CN107557363B - 可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型shRNA及其制备方法和应用。所述shRNA从5′端到3′端依次为：(a)5′端旁侧序列区；(b)5′端配对siRNA区域；(c)顶端环区域；(d)3′端配对siRNA区域，并且所述5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域形成双链区域；(e)3′端旁侧序列区；所述shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对siRNA区域或5′端配对siRNA区域。本发明还提供了包含所述的shRNA的表达盒、构建物、慢病毒载体和细胞。

Description

可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(smallinterfering RNA，siRNA)介导的RNA降解现象。RNAi最初在秀丽线虫中被发现，此后在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中发现RNAi都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，Craig Mello和Andrew Fire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wet age-related macular degeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(Hepatitis B)、实体瘤(solid tumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychiacongenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。

RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的siRNA表达载体。其中目前应用最广的是shRNA(shorthairpin RNA)，虽然这些基于RNA聚合酶Ⅲ的siRNA前体表达载体的转录效率高，且能在大多数种类的组织细胞中表达，但很难做成可诱导型的siRNA表达载体，从而阻碍了对基因表达的可控调节。后来研究人员将siRNA序列替换miRNA序列并构建到miRNA的前体上，通过RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，polⅡ)启动子转录产生类似pri-miRNA结构的shRNAmir。这种siRNA前体可以被细胞核内的核酸酶Drosha以及细胞质中的Dicer进行连续切割并进一步产生成熟的siRNA，也可以有效地沉默靶基因的表达。shRNAmir的主要优点是可以通过选择不同类型的RNA聚合酶Ⅱ启动子进行组织特异性的表达siRNA，以及通过可诱导调节的启动子，从而达到对靶基因表达的可控调控。

目前国际上广泛使用的shRNAmir表达载体主要是用人miR-30的骨架为基础构建的，如OpenBiosystem，但其介导的基因沉默效率总体偏低，并且由于miRNA的加工过程造成所在慢病毒载体包装成病毒颗粒的效率显著降低。因此，本领域迫切需要开发经济高效的siRNA载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效地可诱导调控或组织特异性调控靶基因表达的基于miRNA前体的siRNA表达载体。

在本发明的第一方面，提供了一种短发夹RNA(shRNA)序列，所述shRNA序列为核苷酸序列，并且从5′端到3′端依次具有以下区域：

(a)5′端旁侧序列区，所述5′端旁侧序列区长度大于或等于17nt；

(b)5′端配对siRNA区域，所述5′端配对siRNA区域长度大于或等于19nt；

(c)顶端环区域，所述顶端环区域的序列如SEQ ID NO.:1所示(UGUGCUGUC)；

(d)3′端配对siRNA区域，所述3′端配对siRNA区域长度大于或等于19nt，并且所述5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域形成双链siRNA区域，所述双链区域长度大于或等于19bp；

(e)3′端旁侧序列区，所述3′端旁侧序列区长度大于或等于17nt；

其中，所述shRNA序列产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对siRNA区域或5′端配对siRNA区域。

在另一优选例中，所述5′端旁侧序列区长度大于20nt。

在另一优选例中，所述5′端配对siRNA区域长度为20-25nt。

在另一优选例中，所述3′端配对siRNA区域长度为20-25nt。

在另一优选例中，所述双链区域长度为20-25nt。

在另一优选例中，所述3′端旁侧序列区长度大于20nt。

在另一优选例中，所述5′端旁侧序列区和3′端旁侧序列区形成互补的双链旁侧区域，其中所述互补的双链旁侧区域的长度大于4nt。

在另一优选例中，所述互补的双链旁侧区域的长度为4-10nt。

在另一优选例中，所述互补的双链旁侧区域与所述的双链siRNA区域之间有0、1或2个nt的间隔。

在另一优选例中，所述5′端配对siRNA区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt。

在另一优选例中，所述3′端配对siRNA区域长度为19-28nt，更佳地为20-25nt。

在另一优选例中，所述双链siRNA区域的长度为19-28bp，更佳地为20-25bp。

在另一优选例中，所述的5′端配对siRNA区域为shRNA的靶向链(guide strand)。

在另一优选例中，所述的5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域有0、1或2个不配对的核苷酸。

