CN104031916A - 新型RNAi前体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效引发RNAi的新型RNAi前体分子及其制备方法和应用。所述RNAi前体从5′端到3′端依次为：长1nt的5′端未配对区域；长15nt-17nt的5′端配对区域；长3nt-9nt的顶端环区域；长15nt-17nt的3′端配对区域，所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域；长1nt-6nt的3′端未配对区域；以及任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，所述RNAi前体产生的siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。本发明RNAi前体加工生成单链siRNA的效率显著提高，对靶基因的抑制效率更高；脱靶作用更弱；毒性低。

Description

新型RNAi前体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及新型的RNAi前体及其制备和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)介导的RNA降解现象，最初在秀丽线虫中被发现，此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，Craig Mello和Andrew Fire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wet age-related macular degeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(Hepatitis B)、实体瘤(solid tumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychia congenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。

RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的shRNA(short hairpin RNA)。shRNA被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。这种基于RNA聚合酶Ⅲ的shRNA表达载体转录效率高，且能在大多数种类的组织细胞中表达。构建成病毒载体，比如慢病毒和腺病毒载体等后，可以用于感染原代细胞等用普通方法难以转染的细胞，从而达到沉默靶基因的目的。因此，shRNA载体技术得到广泛应用，有多个公司开发了相应的shRNA载体用于商业化应用，这是通常所说的第一代RNAi载体技术。

RNAi已经成为大多数生物和医学实验室日常都需要使用的技术，但目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括：(1)效率不高。往往需要设计5个shRNA或siRNA才能保证有1-2个能对靶基因达到70％以上的抑制效果。(2)脱靶作用(off-target)严重。由于siRNA可以通过与mRNA部分互补配对(类似miRNA的作用方式)，从而非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。这种作用方式不只局限于Ago2蛋白，其它不具有切割活性的Argonaute蛋白，例如哺乳动物中的Ago1、3、4，也可以引起脱靶作用，并且siRNA中除了发挥功能的guide strand(引导链)以外，另一条互补链(称为passenger strand，过客链)也会产生脱靶作用。(3)对细胞内源miRNA具有较强的非特异性竞争作用。由于siRNA在加工成熟以及行使功能时，需要利用参与miRNA途径的蛋白因子，比如Dicer，exportin-5以及Ago2等，所以必然会对内源的miRNA产生竞争，影响内源miRNA的正常加工和功能。研究表明，长期高表达shRNA会对成年小鼠肝脏造成损伤并致死【1】。

综上所述，本领域急需毒副作用低，对靶基因的抑制效率高以及产生成熟siRNA效率高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以引发RNA干扰（RNAi）的新型RNAi前体分子（saRNA，Single-stranded Ago2-processed interfering RNA）及其制备方法和应用，所述RNAi前体对靶基因的抑制效率更高、脱靶作用更弱、毒性低，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。

在第一方面，本发明提供一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端未配对区域，所述5′端未配对区域长度为1nt；

(b)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度为15nt-17nt；

(c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt-9nt；

(d)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；

(e)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；以及

(f)任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，其中，

所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。

在优选的实施方式中，所述siRNA的核苷酸序列位于所述双链区域和顶端环区域的第1到第22位之间。

在优选的实施方式中，所述siRNA的长度为22nt-30nt。

在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt-6nt。

在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。

在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体包含与3′端未配对区域相连的3′端核酶区。

在另一优选的实施方式中，所述核酶选自：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶等；优选地，所述核酶是HDV核酶。

在优选的实施方式中，所述RNAi前体由Ago2选择性加工产生成熟的siRNA。

在优选的实施方式中，所述RNAi前体是化学合成的。

在第二方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明第一方面所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本发明第一方面所述的RNAi前体。

在第三方面，本发明提供一种构建物，所述构建物包含本发明第二方面所述的表达盒。

在第四方面，本发明提供一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物。

在第四方面，本发明提供一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

在优选的实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。

在优选的实施方式中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。

在第五方面，本发明提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞。

在第六方面，本发明提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

2)适合将1)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

在优选的实施方式中，所述组合物还包含Ago2蛋白。

在第七方面，本发明提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

在第八方面，本发明提供本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。

在第九方面，本发明提供本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。

在第十方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)本发明第一方面所述的RNAi前体或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

b)药学上可接受的载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了传统shRNA和本发明saRNA的结构特征及其差异。

图2显示了用于检测不同RNAi前体对靶基因沉默效率的报告基因系统。

图3：(a)显示了荧光素酶报告基因实验检测RNAi前体双链区长度对siRNA的表达和抑制活性的影响；(b)显示了Northern blot检测不同双链区长度的siRNA前体(13bp-23bp)产生siRNA的量及其长度；(c)显示了荧光素酶报告基因实验检测不同大小的顶端环对siRNA表达和抑制活性的影响；(d)显示了Northern blot检测不同大小顶端环的siRNA前体(3nt-9nt)产生siRNA的量。

图4：显示了Northern blot检测Ago2基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)中，RNAi前体双链区长度对siRNA表达的影响。

图5：(a)显示了化学合成的双链siRNA（双链siGP）、shRNA（shGP）以及saRNA（saGP）结构示意图；(b、c)显示了报告基因实验以及Northern blot检测化学合成的双链siGP、shGP以及saGP在细胞内的加工情况。

