CN106636084A - 新型shRNA表达载体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效引发RNAi的新型核酶增强型shRNA及其制备方法和应用。所述核酶增强型shRNA从5′端到3′端依次为：(a)5′端配对区域；(b)顶端环区域；(c)3′端配对区域，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；(d)3′端未配对区域；(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶增强型shRNA可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端或5′端配对区域。本发明核酶增强型shRNA加工生成siRNA的效率显著提高，对靶基因的抑制效率更高。

Description

新型shRNA表达载体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及新型的shRNA表达载体及其制备和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)介导的RNA降解现象，最初在秀丽线虫中被发现，此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，CraigMello和Andrew Fire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wet age-related macular degeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(Hepatitis B)、实体瘤(solidtumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychia congenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。

RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的siRNA表达载体。其中目前应用最广的是shRNA(shorthairpin RNA)。转录产生的shRNA被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。

目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括：(1)效率不高。往往需要设计多个shRNA才能保证有1-2个shRNA能对靶基因达到70％以上的抑制效果。(2)脱靶作用(off-target)。siRNA通过与mRNA部分互补配对，以类似miRNA的作用方式非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。

综上所述，本领域急需开发对靶基因抑制效率更高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以引发RNA干扰(RNAi)的新型shRNA表达载体及其制备方法和应用，所述shRNA表达载体的加工效率和对靶基因的抑制效率更高，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。

在第一方面，本发明提供一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；

(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；

(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；

(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0-6nt；

(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶；

其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。

在另一优选例中，所述5′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt。

在另一优选例中，所述顶端环区域长度为2-12nt，更佳地为3-10nt。

在另一优选例中，所述3′端配对区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为19-28bp，更佳地为20-25bp。

在另一优选例中，所述的3′端配对区域为shRNA的靶向链(guide strand)。

在另一优选例中，所述的3′端未配对区域为2nt。

在另一优选例中，所述的核酶的3′端具有4-6个连续的U。

在另一优选例中，所述核酶增强型shRNA中顶端环长度为4-10nt。

在另一优选例中，所述3′端未配对区域长度为1-6nt，更佳地为2-4nt。

在另一优选例中，所述核酶选自下组：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶。

在另一优选例中，所述核酶是HDV核酶。

在另一优选例中，所述的核酶是具有自切割功能的HDV核酶。

在第二方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号。

在另一优选例中，所述表达盒在转录后产生本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA。

在第三方面，本发明提供一种构建物，所述构建物包含本发明第二方面所述的表达盒。

在第四方面，本发明提供一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物。

在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。

在第五方面，本发明提供一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

在另一优选例中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。

在另一优选例中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

在第六方面，本发明提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞。

在第七方面，本发明提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

2)适合将1)所述的核酶增强型shRNA或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

在另一优选例中，所述组合物还包含Dicer蛋白。

在第八方面，本发明提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

在第九方面，本发明提供本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。

在第十方面，本发明提供本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。

在第十一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)本发明第一方面所述的核酶增强型shRNA或本发明第二方面所述的表达盒或本发明第三方面所述的构建物；和

b)药学上可接受的载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了shRNA载体(Dicer依赖型)和另一种RNAi载体—saRNA(Ago2依赖型)的区别。其中，图1a显示了shRNA与saRNA发生途径及作用机制的区别。图1b显示了shRNA与saRNA的结构区别。

图2显示了本发明一个实例中的shRNA与HDV核酶的表达载体及结构特征。其中图2a显示了RNA聚合酶Ⅲ启动子(如H1,U6启动子)驱动的shRNA、HDV核酶以及6个T碱基(转录终止信号)组成的表达盒。图2b显示了本发明一个实例中新型shRNA载体在真核细胞内转录生成的shRNA+核酶RNA的序列和结构特征。

图3显示了本发明一个实例中具有自切割活性的HDV核酶可以进行自切割，从而产生shRNA,HDV核酶的催化活性位点被突变后就不再具有自切割活性，也就不产生相应的shRNA。

图4显示了本发明一个实例中，HDV核酶对shRNA抑制效率的增强作用。其中图4a显示了用于检测shRNA对靶基因沉默效率的报告基因系统。图4b和4c显示了荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA(21bp)抑制活性的影响的结果。