在另一优选例中，所述的不配对的核苷酸位于(a)5′端配对siRNA区域与5′端旁侧序列区的交界处和/或(b)3′端配对siRNA区域与3′端旁侧序列区的交界处。

在另一优选例中，所述的5′端旁侧序列区含有限制性内切酶识别序列。

在另一优选例中，所述的5′端旁侧序列区含有限制性内切酶Xhol识别序列。

在另一优选例中，所述的5′端旁侧序列区的序列选自下组：

如SEQ ID NO.:2所示的野生型序列(5′-CCCUGCCCGGGACCCAG-3′)、和如SEQ IDNO.:3所示的突变型序列(含XhoI酶切位点，5′-CCCUGCCCGGCUCGAGG-3′)。

在另一优选例中，所述的3′端旁侧序列区含有限制性内切酶识别序列。

在另一优选例中，所述的3′端旁侧序列区含有限制性内切酶Agel识别序列。

在另一优选例中，所述的3′端旁侧序列区的序列选自下组：

如SEQ ID NO.:4所示的野生型序列(5′-UCGGGGACCGGUGCCCU-3′)、和如SEQ IDNO.:5所示的突变型序列(含Agel酶切位点，5′-CCUCGCACCGGUGCCCU-3′)。

在本发明的第二方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含本发明第一方面所述的shRNA序列的编码序列以及任选的与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号。

在另一优选例中，所述的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。

在另一优选例中，所述表达盒在转录后产生本发明第一方面所述的shRNA序列。

在另一优选例中，所述的表达盒为诱导型表达盒，所述的诱导型表达盒从5′端到3′端依次具有以下元件：

(i)诱导型启动子；

(ii)第一元件，所述的第一元件包含一荧光蛋白基因5′UTR及其包含的内含子序列和插入所述内含子序列中的本发明第一方面所述的shRNA的编码序列；

(iii)第二元件，所述的第二元件包含所述荧光蛋白的编码序列；

(iv)任选的终止信号。

在本发明的第三方面，提供了一种构建物，所述构建物从5′端到3′端依次具有以下元件：

(i)第一元件，所述的第一元件包含一荧光蛋白基因5′UTR及其包含的内含子序列和插入所述内含子序列中的本发明第一方面所述的shRNA序列的编码序列；

(ii)第二元件，所述的第二元件包含所述荧光蛋白的编码序列。

在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自下组：红色荧光蛋白(tRFP)、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白。

在另一优选例中，所述的第二元件的下游还包含转录终止信号。

在另一优选例中，所述的转录终止信号与所述荧光蛋白的编码序列为同向连接。

在另一优选例中，所述的转录终止信号为HSV-TK(herpes simplex virusthymidine kinase)polyA转录终止信号序列，较佳地为HTpA。

在另一优选例中，所述的转录终止信号包括源于Actin、Globin等基因的转录终止信号序列

在另一优选例中，所述的转录终止信号包括人工合成的转录终止信号序列。

在另一优选例中，所述第一元件的上游还包含第一启动子。

在另一优选例中，所述第一启动子包括诱导型启动子。

在另一优选例中，所述的诱导型启动子包括：

(i)由四环素及其衍生物Dox诱导的启动子，较佳地为TRE3G或TRE启动子；

(ii)Gal4启动子、Ecdysone诱导启动子、光诱导启动子、或热诱导的启动子。

在另一优选例中，所述的shRNA的编码序列插入所述内含子序列中间位置，但不限于中间，以避免插入序列对内含子的剪接造成影响为准。

在本发明的第四方面，提供了一种慢病毒载体，所述的慢病毒载体包括慢病毒基因组序列，以及反向插入所述慢病毒基因组序列的本发明第二方面所述的表达盒作为第一表达盒。

在另一优选例中，所述的第一表达盒为诱导型表达盒。

在另一优选例中，所述的第一表达盒插入所述慢病毒基因组序列中内源性或外源性的内含子区域。

在另一优选例中，所述的内含子区域(黑色三角箭头标出)为5′UTR的内含子区域。

在另一优选例中，所述的5′UTR的内含子区域为荧光蛋白基因5′UTR内含子序列。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体还包括(ii)表达所述诱导型启动子的调节蛋白的第二表达盒。

