu-miR-1231-3p
499 mmu-miR-5616-3p
500 mmu-miR-5617-3p
501 mmu-miR-3073b-5p
502 mmu-miR-5710
503 mmu-miR-1929-3p
504 mmu-miR-669a-5p // mmu-miR-669p-5p
505 mmu-miR-466b-5p // mmu-miR-466o-5p
506 mmu-miR-344e-5p // mmu-miR-344h-5p
507 mmu-miR-96-5p
508 mmu-miR-200c-3p
509 mmu-miR-216a-5p
510 mmu-miR-761
511 mmu-miR-18a-3p
512 mmu-miR-466k
513 mmu-miR-467h
514 mmu-miR-1955-5p
515 mmu-miR-3096-3p
605 mmu-let-7f-5p
607 mmu-miR-24-3p
608 mmu-miR-298-3p
609 mmu-miR-7b-5p
그룹 4의 miRNA(표 4)는 증식을 촉진하는 반면 그룹 5의 miRNA(표 5)는 세포 분열을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 그룹 4의 miRNA의 발현 및 그룹 5의 miRNA의 억제는 증식을 촉진시키기에 적합하고, 반면 그룹 5의 miRNA의 발현 및 그룹 4의 miRNA의 억제는 증식을 억제하는 데 적합하다. 각 단일 세포의 세포 수준의 생산 외에, 배양액에 존재하는 세포의 수는 수득할 수 있는 생체분자의 생산량을 결정한다. 따라서, 세포 증식을 자극하는 것은 생산하는 배양액의 크기를 증가시킬 때, 특히 천천히 자라는 세포가 사용되거나 세포 배양을 시작할 때 바람직할 수 있다. 반면에, 일단 배양액이 최적의 세포 농도에 도달하게 되면, 세포 증식을 억제하는 것이 바람직하다. 세포 분열을 위하여 세포는 세포막, 세포핵 및 추가 세포기관들을 포함하는 거의 모든 구성요소를 약 두 배로 복제할 필요가 있다. 이는 에너지 및 단백질 번역 한계를 소비하고, 그 후 이는 원하는 생체분자의 생산에 제공되지 못한다. 따라서, 세포 증식을 억제하는 것이 바람직할 수 있고, 특히 일단 최적의 배양 크기에 도달하면 더욱 그러하다. 그룹 4의 miRNA 중 서열번호 5, 7, 22, 30, 35, 43, 68, 72, 78, 84, 96, 146, 148, 160, 173, 177, 198, 202, 232, 234, 244, 267 및 283으로 구성되어 있는 그룹 12의 miRNA는 세포 증식에 가장 현저한 효과를 가지고, 증식을 억제하는 것으로 밝혀진 miRNA 중 서열번호 517, 523, 526, 529, 531, 533, 537, 548, 550, 558, 560, 561, 563, 566, 567, 571, 575, 577, 583, 591, 600, 601 및 604로 구성되어 있는 그룹 13의 miRNA가 가장 효과적이다. 따라서, 세포 증식을 촉진시키기 위하여, 제3 영역은 바람직하게는 그룹 12로부터 선택되는 miRNA 및/또는 그룹 13으로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 miRNA-억제제를 암호화한다. 세포 증식을 억제하기 위하여, 제3 영역은 바람직하게는 그룹 13의 miRNA 및/또는 그룹 12의 miRNA를 억제하는 miRNA-억제제를 암호화한다.
증식을 촉진하는 miRNA
서열번호 miRNA
5 mmu-miR-291b-3p
7 mmu-miR-1a-3p
68 mmu-miR-3076-3p
79 mmu-miR-205-5p
94 mmu-miR-136-3p
10 mmu-miR-694
11 mmu-miR-674-3p
12 mmu-miR-669d-3p
13 mmu-miR-301b-5p
14 mmu-miR-212-5p
15 mmu-miR-203-5p
16 mmu-miR-200b-5p
17 mmu-miR-200a-3p
18 mmu-miR-1968-5p
19 mmu-miR-150-3p
22 mmu-miR-880-5p
23 mmu-miR-878-5p
30 mmu-miR-684
35 mmu-miR-582-5p
36 mmu-miR-582-3p
38 mmu-miR-540-5p
43 mmu-miR-5122
65 mmu-miR-3096b-5p
72 mmu-miR-294-3p
78 mmu-miR-206-3p
84 mmu-miR-1930-3p
96 mmu-miR-1190
105 mmu-miR-669l-3p
107 mmu-miR-539-3p
108 mmu-miR-5123
119 mmu-miR-381-3p
122 mmu-miR-370-5p
123 mmu-miR-363-3p
124 mmu-miR-350-3p
125 mmu-miR-344h-3p
126 mmu-miR-330-3p
127 mmu-miR-3110-5p
129 mmu-miR-3070a-3p
131 mmu-miR-224-3p
133 mmu-miR-1961
135 mmu-miR-1931
139 mmu-miR-148a-5p
140 mmu-miR-130b-5p
144 mmu-miR-125b-5p
146 mmu-miR-27a-3p
148 mmu-miR-99a-5p
149 mmu-miR-99a-3p
150 mmu-miR-93-5p
160 mmu-miR-712-5p
162 mmu-miR-709
164 mmu-miR-676-3p
173 mmu-miR-5622-5p
177 mmu-miR-544-5p
187 mmu-miR-491-3p
189 mmu-miR-488-3p
193 mmu-miR-431-5p
198 mmu-miR-376b-5p
202 mmu-miR-3470a
215 mmu-miR-3095-5p
218 mmu-miR-3089-5p
232 mmu-miR-302b-3p
234 mmu-miR-302a-3p
235 mmu-miR-301a-5p
244 mmu-miR-224-5p
246 mmu-miR-219-5p
249 mmu-miR-208b-5p
250 mmu-miR-208a-3p
261 mmu-miR-1933-3p
263 mmu-miR-18a-5p
264 mmu-miR-1894-5p
267 mmu-miR-148a-3p
270 mmu-miR-132-3p
275 mmu-miR-1251-3p
281 mmu-miR-103-2-5p
283 mmu-miR-100-3p
287 mmu-miR-107-5p
288 mmu-miR-10a-3p
291 mmu-miR-191-5p
세포 분열을 억제하는 miRNA
서열번호 miRNA
516 mmu-miR-9-3p
517 mmu-miR-136-5p
518 mmu-miR-155-5p
519 mmu-miR-193-3p
520 mmu-miR-204-5p
521 mmu-miR-143-3p
522 mmu-let-7c-5p
523 mmu-let-7e-5p
524 mmu-miR-29a-3p
525 mmu-miR-34a-5p
526 mmu-miR-320-3p
527 mmu-miR-379-5p
528 mmu-miR-196b-5p
529 mmu-miR-484
530 mmu-miR-546
531 mmu-miR-488-5p
532 mmu-miR-696
533 mmu-miR-720
534 mmu-miR-697
535 mmu-miR-713
536 mmu-miR-501-5p
537 mmu-miR-666-5p
538 mmu-miR-764-5p
539 mmu-miR-804
540 mmu-miR-145-3p
541 mmu-miR-294-5p
542 mmu-miR-299-3p
543 mmu-miR-302a-5p
544 mmu-miR-330-5p
545 mmu-miR-340-5p
546 mmu-miR-139-3p
547 mmu-miR-362-3p
548 mmu-miR-409-5p
549 mmu-miR-671-3p
550 mmu-miR-881-3p
551 mmu-miR-297c-5p
552 mmu-miR-466h-5p
553 mmu-miR-467d-5p
554 mmu-miR-568
555 mmu-miR-872-3p
556 mmu-miR-669d-5p
557 mmu-miR-669e-5p
558 mmu-miR-1197-3p
559 mmu-miR-1941-5p
560 mmu-miR-1953
561 mmu-miR-1963
562 mmu-miR-1966
563 mmu-miR-1249-3p
564 mmu-miR-3058-3p
565 mmu-miR-344d-1-5p
566 mmu-miR-3060-3p
567 mmu-miR-3061-5p
568 mmu-miR-3065-5p
569 mmu-miR-3074-5p
570 mmu-miR-669d-2-3p
571 mmu-miR-3093-3p
572 mmu-miR-3100-3p
573 mmu-miR-344g-5p
574 mmu-miR-3102-3p.2-3p
575 mmu-miR-3104-3p
576 mmu-miR-3107-3p
577 mmu-miR-3112-5p
578 mmu-miR-130a-5p
579 mmu-miR-132-5p
580 mmu-miR-187-5p
581 mmu-let-7a-2-3p
582 mmu-miR-351-3p
583 mmu-miR-215-3p
584 mmu-miR-412-5p
585 mmu-miR-592-3p
586 mmu-miR-760-5p
587 mmu-miR-497-3p
588 mmu-miR-700-5p
589 mmu-miR-871-3p
590 mmu-miR-874-5p
591 mmu-miR-504-3p
592 mmu-miR-669k-5p
593 mmu-miR-466i-5p
594 mmu-miR-1193-5p
595 mmu-miR-5098
596 mmu-miR-5106
597 mmu-miR-5114
598 mmu-miR-5134
599 mmu-miR-1231-5p
600 mmu-miR-5617-5p
601 mmu-miR-5621-5p
602 mmu-miR-5621-3p
603 mmu-miR-5623-5p
604 mmu-miR-3073b-3p
606 mmu-miR-24-2-5p
세포자멸을 촉진하는 miRNA
서열번호 miRNA
296 mmu-miR-9-5p
297 mmu-miR-133a-3p
298 mmu-miR-134-5p
299 mmu-miR-135a-5p
300 mmu-miR-137-3p
301 mmu-miR-154-5p
302 mmu-miR-183-5p
303 mmu-miR-185-5p
304 mmu-let-7d-3p
305 mmu-miR-29c-3p
306 mmu-miR-337-3p
307 mmu-miR-28-5p
308 mmu-miR-218-5p
309 mmu-miR-33-5p
310 mmu-miR-378-5p
311 mmu-miR-410-3p
312 mmu-miR-540-3p
313 mmu-miR-690
314 mmu-miR-133a-5p
315 mmu-miR-673-5p
316 mmu-miR-744-5p
317 mmu-miR-183-3p
318 mmu-miR-29a-5p
319 mmu-miR-338-5p
320 mmu-miR-466a-5p
321 mmu-miR-882
322 mmu-miR-466e-5p
323 mmu-miR-466g
324 mmu-miR-466j
325 mmu-miR-467g
326 mmu-miR-1906
327 mmu-miR-1904
328 mmu-miR-1943-5p
329 mmu-miR-1962
330 mmu-miR-1839-5p
331 mmu-miR-3064-5p
332 mmu-miR-3068-3p
333 mmu-miR-3073-3p
334 mmu-miR-3091-5p
335 mmu-miR-3098-5p
336 mmu-miR-344c-5p
337 mmu-miR-3102-3p
338 mmu-miR-3104-5p
339 mmu-miR-3112-3p
340 mmu-miR-192-3p
341 mmu-miR-103-1-5p
342 mmu-miR-135a-2-3p
343 mmu-miR-452-3p
344 mmu-miR-669f-5p
345 mmu-miR-1948-5p
346 mmu-miR-1964-5p
347 mmu-miR-3096b-3p
348 mmu-miR-3968
349 mmu-miR-5101
350 mmu-miR-5709
351 mmu-miR-3070a-5p // mmu-miR-3070b-5p
352 mmu-miR-669m-5p // mmu-miR-466m-5p
507 mmu-miR-96-5p
508 mmu-miR-200c-3p
509 mmu-miR-216a-5p
510 mmu-miR-761
511 mmu-miR-18a-3p
512 mmu-miR-466k
513 mmu-miR-467h
514 mmu-miR-1955-5p
515 mmu-miR-3096-3p
605 mmu-let-7f-5p
608 mmu-miR-298-3p
괴사를 촉진하는 miRNA
서열번호 miRNA
296 mmu-miR-9-5p
297 mmu-miR-133a-3p
298 mmu-miR-134-5p
299 mmu-miR-135a-5p
300 mmu-miR-137-3p
301 mmu-miR-154-5p
302 mmu-miR-183-5p
303 mmu-miR-185-5p
304 mmu-let-7d-3p
305 mmu-miR-29c-3p
306 mmu-miR-337-3p
307 mmu-miR-28-5p
308 mmu-miR-218-5p
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생산 효율 및 세포 배양으로부터 수득할 수 있는 전체 생체분자의 산출(output)은 다양한 세포 수준의 과정에 의존하고, 이에 가장 중요한 것은 생체분자의 단백질 세포 내 생산(번역/분비), 세포 생존 및 세포 증식이고, 이를 조절하는 것과도 밀접한 관련이 있다. 다른 세포 수준의 과정과 관련이 있는 적어도 두 개의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 도입함으로써, 다양한 세포 수준의 기작들을 최적화시켜 원하는 생체분자의 생산량을 증가시킬 수 있다. 각 miRNA 및 miRNA-억제제는 다양한 밀접하게 관련되어 있는 세포 수준의 기작들에 대한 다양한 표적 유전자에 영향을 미치고, 따라서 세포 내 단백질들의 구성성분에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 합성을 증가시키는 하나 또는 수개의 효소의 과발현과 대조적으로, 세포의 내생의 단백질 풀(pool) 내 균형을 이동시키는 것은 원하는 생체분자의 생산으로부터 에너지를 산출하지 못한다. miRNA를 발현하는 것은 실질적으로 번역을 감소시키고, 따라서, 생체분자의 생산을 위한 에너지 방출과 단백질 번역의 한계를 감소시킨다. 게다가, 생산력의 제한적인 요소는 생산되는 생체분자에 따라 따르고, 심지어 배양 조건에 따라 배양(cultivation) 동안 변화한다. miRNA를 조절함으로써 많은 다양한 단백질의 구성성분에 영향을 미침으로써, 전체 기작을 조절할 수 있다. 따라서, 이것은 다양한 한계를 극복할 수 있고, 이는 단일 합성 효소를 과발현하거나 단일 단백질 분해 효소를 억제하거나 녹아웃하여 할 수 없는 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "생체분자"는 세포에 의해 생산되고 이로부터 수득되는 적절한 임의의 화합물을 나타낸다. 바람직하게, 생체분자는 생물의약품, 즉 치료, 예방 및 진단을 포함하는 의약품이고, 이는 본질적으로 자연에서 얻을 수 있고 생명공학을 사용하여 제조될 수 있다. 생물의약품은 그 중에서도 항체, 효소, 호르몬, 백신뿐만 아니라 암용해(oncolytic) 바이러스 및 유전자 치료에 사용되는 바이러스와 같은 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 생물의약품은 바람직하게는 재조합 분자이고, 보다 바람직하게는 재조합 단백질 또는 재조합 바이러스이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "miRNA-억제제"는 세포 내에 제공되는 miRNA의 양을 특이적으로 줄이는 데 적합한 임의의 화합물을 나타낸다. miRNA-억제제는 예를 들어 원하는 miRNA에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 포함하고 이에 따라 이의 표적 mRNA와의 결합을 억제한다. 상기 억제제는 안타고미르(antagomir), miRNA 스폰지 및 miRNA 디코이(decoy)를 포함한다. 아타고미르는 표적 miRNA에 완벽하게 상보적인 작은 올리고뉴클레오티드이고, 반면에 miRNA 스폰지 및 RNA 디코이는 원하는 miRNA의 다양한 탠덤(tendem) 결합 부위를 포함하는 핵산 분자이다. 다양한 결합 부위 때문에 상기 분자는 miRNA의 강한 경쟁적 억제제로 작용한다(Ebert 및 Sharp, 2010). 따라서, miRNA-억제제는 바람직하게는 안타고미르, miRNA 스폰지 및 miRNA 디코이로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 대안적으로, miRNA 억제제는 원하는 miRNA, 예를 들어 이의 프로모터 또는 인핸서의 조절 요소를 표적할 것이다.