图5显示了HDV核酶对shRNA抑制效率的提高具有普适性。

图6显示了HDV核酶对shRNA抑制效率的提高也适用于对细胞内源基因的沉默。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种具有特殊结构的核酶增强型shRNA，与传统的shRNA相比，本发明的新型核酶增强型shRNA可以显著增强Dicer依赖型的siRNA表达前体—shRNA对靶基因的抑制效率，具有表达效果更强、抑制效率更高等优点，从而能更好地应用于科学研究和疾病治疗。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明的实验表明，在shRNA结构的3′末端增加了一个核酶，优选为改造过的丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis Delta Virus Ribozyme，简称HDV核酶)，可以显著提高现有的shRNA载体对靶基因的抑制效率，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有较高的应用潜力。

此外，当3′端配对区域为shRNA的靶向链(guide strand)时，本发明的核酶增强型shRNA有助于提高最终siRNA产物中所需siRNA靶向链的比例。

术语定义

如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的RNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。

如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之序列互补的目标RNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

如本文所用，术语“siRNA前体”是指可以在哺乳动物细胞中被加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。类似地，如本文所用，术语“表达盒”是指包含本发明核酶增强型shRNA的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的核酶增强型shRNA；而如本文所用，术语“构建物”是包含所述表达盒的构建物。

如本文所用，术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

如本文所用，术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，通常由细胞内源的RNA聚合酶III(RNA polymerase III)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。shRNA也可以由其它RNA聚合酶的启动子转录产生。

在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。

核酶

如本文所用，术语“核酶(ribozyme)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指具有催化活性的RNA分子，即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA、有的能够切割DNA，有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。

本领域技术人员鉴于本发明的教导，不难理解，本发明可利用各种核酶，包括但不限于，HDV核酶、发夹状核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)等。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导进行切割的核苷酸序列，都可以用于本发明，并且典型地位于本发明核酶增强型shRNA的3′端一侧。

核酶增强型shRNA

如本文所用，术语“本发明shRNA”、“核酶增强型shRNA”、“核酶自切割型shRNA”可互换使用，指在3′端连接有具有自切割功能的核酶的shRNA前体分子，从而当所述核酶增强型shRNA被转录后，位于3′端的核酶可进行自切割，从而产生具有特定长度3′端未配对区域的shRNA前体。

本发明提供一种具有茎环结构的核酶增强型shRNA。本发明shRNA结构的3′末端与核酶相连。所述核酶包括但不限于：HDV核酶、发夹状核酶(hairpinribozyme)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)等；优选地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该siRNA前体的核苷酸序列都可以加在该siRNA前体的3′末端。该发明中所指的siRNA前体指带发夹结构的RNA序列，其双链区长度大于或等于19bp并可以被细胞内的Dicer蛋白加工产生siRNA，发挥基因沉默的功能。

本发明人发现，本发明核酶增强型shRNA可以更高效地生成siRNA，从而更高效地对靶基因进行抑制，抑制效率显著高于现有技术的shRNA。例如，当3′末端连接有核酶编码序列，例如丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis Delta VirusRibozyme，简称HDV核酶)时，核酶自切割后产生具有特定长度3′端未配对区域的shRNA，可以更高效地被Dicer识别和加工，从而显著提高用DNA载体表达的shRNA加工产生的siRNA量及其对靶基因的抑制效率。

一种代表性的3′末端连接HDV核酶后的shRNA表达载体及结构示意图如图2所示。针对传统的RNA聚合酶Ⅲ启动子(如H1,U6等)表达载体，通过在shRNA 3′末端连接HDV核酶来提高shRNA对靶基因的抑制效率(图2a)，其中shRNA的双链区长度大于或等于19bp(如20-25bp)，顶端环大于或等于2nt(如3-6nt)，3′末端悬垂为0-6个nt(较佳地为2nt)，HDV核酶末端连接6个U碱基(图2b)。

在本发明一个优选的实施方式中，本发明shRNA结构的3′末端与核酶相连，并且其中间隔了n个碱基，其中，n为0-6的正整数，较佳地n为1、2、3或4，更佳地n为2或3。

在本发明中，合适的核酶例子包括但不限于：HDV核酶、发夹状核酶(hairpin ribozyme)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)等；优选地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割并产生该核酶增强型shRNA的核苷酸序列都可以加在该核酶增强型shRNA的3′端。