图6：(a)显示了荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA和saRNA表达和抑制活性的影响；(b)显示了Northern blot检测HDV核酶对shRNA和saRNA加工产生成熟单链siRNA效率的影响。

图7：(a、b)显示了荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA和saRNA表达和抑制活性的影响；(c、d)显示了Western blot检测shRNA以及saRNA在HEK293细胞中沉默内源基因laminC和p53的效果；(e、f)显示了Northern blot检测细胞内用传统shRNA和所述新型saRNA载体表达siRNA（siLC和sip53）的效率和加工情况。

图8：(a、b)显示了免疫沉淀(IP)过表达的Ago1、2、3并检测其与shRNA和saRNA及其加工产物的结合情况；(c、d)显示了免疫沉淀(IP)细胞内源的Ago1、2并检测其与shRNA和saRNA及其加工产物的结合情况。

图9显示了比较传统shRNA与带有核酶的saRNA（saRNA-RZ）的脱靶作用(分别针对siGP、siLC以及sip53三个siRNA)的报告基因实验结果。

图10显示了shRNA和saRNA中passenger strand产生的脱靶作用的报告基因实验结果。

图11：(a)显示了shRNA和saRNA对miRNA加工和功能的影响；(b)显示了用小RNA深度测序方法检测saRNA-RZ对细胞内源miRNA表达谱的影响。

图12：(a)显示了saRNA表达盒示意图；(b)显示了saRNA及其表达盒应用于慢病毒载体的示意图。

图13显示了Western blot检测shRNA以及saRNA慢病毒表达载体对内源p53基因的沉默效果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现了具有特殊结构的RNAi前体，与传统的shRNA相比具有不同的加工成熟和作用机制，对靶基因具有更高的抑制效率；脱靶作用更弱；毒副作用低，从而能更好地应用于科学研究和疾病治疗。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解同源mRNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional genesilencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。

本文所用的术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体（比如dsRNA、shRNA等）加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

本文所用的术语“RNAi前体”是指可以在哺乳动物细胞中加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer、Ago2或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。类似地，本文所用的术语“表达盒”是指包含本发明RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的RNAi前体；而本文所用的术语“构建物”是包含所述表达盒的构建物。

本文所用的术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ（RNA polymeraseⅢ）启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer和Ago2等蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。然而，在动物整体水平对shRNA毒性的研究表明，长期高表达shRNA会对成年小鼠肝脏造成损伤，导致小鼠死亡。目前认为造成毒性的主要原因是由于shRNA在加工成熟以及行使功能时需要利用miRNA途径的蛋白因子，如Dicer和exportin-5(参与将分子输送出细胞核的蛋白因子)等。过量shRNA会对细胞内源miRNA的加工和功能产生非特异性竞争作用，造成毒性。从而为基于shRNA的RNAi技术在科研和基因疗法的开发前景蒙上了阴影。

本文所用的术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

本文所用的术语“核酶(ribozyme)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指具有催化活性的RNA分子，即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA、有的能够切割DNA，有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。

本领域技术人员鉴于本发明的教导，不难理解，本发明可利用各种核酶，包括但不限于，HDV核酶、发夹状核酶（hairpin ribozyme）、锤头状核酶（hammerhead ribozyme）等。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该RNAi前体的核苷酸序列都可以加在该RNAi前体的5′或3′端。

saRNA

本发明提供一种具有茎环结构的RNAi前体，saRNA(Single-strandedAgo2-processed interfering RNA)。发明人发现本发明saRNA生成的单链siRNA对靶基因的单位分子抑制效率远远高于现有技术的shRNA，而脱靶作用和细胞毒性显著低于现有技术的shRNA。本发明的saRNA由RNA聚合酶III(RNApolymerase III，简称pol III)转录产生或由化学方法合成，直接被细胞内的Ago2选择性加工产生成熟的单链siRNA，而不依赖于Dicer蛋白。

本发明的saRNA从5′端到3′端依次具有以下区域：5′端未配对区域，5′端配对区域，顶端环区域、3′端配对区域，3′端未配对区域以及与3′端未配对区域相连的任选的3′端核酶区；其中，所述5′端未配对区域长度为1nt；所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；所述顶端环区域长度为3nt-9nt；所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；与靶基因序列互补配对的核苷酸序列位于saRNA双链区和顶端环的第1到第22位之间。