바람직한 구현예에서, 핵산 구조물은 세 개의 다른 영역을 포함한다. 세포 수준의 생산, 세포 사멸 및 세포 증식 각각에 영향을 미치는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA 억제제를 포함함으로써, 생체분자를 생산하는 세포의 효율성은 최적화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 영역, 바람직하게는 각각의 영역은 적어도 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 다른 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화한다. 임의의 영역은 하나 이상의 miRNA 또는 miRNA-억제제를 암호화할 것이다. 예를 들어, 동일한 패밀리에 속하고 따라서 유사한 mRNA를 표적하는 다수의 miRNA를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, miR-30 패밀리 멤버의 다수를 결합하여 도입함으로써 관찰되는 것과 같은 하나의 특정 기작의 조절을 강화할 수 있다. 대안적으로, 다른 기작을 표적하는 다양한 miRNA는 보다 다양한 효과를 나타내는 대 사용될 수 있다. 증식, 단백질 합성 및 세포 사멸과 같은 세포 과정은 대개 하나 이상의 신호 기작으로 조절되고, 이들 중 대부분은 서로 밀접하게 관련되어 있다. 따라서, 다양한 기작을 표적하는 것은 생체분자 생산을 위하여 제한적인 요소가 존재하는 세포 수준의 기작이 알려지지 않은 경우에 대비하여 특히 이점이 있다. miRNA의 다소 작은 크기 때문에, 본 발명의 핵산 구조물은 20개, 또는 보다 많은 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "영역(region)"은 miRNA 또는 안타고미르 또는 miRNA 디코이와 같은 miRNA-억제제로 전사되는 부분을 포함하는 핵산 구조물의 부분(section)을 나타낸다. 영역은 프로모터, 작동자(operator)(예를 들어, 인핸서, 억제제 및 절연제(insulator)), 3'UTR 조절 요소(예를 들어, siRNA 결합 자리, miRNA 결합 자리) 또는 스플라이싱 신호와 같은 miRNA 또는 miRNA-억제제의 전사를 조절하는 조절 인자를 더 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 두 개의 다른 영역은 다른 프로모터에 의해 조절된다. 이는 각 영역은 특유의 조절 요소를 포함하고, 이에 따라 상기 영역에 포함되는 miRNA 및/또는 miRNA-억제제의 전사는 구조물의 다른 영역에 포함되는 miRNA 및/또는 miRNA-억제제와 독립적으로 조절될 수 있다. 이는 세포 증식 및 세포 수준의 생산이 세포 배양 동안 다른 시점에 조절되어야 할 경우 이점이 된다. 배양을 유도할 때, 세포 증식은 촉진되고 반면에 일단 최적의 세포 농도에 도달하게 되면, 세포 수준의 생산력은 향상될 것이다. 세포 사멸의 조절은 배양 상태에 따라 특이적으로 유도될 수 있다. 게다가, 독립적인 조절 요소를 사용하는 것은 다양한 양으로 다른 세포 수준의 과정에 대하여 miRNA 및 miRNA-억제제를 제공할 수 있도록 한다. 예를 들어, 세포 수준의 생산을 촉진하는 miRNA는 강한 프로모터와 함께 구성될 수 있고, 반면 세포 사멸에 영향을 주는 miRNA 또는 miRNA-억제제는 약한 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 두 개의 다른 영역은 하나의 공통된 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이는 핵산 구조물의 빠르고 쉬운 제조를 가능하게 하고 바람직하게는 다소 단순한 조절로 생체분자의 생산량을 이미 만족시킨 경우에 대비하여 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 유도성(inducible) 또는 억제성(inhibitable)이다. 유도성/억제성 프로모터는 이들의 활성이 온도, 빛, 산소 또는 화학적 화합물의 존재와 같은 외부 환경에 의해 의존하도록 특징지어 진다. 유도성 또는 억제성 프로모터를 사용함으로써 세포 배양 동안 구조의 하나 또는 모든 영역의 전사가 시작 및/또는 종결되는 시점을 정확하게 결정할 수 있다. 유도성 조절 요소는 예를 들어 테트라사이클린(tetracycline)/독시사이클린(doxycycline) "테트-온(Tet-On)"-시스템을 포함하고, 억제성 조절 요소는 예를 들어 "테트-오프(Tet-Off)"-시스템 또는 조절된 광유전적(optogenetic) 유전자 발현 시스템, 온도 조절된 프로모터 및 Tsr-기초한 시스템(정족수(quorum) 감지 기반)을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 핵산 구조물은 발현 벡터, 에피좀 벡터(episomal vector) 또는 바이러스 벡터이다. 세포 내에서 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 발현하기 위해, 핵산 구조물은 세포로 도입될 필요가 있다. 이는 다른 수단, 예를 들어 형질주입(transfection), 즉 핵산 분자를 진핵 세포로 전달하는 비-바이러스 방법으로 할 수 있다. 이와 같은 적용을 위하여, 핵산 구조물은 바람직하게는 발현 벡터 또는 에피좀 벡터로 제공된다. 대안적으로, 핵산 구조물은 세포 내로 형질도입(transduction), 즉 핵산을 세포로 바이러스-매개 전달을 통하여 도입할 수 있다. 이와 같은 적용을 위하여, 핵산 구조물은 바람직하게는 바이러스 벡터로 제공된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 발명의 핵산 구조물를 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 생체분자를 생산하기에 적합하고, 여기서 생산의 효율 및 전체적인 생산량은 다른 세포 수준의 과정과 관련되어 있는 적어도 두 개의 miRNA를 조절함으로써 최적화된다. 상기 세포는 바람직하게는 생물의약품 제조에 사용된다.
바람직한 구현예에서, 상기 구조물은 세포의 게놈으로 병합된다(integrated). 본 발명에 따라 구조물을 세포의 내인성 게놈으로 도입함으로써, 생물의약품 생산을 위한 안정적인 세포주가 제공된다. 상기 세포주는 일정하고 믿을만한 양으로 생체분자를 생산하고 따라서, 특히 대량 생산에 바람직하고, 이는 대개 만들어지고(established) 수요가 많은 생물의약품을 제공하기 위해 작동된다. 게다가, 핵산 구조물을 게놈에 병합시킴으로써, 계속적인 세포 증식 동안 상기 구조물이 풀릴 가능성이 감소하고 핵산 구조물이 전체 배양의 라이프타임(lifetime) 동안 계속 존재한다. 따라서, 상기 세포는 바람직하게는 안정한 세포주 세포이다.
바람직한 구현예에서, 상기 구조물은 세포로 형질주입을 통하여 도입된다. 일시적인 형질주입은 주어진 세포에 새로운 특징을 부여하는 쉽고 빠른 방법이다. 이는 노동 또는 비용 집약적인 것이 아니고 광범위한 선택 과정을 필요로 하지 않는다. 생체분자가 단기에 생산될 필요가 있거나 오직 소량의 생체분자만이 필요한 경우 형질주입으로 핵산 구조물을 도입하는 것이 특히 바람직하고, 그런 경우 안정한 세포주의 노동-집약적인 생산(establishment)은 효율적이지 못하다.
바람직한 구현예에서, 그룹 1, 2, 4 및/또는 5로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 세포의 게놈의 영역은 증폭되고, 및/또는 그룹 3, 4 및/또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 세포 게놈의 영역은 삭제되거나 침묵화된다(silenced). 본 발명의 핵산 구조물을 세포로 도입하는 것 외에도, miRNA는 miRNA의 세포 내생의 발현을 변형함으로서 제공되거나 억제된다. 특정 miRNA의 수준을 증가시키기 위해, 이 miRNA를 암호화하는 세포 게놈의 영역은 증폭될 것이다. 마찬가지로, 내생의 miRNA를 암호화하는 영역은 삭제되고 이에 따라 miRNA는 더이상 세포에 존재하지 않게 된다. miRNA를 암호화하는 유전자를 삭제하는 것 대신, 세포 내 miRNA 수준은 예를 들어 경쟁적 억제제를 사용하여 사일런싱함으로서 감소될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 예를 들어 정교한 번역 후 변형을 포함하는 것과 같이 특히 복잡한 구조의 생체분자를 생산하는데 특히 바람직하다. 포유류 세포는 내생적으로 컴플렉스 단백질(complex protein)을 모으고, 접고 및 변형하기 위해 필요한 합성 기작을 포함한다. 예를 들어 햄스터, 쥐, 오리 또는 인간과 같은 다른 기원으로부터 유래된 다양한 세포 수준 시스템이 이용 가능하다. 다른 포유동물 종 사이 많은 유전자들의 알려진 서열 상동관계(homology) 때문에, 비록 중국 햄스터 난자(CHO; Chinese hamster ovary) 세포를 사용하여 확인된 miRNA임에도 불구하고 상기 miRNA은 다른 종의 세포, 특히 다른 포유동물 세포에서 단백질 발현, 접힘, 분비 및 생산 품질을 결정하는 세포 수준의 파라미터에 영향을 미치기에 적합하다. 예를 들어, CHO 세포에서 세포자멸을 촉진하는 효과를 가지는 것으로 밝혀진 miRNA는 인간 종양 및 지방선구세포(preadipocyte) 세포주에서 또한 세포자멸을 유도하는데 적합하다(도 10).
바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난자 세포(CHO)이고, 바람직하게는 CHO-K1 세포, CHO DG44 세포, CHO DUKX B11 세포, CHO dhfr- 세포 또는 CHO-S 세포이다.