在shRNA结构的3′末端增加HDV核酶后可以显著提高用DNA载体表达的shRNA对靶基因的抑制效率。在转录时，shRNA和HDV核酶序列被一同转录出来，HDV核酶在shRNA的3′末端特异性位点发生自切割，从而高效产生了更适合Dicer加工的shRNA前体，加工效率明显高于常规的shRNA，可产生了更多的成熟单链siRNA，显著提高了对靶基因的抑制效率。

一种特别优选的核酶增强型shRNA是核酶自切割后产生3′末端具有2-3个碱基悬垂的shRNA，这种3′末端带有2-3个碱基悬垂的shRNA可以进一步高效地被细胞内Dicer蛋白识别并加工。

鉴于本发明以及现有技术的教导，本领域技术人员还应明白，虽然本发明实施例中采用在细胞内转录的方法产生本发明的shRNA，但本发明的shRNA还可采用其它方法，例如体外转录或化学合成的方法获得。

表达盒、构建物和应用

在本发明shRNA的基础上，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明shRNA的编码序列，以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本发明的shRNA，被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA。

在表达盒的基础上，本发明进一步提供一种构建物，所述构建物包含上述表达盒。

本发明还提供一种细胞，所述细胞包含本发明的shRNA或表达盒或构建物。

本发明还提供了一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将本发明的shRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

在另一优选例中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中获得产生的siRNA。

在另一优选例中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。

本发明还提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将本发明的shRNA或表达盒或构建物转染入哺乳动物细胞。

本发明还提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)本发明的shRNA或表达盒或构建物；

2)适合将1)所述的核酶增强型shRNA或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

本发明还提供一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有本发明的shRNA或表达盒或构建物；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)本发明的核酶增强型shRNA或表达盒或构建物；和

b)药学上可接受的载体。

shRNA与saRNA的区别

如图1所示,就发生途径及作用机制而言，本发明的shRNA前体被细胞内的Dicer蛋白识别并加工产生成熟的siRNA(通常为21nt),并且多数情况下两条链都会被保留下来。因此本发明的shRNA前体属于Dicer蛋白依赖型的siRNA前体。该成熟siRNA可以被细胞内的Ago1,2,3,4结合并发挥沉默靶基因的作用。

与此相反，现有的saRNA(或saiRNA)转录产生后，直接被细胞内的Ago2选择性加工产生成熟的单链siRNA，而不依赖于Dicer蛋白。被Ago1,3,4结合的saRNA不能被进一步加工。换言之，saRNA前体不能被细胞内的Dicer蛋白识别而是直接被Ago2蛋白识别并加工，然后通过PARN家族的核酸外切酶对3′端做进一步的修剪(trimming)，产生成熟的单链siRNA，长度通常大于24nt，该成熟的单链siRNA只能与Ago2结合并发挥沉默靶基因的作用。

就两者的结构区别而言，本发明中shRNA前体的双链区长度大于或等于19bp，靶向链(红色所示)优选位于shRNA 3′臂(但也可位于5′臂)。与此相反，saRNA双链区长度仅为16-18bp，靶向链(红色所示)只能位于saRNA 5′臂和顶端环区域。

本发明的主要优点包括：

(1)与现有的shRNA载体相比，本发明单位分子的核酶增强型shRNA载体产生的siRNA更多，对靶基因的的抑制效率更高；

(2)本发明的shRNA为利用RNAi技术选择性沉默靶基因表达提供了比传统shRNA更好的选择，在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大的潜力。

实施例

材料与方法

1.质粒构建

所有实施例中用到的shRNA瞬时表达载体构建时都是将退火后的DNA双链分子插入到H1启动子下游的BamHⅠ和HindⅢ两个限制性内切酶位点之间。所用到的针对siRNA的报告基因载体构建时都是将退火后的DNA双链分子(含siRNA靶序列)插入到萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)基因3′UTR的NheⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶位点之间。

具体实施例中所用到的shp53和shLC序列如下：

shp53:ccactacaactacatgtgtatctcgagatacacatgtagttgtagtggat(SEQ ID NO.:5)

shLC:aactggacttccagaagaactctcgagagttcttctggaagtccagttat(SEQ ID NO.:6)