在另一优选例中，所述的第二表达盒正向插入所述的慢病毒基因组序列。

在另一优选例中，所述的第二表达盒包含所述调节蛋白的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的第二启动子和第二终止信号。

在另一优选例中，所述的第二启动子为组成型启动子。

在另一优选例中，所述的组成型启动子选自下组：EF1、PGK、CMV、UBC、CAG、和SV40。

在另一优选例中，所述的第二启动子为组织特异性启动子。

在另一优选例中，所述的组织特异性启动子选自下组：肝脏特异性的启动子IGFⅡ、Alb，或神经组织特异性的启动子NSE、GFAP。

在另一优选例中，所述的调节蛋白为Teton3G。

在另一优选例中，所述的第二表达盒中还包含一筛选基因。

在另一优选例中，所述的筛选基因包括抗性基因，较佳地为Puromycin基因、Hygromycin基因、或Neomycin基因。

在另一优选例中，所述的筛选基因位于所述调节蛋白编码序列的下游。

在另一优选例中，所述的调节蛋白的编码序列和所述的筛选基因由同一启动子(即第二启动子)调控。

在另一优选例中，所述的筛选基因与所述调节蛋白编码序列之间设有IRES元件。

在另一优选例中，所述的诱导型启动子与第二启动子操作性相连。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体从5′端到3′端依次具有以下元件：

(i)5′LTR元件；

(ii)cPPT元件；

(iii)反向连接的本发明第二方面所述的表达盒；

(iv)所述的第二表达盒；

(v)WRE元件；

(vi)sinLTR元件。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体为可诱导型载体。

另一优选例中，所述的慢病毒载体可被Doxycycline诱导。

在本发明的第五方面，提供了一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体。

在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种产生siRNA的方法，所述方法包括：

1)将本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体转入哺乳动物细胞；和

2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

在另一优选例中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。

在另一优选例中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

在本发明的第七方面，提供了一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：

将本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体转入哺乳动物细胞。

在本发明的第八方面，提供了一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：

1)本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体；和

2)适合将1)所述的shRNA序列或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

在另一优选例中，所述组合物还包含Dicer蛋白。

在本发明的第九方面，提供了一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)容器，所述容器中装有本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体；和

2)使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

在本发明的第十方面，提供了本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体在哺乳动物细胞中产生siRNA，从而实施RNA干扰，进而能特异性地调控靶基因表达中的应用。

在本发明的第十一方面，提供了本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体在制备在哺乳动物细胞中实施RNA干扰的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的第十二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)本发明第一方面所述的shRNA序列、本发明的第二方面所述的表达盒、本发明的第三方面所述的构建物、本发明的第四方面所述的慢病毒表达载体；和

b)药学上可接受的载体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了以不同miRNA前体为骨架的siRNA表达载体对靶基因抑制效率的比较。

图2显示了以miR-26b前体为骨架的siRNA表达载体(shRNAmir)示意图及siRNA序列设计图。

图3A显示了对稳定整合了shP53mir的HEK293细胞用药物(Doxycycline)诱导不同时间后荧光蛋白的表达变化。

图3B显示了对稳定整合了shP53mir的HEK293细胞用药物(Doxycycline)诱导不同时间后内源p53蛋白的表达变化，β-actin作为内参蛋白。

图4A显示了对用Doxycycline持续诱导的稳定整合了shP53mir的HEK293细胞，撤除药物不同时间后荧光蛋白的表达变化。

图4B显示了对用Doxycycline持续诱导的稳定整合了shP53mir的HEK293细胞，撤除药物不同时间后内源p53蛋白的表达变化，β-actin作为内参蛋白。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现具有特殊结构的shRNA，其加工生成siRNA和介导基因沉默的效率显著高于目前已有的同类型载体。在此基础上，对该shRNA进行了一系列改造和加工，构建了基于该shRNA的诱导型siRNA表达载体，大大提高了病毒的包装效率。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过大量前期实验发现人miR-26b前体具备高效加工产生siRNA所需的关键二级结构或一级序列特征，其加工生成siRNA和介导基因沉默的效率显著高于目前已有的载体。在此基础上对miR-26b前体进行了一系列改造，在siRNA位点旁侧插入了酶切位点便于克隆siRNA序列而不影响siRNA的加工效率。另外，同时在慢病毒载体上引入了反向的内含子序列，将经过改造的miR-26b前体引入该内含子区域的特定位点，大大提高了病毒的包装效率，成功构建了更为高效的基于miR-26b前体的诱导型siRNA表达慢病毒载体。