바람직한 구현예에서, 세포는 인간 세포이고, 바람직하게는 신장 세포, 간 세포, 배아 망막 세포, 양수 세포(amniocytic cell) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)이다. 인간 세포로부터 유래한 세포 수준 생산 시스템은 특히 인간 약에 사용되는 경우 인간 유래의 생체분자의 생산을 위해 바람직하다. 변형의 부정확한 접힘에 의한 생체분자의 미미한 변형은 상기 단백질이 덜 활성되도록 하거나 심지어는 부작용을 나타내도록 한다. 게다가, CHO 세포를 사용하여 확인된 miRNA는 인간 세포에서 비슷한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
바람직한 구현예에서, 세포는 곤충 세포이고, 바람직하게는 Sf9, Sf21, TriEXTM 또는 Hi5 세포이다. 상기 세포 시스템은 특히 분자, 예를 들어 필수적인 기능을 발휘하는 다른 시스템에서 유래한 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 그들의 자연상태 세포 수준의 환경에서 그와 같은 단백질의 발현은 생산세포의 세포 수준의 과정을 방해하고 심지어는 세포 사멸을 야기한다. 이는 생체분자의 생산 효율성을 현저하게 손상시키고, 생산되는 생산량을 강하게 제한한다. 예를 들어, 이들은 이러한 세포에서 임의의 생물 효과를 발휘하지 않는다는 점에서, 세포 수준 기작에서 현저한 영향을 가지는 임의의 인간 수용체 분자는 곤충 세포에서 높은 생산량으로 생산될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 세포에서 그룹 1로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시켜 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 단계, 세포에서 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 3으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 세포 사멸을 감소시키는 단계, 및 세포에서 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시킴으로써 세포의 증식을 조절하는 단계로부터 선택되는 적어도 두 단계를 포함하는 방법이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체분자의 생산량(yield of a biomolecule)"은 전체 배양의 용적 생산성, 즉 배양액으로부터 수득할 수 있는 원하는 생체분자의 전체량을 나타낸다. 생체분자를 생산하기 위하여, 세포 배양은 바람직하게는 원하는 생체분자를 생산하기 적합한 안정한 세포주로 확립된다. 생체분자가 단백질인 경우에, 이는 원하는 단백질을 암호화하는 유전자의 하나 또는 다양한 복제를 도입함으로서 수행할 수 있다. 개시된 방법을 사용함으로써, 세포 수준 생산, 증식 및 세포 생존의 적어도 두 개의 세포 수준의 기작은 특정 miRNA의 수준을 조절하는 것을 통해 영향을 받는다. 세포 수준의 생산 능력, 세포 증식 및 세포 생존의 균형을 잡으면서, 이는 세포의 에너지 및 영양의 세포 배양 소비를 증가시키는 추가적인 번역 부담을 가중시키지 않고 생체분자의 산출(output)을 증가시킨다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 miRNA의 수준은 세포 내에서 miRNA를 과발현함으로써 miRNA 존재 하에서 세포를 전기천공(electroporating)함으로써 또는 세포를 배양하는 배지에 miRNA 및 형질전환체(transfectant)를 첨가함으로써, 증가된다. 대안적으로, miRNA 및 형질전환체는 버퍼에 첨가될 수 있고, 버퍼는 형질주입을 위해 세포가 전달되는 것이다. 세포 내 miRNA의 수준을 증가시키기 위해 두 개의 특유의 방안이 이용 가능하다. miRNA를 암호화하는 핵산 분자는 세포로 도입되고, 이에 따라 세포 수준의 전사 기관(transcription machinery)은 그 구조물로부터 miRNA를 발현한다. 이는 개별적인 에피좀 분자로써 세포에서 유지되거나 세포의 게놈으로 병합되는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터의 사용 또는 안정한 세포주의 사용으로 달성된다. 대안적으로, 세포 내 miRNA의 수준은 예를 들어, pri- 또는 pre-miRNA, 성숙 miRNA 또는 miRNA 모방체와 같은 RNA 분자로 miRNA를 제공함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 형질주입체 즉, 리포펙타민(lipofactamine)(인비트로젠(Invitrogen))과 함께 배양액에 첨가되고, 이는 핵산 또는 miRNA를 캡슐화하는 리포좀을 형성하는 지질 소단위를 포함한다. 그 후 리포좀은 세포막과 융합되고, 그 경우 핵산은 세포질로 도입되게 된다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 miRNA의 수준은 miRNA를 암호화 또는 이의 전사를 조절하는 세포의 게놈 영역을 삭제함으로써, 세포 내에서 상기 miRNA에 대한 miRNA-억제제를 발현함으로써, miRNA-억제제의 존재 하에서 세포를 전기천공함으로써, 또는 세포를 배양하는 배지에 miRNA-억제제 및 형질주입체를 첨가함으로써 감소된다. 대안적으로, miRNA-억제제 및 형질주입체는 버퍼에 추가될 수 있고, 그곳으로 세포가 형질주입을 위하여 전달된다. miRNA 수준의 감소는 다양한 방안으로 수행된다. 예를 들면, miRNA를 암호화하는 내생의 유전자가 세포의 게놈으로부터 삭제될 수 있다. 이는 생체분자가 안정한 세포주에 의해 생산될 때 바람직하다. 그러나, 이 방안은 어떤 경우에는 비가역적이다. 대안적으로, miRNA를 암호화하는 내생의 유전자가 유도성 조절 요소 하에 존재할 수 있고, 이 경우 miRNA의 전사가 활성화되거나 불활성화되는 것을 확인할 수 있다. 이 외에도, 내생의 miRNA는 또한 경쟁적 억제제, 예를 들어 안타고미르 또는 RNA 스폰지를 제공하여 억제될 수 있다. 이는 형질주입시 세포에서 발현될 수 있고 또는 형질주입체와 함께 배양액에 RNA 분자로서 첨가될 수 있다. 단일 방안 대신에, 또한 다른 방안들의 조합이 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 사멸은 세포 내에서 그룹 2로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준의 증가 및/또는 그룹 6으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA 수준의 감소를 통해 세포자멸을 감소시킴으로서 감소된다. 세포 사멸의 두 개의 주요 유형이 알려졌고, 이는 서로 명백하게 다르다. 소위 예정세포사(programmed cell death)로도 지칭되는 세포자멸(apoptosis)은 대개 세포 수준의 과정의 실패의 결과로 시작되는 세포 수준의 형질전환(transformation)의 특유의 순서가 관련된다. 반면에, 괴사(necrosis)는 대개 외부 충격, 예를 들어 세포 수준의 손상으로 시작되는 세포의 충격 흡수(traumatic dissolving)에 의해 개시되는 것으로 설명된다. 세포 유형 및 배양 상태에 따라, 세포 사멸의 일 유형은 다른 것보다 현저하다. 놀랍게도, 발명자들은 세포자멸 및 괴사는 모두의 조절에 관여하는 몇 개의 miRNA를 밝혀내었다. 게다가, 세포자멸의 관점에서 촉진하는 것뿐만이 아니라 억제하는 miRNA가 확인되었다(그룹 2 및 6, 각각). 대조적으로, 괴사에서, 배타적으로 촉진하는 miRNA가 발견되었다(그룹 7). 특정 세포 배양 및 배양 상태에 의존하여, 세포자멸 또는 괴사는 생체분자 생산 동안에 보다 현저하다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 세포 사멸은 그룹 7로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 괴사를 약화시킴으로써 감소될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 세포 배양에서 세포를 번식시키는 단계, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시키는 단계, 및 세포 배양으로부터 생체분자를 분리시키는 단계를 포함하는 세포 내 생체분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 세포 수준의 생산, 증식 및 세포 생존과 같은 특유의 세포 수준의 과정을 특이적으로 조절하는 miRNA가 나타났을 때, 본 발명자는 추가적으로 이들 과정 중 하나 이상에 영향을 미치는 특정 miRNA를 밝혀내었다. miR-99b-3p(서열번호 1)는 생체분자의 세포 수준의 생산을 증가시킬 뿐 아니라, 항-세포자멸 효과를 나타낸다. 유사한 결합된 효과가 miR-767(서열번호 2), miR-30a-5p(서열번호 3), miR-3062-5p(서열번호 4), miR-200a-5p(서열번호 6), miR-135a-1-3p(서열번호 8), miR-743a-5p(서열번호 9) 및 miR-30d-5p(서열번호 20)에서 관찰되었다. miR-291b-3p(서열번호 5) 및 miR-1a-3p(서열번호 7)는 세포 생존 및 세포 증식을 촉진하여 생산된 생체분자의 전체적인 생산량을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, miR-694(서열번호 10), miR-674-3p(서열번호 11), miR-669d-3p(서열번호 12); miR-301b-5p(서열번호 13), miR-212-5p(서열번호 14), miR-203-5p(서열번호 15), miR-200b-5p(서열번호 16), miR-200a-3p(서열번호 17), miR-1968-5p(서열번호 18) 및 miR-150-3p(서열번호 19)는 증식 및 세포 수준의 생산성 모두에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 이들 miRNA의 하나 이상을 증가시키는 것은 생체분자의 생산을 최적화하는 쉽고 효율적인 방안을 제공한다. miRNA를 세포로 도입하기 위하여 여기에서 언급하는 임의의 방법 또는 이들의 조합이 사용된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 생체분자를 생산할 때 그룹 1로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA, 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제, 및 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제의 조합의 용도에 관한 것이다. 세포 수준의 생산을 촉진하는 miRNA, 세포 사멸을 억제하는 miRNA 또는 miRNA-억제제, 세포 증식을 조절하는 miRNA 또는 miRNA-억제제의 조합은 다양한 형태로 제공될 것이다. 예를 들어, miRNA/억제제는 단일 핵산 구조물로 제공될 것이다. 대안적으로, miRNA의 하위집합을 암호화하는 다수의 핵산 분자의 각각은 예를 들어, 그룹 1의 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 제1 발현 벡터, 그룹 2의 miRNA를 암호화하는 제2 발현 벡터, 직접적으로 그룹 5의 miRNA에 대응하는 miRNA-억제제를 암호화하는 제3 발현 벡터가 제공될 것이다. 마찬가지로, miRNA 및 miRNA-억제제는 다수의 pri- 또는 pre-miRNA 분자 또는 miRNA 모방체의 편집을 위해 제공될 것이다. 따라서 miRNA는 단일 구성 또는 각각에서 다양한 miRNA 및/또는 억제제를 포함하는 키트로서 제공될 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-295로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 영역 및/또는 서열번호 296-609로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA에 직접적으로 작용하는 적어도 하나의 억제제를 암호화하는 영역을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다. 서열번호 1-295의 모든 miRNA는 전체 생체분자 생산을 촉진하는 것으로 밝혀졌고, 이에 따라 증가하는 생체분자량은 이들 중 임의의 miRNA를 과발현하는 배양액로부터 수득할 수 있다. 대부분의 miRNA에 대하여, 특유의 기작(즉 세포 증식, 세포 사멸 및 세포 수준의 생산성)에서 특정 효과가 밝혀졌고, 이는 적어도 부분적으로는 전체적인 생체분자 생산에서 관찰되는 증가를 설명한다. 따라서, miRNA 단독 또는 조합은 생산 세포로부터 생체분자 생산을 향상하는 데 적합하다. 추가적으로, 일부 miRNA는 보다 일반적으로 세포의 능력(performance)에 영향을 미치는 것으로 보이고, 이는 세포 생존, 증식 또는 세포 수준의 생산의 현저한 변화 없이 용적의 생산에서 전체적인 증가를 야기한다. 이들 miRNA는 miR-721(서열번호 157), miR-107-3p(서열번호 286), miR-181a-1-3p(서열번호 290) 및 miR-19b-2-5p(서열번호 292)이다. 이는 상기 과정의 하나 또는 둘을 현저하게 변형시키는 대신, 이들 miRNA가 상기 전체 과정 및 아마도 추가적인 세포 신호 기작에 영향을 미침을 나타낸다. 서열번호 1-295의 대부분의 miRNA와 비슷하게, 서열번호 296 내지 609의 각각은 세포 증식 및/또는 세포 사멸에 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 이들 miRNA의 단일 또는 복수의 억제는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하기에 적합하고, 이는 전체적인 생체분자 생산의 증가를 야기한다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 세포 내에서 서열번호 1-295로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시키는 단계 및/또는 세포 내에서 서열번호 296-609로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
추가적으로, 본 발명은 세포에서 생체분자를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 세포 배양액에서 세포를 번식시키는 단계, 세포 내에서 서열번호 1-295로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 세포 내에서 서열번호 296-609로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시키는 단계 및 세포 배양액으로부터 상기 생체분자를 분리시키는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 miRNA 및/또는 miRNA-억제제는 전기천공법 또는 형질주입체와 함께 세포 배양액에 첨가되거나, 또는 바이러스 벡터에 의하여 세포 배양에 도입되는 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하기 위한 그룹 1로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 용도에 관한 것이다. 그룹 1의 miRNA는 세포 수준의 생산을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 전체 배양에 의하여 생산되는 생체분자의 양의 증가를 야기한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포의 세포 사멸을 억제하기 위한 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 3의 miRNA에 직접적으로 작용하는 miRNA-억제제의 용도에 관한 것이다. 그룹 2의 임의의 miRNA를 과발현하고 및/또는 그룹 3의 임의의 miRNA을 억제함으로써 세포 생존이 촉진되고, 이는 생산 세포의 전체 수를 증가시킨다. 이는 차례로 생산되는 전체 생체분자의 양이 증가되도록 한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 배양되는 세포의 증식을 조절하기 위한 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 4 또는 5의 miRNA에 직접적으로 작용하는 miRNA-억제제의 용도에 관한 것이다. 세포 증식은 배양의 상태에 따라 특이적으로 조절될 수 있다. 배양 초기에, 증식은 가능한 빨리 최적의 세포 농도에 도달되도록 강화될 것이다. 이는 그룹 4의 임의의 miRNA의 과발현 및/또는 그룹 5의 임의의 miRNA를 억제함으로써 이루어질 것이다. 대조적으로, 일단 배양이 충분히 이루어지면, 증식의 감소는 생체분자의 생산에 더 큰 능력치(capacity)를 제공한다는 점에서 이점이 있다. 이는 그룹 5의 임의의 miRNA를 과발현 및/또는 그룹 4의 임의의 miRNA를 억제함으로써 이루어질 것이다.