在优选的实施方式中，本发明saRNA中顶端环长度为4nt-6nt，更优选4nt。

此外，本领域技术人员应该明白，本文所述的的配对包括核苷酸碱基的G:C、C:G、A:U和U:A配对，还包括G:U和U:G配对。

除了单位分子抑制效率比传统的shRNA高，本发明saRNA的脱靶作用(off-target)比shRNA低。本文所用的术语“脱靶作用”是指siRNA对与其序列部分互补配对的mRNA的表达产生抑制作用的现象，其作用机制与miRNA通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达的机制相类似【2】。saRNA脱靶作用较小原因之一是只有具备RNaseIII核酸内切酶活性的Ago2蛋白(即RNAi中发挥沉默功能的主要蛋白)才能对saRNA进行加工并产生具有功能的单链siRNA，而没有RNaseIII核酸内切酶活性的Ago1、Ago3和Ago4蛋白不能产生成熟的单链siRNA，也就不会产生由Ago1、Ago3和Ago4导致的脱靶作用；而shRNA由Dicer加工后产生的siRNA可以同时与Ago1、Ago2、Ago3和Ago4蛋白结合，所有这四种Ago蛋白都会产生脱靶作用。发明人在HEK293细胞中同时过表达传统的shRNA（shGP）或带有核酶的saRNA（saGP-RZ）以及带有flag标签的Ago1、Ago2和Ago3蛋白(细胞中Ago4表达量很低)，并通过flag抗体免疫共沉淀富集Ago蛋白，然后通过Northern blot检测进入不同Ago蛋白的小RNA种类。实验结果显示，shGP加工产生的siRNA既能和Ago2结合，也能够和Ago1和Ago3结合；saGP-RZ被核酶切割后产生的siRNA前体形式(未被加工的RNAi前体没有抑制活性)可以与Ago1、Ago2和Ago3结合，但成熟的siRNA产物只能在Ago2中检测到(图8a、8b)。针对细胞内源的Ago1和Ago2的免疫共沉淀实验也显示相同的结合情况(图8c、8d)。

本文所用的术语“passenger strand(过客链)”是指在双链siRNA中与有功能的单链siRNA(与靶基因序列完全互补配对，也称为guide strand，引导链)互补配对的另一条单链RNA。passenger strand不参与沉默靶基因，但同样可以结合Ago蛋白，通过与细胞内的其它mRNA序列部分或完全互补配对，非特异性抑制其它基因的表达，从而导致脱靶作用。

发明人还发现，当本发明saRNA结构的3′末端还连接有核酶编码序列，例如丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis Delta Virus Ribozyme，简称HDV核酶)时，可以进一步显著提高用DNA载体表达的saRNA加工产生的siRNA量及其对靶基因的抑制效率。

因此，在优选的实施方式中，本发明saRNA结构的3′末端与核酶相连。所述核酶包括但不限于：HDV核酶、发夹状核酶（hairpin ribozyme）、锤头状核酶（hammerhead ribozyme）等；优选地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该RNAi前体的核苷酸序列都可以加在该RNAi前体的5′或3′端。

在RNA聚合酶III启动子的驱动下，saRNA和HDV核酶序列被一同转录出来，HDV核酶在saRNA的3′末端特异性位点发生自切割，产生的saRNA可以进一步有效地被Ago2识别并加工。Northern blot结果显示，这种带有HDV核酶的saRNA的加工效率明显高于不带HDV核酶的saRNA，产生了更多的成熟单链siRNA，显著提高了对靶基因的抑制效率(图6b、图7e、7f)。

本领域技术人员鉴于本发明的教导，不难理解，本发明可利用各种核酶，包括但不限于，HDV核酶、发夹状核酶（hairpin ribozyme）、锤头状核酶（hammerhead ribozyme）等，只要所述核酶能在本发明saRNA的3′末端特异性位点发生自切割，从而产生所述saRNA。在优选的实施方式中，本发明利用的核酶是HDV核酶。所述HDV核酶是一种具有催化活性的RNA分子，能在动物细胞体内形成具有活性的高级结构，高效催化所在的RNA发生自切割。

鉴于本发明以及现有技术的教导，本领域技术人员还应明白，虽然本发明实施例中采用转录的方法产生本发明的saRNA，但本发明的saRNA还可采用其它方法，例如化学合成的方法获得。可如文献【3】和【4】所述方法化学合成本发明的saRNA，或者还可由提供多核苷酸化学合成服务的公司，例如IDT、Dharmacon等公司获得本发明的saRNA。

在本发明saRNA的基础上，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明saRNA的编码序列，以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本发明的saRNA，经Ago2蛋白加工后产生成熟的siRNA。

在表达盒的基础上，本发明进一步提供一种构建物，所述构建物包含上述表达盒。

本发明还提供一种细胞，所述细胞包含本发明的saRNA或表达盒或构建物。

本发明还提供了一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将本发明的saRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

在优选的实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中获得产生的siRNA。

在优选的实施方式中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。

本发明还提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将本发明的saRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞。

本发明还提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)本发明的saRNA或表达盒或构建物；

2)适合将1)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

在一优选例中，所述组合物还包含Ago2蛋白。

本发明还提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有本发明的saRNA或表达盒或构建物；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)本发明的RNAi前体或表达盒或构建物；和

b)药学上可接受的载体。

本发明的优点：

(1)与现有的shRNA载体相比，本发明saRNA载体产生siRNA的单位分子抑制效率更高；

(2)本发明saRNA载体的脱靶作用显著低于现有shRNA；

(3)本发明saRNA载体对细胞内源包括miRNA在内的小RNA的影响较小，毒性低；

(4)本发明的saRNA为利用RNAi技术选择性沉默靶基因表达提供了比传统shRNA更好的选择，在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大的潜力。