本发明的主要特征有：(1)选择人类miR-26b的前体作为骨架表达siRNA序列；(2)为了方便克隆siRNA序列，在miR-26b前体序列中引入两个酶切位点，该位点的引进不影响其加工生成siRNA；(3)为了避免该miRNA前体加工时对其所在转录本的破坏，将shRNAmir表达盒置于一个红色荧光蛋白基因5′UTR的内含子中，使得miR-26b前体的加工和内含子的剪接就可以同时进行又不会相互干扰；(4)为了避免慢病毒包装过程中病毒转录本发生剪接导致shRNAmir的丢失，将包含内含子在内的诱导表达盒反向连接入慢病毒基因组；(5)将该表达盒置于一个诱导型的启动子(TRE3G)后面，同一载体上也表达该诱导启动子的调节蛋白(Teton3G)并将整个框架构建到慢病毒载体中。

术语

如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的RNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。

如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之序列互补的目标RNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

如本文所用，术语“siRNA前体”是指可以在哺乳动物细胞中被加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。

如本文所用，术语“构建物”是包含本发明shRNA的构建物。

如本文所用，术语“表达盒”是指包含本发明shRNA的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的shRNA。

如本文所用，术语“诱导型表达盒”是指包含本发明shRNA编码序列和诱导型启动子的表达盒，较佳地，所述表达盒还包含一荧光蛋白基因，且所述的shRNA编码序列插入所述荧光蛋白基因5′UTR内含子序列中。

如本文所用，术语“第二表达盒”是指包含调节蛋白的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的第二启动子和第二终止信号，所述的调价蛋白是所述“诱导型表达盒”中包含的诱导型启动子的调节蛋白。

如本文所用，术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。

shRNA

如本文所用，术语“本发明shRNA”、“shRNA”可互换使用，是以人miR-26b的前体作为骨架构建的一种特殊的shRNA。所述shRNA从5′端到3′端依次为：(a)5′端旁侧序列区；(b)5′端配对siRNA区域；(c)顶端环区域；(d)3′端配对siRNA区域，并且所述5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域形成双链区域；(e)3′端旁侧序列区；所述shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对siRNA区域或5′端配对siRNA区域。

广义的shRNA是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，通常由细胞内源的RNA聚合酶III(RNA polymerase III)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。shRNA也可以由其它RNA聚合酶的启动子转录产生。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的siRNA表达载体加工生成siRNA和介导基因沉默的效率显著高于目前已有的同类型基于其它miRNA前体的siRNA表达载体。

(b)本发明通过可诱导调节的启动子，从而达到对靶基因表达的可控调控。

(c)本发明可以通过将第二启动子更换为组织特异性的启动子，可以实现对靶基因的组织特异性调控。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料和方法

1.质粒构建

所有实施例中用到的pT3G-siP53及相关表达shRNAmir的慢病毒质粒构建时将退火后的双链DNA oligo插入到pT3G-con质粒(改造自pTRIPZ质粒-Open Biosystem)的AgeⅠ和XhoⅠ位点之间。

2.细胞培养

所有实施例中用到的HEK293细胞都是生长在含10％胎牛血清和青霉素、链霉素两种抗生素的DMEM培养基(购自GIBCO公司)中并于37℃、5％CO₂的环境下培养。

3.慢病毒包装及感染实验

所有实施例中的慢病毒的包装是采用VSVG/ΔR8.91系统，将三种质粒(pCMV-VSV-G、pCMVΔR8.91以及载体质粒)按照1:3:4的质量比混合并转染HEK293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收取含慢病毒颗粒的细胞上清并用0.45μm的滤膜(购自Sigma公司)过滤。获得病毒后感染目的细胞(本专利中采用HEK 293细胞)，同时在细胞培液中加入8μg/mLHexadimethrine bromide(购自Sigma公司)，培养24小时后换成含1μg/ml puromycin(购自Sigma公司)的培液并培养几天以获得稳转的细胞系。