실시예
재료 및 방법
세포 배양
CHO 세포 배양
CHO DG44 세포(Life Technologied, Carlsbad, CA, USA)로부터 얻은 부유성(suspension-adapted) CHO-SEAP 세포는 TubeSpin® 생물반응기 50 튜브(TPP, Trasadingen, Switzerland)에서 4 mM L-글루타민(Lonza) 및 0.1% 항-클럼핑제(clumping agent)(Life Technologies)로 보충된 ProCHO5 세포 배양 배지(Lonza, Vervier, Belgium) 하에서 배양하였다. 안정한 miRNA를 과발현하는 CHO-SEAP 세포를 위한 배양 배지는 추가적으로 10 μg/ml의 퓨로마이신-중염산염(puromycin-dihydrochloride)(InvivoGen, San Diego, CA, USA)으로 보충하였다. 일반적으로 전-배양(pre-cultures)의 세포 농도는 지수적인 성장을 보장하기 위하여 형질주입 하루 전에 ml 당 0.5×106 생존 세포로 조절되고 세포는 오비탈 쉐이커 배양기(Sartorius Stedim, Goettingen, Germany or Kuehner, Birsfelden, Switzerland)에서 140 rpm(25 mm 올빗(orbit))의 교반과 함께 37 ℃, 5 % CO2 및 85 % 습도에서 유지하였다.
인간 세포주 배양
T86G, HCT1 16, SKOV3 및 SGBS는 4 mM 글루타민, 100 μM 피루브산염 및 10 % v/v 소태아혈청(FBS)을 포함하는 고 글루코스 돌베코수정이글배지(DMEM)에서 T25, T75, T175 조직 배양 플라스크 또는 96 웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 세포는 37 ℃, 5 % CO2 및 95 % 습도에서 유지하였다.
헬라(HeLa) 세포의 배양
부착되어 자라는 헬라 DJ 세포(MediGene AG, Planegg/Martinsried, Germany)는 10 % 가열-불활성화된 FBS(Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA) 및 2 mM GlutaMAX®(Life technologies)로 보충된 고 글루코스 돌베코수정이글배지(DMEM)(Life technologies, Carlsbad, CA, USA) 내에서 자랐다. 세포는 T75 또는 T175 조직 배양 플라스크 내에서 배양되었고 37 ℃, 5 % CO2 및 95 % 습도에서 유지하였다.
CHO 부유 세포주의 형질주입(transfection)
miRNA 모방체 또는 작은 간섭 RNAs(siRNAs)의 비-바이러스 전달은 ScreenFect®A(InCella, Eggenstein-Leopoldshafen, Germany)를 사용하여 수행하였다. 제1 및 제2 스크리닝을 위한 소규모 형질주입은 U-바닥 형태의 96-웰 현탁 배양 플레이트(Greiner, Frickenhausen, Germany)에서 수행하였다. 제2 스크리닝을 위하여, 선택된 miRNA 모방체는 다시 형질주입되고 플레이트는 Heraeus® BBD 6220 세포 배양기(Thermo Scientific) 내에 위치하는 미니-오비탈 디지털 쉐이커(Bello, Vineland, USA)에 37℃, 5% CO2, 90% 습도 및 800 rpm으로 교반한 상태로 놔두었다. 표적 검증을 위한 대규모 형질주입은 12-웰 현탁 배양 플레이트(Geiner)에서 수행하였고 플레이트는 140 rpm으로 교반하는 오비탈 쉐이커 배양기에서 배양하였다. 1139개의 다른 miRNA 모방체(Qiagen, Hilden, Germany)를 포함하는 전체의 쥐과의(murine) miRNA 모방체 라이브러리(Sanfer miRBase release 18.0을 기반으로 함)는 형질주입을 위하여 사용되고 모든 형질주입은 생물학적 3회 반복으로 수행되었다. 비-표적 siRNA(AF647-siRNA)(Qiagen)로 표지된 Alexa Fluor®647은 형질주입 효율의 지표로서 각 작동인자(effector) 및 대조군 miRNA과 함께 공동-형질주입시켰다. 기능적인 형질주입 대조군으로서, 항-SEAP siRNA(Quagen), 세포 사멸 대조군 siRNA(제2 스크린) 뿐만 아니라 CHO-특이적 항-증식성(제1 스크린을 위해 사용됨)이 사용되었다. 비-표적성, 스크램블된 miRNA(Qiagen)는 음성 대조군(miR-NT)으로 사용되었다. 플라스미드 DNA(pDNA) 형질주입을 위해, CHO-SEAP 세포는 NEON® 형질주입 시스템(Life Technologies)을 이용하여 핵안으로 도입되었다. 1.0×107 생존 세포를 펠렛화하고(pelleted) 110 μL의 버퍼 R(Life Technologies)로 재현탁한 후 25 μg 내독소-무(free) pDNA를 첨가하였다. 세포는 20 미리초 동안 1650 볼트(volts)에서 일 펄스(pulse)로 핵 도입되었고 10 mL의 신선한 배양 배지에 시드(seed)되었다. 형질주입된 세포는 배지에 10 μg/mL의 퓨로마이신-중염산염을 첨가함으로써 48시간 후 형질주입 항생제 선별을 받았다.
부착 세포주의 형질주입
세포는 96 웰-조직 배양 플레이트 내에서 7.500/cm2(T98G), 10.000/cm2(HCT1 16) 13.000/cm2(SKOV3) 또는 6.000/cm2(SGBS)로 시드되었고 24시간 동안 배양하였다. 형질주입일에, 형질주입 복합체는 0.4 μl ScreenFectA, 4.6 μl 희석 버퍼, 5.0 μl miRNA(1 μM) 및 90 μl DMEM을 조합하여 형성하였고 리포플렉스(lipoplex)를 형성하기 위하여 상온에서 20분 동안 두었다. 배양 배지를 제거하고 100 μl의 형질주입 복합체를 각 웰로 첨가하였다. 6시간이 경과한 후, 또 다른 75 μl의 DMEM을 첨가하였다.
miRNA의 형질주입 및 재조합 아데노-관련 벡터(adeno-associated vector; rAAV)의 제조
형질주입 하루 전, 헬라 DJ 세포(MediGene AG)는 12-웰 마이크로플레이트에서 cm2 당 3.0×104 세포 농도로 10% 가열-불활성화된 FBS 및 2 mM GlutaMAX®로 보충된 고 글루코스 DMEM 내에 시드되었다. 형질주입일에 세포에 LipofectaminTM2000(Life Technologies)을 사용하여 rAAV 생산 플라스미드 및 miRNA 모방체를 공동-형질주입하였다. 각 웰에서 1.8 μL의 LipofectaminTM2000을 100 μL DMEM 배지(Life Technologies)에서 전-희석화시켰다. rAAV 벡터, HAdV 헬퍼 플라스미드(E2A, E4, VARNA 1 및 2) 및 HAdV5 E1 헬퍼 플라스미드를 포함하는 1.5 μg의 플라스미드 DNA는 1:1:1로 100 μL DMEM 배지에서 혼합하였고, 50 nM miRNA 모방체(Qiagen, Hilden, Germany)를 첨가하였다. 리포플렉스는 DNA/miRNA 용액과 함께 희석화된 LipofectaminTM2000와 혼합함으로써 생성되었고, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 10% 열-불활성화된 FBS 및 2 mM의 GlutaMAX®로 보충된 800 μL의 고 글루코스 DMEM를 각 웰에 첨가하였다. 마지막으로 200 μL의 리포플렉스 용액을 각 웰에 연속적으로 첨가하였다.
miRNA 발현 벡터의 클로닝
Cricetulus griseus(cgr)-cgrMIR30a, cgr-MIR30c-1, 및 cgr-MSR30e의 자연적인 miRNA 전구체(pre-miR) 서열을 햄스터 게놈 DNA(gDNA)로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득하였다. 따라서 gDNA는 CHO-SEAP 배양액에서 분리하였다. gDNA로부터 PCR은 두 개의 다른 Thermus aquaticus(Taq) 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)(Fishter Scientific, sT.Leon Rot, Germany) 유래의 두 개의 다른DNA 중합효소의 1:1 혼합물을 사용하여 수행하였다. 다음 PCR 프라이머는 약 100 bp의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 게놈의 측부(franking) 영역을 포함하는 pre-miR 서열을 증폭하기 위하여 사용되었다: cgr-MIR30a(332 bp PCR 조각 길이), 정방향 5'-TTGGATCCAGGGCCTGTATGTGTGAATGA-3'(서열번호 610), 역방향 5'-TTTTGCTAGCACACTTGTGCTTTAGAAGTTGC-3'(서열번호 611) , cgr-MIR30c-1(344 bp PCR 조각 길이), 정방향 5'-TTGGATCCAAAATTACTCAGCCCATGTAGTTG-3'(서열번호 612), 역방향 5'- TTTTGCTAGCTTAGCCAGAGAAGTGCAACC-3'(서열번호 613); cgr-MIR30e(337 bp PCR 조각 길이), 정방향 5'-TTGGATCCATGTGTCGGAGAAGTGGTCATC-3'(서열번호 614), 역방향 5'-TTTTGCTAGCCTCCAAAGGAAGAGAGGCAGTT-3'(서열번호 615). 증폭된 PCR 산물은 이들의 각각의(repective) 말단(ends)에서 상기 PCR 프라이머에 의해 도입된 BamHI/Nhel 제한 효소 자리를 포함한다. 분해된 PCR 조각은 miRNASelectTM pEGP-miR 발현 벡터(Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) BamHI 및 Nhel 제한효소 사이로 Rapid DNA Dephos&Ligation 키트(Roche Diagonistics)를 이용하여 연결하였다. pre-miR 서열의 정확한 병합은 모든 miRNA에 대하여 DNA 시퀀싱(SRD, Bad Homburg, Germany)을 통해 확인하였다. 임의의 pre-miR 서열이 결핍된 miRNASelectTM pEGP-miR-Null 벡터(Cell Biolabs)는 음성 대조군으로 사용되었다.
정량적인 유세포 분석기(quantitative flow cytometry)
세포 수준의 분석을 위하여, 세포 농도, 생존 능력, 괴사 및 형질주입 72시간 후 형질주입 효율을 형질주입된 CHO-SEAP 세포로 분석하였다. 세포는 바이올렛(405 nm), 블루(488 nm) 및 레드(635 nm) 여기(excitation) 레이저를 갖춘 MACSQuant® 분석기(Melteny Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany)를 이용하여 고성능((high-throughput) 정량적인 유세포 분석기로 분석하였다. 40 μL의 3× 염색 용액[15 μg/mL 프로피디움 요오드화물(PI)(Roth, Karlsruhe, Germany), 6 μg/mL Calcein-Violet450-AM(eBioscience, Frankfurt, Germany), 0.5 mM EDTA로 보충된 ProCH05 배지(Lonza)]을 80 μL의 세포 현탁액에 첨가하고 20분 동안 37 ℃, 5% CO2 및 85% 습도에서 배양하였다. 그 후 세포의 수를 세었고 세포 생존은 Calcein-Violet450-AM 염색으로 측정하였다. 괴사성(Necrotic)/늦은 세포자멸성 세포는 PI 익스클루젼(exclusion)으로 검출하고 형질주입 효율은 Alexa Fluor®647 형광으로 살아있는 세포를 분석함으로써 확인하였다.
세포자멸의 분석
형질주입된 세포는 Nicoletti 염색 절차를 이용하여 세포자멸을 분석하였다. 절차 끝에, 부착되어 자라는 세포는 PBS로 세척하고 35 μl 트립신/EDTA-용액을 첨가하여 떼어내었고 반응은 10% v/v FBS를 포함하는 80 μl DMEM을 첨가하여 멈추었다. 세척 단계를 거친 완전한 물질(complete material)을 분석에 사용하였다. 현탁 세포는 직접적으로 염색 과정에 사용되었다. 2n(=Sub-G0/G1 세포)보다 적은 DNA 내용물을 가지는 세포는 세포자멸로 분류하였다. 따라서, 50 μL의 형질주입된 세포 현탁액은 웰 당 100 μL의 배양 배지를 포함하는 새로운 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼고 5분 동안 150×g로 원심분리하였다. 100 μL의 상청액은 SEAP 단백질 정량화를 위해 사용되는 또 다른 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 세포 펠렛(pellet)은 100 μL의 Nicoletti 염색 용액(0.1 % 시트르산 나트륨, 0.05 % 트리톤 X-100, 10 μg/mL PI 및 1 U/μL RNase A로 보충된 1× 인산완충생리식염수(PBS))으로 재현탁되고 어둠속에서 30분 동안 4 ℃에서 배양되었다. 처리된 세포는 MACSQuant® 분석기(Miltenyi Biotech)에서 정량적인 유세포 분석기로 분석하였다.