所产生的siRNA序列如下：

sip53 5′-AUACACAUGUAGUUGUAGUGG-3′(SEQ ID NO.:2)

siLC 5′-AGUUCUUCUGGAAGUCCAGUU-3′；(SEQ ID NO.:1)

2.HDV核酶体外转录及切割实验

以含有shp53-RZ或shp53-mRZ的DNA片段(通过PCR方法获得)为模板，通过T7RNA聚合酶(购自Thermo公司)体外转录可获得shRNA与HDV核酶串联的RNA分子，将其中一部分RNA产物用T4PNK(购自NEB公司)在37℃处理2小时(不加ATP)，然后65℃处理20分钟。将处理过的RNA与体外转录的RNA通过TRIzol-LS试剂(购自Invitrogen公司)提取出来，然后在20％的聚丙烯酰胺凝胶(含8M尿素)上进行电泳和溴化乙锭(Ethidium Bromide)染色。

3.细胞培养及报告基因实验

所有实施例中用到的HEK293细胞都是生长在含10％胎牛血清的DMEM培养基(购自GIBCO公司)中并于37℃、5％CO₂的环境下培养。

所有针对HEK293细胞的瞬时转染实验都是使用Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)转染试剂并按其说明进行操作。荧光素酶活性的检测采用Dual-Glo luciferase assay system(购自Promega公司)并在BERTHOLD LB940仪器上进行操作。

4.慢病毒包装及感染实验

慢病毒的包装是采用VSVG/ΔR8.91系统，将三种质粒(pCMV-VSV-G、pCMVΔR8.91以及载体质粒)按照一定比例混合并转染HEK 293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收取含慢病毒颗粒的细胞上清并用0.45μm的滤膜(购自Sigma公司)过滤。获得病毒后感染目的细胞(本发明中采用HEK 293细胞)，同时在细胞培液中加入8μg/mL Hexadimethrine bromide(购自Sigma公司)，病毒感染后72小时，裂解细胞并做Western blot。

5.Western blot实验

Western blot实验都是采用含SDS的10％的聚丙烯酰胺凝胶系统，针对p53基因的鼠源单克隆抗体(购自Sigma公司)采用1:1000比例稀释并使用，针对β-actin基因的鼠源单克隆抗体(购自CoWin Biotech公司)采用1:2000比例稀释并使用。底物显色反应采用Immun-Star HRP chemiluminescence试剂盒(购自Thermo公司)并按其说明进行操作。

6.实施例中所用到的瞬时表达载体序列：

ggtaccatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccggaaaagcttagatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata(SEQ ID NO:3)，其中下划线所示序列为BamH Ⅰ和HindIII位点。

7.HDV核酶的序列：

ggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggacccactttttt(SEQ ID NO.:4)

实施例1

核酶自切割型shRNA具有自切割功能

制备的核酶自切割型shRNA的结构如图2所示。在构建的DNA表达载体中，用RNA聚合酶Ⅲ启动子(如H1)进行驱动的，表达盒包括shRNA、HDV核酶以及6个T碱基(转录终止信号)。

在该实施例中，shRNA的双链区长度大于或等于19bp(该示意图中为21bp)，顶端环大于等于2nt(该示意图中为6nt)，3′末端悬垂为2nt，HDV核酶末端连接6个U碱基。蓝色箭头处为HDV核酶切割位点。

在本实施例中，检验HDV核酶的自切割活性。

结果表明，如图3所示，通过T7RNA聚合酶体外转录的shp53-RZ可以高效地切除HDV核酶自身，产生3′末端为2′，3′-环磷酸(>P)的shRNA前体(泳道1)，这种特殊的末端结构为核酶切割所固有的特性，经过T4PNK处理后可以将环磷酸转变为羟基(OH),从而导致电泳迁移率变慢(泳道2)。通过点突变(C75U)使HDV核酶切割活性缺失后，其也就丧失了切割产生shRNA的能力(泳道3)。