4.Western blot实验

实施例中所涉及的Western blot实验都是采用含SDS的10％的聚丙烯酰胺凝胶系统，针对p53基因的鼠源单克隆抗体(购自Sigma公司)采用1:1000比例稀释并使用，针对β-actin基因的鼠源单克隆抗体(购自CoWin Biotech公司)采用1:2000比例稀释并使用。底物显色反应采用Immun-Star HRP chemiluminescence试剂盒(购自Thermo公司)并按其说明进行操作。

实施例1

本发明通过改造常用的几个miRNA前体—miR-26b、miR-30a、miR-125b以及let-7a(其中miR-30a是Openbiosystem公司shRNAmir产品所采用的miRNA前体)，把它们的成熟miRNA序列替换成siRNA序列，并通过报告基因实验检测它们所表达的siRNA对靶基因的抑制效果。

结果显示以miR-26b前体所表达的siRNA对靶基因的抑制效率明显高于其它三个miRNA前体(图1)。

实施例2

本发明中的载体构造如图2所示，为了方便克隆siRNA序列，在miR-26b前体中引进了两个酶切位点—XhoI和AgeI(蓝色序列)，该位点的引进并不影响其加工，图中的红色序列表示siRNA的guide strand，其位于miR-26b前体的5′臂上。为了避免miRNA前体加工时对其所在转录本的破坏，将shRNAmir置于一个红色荧光蛋白基因(tRFP)5′UTR的内含子中，这样miR-26b前体的加工和内含子的剪接就可以同时进行又不会相互干扰。将该表达盒置于一个诱导型的启动子(TRE3G)后面，同一载体上也表达该诱导启动子的调节蛋白(Teton3G)并将整个框架构建到慢病毒载体中(图2)。将包含内含子在内的诱导表达盒反向连接入慢病毒基因组是为了避免慢病毒包装过程中病毒转录本发生剪接并导致shRNAmir的丢失。

实施例3

将针对内源P53基因的siRNA序列克隆到改造后的miR-26b前体骨架中，包装成慢病毒并感染HEK293细胞，通过puromycin药物筛选后得到稳定整合shP53mir的细胞系，然后用Doxycycline诱导该细胞。结果显示，随着诱导时间的增加，荧光蛋白(turboRFP)的表达也逐渐增强，而没有诱导时(0天)，完全看不到荧光蛋白的表达，说明该诱导启动子的渗漏性非常低(图3A)，同时Western blot结果显示，随着诱导时间的增加，内源p53蛋白的表达逐渐减少，最后达到80％左右的稳定knockdown效果(图3B)。

实施例4

对于用Doxycycline持续诱导的稳转shP53mir的细胞，当把Doxycycline从细胞培液中撤除后，荧光蛋白的表达逐渐关闭(图4A)，同时内源p53蛋白的表达也得到了恢复，撤除Doxycycline 12天时，p53蛋白基本恢复到野生型细胞的表达水平(图4B)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (27)

1.一种shRNA序列，其特征在于，所述shRNA序列为核苷酸序列，并且从5´端到3´端依次具有以下区域：

(a) 5´端旁侧序列区，所述5´端旁侧序列区长度大于或等于17 nt；

(b) 5´端配对siRNA区域，所述5´端配对siRNA区域长度大于或等于19 nt；

(c) 顶端环区域，所述顶端环区域的序列如SEQ ID NO: 1所示；

(d) 3´端配对siRNA区域，所述3´端配对siRNA区域长度大于或等于19 nt，并且所述5´端配对siRNA区域与3´端配对siRNA区域形成双链siRNA区域，所述双链区域长度大于或等于19 bp；

(e) 3´端旁侧序列区，所述3´端旁侧序列区长度大于或等于17 nt；

其中，所述shRNA序列产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3´端配对siRNA区域或5´端配对siRNA区域；

并且，所述的5´端旁侧序列区的序列如SEQ ID NO: 3所示，所述的3´端旁侧序列区的序列如SEQ ID NO: 5所示。

2.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述5´端配对siRNA区域长度为19-28nt。

3.如权利要求2所述的shRNA序列，其特征在于，所述5´端配对siRNA区域长度为20-25nt。

4.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述3´端配对siRNA区域长度为19-28nt。

5.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述3´端配对siRNA区域长度为20-25nt。

6.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述5´端旁侧序列区和3´端旁侧序列区形成互补的双链旁侧区域，其中所述互补的双链旁侧区域的长度为4-10 nt。