SEAP 정량화
형질주입된 세포의 배양 상청액에서 SEAP 단백질 수준은 SEAP 리포터 유전자 분석(Roche Diagnositics)을 이용하여 백색 96-웰 비-결합 마이크로플레이트에서 정량화되었다. 원칙적으로, 화학 발광 기질 CSPD(3-(4-메톡시스파이로[1 ,2-디옥세탄-3,2'(5'-클로로)-트리클로로(3.3.1 .1 3,7)데칸]-4-일)페닐인산염)는 SEAP로 탈인산화되어, 477 nm의 최대 파장 빛이 분해되고 방출되는 불안정한 디옥세탄 음이온이 된다. 내생의 알칼린 인산염은 제공된 불활성화 버퍼(Roche Diagnostics)를 이용하여 화학적 불활성화된 후 30분 동안 65℃에서 표본을 배양함으로써 억제되었다. CHO-SEAP 세포주의 높은 SEAP 발현 수준 때문에, 배양 상청액은 신선한 배양 배지에서 1:60으로 전-희석화되었다. 화학 발광은 Spectra Max® M5e 마이크로플레이드 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 CSPD 기질을 첨가한 후에 검출되었다.
qRT-PCR 분석
전체 RNA(작은 RNA<200 bp를 포함)는 제작자가 제공하는 프로토콜에 따라 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. RNA 농도 및 순도는 NanoDrop® 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 UV-분광분석법(spectrometry)으로 확인하였다. 상보적인 DNA(cDNA)는 1 μg의 전체 RNA로부터 miScriptⅡ RT 키트(Qiagen)를 이용하여 합성하였다. RT-PCR은 성숙한 miRNA를 검출하기 위하여 20-1 희석된 cDNA로 miScript SYBR 그린 PCR 키트(Qiagen)를 이용하여 LightCycler® 480(Roche Diagnositics)에서 수행하였다. 다음의 miRNA-특이적 프라이머가 사용되었다: 성숙 miR-30a-5p 정방향 5'-TGTAAACATCCTCGACTGGAAGC-3'(서열번호 616); miR-30b-5p 정방향, 5'-TGTAAACATCCTACACTCAGCT-3'(서열번호 617); miR-30c-5p 정방향, 5'-TGTAAACATCCTACACTCTCAGC-3'(서열번호 618); miR-30d-5p 정방향, 5'-CTTTCAGTCAGATGTTTGCTGC-3'(서열번호 619); miR-30e-5p 정방향, 5'-TGTAAACATCCTTGACTGGAAGC-3'(서열번호 620); miScript 일반적인 프라이머(Universal Primer)(Qiagen)는 각 성숙 miRNA의 역방향 프라이머로 사용되었다; U6 정방향, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'(서열번호 621); U6 역방향, 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'(서열번호 622). 상대적인 성숙한 miRNA 발현 차이는 비교의 C(T) 방법(comparative C(T) method)을 사용하여 측정하였다.
rAAV 벡터 정량화
형질주입 후 72시간 후, 헬라 DJ 세포는 3회의 동결/융해 주기(액체 질소/37 ℃)를 거치고, 세포 잔여물(debris)은 15분 동안 3700×g에서 원심분리하여 제거하였다. AAV 게놈 입자는 AVV-2 전환된 말단 반복부위(ITR; inverted terminal repeats)의 정량화에 기초하여 qRT-PCR로 확인하였다. 숙주세포 및 언팩 DNA의 제거를 위한 크루드 표본의 전처리는 Mayginnes와 동료들(Mayginnes et al., 2006)에 의해 개시된 절차로 수행하였고, 다음의 변화(change)를 수반한다: 표본은 DNaseⅠ처리(Qiagen) 전 DNase 반응 버퍼(22.2 mM Tris/HCl pH 8.0, 2.2 mM MgCl2)로 200배 희석하였고 최종 표본은 추가적으로 MilliQ H2O로 3배 희석시켰다. 1 x 106 AAV 벡터 플라스미드 카피(copies) 및/또는 DNaseI을 포함하는 버퍼 대조군은 동일하게 처리하였다. 반응은 CFX96TM 기구(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Canada)에서 12.5 μL SYBR 그린 마스터 믹스(QIAGEN), 2.5 μL AAV2 ITR 프라이머 믹스(Aurnhammer et al., 2012), 5 μL 물 및 5 μL 주형(전-처리된 표본/대조군, 비-주형 대조군을 위한 물 또는 102 내지 108 플라스미드 카피로부터 표준(standard)의 연속적인 희석)을 포함하는 전체 부피 25 μL에서 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 5분 동안 95℃에서 전-배양, 다음으로 95℃에서 10초 동안 변성(denaturation) 및 60℃에서 30초 동안 어닐링(annealing)/연장(extension)의 39회 반복, 자료 분석은 CFX 매니저 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories Inc.)를 사용하여 수행하였다.
결과
재조합 CHO-SEAP 현탁 세포에서 일시적인 고-함량 miRNA 스크린
본 발명자는 세포 수준의 기능을 개선시키는 miRNA를 확인하기 위하여 1139개의 다른 miRNA 모방체를 사용하여 재조합 CHO-SEAP 현탁 세포주에서 고-함량 마이크로RNA 스크린을 수행하였다. 이에서, 형질주입된 모든 세포는 다양한 세포 수준의 파라미터로 다중 파라메트릭 유세포 분석기-기반 세포 분석을 이용하여 분석하였다. 96-웰 포맷에서 작은 이중-가닥의 RNA의 형질주입 조건은 점차적으로 최적화되었고, 비-표적 대조군 miRNA(miR-NT), CHO-특이적 항-증식 siRNA 뿐만 아니라 SEAP mRNA에 대한 siRNA(항-SEAP siRNA)를 포함하는 다양한 기능적 대조군이 사용되었다. 이미 복합 생산 배지(Fischer et al., 2013) 내에서 자라는 세포로 miRNA 모방체를 효율적 및 기능적으로 전달하는 것으로 알려진 신규의 비-바이러스 형질주입 시약(ScreenFect®A)을 사용하여, >95%의 높은 형질주입률은 낮은 세포독성비(rate)에서 재생 가능하도록 수행될 수 있다. 전달 대조군으로써, 형광-표지된 비-표적 siRNA(AlexaFluor®647-siRNA)는 모든 작동자(effector) 및 대조군 miRNAs/siRNAs 각각과 공동-형질주입되었다. 세포 농도, 생존 능력, 괴사 및 형질주입 효율성은 고성능 정량적인 유세포 측정기로 형질주입 후 72시간에 측정하였다. Nicoletti 염색을 통한 세포자멸성의 세포 사멸 분석은 또한 정량적인 유세포 측정기로 수행하였다. SEAP 단백질 농도는 상업적으로 이용 가능한 SEAP 리포터 분석을 사용하여 결정하였다. 3일 동안의 배양 기간은 miRNA 모방체의 시간-제한적인 일시적인 효과 및 세포 표현형 내 변화 입증 모두를 고려하여 선택되었다. 모든 스크린 플레이트에서 항-증식 siRNA로 형질주입된 세포의 생존 세포 농도(VCD) 내에서 현저한 감소뿐 아니라 항-SEAP siRNA로 형질주입한 세포에서 SEAP 생산성의 현저한 감소는 기능적인 형질주입을 나타낸다(도 1). 게다가, 스파이크-인된(spiked-in) AlexaFluor®(AF) 647-siRNA는 각 웰에서 miRNA 모방체의 흡수를 확인하였다.
자료 표준화는 내부-플레이트 비교를 위해 각 표본 값을 각각의 온-플레이트 대조군(miR-NT)의 평균값으로 표준화하여 수행하였다. 각 해독 파라미터에서 현저한 변화는 Dunnett의 다중 비교 테스트(온-플레이트 miR-NT 대조군에 대하여; p<0.05)와 결합된 분산의 편도 분석(ANOVA)을 적용하여 확인하였다. VCD, 세포자멸, 괴사/늦은 세포자멸, 특이적 및 용적 SEAP 생산성과 같은 중요한 세포 특징을 고려할때 모든 1139 작동인자(effector) miRNAs를 위한 표준화된 평균값이 결정된다. 테스트되는 모든 모방체의 퍼센트로서 통계학적으로 현저한 히트(hits)의 수를 나타내는 케이크 차트는 도 2에 나타내었다. SEAP 생산성 관점에서, 형질주입된 miRNA의 16%의 높은 비율은 SEAP 생산량이 현저하게 증가하였고 72시간이 경과한 후에 상청액에서 최고의 후보자는 두 배 가량의 개선을 나타내었다(도 2A). 현저하게 증가된 세포-특이적 생산성은 심지어 21%의 miRNA에서 검출되었다(도 2B). 그러나, 이는 세포 사멸 유도가 아니라 감소된 세포 농도와 부분적으로 관련이 있다. 특히, 적어도 20%까지 평균 특이적 생산성이 증가된 314개의 miRNA는 또한 형질주입 후 3일 경과시 세포 생존능력이 감소되지 않고 평균 VCD가 69%까지 감소되는 것을 밝혀냈다. 현저하게 높은 생존 세포 농도는 모든 miRNA의 5%에 대하여 확인되었고, 반면 모든 miRNA의 13%에서 세포자멸 비율이 감소되었다(도 2C 및 D). 세포 증식을 촉진하는 miRNA의 비율은 4%의 miRNA 라이브러리에서 miRNA 도입으로 더 높아진 생존 능력을 나타내는 괴사 세포의 수가 감소되었다는 사실과 궤를 같이한다(도 2E).
miR-30 패밀리의 식별된 기능성 스크린 분석
제1 스크린을 통해 얻은 결과를 명확하게 하기 위하여, 본 발명자들은 교반된 배양에서 선택된 miRNA 히트의 하위세트를 일시적으로 형질주입하여 제2 스크린을 수행하였다. 다수-웰 플레이트 내 교반된 배양 모드는 표준 쉐이킹 플라스크 배양과 보다 비교할만하고, 여기서 정적인 배양의 추정되는 산소 한계는 실질적으로 극복된다. miRNA 모방체 농도를 포함하는 96-웰 플레이트의 교반 속도는 점차적으로 최적화되어 활발한 배양 및 현탁액에서 일시적인 형질주입을 가능케 한다. 첫 단계에서, 제1 세포 수준의 스크린에서 유래한 297개의 miRNA 히트는 상기에 언급한 세포 수준의 파라미터와 비슷한 생물학적 과정 중 적어도 하나에 대한 양성적인 효과의 재평가를 위해 선택된다. 이러한 방안은 제1 스크린과 비교하여 대부분의 miRNA의 표현학적 효과를 확인하였고(도 7, 8 및 9), 이는 고-함량 스크리닝 방법의 높은 재현성에 관한 것이다.
양 스크리닝의 결과를 분석함으로써, 전체 miR-30 패밀리(miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30e를 포함)는 명확하게 CHO 세포에서 향상된 SEAP 생산에 기여한다. 모든 miR-30 멤버에서, 가이드 가닥으로 여겨지는 성숙한 5p-가닥이 관찰된 세포 수준의 표현형을 유도한다. 그러나, miR-30 패밀리 중 유일한 3p 가닥인 miR-30c-1-3p 또한 실질적으로 SEAP 생산성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 도 3A는 제1 스크린에서의 모든 6개의 생산성-개선 miR-30 패밀리 멤버에 대한 용적 SEAP 생산성에서 각각의 배수 변화를 나타낸다. 비록 miR-30b-5p에 의해 매개되는 상기 증가가 생물적 3회 반복의 높은 표준 편차 때문에 통계적으로 유의적이지 않으나, 본 발명자들은 더 높은 용적 생산성에 대해 기대하는 명백한 경향성을 위하여 이를 그래프로 포함하였다.
게다가, miR-30 패밀리는 입증 스크린에서 CHO 세포 내 재조합 단백질 발현의 강력한 드라이버로 확실하게 확인될 수 있다(도 3b). 정적인 배양(15 nM)에서 형질주입과 비교하여, miRNA 모방체의 더 많은 비율의 형질주입(50 nM)으로, SEAP 생산성 증가는 농도 의존적 오프-표적 효과의 유도 없이 더 두드러진다. SEAP 생산에서 나타난 뚜렷한 증가는 miR-30 형질주입된 배양에서 세포 농도의 감소를 동반한다(도 3C). 그러나, 생존 능력은 세포가 세포 성장 및 증식을 위한 것보다 실질적으로 향상된 단백질 생산을 위하여 이들의 대부분의 에너지 자원을 사용한다는 가정을 지지하는 것에 의해 부정적인 영향을 받지 않는다(도 3D).
miRNA 패밀리의 특징은 성숙한 miRNA 가닥은 이들의 mRNA 표적과 완벽하게 짝을 이루는 일반적인 miRNA '시드(seed)' 서열을 공유한다는 것이다. 모든 miR-30-5ps의 5' 말단에 7개의 뉴클레오티드를 구성하는 일반적인 '시드' 외에도, 이들은 또한 각각 위치 9 내지 11(UCC), 및 15 내지 17(ACU)에서 뉴클레오티드를 공유한다. miR-30의 전체 22-23 길이의 뉴클레오티드를 고려할 때, 이러한 발견은 이 miRNA 패밀리가 최소 60% 서열 유사성을 공유하고, miR-30a-5p, miR-30d-5p 및 miR-30e-5p는 심지어 >90% 서열 동종성을 공유함을 나타낸다.
각각의 miRNA의 다양한 효과에 대한 통찰력을 얻기 위하여, 일 세포 수준의 파라미터는 다른 것에 대하여 플롯(plot)되고, 이는 세포 공학을 위한 매우 흥미로운 기능적 후보 miRNA의 확인을 가능하게 한다. 끝으로, 단백질 생산 및 생존 세포 농도의 증가, 또는 세포자멸의 감소와 같은 생물학적 과정 수행에 이점이 있는 표현학적 변화가 관찰되었다. miR-30 패밀리의 세부적인 분석은 3개의 miRNA인 miR-30a-5p, miR-30c-1-3p 및 miR-30d-5p이 증가하는 용적 및 특이적 생산성을 모두 증가시키는 조합 효과를 나타내고(도 3E), 및 miR-30a-5p 및 miR-30d-5p 모두는 추가적으로 세포 공학을 위한 매력적인 표적으로서의 가능성이 강조하는 세포자멸 세포의 수가 감소됨을 확인하였다(도 3F).