实施例

材料与方法

1.质粒构建

本发明实施例中用到的shRNA或saRNA瞬时表达载体构建时都是将T4PNK加磷处理，然后将变性、退火后的DNA双链分子(含shRNA或saRNA序列)插入瞬时表达载体中H1启动子下游的BamHⅠ和HindⅢ两个限制性内切酶位点之间得到的。以实施例6中所用到的saGP为例，构建时将正向引物5′-gatccaacttcagggtcagcttgccgtcaagctgaccctgaagtcattttttggaaa-3′(SEQ ID NO:1)与反向引物5′-agcttttccaaaaaatgacttcagggtcagcttgacggcaagctgaccctgaagttg-3′(SEQ IDNO:2)(构建其它shRNA或saRNA表达盒所需的具体序列参见表1)作如上T4PNK加磷以及变性、退火处理后插入瞬时表达载体中H1启动子下游的BamHⅠ和HindⅢ两个限制性内切酶位点之间。实施例中所用到的瞬时表达载体序列为：ggtaccatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccggaaaagcttagatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata(SEQ ID NO:3)，其中下划线所示序列为BamHⅠ和HindⅢ位点。

带有HDV核酶的saRNA表达盒是通过PCR的方法在saRNA的3′端加上HDV核酶，然后酶切并插入到瞬时表达载体中H1启动子下游的BamHⅠ和HindⅢ两个限制性内切酶位点之间得到的，也可以在saRNA与HDV核酶之间引入其它的酶切位点以便于saRNA表达盒的构建。以实施例6中所用到的saGP-RZ表达盒为例，其序列为： ggccggcatggtcccagc ctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggacccactttttt(SEQ ID NO:4)，其中斜体字所示为H1启动子序列；黑体字所示为saGP序列；下划线示出HDV核酶序列；tttttt为转录终止序列。PCR所用的正向引物序列为5′-acgtggatccaacttcagggtcagcttgccgtcaagctgaccctgaagtcatggccggcatggtcccagcct-3′(SEQ ID NO:5)，反向引物序列为5′-atctaagcttttccaaaaaagtgggtcccattcgcca-3′(SEQ ID NO:6)(构建其它带有HDV核酶的shRNA或saRNA表达盒所需的具体序列参见表1)，将PCR产物用BamHⅠ和HindⅢ两个限制性内切酶双酶切后插入到瞬时表达载体中H1启动子下游的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，就可以获得最终用于表达saRNA的质粒。

针对siRNA的报告基因载体构建时都是将T4PNK加磷处理，然后变性、退火后的DNA双链分子(含siRNA靶序列)插入萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)基因3′UTR的NheⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶位点之间得到的。以siGP的报告基因载体为例，构建时将正向引物5′-ctagctctacggcaagctgaccctgaagttcaaatt-3′(SEQ ID NO:7)与反向引物5′-ctagaatttgaacttcagggtcagcttgccgtagag-3′(SEQ ID NO:8)(构建其它报告基因载体所需的具体序列参见表2)作如上T4PNK加磷以及变性、退火处理后插入萤火虫荧光素酶基因3′UTR的NheⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶位点之间。其中所用到的萤火虫荧光素酶报告基因(含3′UTR)的序列为：atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaattctagtgaattcgtttcggaccccacctcccaatcccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacgggatctcggctagcttatcatctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggta，其中下划线所示序列为Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ位点。当然，本领域普通技术人员知晓，还可以利用其它报告基因，例如GFP蛋白基因。

具体实施例中所用到的siRNA序列如下：

siGP5′-AACTTCAGGGTCAGCTTGCCGT-3′(SEQ ID NO:9)

siLC5′-AGTTCTTCTGGAAGTCCAGTTC-3′(SEQ ID NO:10)

sip535′-ATACACATGTAGTTGTAGTGGA-3′(SEQ ID NO:11)

siBACE15′-ACTGTCCACAATGCTCTTGTCA-3′(SEQ ID NO:12)

sip155′-ATAACCGTTACAATTGCTCTCA-3′(SEQ ID NO:13)

2.细胞培养及报告基因实验

本发明所有实验案例中用到的HEK293细胞都是生长在含10%胎牛血清的DMEM培养基(购自GIBCO公司)中并于37℃、5%CO₂的环境下培养。所有针对HEK293细胞的瞬时转染实验都是使用Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)转染试剂并按其说明进行操作。荧光素酶活性的检测采用Dual-Glo luciferaseassay system(购自Promega公司)并在BERTHOLD LB940仪器上进行操作。

3.Northern blot实验

本发明所有涉及Northern blot的实验案例中，细胞总RNA的提取都是使用Trizol试剂(购自Takara公司)并按其说明进行操作。所使用的凝胶系统是含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶，电泳电压采用500V。杂交及洗膜系统都是采用罗氏公司的Northern blot系统并按其说明进行操作，杂交温度为50℃，所使用的探针是3′端带地高辛修饰的与目的siRNA序列完全互补配对的DNA序列(购自生工生物工程公司)。底物显色反应是采用的CDP-star系统(购自ABI公司)并按其说明进行操作

4.Western blot实验

本发明所涉及的Western blot实验都是采用含SDS的10%的聚丙烯酰胺凝胶系统，针对p53基因的鼠源单克隆抗体(购自Sigma公司)采用1:1000比例稀释并使用，针对laminC基因的兔源多克隆抗体(购自Bioworld Technology公司)采用1:500比例稀释并使用，针对β-actin基因的鼠源单克隆抗体(购自CoWin Biotech公司)采用1:2000比例稀释并使用。底物显色反应采用Immun-Star HRPchemiluminescence试剂盒(购自Thermo公司)并按其说明进行操作。