7.如权利要求6所述的shRNA序列，其特征在于，所述互补的双链旁侧区域与所述的双链siRNA区域之间有0、1或2个nt的间隔。

8.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述的5´端配对siRNA区域与3´端配对siRNA区域有0、1或2个不配对的核苷酸。

9.如权利要求8所述的shRNA序列，其特征在于，所述的不配对的核苷酸位于(a)5´端配对siRNA区域与5´端旁侧序列区的交界处和/或(b)3´端配对siRNA区域与3´端旁侧序列区的交界处。

10.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述的5´端旁侧序列区含有限制性内切酶识别序列。

11.如权利要求1所述的shRNA序列，其特征在于，所述的3´端旁侧序列区含有限制性内切酶识别序列。

12.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的shRNA序列的编码序列以及任选的与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号。

13.如权利要求12所述的表达盒，其特征在于，所述的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。

14.如权利要求12所述的表达盒，其特征在于，所述的表达盒为诱导型表达盒，所述的诱导型表达盒从5´端到3´端依次具有以下元件：

(i) 诱导型启动子；

(ii) 第一元件，所述的第一元件包含一荧光蛋白基因5´UTR及其包含的内含子序列和插入所述内含子序列中的权利要求1所述的shRNA的编码序列；

(iii) 第二元件，所述的第二元件包含所述荧光蛋白的编码序列；

(iv) 任选的终止信号。

15.一种构建物，其特征在于，所述构建物从5´端到3´端依次具有以下元件：

(i) 第一元件，所述的第一元件包含一荧光蛋白基因5´UTR及其包含的内含子序列和插入所述内含子序列中的权利要求1所述的shRNA序列的编码序列；

(ii) 第二元件，所述的第二元件包含所述荧光蛋白的编码序列。

16.如权利要求15所述的构建物，其特征在于，所述的第二元件的下游还包含转录终止信号。

17.如权利要求15所述的构建物，其特征在于，所述第一元件的上游还包含第一启动子，且所述第一启动子包括诱导型启动子。

18.一种慢病毒载体，其特征在于，所述的慢病毒载体包括慢病毒基因组序列，以及反向插入所述慢病毒基因组序列的如权利要求12所述的表达盒作为第一表达盒。

19.如权利要求18所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的第一表达盒插入所述慢病毒基因组序列中内源性或外源性的内含子区域。

20.如权利要求19所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的内含子区域为5´UTR的内含子区域。

21.如权利要求20所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的5´UTR的内含子区域为荧光蛋白基因5´UTR内含子序列。

22.如权利要求18所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的启动子为诱导型启动子，且所述的慢病毒载体还包括表达所述诱导型启动子的调节蛋白的第二表达盒。

23.如权利要求22所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的慢病毒载体从5´端到3´端依次具有以下元件：

(i) 5´LTR元件；

(ii) cPPT元件；

(iii) 反向连接的权利要求13所述的表达盒；

(iv) 所述的第二表达盒；

(v) WRE元件；

(vi) sinLTR元件。

24.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述的shRNA序列、权利要求12所述的表达盒、权利要求15所述的构建物、或权利要求18所述的慢病毒表达载体。

25.一种产生siRNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

1) 将权利要求1所述的shRNA序列、权利要求12所述的表达盒、权利要求15所述的构建物、或权利要求18所述的慢病毒表达载体转入哺乳动物细胞；和

2) 培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。

26.一种组合或组合物，其特征在于，所述组合或组合物包含：

1) 权利要求1所述的shRNA序列、权利要求13的表达盒、权利要求15所述的构建物、或权利要求18所述的慢病毒表达载体；和

2) 适合将1)所述的shRNA序列或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；

所述组合或组合物在导入哺乳动物细胞后产生siRNA或实施RNAi。

27.一种用于实施RNA干扰或产生siRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1) 容器，权利要求1所述的shRNA序列、权利要求12的表达盒、权利要求15所述的构建物、或权利要求18所述的慢病毒表达载体；和

2) 使用说明书，所述说明书记载了利用所述试剂盒产生siRNA或实施RNA干扰的方法。

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