CHO 세포에서 단백질 생산을 향상하는 miR-30 패밀리의 가능성을 추가적으로 조사하기 위하여, 본 발명자는 재조합 SEAP 생산 증가의 다양한 범위를 나타내는 두개의 miR-30 패밀리 멤버(miR-30a-5p 및 miR-30c-5p)를 선택하고 증가된 배양 규모에서 miRNA 둘 다의 조합뿐만 아니라 이들 각각을 형질주입하여 대규모 실험을 수행하였다. 유사하게, miR-30a-5p 및 miR-30c-5p는 2 mL 배치(batch) 배지 내에서 일시적인 형질주입 후에 용적 및 특이적 SEAP 생산성을 실질적으로 증가시킨다(도 4A). miR-30a-5p 단독을 형질주입한 CHO-SEAP 배양액은 72시간 후에 보다 높은 세포 농도를 나타내는 반면, miR-30c-5p는 감소된 세포 농도를 야기한다(도 4B). 그러나, 생존 능력은 감소된 세포 농도가 세포-특이적 SEAP 생산성을 실질적으로 증가시키기 때문이라는 가정에 부정적인 영향을 받지 않는다. 동일한 농도(각각 25 nM) 내 양 miRNA 종의 공동-형질주입은 miR-30c-5p의 성장-억제 효과를 뒤짚을 수 있고 50 nM의 miR-30c-5p 모방체로 형질주입한 세포와 비교하여 보다 높은 SEAP 역가(titer)를 가지게 된다. 게다가 miR-30a/miR-30c 농도를 50 nM까지 증가시킴으로써(100 nM 전체 miRNA 농도), 생존하는 세포 농도는 miR-NT 형질주입된 대조군 세포와 비교하여 더 증가하고, 50 nM miR-30a-5p 모방체로 형질주입된 세포와 유사한 값을 나타낸다. 이는 miR-30a 및 miR-30c가 추가적인 또는 심지어 시너지 효과를 가질 것이고, 이는 다양한 miRNA의 조합된 안정한 발현에 중요한 암시를 가지는 것이다.
miR-30 패밀리 멤버의 안정한 과발현
miRNA 모방체를 일시적으로 도입하는 결과가 안정한 miRNA 과발현을 나타낼 수 있음을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 3개의 miR-30 패밀리 멤버를 선택하고 CHO-SEAP 부(parental)세포주에 기초하여 안정한 과발현 세포 풀(pool)을 만들었다. 표적 miRNA의 안정한 장기 발현을 위하여, 각각의 전구체 서열이 숙주 세포 게놈으로 병합되어야 한다. 정확한 핵 내 Drosha/DGCR8 가공은 적절한 상류 및 하류측부 영역을 포함하는 내생의(endogenous) pre-miRs의 자연적인 게놈 서열을 요구한다. 본 발명자들은 따라서 약 100bp의 게놈 DNA의 상류 및 하류 측부 영역을 포함하는 MIR30a, MIR30c 및 MIR30e의 내생의 전구체 miRNA 서열을 PCR-증폭하고, 이들을 포유동물 발현 벡터로 아클론하였다(subcloned). pre-miR 서열을 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터의 조절 하에서 녹색 형광 단백질-퓨로마이신(GFP-Puro) 융합 단백질의 상류에 삽입하였다(도 5A). 이러한 특징은 두가지 이점을 제공한다: 첫째, 이는 GFP-형광(형광-활성화된 세포 분류뿐 아니라)을 통하여 양성적으로 형질주입된 세포의 검출을 가능하게 하고, 그리고 두번째로, 이는 배지에 항생제를 추가함으로써 안정적으로 형질주입된 세포를 선별하게 한다. 게다가, EF1α 프로모터는 miRNA 발현뿐 아니라 강한 전이 유전자를 유도하고 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(hCMV) 급 초기(immediate early) 프로모터와 같은 바이러스 프로모터와 비교하여 CHO 세포에서 후생적(epigenetic) 유전자를 침묵을 시키는 경향이 낮음이 보고되어 있다. 결과적으로, 재조합 CHO 세포에서 장기 miRNA 과발현은 성숙한 miRNA -5p 및 -3p 가닥만이 인공적으로 제작된 키메릭 줄기-루프로 병합되는 이전에 개시된 miRNA 발현 방안보다 안정적이고 효율적일 것으로 기대된다.
miR-30 패밀리의 각 멤버를 과발현하는 안정한 세포 풀(pool)은 퓨로마이신 선별에 의해 수행되고 성숙 miRNA의 과발현은 qRT-PCR를 통해 평가되었다(도 5B). 특히, miRNA 과발현의 배수 변화 값은 각각의 성숙 miRNA의 내생적인 수준에 매우 의존적이다. qRT-PCR 분석은 miR-30e-5p가 적당히 발현되는 miR-30a-5p 또는 miR-30c-5p와 비교하여 CHO 세포에서 보다 풍부하고, 이는 안정한 풀 내에 miR-30 과발현에서 관찰되는 차이를 설명하는 것이 가능함을 나타낸다.
안정한 MIR30a, MIR30c 및 MIR30e 과발현 풀을 7일 동안 배치(batch)-배양하였고 부(parental) CHO-SEAP 세포주뿐만 아니라 모의(mock) 대조구 세포(pEGP-MIR-Null)와 비교하였다. 상청액 내 SEAP 단백질 농도의 분석은 CHO-pEGP-MIR30a, CHO-pEGP-MIR30c 및 CHO-pEGP-MIR30e가 대조군 세포에 비하여 현저하게 더 많은 SEAP를 생산함을 확인하였다(도 5C). 용적 생산성에서 관찰된 증가가 세포 수 또는 특이적 생산성의 증가 때문인지 아닌지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 세포 농도 및 생존 능력을 분석하였고 MIR30a 과발현 세포는 부 CHO-SEAP 세포와 비교하여 시딩 후 3일 경과시 더 높은 세포 농도 및 세포 생존에 도달함을 밝혀내었다(도 5D). 결핍된 배양 배지에 의한 영양 공급 감소뿐만 아니라 물질대사 부산물의 축적은 대개 음성 대조군(pEGP-MIR-Null) 및 부 CHO-SEAP 세포의 고정 성장 상태(stationary growth phase)의 시작에 의해 나타난 감소된 증식률과 관계가 있다. MIR30a 과발현 세포가 시딩 후 6일이 경과할 때까지 보다 높은 생존 능력으로 계속적으로 성장한다는 사실은, miR-30a-5p의 일시적인 도입이 세포자멸률을 감소시킨다는 관찰과 함께, MIR30a의 항-세포자멸 기능을 나타낸다.
대조적으로, MIR30c 과발현 풀은 세포 농도에 미세한 감소를 나타내고, 반면 MIR30e 과발현은 배치 배양 동안 세포 농도 및 세포 생존에 큰 영향을 나타내지 않는다. 그러나, 세포-특이적 SEAP 생산성은 실질적으로 MIR30c 및 MIR30e 과발현 세포에서 각각 거의 2배 정도 증가한다(도 5E). 이러한 연결관계에서, 눈에 띠게 향상된 재조합 단백질 생산성은 생존 능력의 이른 감소뿐만 아니라 CHO-pEGP-MIR30c 풀의 감소되는 세포 성장에 대한 하나의 가능성 있는 이유이고, 이는 배지에서 보다 빠른 영양의 소비 때문이다. 게다가, 본 발명자들은 동일한 pre-miR30c 전구체로부터 유래한 양 miR-30c 가닥(5p 및 3p)이 일시적인 스크리닝에서 재조합 단백질 발현을 향상시킴을 관찰하였다(도 3A 및 B). 따라서, 또 다른 가능성 있는 이유는 양 가닥이 MIR30c 과발현의 결과로 보다 풍부해졌기 때문에, 성숙한 miR-30c-5p 및 miR-30c-1-3p가 동시에 작용하여 더 강한 표현형적 효과를 야기하기 때문인 것이 될 수 있다.
놀랍게도, 이들 3개의 miRNA는 동일한 시드 서열을 공유하고 그 외 남은 서열은 오직 적은 뉴클레오타이드만 다름에도 불구하고, 세포 표현형에서의 효과는 현저하게 다양하다. 이는 주어진 mRNA의 표적 mRNA에 대한 특이성 및 이의 생물학적 기능이 오직 시드 서열에 의한 경우보다 전체 miRNA 서열에 의하여 결정됨을 설명한다. miR-30 패밀리의 다양한 기능에 대한 또 다른 이유는 성숙한 서열이 거의 동일하기 때문에, miRNA 전구체 서열이 miRNA 운명에 중요한 역할을 하고 miRNA의 기능을 결정하는 데 관여할 수 있다는 것을 생각해볼 수 있다. 안정한 miR-30 과발현의 결과와 함께 일시적인 miRNA 모방체 형질주입 실험의 효과는 안정한 방식으로 재현되고, 더욱 중요하게 miRNA가 생물의약품 생산 세포의 배양 성과를 개선시키는 매력적인 도구임을 강조한다.
성숙한 miR-30 발현 수준이 정지 성장 상태 동안 상향조절된다.
배치 현탁 세포 배양 생산 과정은 두 개의 상(biphasic) 생산 과정에서 뿐만 아니라 유가배양에서 이용되는 특징의 일반적으로 세포가 그들의 물질대사를 성장에서 증가된 단백질 발현으로 변화시키는 주된 생산 기간으로 여겨지는 고정상(stationary phase)과 함께 다른 상으로 나뉜다. miR-30 패밀리는 이전에 다양한 배양 조건 하에서 뿐만 아니라 다른 CHO 종(strain)에 의하여 발현되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 만약 miR-30 패밀리가 실질적으로 CHO 세포에서 증가된 단백질 생성에 기여한다면, 성숙한 miR-30 분자의 농도가 지수적인 성장동안 고정상(stationary phase)에서 보다 풍부할 것이라는 가정을 하였다. 이러한 가정을 확인하기 위하여, 발명자들은 CHO-SEAP 세포의 3개의 독립적인 배치 배양을 수행하였고, 배양 과정 동안 miR-30a-5p 및 miR-30c-5p 각각의 발현수준을 분석하였다. qRT-PCR 분석은 성숙한 miR-30a 및 miR-30c이 CHO 배치 배양의 고정상 동안에 강하게 상향조절됨을 나타낸다(도 6A), 비록 양 miRNA의 발현 수준이 주로 세포자멸성 세포 사멸에 의한 마지막 단계인 쇠퇴기(decline phase)에서 상향조절되도록 남아있으나, miR-30 패밀리는 일시적(도 6B) 또는 안정한 miR-30 과발현(도 5D) 후에 증가된 세포자멸이 관찰되지 않았기 때문에 세포자멸과 관련이 있는 것이 아닌 듯하다. 따라서 이는 세포가 보다 효율적인 단백질 발현에 대한 물질대사적 이동을 조절하는 내생의 비히클로써 miR-30을 사용하는 것 같다. 느리게 번역되고, 번역 후 변형뿐만 아니라 정확하게 접히는 단백질과 달리, 작은 RNA와 같은 마이크로RNA는 유전자 조절을 위해 전사되고, 즉시 이용 가능하도록 가공되어야 한다. 이는 miRNA를 스마트 내생의 도구로써 세포 표현형에 빠른 변형(transformation)을 수여하는 것으로 분류하는 최근 연구의 가정을 뒷받침한다.
이소성의(ectopic) miR-30 과발현 후 관찰되는 효과가 miR-30 패밀리 멤버의 녹다운에 의해 반전될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 일시적으로 내생의 miR-30c-5p를 억제하고 다음으로 CHO-SEAP 세포의 단백질 생산성 및 생존 세포 농도 결과를 확인하였다. 성숙 miR-30c-5p를 위한 특이적인 안티센스 억제제, 소위 안타고미르 또는 miRNA-억제제로 불리는 것을 사용하여, 본 발명자들은 내생의 miR-30c 발현이 강하게 약화되었음을 밝혀내었다(도 6C). 그러나, 특이적 SEAP 생산성 또는 생존 세포 농도 그 어느 것도 항-miR-30c-5p 안타고미르에 의하여 영향을 받지 않고, 이는 낮아진 내생의 miR-30 수준이 단백질 생산에 따른 반대 효과를 야기하는 것은 아닌 것임을 시사한다(도 6D 및 E).
종양 세포 및 지방선구세포(preadipocyte) 내 세포자멸 유도
상기 개시된 스크리닝에서 확인한 miRNA가 중국 햄스터와 다른 종으로부터 유래된 세포에서 또한 특정 세포 수준의 기능을 발휘하는지 여부를 확인하기 위하여, miR-134-5p, miR-378-5p 및 let-7d-3p를 인간 세포주에서 일시적으로 과발현시켰다. 실험된 세포주는 종양 세포주, 즉 SKOV3(난자 종양세포), T98G(신경교종), HCT 116(대장 종양세포), 및 SGBS 지방선구세포주로 구성되었다. CHO-SEAP 세포처럼, miR-134-5p, miR-378-5p 및 let-7d-3p는 지방전구세포에서 가장 현저한 효과를 가지고 모든 4개의 세포주에서 세포자멸을 유도하였다. 이 결과는 특정 세포 수준의 기능을 가지는 CHO 세포에서 확인한 miRNA가 그들의 특정 효과를 다른 종에서 유래한 세포에서도 유도하기에 적합함을 나타낸다.
재조합 아데노-관련 벡터의 생산(rAAVs; recombinant adeno-associated vectors)
바이러스 생산 플라스미드로 형질주입한 헬라 세포는 추가적인 감염을 위하여 바이러스 입자 생산을 위해 사용될 수 있다. 아데노-관련 벡터(rAAVs)의 생산을 증가시키기 위하여, 헬라 세포는 rAAV 생산 플라스미드 및 miRNA 483 모방체로 공동-형질주입된다. 이는 rAAVs의 세포 수준의 생산의 1.5 내지 2배 증가를 야기한다(도 11).