5.免疫共沉淀实验

本发明所涉及的免疫共沉淀实验是采用的EZview Red Anti-FLAG AffinityGel系统(购自Sigma公司)并按其说明进行操作。细胞内源的Ago1和Ago2的免疫共沉淀实验是采用的兔抗Ago1以及Ago2的抗体（购自MBL InternationalCorporation公司）并按其说明进行操作。

6.慢病毒包装及感染实验

本发明中慢病毒的包装是采用VSVG/ΔR8.91系统，将三种质粒(pCMV-VSV-G、pCMVΔR8.91以及载体质粒)按照一定比例混合并转染HEK293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收取含慢病毒颗粒的细胞上清并用0.45μm的滤膜(购自Sigma公司)过滤。获得病毒后感染目的细胞(本发明采用HEK293细胞)，同时在细胞培液中加入8μg/mL的Hexadimethrine bromide(购自Sigma公司)，病毒感染后24小时，换成含1μg/mL的puromycin(购自Sigma公司)的培液进行药物筛选。六天后，裂解细胞并做Western blot。

7.小RNA深度测序实验

本发明所涉及的小RNA深度测序实验中细胞总RNA的提取采用Trizol试剂(购自Takara公司)并按其说明进行操作。小RNA的建库采用Illumina公司的小RNA建库系统并按其说明进行操作。

表1shRNA和saRNA表达盒序列

shRNA编号

序列信息

shGP	cggcaagctgaccctgaagttctcgagaacttcagggtcagcttgccgttttt(SEQ ID NO:14)
		shLC	aactggacttccagaagaactctcgagagttcttctggaagtccagttttttt(SEQ ID NO:15)
shp53	ccactacaactacatgtgtatctcgagatacacatgtagttgtagtggttttt(SEQ ID NO:16)
		shBACE1	gacaagagcattgtggacagtctcgagactgtccacaatgctcttgtcttttt(SEQ ID NO:17)
shp15	gagagcaattgtaacggttatctcgagataaccgttacaattgctctcttttt(SEQ ID NO:18)
		saRNA编号	序列信息
saGP	aacttcagggtcagcttgccgtcaagctgaccctgaagtcat(SEQ ID NO:19)
		saLC	agttcttctggaagtccagttctggacttccagaagaacaat(SEQ ID NO:20)
sap53	atacacatgtagttgtagtggactacaactacatgtgtaaat(SEQ ID NO:21)
		saBACE1	actgtccacaatgctcttgtcaaagagcattgtggacagaat(SEQ ID NO:22)
sap15	ataaccgttacaattgctctcaagcaattgtaacggttaaat(SEQ ID NO:23)

表2报告基因载体构建引物序列

实施例1.制备shRNA与本发明的saRNA

发明人制备了传统的shRNA(PCT/US2005/042488)与本发明的saRNA，如图1所示，shRNA的双链区长度大于等于19bp，顶端环大于等于4个核苷酸，3′末端有未配对区(参见图1a)，与靶基因序列互补配对的siRNA序列(guidestrand)设计在3′臂上(3′arm，参见图1a红色部分)。本发明的saRNA的双链区长度为15bp-17bp，第一个核苷酸不配对，顶端环大小为3到9个核苷酸，3′末端有1nt-6nt未配对区(参见图1b)，与靶基因序列互补配对的siRNA序列(guidestrand)设计在saRNA双链区和顶端环的第1到第22位上(参见图1b红色部分)。

实施例2.荧光素酶报告基因系统

发明人采用荧光素酶报告基因系统(图2a，2b)以及Northern blot(RNA印迹杂交)等技术比较了传统shRNA与本发明saRNA的siRNA加工成熟、对靶基因的抑制效率以及对细胞的毒副作用等方面。单拷贝与siRNA(21nt)序列完全互补配对(图2a)或四拷贝与siRNA序列部分互补配对(图2b)的靶序列插入萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly luciferase)的3′UTR中。siRNA表达载体与报告基因共同转染细胞(如Human Embryonic Kidney293cell，简称HEK293细胞)后，产生的siRNA结合到靶序列后会对报告基因的表达产生抑制，通过检测荧光素酶活性的变化可以灵敏反映siRNA的表达水平以及抑制活性的高低。荧光素酶活性下降得越多表明该siRNA的抑制效果越好。在以下试验中都使用了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)报告基因与shRNA或saRNA共同转染细胞，其中海肾荧光素酶作为内参用于排除由转染效率和细胞生长差异等原因对实验结果所造成的影响。