实施例2

HDV核酶对shRNA抑制效率的作用

在本实施例中，用于检测siRNA对靶基因沉默效率的报告基因系统如图4a所示。将单拷贝与siRNA(21nt)序列完全互补配对的靶序列装在Fireflyluciferase(萤火虫荧光素酶)报告基因的3′UTR中。siRNA表达载体质粒与报告基因共同转染HEK293细胞后，siRNA表达载体产生的siRNA结合到靶序列后会对报告基因的表达产生抑制，通过检测Firefly luciferase活性的变化可以灵敏反映siRNA的表达和活性高低。Firefly luciferase活性下降得越多表明该siRNA的抑制效果越好。在下述试验中都使用了Firefly luciferase报告基因与shRNA共同转染细胞，Renilla luciferase(海肾荧光素酶)作为内参用于排除由转染效率和细胞生长差异等所造成的影响。

分别针对人内源P53和laminC基因设计了3′末端带有以及不带有HDV核酶的shRNA，然后将带有以及不带有HDV核酶的shp53或shLC与含对应靶序列的报告基因共同转染到HEK293细胞，24小时后检测报告基因的表达，计算shRNA对靶报告基因的抑制倍数。抑制倍数越高，表明该载体产生的siRNA效率越高。

结果如图4b和4c所示，其中，抑制倍数为1说明没有任何抑制效果，如负对照con。实验结果表明，在shRNA结构的3′末端引入HDV核酶后，其对靶基因的抑制效率相比不带HDV核酶的载体均显著提高，提高幅度分别为104％和20％(图4b、4c)。

实施例3

HDV核酶对shRNA抑制效率的提高具有普适性

方法同实施例2，不同点在于：在HeLa和Huh7细胞内用荧光素酶报告基因实验检测HDV核酶对shRNA(21bp)抑制活性的影响。将带有以及不带有HDV核酶的shRNA与含对应靶序列的报告基因共同转染到目的细胞中，24小时后检测报告基因的表达。抑制倍数越高，表明该载体产生的siRNA效率越高。

结果表明，shRNA+HDV核酶表达盒具有很好的普适性,在多种人类体外培养细胞(如HeLa、Huh7等)中都显示增加HDV核酶后对shRNA的抑制效率有明显的提高作用(图5a、5b)。

实施例4

HDV核酶对shRNA抑制效率的提高适用于内源基因的沉默

在本实施例中，将核酶增强型shRNA的表达盒构建到慢病毒表达载体中(图6a)，通过包装获得相应慢病毒，将慢病毒形式的shp53和shp53-RZ以及对照病毒(con)分别加到HEK293细胞中，并通过Western blot比较它们对细胞内源的p53基因表达的抑制作用。

结果表明，shRNA+HDV核酶慢病毒形式表达盒相对于不加HDV核酶的表达盒，其对细胞内源基因(P53)的抑制作用有明显的提高(图6b)，其中shp53-RZ-1和shp53-RZ-2都比shp53的抑制作用提高了约60％。

实施例5.3′端连接其它核酶的saRNA的制备及效果

重复实施例2，但区别在于：用发夹状核酶、锤头状核酶替换实施例2中核酶增强型shRNA中的HDV核酶。

同样，相比不带核酶的shp53，在3′端引入上述核酶后，其对靶基因的抑制效率的提高幅度为＞20％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (10)

1.一种核酶增强型shRNA，所述核酶增强型shRNA的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度大于或等于19nt；

(b)顶端环区域，所述顶端环区域长度大于或等于2nt；

(c)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；

(d)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为0-6nt；

(e)与3′端未配对区域相连的核酶区，所述核酶区编码具有自切割功能的核酶，

其中，所述核酶增强型shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对区域或5′端配对区域。

2.如权利要求1所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述核酶增强型shRNA中顶端环长度为2-10nt。

3.如权利要求1所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述3′端未配对区域长度为1-6nt。

4.如权利要求1-3中任一项所述的核酶增强型shRNA，其特征在于，所述核酶选自下组：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶。

5.一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-4中任一项所述的核酶增强型shRNA的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号。

6.一种构建物，所述构建物包含权利要求5所述的表达盒。

7.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-4中任一项所述的核酶增强型shRNA或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的构建物。

8.一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将权利要求1-4中任一项所述的核酶增强型shRNA或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的构建物转入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

9.一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将权利要求1-4中任一项所述的核酶增强型shRNA或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的构建物转入哺乳动物细胞。

10.一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)权利要求1-4中任一项所述的核酶增强型shRNA或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的构建物；和

2)适合将1)所述的核酶增强型shRNA或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。