SEQUENCE LISTING <110> Hochschule Biberach <120> miRNAs enhancing cell productivity <130> T30058 <160> 622 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 1 caagcucgug ucuguggguc cg 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 2 ugcaccaugg uugucugagc a 21 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 3 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 4 ggagaaugua guguuaccgu ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 5 aaagugcauc cauuuuguuu gu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 6 caucuuaccg gacagugcug ga 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 7 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 8 uauagggauu ggagccgugg cg 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 9 uauucagauu ggugccuguc au 22 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 10 cugaaaaugu ugccugaag 19 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 11 cacagcuccc aucucagaac aa 22 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 12 uauacauaca cacccauaua c 21 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 13 gcucugacua gguugcacua cu 22 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 14 accuuggcuc uagacugcuu acu 23 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 15 agugguucuu gacaguucaa ca 22 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 16 caucuuacug ggcagcauug ga 22 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 17 uaacacuguc ugguaacgau gu 22 <210> 18 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 18 ugcagcuguu aaggauggug gacu 24 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 19 cugguacagg ccugggggau ag 22 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 20 uguaaacauc cccgacugga ag 22 <210> 21 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 21 agggacggga cguggugcag uguu 24 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 22 uacucagauu gauaugaguc a 21 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 23 uaucuaguug gaugucaaga ca 22 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 24 gcaugacacc acacugggua ga 22 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 25 ugacuggcac cauucuggau aau 23 <210> 26 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 26 ccccucaggc caccagagcc cgg 23 <210> 27 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 27 ugagagaugc cauucuaugu aga 23 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 28 ugcacugaag gcacacagc 19 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 29 uaaggcuccu uccugugcuu gc 22 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 30 aguuuucccu ucaagucaa 19 <210> 31 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 31 cauauacaua cacacacacg uau 23 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 32 auauacauac acacccauau ac 22 <210> 33 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 33 acauaacaua cacacacaug uau 23 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 34 agcgggcaca gcugugagag cc 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 35 auacaguugu ucaaccaguu ac 22 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 36 uaaccuguug aacaacugaa c 21 <210> 37 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 37 uggcagcugg caagucagaa ugca 24 <210> 38 <211> 23 <212> RNA <213> 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uguaaacauc cuugacugga ag 22 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 65 ggccaaggau gagaacucua a 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 66 uguuggggac auuuuuaaag c 21 <210> 67 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 67 aggcugggaa uauuucagag au 22 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 68 cgcacucugg ucuucccuug cag 23 <210> 69 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 69 guuccugcug aacugagcca gu 22 <210> 70 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 70 ucagcaccag gauauuguug ggg 23 <210> 71 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 71 ucagccacgg cuuaccugga aga 23 <210> 72 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 72 aaagugcuuc ccuuuugugu gu 22 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 73 ggggccuggc ggcgggcgg 19 <210> 74 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 74 agaguugcgu cuggacgucc cg 22 <210> 75 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 75 aaacaugguu ccgucaagca cc 22 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 76 ucugucauuc uguaggccaa u 21 <210> 77 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 77 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90 ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 91 ggugcagugc ugcaucucug g 21 <210> 92 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 92 caucuuccag ugcaguguug ga 22 <210> 93 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 93 acuccauuug uuuugaugau gg 22 <210> 94 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 94 aucaucgucu caaaugaguc uu 22 <210> 95 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 95 acccgucccg uucguccccg ga 22 <210> 96 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 96 ucagcugagg uuccccucug uc 22 <210> 97 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 97 acugcagugc cagcacuucu uac 23 <210> 98 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 98 cuauacaauc uacugucuuu cc 22 <210> 99 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 99 uauaccucag uuuuaucagg ug 22 <210> 100 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 100 ucaguaacaa agauucaucc uu 22 <210> 101 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 101 caacuagacu gugagcuucu ag 22 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 102 cagccucgcu ggcaggcagc u 21 <210> 103 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 103 uucagugaug auuagcuucu ga 22 <210> 104 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 104 cuguaugccc uaaccgcuca gu 22 <210> 105 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 105 auauacauac acacccauau au 22 <210> 106 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 106 ugucuugugu gugcauguuc au 22 <210> 107 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 107 cauacaagga uaauuucuuu uu 22 <210> 108 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 108 uguagaucca uaugccaugg ugug 24 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 109 cuggacgcga gcugggccc 19 <210> 110 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 110 ggcgccgcuc guggggggcc 20 <210> 111 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 111 cugugcuagu gagguggcuc agca 24 <210> 112 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 112 gaguauuguu uccacugccu gg 22 <210> 113 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 113 ugucauaugu gugaugacac uuucu 25 <210> 114 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 114 agucauacac ggcucuccuc uc 22 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 115 ucacuccucc ccucccgucu u 21 <210> 116 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 116 auauacauac acacaccuau ac 22 <210> 117 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 117 gagguuguag uuugugcuuu 20 <210> 118 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 118 cccuaaagua gaaaucacua 20 <210> 119 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 119 uauacaaggg caagcucucu gu 22 <210> 120 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 120 guggauauuc cuucuauguu ua 22 <210> 121 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 121 gcgacgagcc ccucgcacaa ac 22 <210> 122 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 122 caggucacgu cucugcaguu 20 <210> 123 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 123 aauugcacgg uauccaucug ua 22 <210> 124 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 124 uucacaaagc ccauacacuu uc 22 <210> 125 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 125 gguauaacca aagcccgacu gu 22 <210> 126 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 126 gcaaagcaca gggccugcag aga 23 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 127 uucugccucc ccugaaggcu c 21 <210> 128 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 128 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 129 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 129 uggugcuacc gucaggggua ga 22 <210> 130 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 130 ucccacaggc ccagcucaua gc 22 <210> 131 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 131 aaauggugcc cuagugacua ca 22 <210> 132 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 132 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 133 <211> 17 <212> RNA <213> mouse <400> 133 ugagguagua guuagaa 17 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 134 ucagaugucu ucaucugguu g 21 <210> 135 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 135 augcaagggc uggugcgaug gc 22 <210> 136 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 136 ccuucuucuu cuuccugaga ca 22 <210> 137 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 137 ccgcucguac ucccgggggu cc 22 <210> 138 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 138 ccgaucguuc cccuccauac 20 <210> 139 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 139 aaaguucuga gacacuccga cu 22 <210> 140 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 140 acucuuuccc uguugcacua cu 22 <210> 141 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 141 caaaucuuau uugagcaccu gu 22 <210> 142 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 142 gaaugaguaa cugcuagauc cu 22 <210> 143 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 143 uccgaggcuc cccaccacac ccugc 25 <210> 144 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 144 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 145 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 145 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 146 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 147 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 147 cugggagagg guuguuuacu cc 22 <210> 148 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 148 aacccguaga uccgaucuug ug 22 <210> 149 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 149 caagcucguu ucuauggguc u 21 <210> 150 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 150 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 151 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 151 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 152 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 152 gcuuauggcu ucaagcuuuc gg 22 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 153 aagguuacuu guuaguucag g 21 <210> 154 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ucugugauug ag 22 <210> 205 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 205 uccgucucag uuacuuuaua gc 22 <210> 206 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 206 caauguuucc acagugcauc ac 22 <210> 207 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 207 ucucugggcc ugugucuuag gc 22 <210> 208 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 208 aggcaagaug cuggcauagc ug 22 <210> 209 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 209 gcacuccauc ggaggcagac ac 22 <210> 210 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 210 uagggccauc ucauccagau a 21 <210> 211 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 211 acgcucugcu uugcuccccc aga 23 <210> 212 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 212 cucuacuccc ugccccagcc a 21 <210> 213 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 213 uugggaacgg ggugucuuug gga 23 <210> 214 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 214 cugugacaca cccgcuccca g 21 <210> 215 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 215 aagcuuucuc aucugugaca cu 22 <210> 216 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 216 ccuuuaaauu guguccucaa g 21 <210> 217 <211> 22 <212> RNA <213> 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agugccgcag aguuuguagu gu 22 <210> 243 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 243 gggguuccug gggaugggau uu 22 <210> 244 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 244 uaagucacua gugguuccgu u 21 <210> 245 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 245 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 246 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 246 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 247 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 247 caucaguucc uaaugcauug ccu 23 <210> 248 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 248 gcaaggacag caaagggggg c 21 <210> 249 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 249 aagcuuuuug cucgcguuau gu 22 <210> 250 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 250 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 251 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 251 cgucuuaccc agcaguguuu gg 22 <210> 252 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 252 ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23 <210> 253 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 253 ucggcaacaa gaaacugccu ga 22 <210> 254 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 254 aagggagcug gcucaggaga gaguc 25 <210> 255 <211> 23 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mouse <400> 381 cauucucguu uccuucccu 19 <210> 382 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 382 agagaaaccc ugucucaaaa aa 22 <210> 383 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 383 cagucaugcc gcuugccuac g 21 <210> 384 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 384 cgacgagggc cggucggucg c 21 <210> 385 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 385 aaugcacccg ggcaaggauu ug 22 <210> 386 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 386 auugggaaca uuuugcaugc au 22 <210> 387 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 387 cgucaacacu ugcugguuuu cu 22 <210> 388 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 388 cuuccgcccg gccggguguc g 21 <210> 389 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 389 uggugcggaa agggcccaca gu 22 <210> 390 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 390 gguuguauua ucauuguccg ag 22 <210> 391 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 391 accaggaggc ugaggucccu 20 <210> 392 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 392 uuugugaccu gguccacua 19 <210> 393 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 393 ccagcuggga agaaccagug gc 22 <210> 394 <211> 21 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<210> 483 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 483 uucacuggag uuuguuucag u 21 <210> 484 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 484 ugaauauaca cacacuuaca c 21 <210> 485 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 485 ugcggccggu gcucagucgg c 21 <210> 486 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 486 gcacugagcu agcucucccu cc 22 <210> 487 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 487 gagcauugca ugcugggaca u 21 <210> 488 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 488 cuggcugggg aaaaugacug g 21 <210> 489 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 489 auaagguaga aagcacuaaa 20 <210> 490 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 490 gggcuggaga gauggcucag 20 <210> 491 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 491 ucucuccagc ccccauaaua ag 22 <210> 492 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 492 uguugcggac caggggaauc cga 23 <210> 493 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 493 aagguuaggc cagccuggu 19 <210> 494 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 494 uuuggggcug uggugccacc agc 23 <210> 495 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 495 agcuugugau gagacaucuc c 21 <210> 496 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 496 acuccugcau gacgccguuc cc 22 <210> 497 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 497 ugucucagaa aacaaccaag ga 22 <210> 498 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 498 ugcccugucu guucugccca cag 23 <210> 499 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 499 aacuugugau gaggugagac ag 22 <210> 500 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 500 caggcggccu cagcucucac u 21 <210> 501 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 501 auggucacag uggacaucaa cc 22 <210> 502 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 502 ucuugggaca uaguguaagg ca 22 <210> 503 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 503 cagcucaugg agaccuaggu gg 22 <210> 504 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 504 aguugugugu gcauguucau gucu 24 <210> 505 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 505 ugaugugugu guacauguac au 22 <210> 506 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 506 caggcuucug gcuauauucc 20 <210> 507 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 507 uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23 <210> 508 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 508 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 509 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 509 uaaucucagc uggcaacugu ga 22 <210> 510 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 510 gcagcagggu gaaacugaca ca 22 <210> 511 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 511 acugcccuaa gugcuccuuc ug 22 <210> 512 