实施例3.比较shRNA与本发明saRNA的抑制效率

发明人分别构建了包括不同双链区长度(13bp-23bp)的siRNA前体(saGP)，与含该siRNA靶序列的报告基因共同转染HEK293细胞。24小时后检测报告基因的表达。抑制倍数越高，表明该载体产生的siRNA抑制作用效率越高。通过Northern blot检测不同双链区长度的siRNA前体(13bp-23bp)产生的siRNA量及其长度。从图中可以看出双链区长度为22bp和23bp的siRNA前体产生的成熟siRNA量最多，长度分布范围约为21-24nt。双链区长度为15bp到17bp的siRNA前体产生的siRNA量较少，长度约为24-28nt(图3b)。对靶基因抑制效率的实验结果表明，基于saRNA结构设计的RNAi载体，产生的siRNA量显著低于shRNA，但对报告基因的抑制效率与shRNA类似(图3a)，从而提示就单位分子对靶基因表达的抑制效果而言，本发明的saRNA比shRNA效率更高。构建顶端环大小不同的siRNA前体(saGP)，并通过报告基因实验以及Northern blot检测顶端环大小对siRNA前体表达的影响。实验结果表明siRNA前体的顶端环从3nt到9nt时，都可以产生成熟的siRNA并对报告基因有抑制作用，尤其是顶端环为3nt或4nt的siRNA前体，其产生的成熟siRNA的抑制效率更高(图3c、3d)。

实施例4.本发明saRNA的加工途径

发明人将带有不同长度双链区的siRNA前体转染Ago2敲除的小鼠胚胎成纤维(Mouse Embryo Fibroblast，简称MEF)细胞系，并进行Northern blot检测。实验结果显示，不同长度双链区的siRNA前体加工生成成熟siRNA过程对Ago2蛋白的依赖程度有很大差异。当Ago2被敲除后，双链区长度为22bp或23bp的siRNA前体仍能产生成熟的siRNA(大小为21-24nt)，而双链区长度为15bp-17bp的siRNA前体不能产生成熟的siRNA(图4)。

以上结果说明与传统的shRNA的加工相比(其依赖于Dicer)，双链区长度为15bp-17bp的siRNA前体的加工依赖于细胞内的Ago2蛋白。因此，发明人将这种茎环结构的siRNA前体命名为saRNA(Single-stranded Ago2-processedinterfering RNA)。

实施例5.在RNA水平比较双链siRNA、shRNA和saRNA

发明人比较了用化学方法合成的双链siRNA、shRNA和saRNA的加工以及对靶基因的抑制效率。siGP每条链长度为21nt，两条链的第1到第19位的核苷酸完全互补配对，3′末端带两个核苷酸的未配对区(第20和第21位)，其中guidestrand的序列(粗体表示)与报告基因序列完全配对。shGP由顶端环、双链区和3′末端的未配对区组成，其中双链区的21bp完全互补配对，顶端带有一个6nt的顶端环，3′末端带有两个核苷酸的未配对区。saGP结构为18bp的双链区(第一个核苷酸不配对)和一个4nt的顶端环以及3′末端两个核苷酸的未配对区(图5a)。将化学方法合成的三种单链siRNA前体分别转染HEK293细胞后，提取细胞总RNA并与用于转染的siRNA前体一同进行Northern blot检测。通过比较这三种结构产生的成熟单链siRNA及其对靶基因的抑制效率可以看出，saGP产生的单链siRNA量虽然远远低于shGP和双链siGP，但对报告基因的抑制效果却与shGP和siGP类似，甚至略好一些(图5b、5c)。

本实施例说明化学合成的siRNA前体中，saRNA所产生的单链siRNA的单位分子效能远远高于shRNA和双链siRNA所产生的单链siRNA，对靶基因表达的抑制活性更高。

实施例6.3′端连接HDV核酶的saRNA的制备及效果

发明人在saRNA结构的3′末端连接一个改造过的丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis Delta Virus Ribozyme，简称HDV核酶)，从而极大提高了用DNA载体表达的saRNA加工产生的siRNA量及其对靶基因的抑制效率。之前其他实验室【5、6、7】和本发明人的实验室(图3)都曾将类似saRNA的茎环结构用于构建RNAi载体，但实验结果表明saRNA载体对靶基因的沉默效率比传统的shRNA载体低，因此不能替代传统的基于shRNA的RNAi载体。而实施例5的研究结果证明(图5)，用化学方法合成的saRNA对靶基因的抑制效果却比shRNA更好。根据对saRNA和shRNA及其产生的成熟单链siRNA的Nrothern blot分析结果，提示造成saRNA表达载体(质粒)抑制效率不高的主要原因可能是RNA聚合酶III转录产生的saRNA加工生成成熟单链siRNA的效率远远低于shRNA。

发明人在RNAi载体的saRNA结构的3′端引入一个HDV核酶序列，结果出乎意料地发现，Northern blot结果显示，这种带有HDV核酶的saRNA的加工效率明显高于不带HDV核酶的saRNA，产生了更多的成熟单链siRNA并且显著提高了对靶基因的抑制效率(图6、图7)。提示，在RNA聚合酶III启动子的驱动下，saRNA和HDV核酶序列被一同转录出来，HDV核酶在saRNA的3′末端特异性位点发生自切割，产生3′末端带有均一长度未配对区的saRNA，可以更有效地被Ago2识别并加工。对靶基因抑制效率的实验结果表明，在saGP结构的3′端引入HDV核酶后，其对靶基因的抑制效率相比不带HDV核酶的saGP提高了50%，而在shGP结构的3′端引入HDV核酶后，其对靶基因的抑制效率没有明显变化（图6a）。同样，相比不带HDV核酶的saLC以及sap53，在它们3′端引入HDV核酶后，其对靶基因的抑制效率分别提高了126%和20%（图7a、7b）

实施例7.HDV核酶对saRNA的影响

带有HDV核酶的saRNA载体可以有效沉默内源基因的表达。发明人针对人内源的laminC以及p53基因设计了相应的RNAi载体序列，比较了包括saRNA3′端不携带HDV核酶、携带野生型HDV核酶或携带没有催化活性的HDV核酶突变体，以及靶向相同靶基因序列的传统shRNA。

分别将靶向laminC以及p53基因的不同siRNA表达载体瞬时转染HEK293细胞。72小时后，裂解细胞并作Western blot检测内源laminC以及p53蛋白的表达情况，其中β-肌动蛋白作为内参基因。结果发现相比不带HDV核酶的saRNA以及shRNA，带有HDV核酶的saRNA对laminC以及p53的沉默效果更显著(图7c、7d)。而通过定点突变HDV核酶(第75位的C变成T【8】)，使其丧失切割活性以后，saRNA不再能被加工产生成熟的siRNA产物(图7e、7f)，也就不再对laminC以及p53基因的表达产生抑制作用(图7c、7d)。

本实施例进一步说明HDV核酶的切割活性对促进saRNA的加工成熟和对靶基因的抑制作用至关重要。

实施例8.比较shRNA与saRNA的脱靶作用

8.1

分别将表达shGP或saGP-RZ的载体与表达带flag标签的Ago1、2、3蛋白(细胞中Ago4表达量很低)的载体共同转染到HEK293细胞中。48小时后，通过特异性识别flag标签的抗体将Ago1、2、3从细胞裂解液中富集下来，提取RNA进行Northern blot，检测Ago1、2、3结合小RNA的情况。实验结果显示，shGP加工产生的siRNA既能和Ago2结合，也能够和Ago1和Ago3结合；saGP-RZ被核酶切割后产生的saRNA的siRNA前体形式(没有抑制活性)可以与Ago1、Ago2和Ago3结合，但成熟的siRNA产物只能在Ago2中检测到(图8a)。同样，Ago1、2、3也能结合shGP的passenger strand，Ago2由于其能够切割passenger strand，因此检测到结合的量较少。saGP-RZ完全不产生passenger strand(图8b)。针对细胞内源的Ago1和Ago2的免疫共沉淀实验也显示相同的结合情况(图8c、8d)。

这提示，saRNA脱靶作用较小原因之一是只有具备RNaseIII核酸内切酶活性的Ago2蛋白(即RNAi中发挥沉默功能的主要蛋白)才能对saRNA进行加工并产生具有功能的单链siRNA，而没有RNaseIII核酸内切酶活性的Ago1、Ago3和Ago4蛋白不能产生成熟的单链siRNA，也就不会产生由Ago1、Ago3和Ago4导致的脱靶作用；而shRNA由Dicer加工后产生的siRNA可以与Ago1、Ago2Ago3和Ago4蛋白结合，所有这四种Ago蛋白都会产生脱靶作用。

8.2

针对GFP、LaminC和P53基因，分别设计了三对shRNA与saRNA-RZ，将它们与含有完全互补配对或部分互补配对靶序列的报告基因共同转染HEK293细胞，结果显示在产生相同中靶作用(含完全互补配对靶序列)的情况下，saRNA-RZ的脱靶作用(含部分互补配对靶序列)要显著低于shRNA，其中saGP-RZ相比shGP，其脱靶作用降低了42%，saLC-RZ相比shLC，其脱靶作用降低了75%，sap53-RZ相比shp53，其脱靶作用降低了45%(图9)。

这提示，saRNA的脱靶作用比shRNA低的原因之二是saRNA所产生的单链siRNA的单位分子效能远远高于shRNA所产生的单链siRNA，在对靶基因具有相同抑制效率(中靶作用)的情况下，saRNA所产生的成熟单链siRNA(guidestrand)的量远远少于shRNA，因而产生的脱靶作用也被显著降低。

8.3

以BACE1和p15为例进行了研究，分别将它们正义链RNA和反义链RNA中重叠区域的序列装入报告基因的3′UTR，然后将这些报告基因与表达siBACE1或sip15的shRNA或saRNA-RZ共同转染HEK293细胞。24小时后，分别检测guidestrand和passenger strand对报告基因的抑制效率。检测shRNA中passenger strand产生的脱靶作用的报告基因实验结果见图10。

实验结果显示，shRNA的guide strand会对含正义链RNA的报告基因产生抑制作用(这是我们希望达到的目的)，其产生的passenger strand也会对含反义链RNA的报告基因产生抑制(也即passenger strand的脱靶作用)。与此形成鲜明对比的是，saRNA-RZ只会对含正义链RNA的报告基因的表达产生抑制，而对含反义链RNA的报告基因的表达没有任何抑制作用(图10)。因为saRNA-RZ不产生passenger strand(参见图8)。