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 512 ugugugugua cauguacaug uga 23 <210> 513 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 513 auaagugugu gcauguauau gu 22 <210> 514 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 514 agucccagga ugcacugcag cuuuu 25 <210> 515 <211> 26 <212> RNA <213> mouse <400> 515 uggguuaaag gauuuaccug aggcca 26 <210> 516 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 516 auaaagcuag auaaccgaaa gu 22 <210> 517 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 517 acuccauuug uuuugaugau gg 22 <210> 518 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 518 uuaaugcuaa uugugauagg ggu 23 <210> 519 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 519 aacuggccua caaaguccca gu 22 <210> 520 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 520 uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 521 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 521 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 522 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 522 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 523 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 523 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 524 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 524 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 525 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 525 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 526 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 526 aaaagcuggg uugagagggc ga 22 <210> 527 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 527 ugguagacua uggaacguag g 21 <210> 528 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 528 uagguaguuu ccuguuguug gg 22 <210> 529 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 529 ucaggcucag uccccucccg au 22 <210> 530 <211> 16 <212> RNA <213> mouse <400> 530 augguggcac ggaguc 16 <210> 531 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 531 cccagauaau agcacucuca a 21 <210> 532 <211> 18 <212> RNA <213> mouse <400> 532 gcgugugcuu gcuguggg 18 <210> 533 <211> 18 <212> RNA <213> mouse <400> 533 aucucgcugg ggccucca 18 <210> 534 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 534 aacauccugg uccuguggag a 21 <210> 535 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 535 ugcacugaag gcacacagc 19 <210> 536 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 536 aauccuuugu cccuggguga aa 22 <210> 537 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 537 agcgggcaca gcugugagag cc 22 <210> 538 <211> 19 <212> RNA <213> mouse <400> 538 ggugcucaca uguccuccu 19 <210> 539 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 539 ugugaguugu uccucaccug ga 22 <210> 540 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 540 auuccuggaa auacuguucu ug 22 <210> 541 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 541 acucaaaaug gaggcccuau cu 22 <210> 542 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 542 uaugugggac gguaaaccgc uu 22 <210> 543 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 543 acuuaaacgu gguuguacuu gc 22 <210> 544 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 544 ucucugggcc ugugucuuag gc 22 <210> 545 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 545 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 546 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 546 uggagacgcg gcccuguugg ag 22 <210> 547 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 547 aacacaccug uucaaggauu ca 22 <210> 548 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 548 agguuacccg agcaacuuug cau 23 <210> 549 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 549 uccgguucuc agggcuccac c 21 <210> 550 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 550 aacugugucu uuucugaaua ga 22 <210> 551 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 551 auguaugugu gcauguacau gu 22 <210> 552 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 552 ugugugcaug ugcuugugug ua 22 <210> 553 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 553 uaagugcgcg cauguauaug cg 22 <210> 554 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 554 auguauaaau guauacacac 20 <210> 555 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 555 ugaacuauug caguagccuc cu 22 <210> 556 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 556 acuugugugu gcauguauau gu 22 <210> 557 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 557 ugucuugugu gugcauguuc au 22 <210> 558 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 558 uaggacacau ggucuacuuc u 21 <210> 559 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 559 agggagaugc ugguacagag gcuu 24 <210> 560 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 560 ugggaaaguu cucaggcuuc ug 22 <210> 561 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 561 ugggacgaga ucaugaggcc uuc 23 <210> 562 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 562 aagggagcug gcucaggaga gaguc 25 <210> 563 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 563 acgcccuucc cccccuucuu ca 22 <210> 564 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 564 uuccugucag ccgugggugc c 21 <210> 565 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 565 agucaggcug cuggcuauac acca 24 <210> 566 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 566 ccauagcaca gaagcacucc ca 22 <210> 567 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 567 cagugggccg ugaaagguag cc 22 <210> 568 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 568 ucaacaaaau cacugaugcu gg 22 <210> 569 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 569 guuccugcug aacugagcca gu 22 <210> 570 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 570 auauacauac acacccauau ac 22 <210> 571 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 571 uguggacacc gugggagguu gg 22 <210> 572 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 572 cugugacaca cccgcuccca g 21 <210> 573 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 573 agucaggcuc cuggcaggag u 21 <210> 574 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 574 cucuacuccc ugccccagcc a 21 <210> 575 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 575 acgcucugcu uugcuccccc aga 23 <210> 576 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 576 cggggcagcu caguacagga 20 <210> 577 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 577 acauagaaaa ggcagucugc a 21 <210> 578 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 578 gcucuuuuca cauugugcua cu 22 <210> 579 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 579 aaccguggcu uucgauuguu ac 22 <210> 580 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 580 aggcuacaac acaggacccg gg 22 <210> 581 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 581 cuguacagcc uccuagcuuu c 21 <210> 582 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 582 ggucaagagg cgccugggaa c 21 <210> 583 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 583 ucugucauuc uguaggccaa u 21 <210> 584 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 584 uggucgacca gcuggaaagu aau 23 <210> 585 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 585 ucaucacgug gugacgcaac au 22 <210> 586 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 586 ccccucaggc caccagagcc cgg 23 <210> 587 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 587 caaaccacac ugugguguua g 21 <210> 588 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 588 uaaggcuccu uccugugcuu gc 22 <210> 589 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 589 ugacuggcac cauucuggau aau 23 <210> 590 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 590 cggccccacg caccagggua ag 22 <210> 591 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 591 agggagagca gggcaggguu uc 22 <210> 592 <211> 25 <212> RNA <213> mouse <400> 592 ugugcaugug uguauaguug ugugc 25 <210> 593 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 593 ugugugugug ugugugugug 20 <210> 594 <211> 20 <212> RNA <213> mouse <400> 594 ugguagaccg gugacguaca 20 <210> 595 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 595 guuacauggu gaagcccagu u 21 <210> 596 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 596 aggucuguag cucaguuggc aga 23 <210> 597 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 597 acuggagacg gaagcugcaa ga 22 <210> 598 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 598 uuggcagaaa gggcagcugu g 21 <210> 599 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 599 ucugggcaga gcugcaggag aga 23 <210> 600 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 600 guaagugagg gcaagccuuc ugg 23 <210> 601 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 601 aggagguccu ggggccgccc uga 23 <210> 602 <211> 21 <212> RNA <213> mouse <400> 602 ugggcccucc agaccucaug c 21 <210> 603 <211> 24 <212> RNA <213> mouse <400> 603 uggcagcugg caagucagaa ugca 24 <210> 604 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 604 cuggcgccaa cugugaccac ug 22 <210> 605 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 605 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 606 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 606 gugccuacug agcugaaaca gu 22 <210> 607 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 607 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 608 <211> 22 <212> RNA <213> mouse <400> 608 gaggaacuag ccuucucuca gc 22 <210> 609 <211> 23 <212> RNA <213> mouse <400> 609 uggaagacuu gugauuuugu ugu 23 <210> 610 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 610 ttggatccag ggcctgtatg tgtgaatga 29 <210> 611 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 611 ttttgctagc acacttgtgc tttagaagtt gc 32 <210> 612 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 612 ttggatccaa aattactcag cccatgtagt tg 32 <210> 613 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 613 ttttgctagc ttagccagag aagtgcaacc 30 <210> 614 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 614 ttggatccat gtgtcggaga agtggtcatc 30 <210> 615 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 615 ttttgctagc ctccaaagga agagaggcag tt 32 <210> 616 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 616 tgtaaacatc ctcgactgga agc 23 <210> 617 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 617 tgtaaacatc ctacactcag ct 22 <210> 618 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 618 tgtaaacatc ctacactctc agc 23 <210> 619 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 619 ctttcagtca gatgtttgct gc 22 <210> 620 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 620 tgtaaacatc cttgactgga agc 23 <210> 621 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 621 ctcgcttcgg cagcaca 17 <210> 622 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 622 aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (15)

  1. 적어도 두 개의 다른 영역(region)을 포함하는 핵산 구조물(nucleic acid construct)로서, 상기 영역은 다음으로부터 선택되는 것이고,
    - 세포에서 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 적어도 하나의 miRNA을 암호화하는 제1 영역으로, 상기 miRNA는 그룹 1으로부터 선택되는 것임,
    - 세포 사멸을 억제하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제2 영역으로, 상기 miRNA는 그룹 2로부터 선택되는 것이고 상기 miRNA-억제제는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 것임, 및
    - 세포 증식을 조절하는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 miRNA-억제제를 암호화하는 제3 영역으로, 상기 miRNA는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 것이고 상기 miRNA-억제제는 그룹 4 또는 5로부터 선택된 miRNA를 억제하는 것임,
    상기 그룹 1은 서열번호 69, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고;
    상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있고;
    상기 그룹 3은 서열번호 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고,
    상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있고;
    및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606로 구성되어 있는 것인, 핵산 구조물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 영역은 그룹 9로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 것이고, 및/또는 상기 제2 영역은 그룹 10으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 11로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 miRNA-억제제를 암호화하는 것이고, 및/또는 상기 제3 영역은 그룹 12 또는 13으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 12 또는 13으로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 miRNA-억제제를 암호화하는 것으로,
    상기 그룹 9는 서열번호 1, 3, 6, 8, 10, 29, 39, 40, 47, 49, 51, 55, 91, 103, 115, 132, 137, 171, 211 및 294로 구성되는 것이고; 그룹 10은 서열번호 3, 7, 20, 54, 59, 73, 94, 145, 159, 175, 176, 178, 179, 199, 206, 248, 251, 252, 266 및 272로 구성되는 것이며; 그룹 11은 서열번호 297, 305, 307, 311, 312, 313, 321, 330, 331, 335, 336, 340, 345, 351, 359, 405, 412, 458, 510 및 608로 구성되어 있는 것이고; 그룹 12는 서열번호 5, 7, 22, 30, 35, 43, 68, 72, 78, 84, 96, 146, 148, 160, 173, 177, 198, 202, 232, 234, 244, 267 및 283으로 구성되어 있는 것이며; 및 그룹 13은 서열번호 517, 523, 526, 529, 531, 533, 537, 548, 550, 558, 560, 561, 563, 566, 567, 571, 575, 577, 583, 591, 600, 601 및 604로 구성되어 있는 것인, 핵산 구조물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 적어도 두 개의 다른 영역은 다른 프로모터에 의해 조절되고, 바람직하게는 적어도 하나의 프로모터가 유도성(inducible) 또는 억제성(inhibitable)인 것인, 핵산 구조물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 항에 있어서,
    상기 miRNA 억제제는 안타고미르(antagomir), miRNA 스폰지 또는 miRNA 디코이(decoy)인 것인, 핵산 구조물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 항에 있어서,
    상기 생체분자는 생물의약품이고, 바람직하게는 재조합 분자이고, 보다 바람직하게는 재조합 단백질 또는 재조합 바이러스인 것인, 핵산 구조물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 항에 있어서,
    상기 핵산 구조물은 발현 벡터(expression vector), 에피좀 벡터(episomal vector) 또는 바이러스 벡터(viral vector)인 것인, 핵산 구조물.
  7. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 항에 따른 구조물을 포함하는 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 구조물은 세포의 게놈으로 병합되는(integrated) 것인, 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    그룹 1, 2 또는 4로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 세포의 게놈의 영역은 증폭되고 및/또는 그룹 3 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 암호화하는 세포의 게놈의 영역은 삭제되거나 침묵화되는(silenced) 것인, 세포.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 안정한(stable) 세포주 세포인 것인, 세포.
  11. 다음으로부터 선택되는 적어도 두 단계를 포함하는 생체 외에서 배양되는 세포에 의해 생산되는 생체분자의 생산량을 증가시키는 방법으로서, 상기 단계는
    - 세포에서 그룹 1로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시켜 생체분자의 세포 수준의 생산을 자극하는 단계,
    - 세포에서 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 3으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 세포 사멸을 감소시키는 단계, 및
    - 세포에서 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 감소시켜 세포의 증식을 조절하는 단계이고,
    상기 그룹 1은 서열번호 69, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고;
    상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있으며;
    상기 그룹 3은 서열번호 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고;
    상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있으며,
    및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606으로 구성되어 있는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 miRNA의 수준은 세포 내에서 miRNA를 과발현함으로써, miRNA 존재하에서 세포를 전기천공(electroporating)함으로써, 또는 세포를 배양하는 배지에 miRNA 및 형질주입체(transfectant)를 첨가함으로써 증가된 것인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 miRNA의 수준은 miRNA를 암호화 또는 이의 전사를 조절하는 세포의 게놈 영역을 삭제함으로써, 세포 내에서 상기 miRNA에 대한 miRNA-억제제를 발현함으로써, miRNA-억제제의 존재 하에서 세포를 전기천공함으로써, 또는 세포를 배양하는 배지에 miRNA-억제제 및 형질주입체를 첨가함으로써 감소된 것인, 방법.
  14. 다음의 단계를 포함하는 세포 내에서 생체분자를 생산하는 방법으로서, 상기 단계는
    - 세포 배양에서 세포를 번식(propagate)시키는 단계,
    - 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20으로 구성되어 있는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 수준을 증가시키는 단계, 및
    - 세포 배양액으로부터 생체분자를 분리시키는 단계인 것인, 방법.
  15. 세포 내에서 생체분자를 생산할 때의 그룹 1로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA, 그룹 2로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 3으로부터 선택된 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제, 및 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA 및/또는 그룹 4 또는 5로부터 선택되는 miRNA를 억제하는 적어도 하나의 miRNA-억제제의 조합의 용도로서, 상기 그룹 1은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 34, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 86, 88, 90, 91, 93, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 128, 130, 132, 134, 136, 137, 138, 141, 142, 143, 147, 151, 152, 155, 158, 163, 165, 171, 174, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 201, 203, 207, 211, 212, 214, 217, 222, 223, 228, 230, 233, 238, 239, 240, 254, 255, 269, 276, 278, 279, 285, 및 294로 구성되어 있고;
    상기 그룹 2는 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 20, 52, 98, 5, 7, 24, 31, 33, 50, 54, 59, 60, 61, 64, 68, 71, 73, 74, 79, 85, 87, 89, 92, 94, 95 97, 145, 153, 154, 156, 159, 161, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 184, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 204, 205, 206, 208, 209, 210, 213, 216, 219, 220, 221, 224, 225, 226, 227, 229, 231, 236, 237, 241, 242, 243, 245, 247, 248, 251, 252, 253, 256, 257, 258, 259, 260, 262, 265, 266, 268, 271, 272, 273, 274, 277, 280, 282, 284, 289, 293, 및 295로 구성되어 있으며;
    상기 그룹 3은 서열번호 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 605, 607, 608, 및 609로 구성되어 있고;
    상기 그룹 4는 서열번호 5, 7, 68, 79, 94, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 30, 35, 36, 38, 43, 65, 72, 78, 84, 96, 105, 107, 108, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 131, 133, 135, 139, 140, 144, 146, 148, 149, 150, 160, 162, 164, 173, 177, 187, 189, 193, 198, 202, 215, 218, 232, 234, 235, 244, 246, 249, 250, 261, 263, 264, 267, 270, 275, 281, 283, 287, 288, 및 291로 구성되어 있으며;
    및 상기 그룹 5는 서열번호 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 및 606으로 구성되어 있는 것인, 용도.
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