saRNA脱靶作用低的原因之三是由于其特殊的加工方式不会产生passengerstrand，也就不会产生由passenger strand导致的脱靶作用。saRNA不产生passenger strand的优点对于运用RNAi技术研究存在反义转录本的基因具有重要意义。在用传统shRNA沉默靶基因表达时，在guide strand沉默正义链RNA(正义RNA)所在基因的同时，shRNA产生的passenger strand也会沉默其反义链RNA(反义RNA)，反之亦然。目前已有越来越多的研究证据表明，很多基因(包括mRNA和非编码RNA)都会产生反义链RNA，并具有重要的生物学功能，例如BACE1的反义链-BACE1-AS，它可以通过调控BACE1mRNA以及蛋白的表达，从而加快阿尔茨海默病病人的病情发展【9】；p15(又名CDKN2B)的反义链-p15-AS(又名ANRIL)，它可以通过结合某些蛋白因子抑制p14/p15/p16这些抑癌基因的表达，从而促进前列腺癌等癌症的发展【10】。如果RNAi载体在抑制正义链所在基因的表达的同时也抑制了反义链的表达，可能会造成实验假象以及产生不良的副作用。

实施例9.比较shRNA与saRNA对内源性miRNA的影响

将shRNA或saRNA与miR-125b过表达载体及其报告基因共同转染HEK293细胞。24小时后，检测miR-125b对含有其部分互补配对靶序列的报告基因抑制效率的影响。结果发现无论是否带有HDV核酶，saRNA对miR-125b调控靶基因表达的功能影响都显著低于shRNA(图11a)。为了进一步研究saRNA对内源miRNA加工表达的影响，发明人将带有核酶的saRNA载体(saGP-RZ)及其空载体对照质粒分别转染HEK293细胞。48小时后，提取细胞总RNA，并按照Illumina公司的小RNA建库方法进行建库并深度测序分析内源小RNA的表达情况。将测到的空白载体对照样品与过表达saGP-RZ的样品中miRNA的表达量做共线性分析，从结果来看，两组样品相关性非常好(R²>0.98)，也就是说过瞬时表达saGP-RZ(saRNA载体)对内源miRNA的表达谱没有显著影响(图11b)。

因此，本实施例证明，本发明的saRNA可以极大降低由于过表达siRNA或shRNA造成对细胞内源miRNA的竞争抑制而带来的毒性作用。本发明的saRNA除了单位分子抑制效率高和脱靶作用低的优势外，对细胞内miRNA表达和功能的影响也比shRNA小。

实施例10.各种saRNA表达载体

以上实施例中使用的saRNA载体都是将saRNA表达框(图12a)克隆在瞬时表达质粒载体上，适合在各种细胞系或组织中进行瞬时表达。发明人对该RNAi载体进行一些必要的改造，从而将saRNA表达框克隆到各种病毒载体，比如慢病毒(Lentivirus)、逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus，Adv)、腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)以及杆状病毒(Baculovirus)载体等(图12b)，进而使得saRNA在原代细胞和胚胎干细胞(ESC)等难转染的细胞，或动物体内进行更广泛的应用。

实施例11.比较shRNA和saRNA慢病毒表达载体对内源p53基因的沉默效果

利用慢病毒包装系统(VSVG以及ΔR8.91系统)在HEK293T细胞中包装含shp53、sap53或sap53-RZ的慢病毒载体用于沉默内源p53基因。然后将含不同感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)病毒的细胞上清液感染HEK293细胞。用puromycin药物筛选获得稳定表达sip53的细胞株后，裂解细胞并做Western blot检测内源p53蛋白的表达情况，其中β-肌动蛋白作为内参基因。

结果表明，sap53-RZ对内源p53基因的抑制效果显著优于shp53和sap53，尤其是在高病毒滴度的情况下(即15<MOI<25)，sap53-RZ载体对内源p53基因的抑制效率超过了95%(图13)。

实施例12.3′端连接其它核酶的saRNA的制备及效果

重复实施例6，但区别在于：用发夹状核酶、锤头状核酶)替换实施例6中RNAi前体中的HDV核酶。

同样，相比不带核酶的saLC，在3′端引入上述核酶后，其对靶基因的抑制效率的提高幅度为40-90%。

总之，本发明的saRNA是一类不依赖于细胞内Dicer蛋白加工的新型RNAi载体，其从5′端到3′端依次具有：5′端未配对区域，5′端配对区域，顶端环区域、3′端配对区域，3′端未配对区域以及与3′端未配对区域相连的任选的3′端核酶区，其中，所述5′端未配对区域长度为1nt；所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；所述顶端环区域长度为3nt-9nt，优选4nt-6nt，更优选4nt；所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；与靶基因序列互补配对的核苷酸序列位于saRNA双链区和顶端环的第1到第22位之间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (15)

1.一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端未配对区域，所述5′端未配对区域长度为1nt；

(b)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度为15nt-17nt；

(c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt-9nt；

(d)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；

(e)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；以及

(f)任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，其中，

所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt-6nt。

3.如权利要求2所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。

4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体包含与3′端未配对区域相连的3′端核酶区。

5.如权利要求4所述的RNAi前体，其特征在于，所述核酶选自：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶等；优选地，所述核酶是HDV核酶。

6.一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体。

7.一种构建物，所述构建物包含权利要求6所述的表达盒。

8.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物。

9.一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物转入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

10.一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物转入哺乳动物细胞。

11.一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和

2)适合将1)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

12.一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

13.权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。

14.权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。

15.一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物；和

b)药学上可接受的载体。