CN101679962A - 单链环状rna及制备该单链环状rna的方法 - Google Patents

单链环状rna及制备该单链环状rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有持续或缓慢释放的RNA干扰作用的单链环状RNA，其特征在于该单链环状RNA包含有义链序列、与该有义链序列互补的反义链序列、在有义链和反义链之间连接这两条链的相同或不同的两条环序列，其中有义链和反义链配对形成茎干。

Description

单链环状RNA及制备该单链环状RNA的方法
技术领域
本发明涉及单链环状RNA，制备该RNA的方法以及包含该RNA的药物组合物。
背景技术
常规的RNA干扰方法通常分成两类：一种方法使用化学合成的双链RNA以及另一种方法使用质粒载体。使用质粒载体的RNA干扰方法被广泛地应用于生物技术领域中，主要是应用于基础生物学实验。然而，当将RNA干扰方法应用于开发药物制剂时，使用质粒载体的方法存在对人体安全性的问题。因此，可能要更优先使用化学合成的双链RNA。
然而，存在着化学合成的双链RNA在体内不稳定的问题，即对细胞中酶(核酸酶)降解敏感。为解决该问题，业已开发了具有非天然核酸的RNA链以增强双链RNA在细胞中的稳定性；然而，仍然存在着另一个问题即当稳定性提高时其生物活性却降低了。此外，非天然核酸所引起的毒性未知。因此，还难以实现应用于药物制剂。
可用于RNA干扰方法的双链RNA的形式包括具有平端或突出端的双链RNA，在双链RNA任何一个末端具有环状发夹结构的RNA(JP2003-502012A)，包含大约19个碱基对、两个环和任选地化学修饰的多核苷酸的环状核酸(JP2006-271387A)等。然而，还未对该环状核酸进行RNA干扰作用的测试。
此外，披露了RNA-DNA嵌合的哑铃形核酸(JP11-137260A(1999))。该核酸没有用于RNA干扰。该哑铃形核酸的RNA部分被细胞中的酶切割，所制备的反义DNA部分结合细胞中的mRNA从而抑制其。JP11-137260A(1999)披露了核酸由于其哑铃形结构而具有对细胞中核酸降解酶的高抗性，并且在细胞中一直保持稳定直到核糖核酸酶H发挥作用。其进一步披露了由于包含反义DNA部分的单链寡核苷酸可只在利用核糖核酸酶H的作用切割互补的RNA部分后才被释放入细胞的细胞质中，因此每剂量的反义作用据信得到增强。
此外，关于合成具有哑铃形结构的环状核酸的方法，举例来说，披露了线型寡核苷酸被合成，形成茎干(stem)区和发夹环区以获得带切口的哑铃形寡核苷酸，其中靶环状哑铃形寡核苷酸的一个位点(上述发夹环区的相对末端)未被结合，以及使用连接酶连接5’末端来制备环状哑铃形环状核酸(JP11-137260(1999))。
本发明的一个目的是提供单链环状RNA以及该单链环状RNA的制备方法。
发明内容
本发明人现已意外地发现可通过分别合成有义链和反义链，两者均包含在各自末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列，并让连接酶同时作用于处于两者末端的核苷酸，从而以高产率获得单链环状RNA，并且这样获得的单链环状RNA发挥持续或缓慢释放的RNA干扰作用。基于这些科学发现，本发明人完成了本发明。
更具体地说，本发明包括下列发明。
(1)一种具有持续或缓慢释放的RNA干扰作用的单链环状RNA，其特征在于该单链环状RNA包含有义链序列、与该有义链序列互补的反义链序列、在有义链和反义链之间连接这两条链的相同或不同的两条环序列，其中有义链和反义链配对形成茎干。
(2)根据上述(1)的单链环状RNA，其中与其靶RNA的表达水平被设定为1的对照细胞相比，在将单链环状RNA引入真核细胞后24小时，靶RNA的表达为0.4或更低。
(3)根据上述(1)或(2)的单链环状RNA，其中在人血清中8小时后70％或更多的单链环状RNA被保留。
(4)一种制备根据上述(1)-(3)任一的单链环状RNA的方法，其包括合成有义链和反义链，两者都包含在5’末端和3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列，以及同时使用连接酶将有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在5’末端的核苷酸与反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在3’末端的核苷酸连接，反之亦然，
其中有义链的在5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列和反义链的在3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列彼此连接形成环，有义链的在3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列和反义链的在5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列彼此连接形成环，以及有义链和反义链配对形成茎干。
(5)根据上述(4)的方法，进一步包括磷酸化有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列和反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的每个5’末端。
(6)根据上述(4)或(5)的方法，其中环序列彼此相同或不同。
(7)根据上述(4)-(6)任一的方法，其中环长度为2-20个核苷酸。
(8)根据上述(4)-(7)任一的方法，其中茎干长度为19-31个核苷酸。
(9)一种体外抑制编码蛋白质的基因表达的方法，其包括将根据上述(1)-(3)任一的单链环状RNA引入人源细胞中，并以一种持续的方式通过该单链环状RNA减弱靶RNA，从而抑制该靶RNA翻译成蛋白。
(10)一种抑制编码蛋白质的基因表达的方法，其包括将根据上述(1)-(3)任一的单链环状RNA引入非人动物、植物或它们的细胞中，并以一种持续的方式通过该单链环状RNA减弱靶RNA，从而抑制该靶RNA翻译成蛋白。
(11)一种药物组合物，其包含作为活性成分的根据上述(1)-(3)任一的单链环状RNA。
当在本文中使用时，术语“单链环状RNA”可指哑铃形RNA。哑铃形RNA指一种单链环状RNA，其中有义链和反义链互补配对形成茎干，通过具有未配对核苷酸的核苷酸序列在茎干两侧形成环，以及该单链环状RNA的整体形状为哑铃形。
根据本发明，能有效地制备在稳定性、持续性和缓释性上优异的哑铃形合成的RNA。
特别是，可通过环化两条RNA链制备用于RNA干扰方法的哑铃形RNA。由于在环形中两末端闭合，因此不具有RNA末端，并且因而不可能作为除细胞中特定的酶例如切酶(Dicer)以外的酶、核酸外切酶(核糖核酸酶)等的底物。因此，其对酶催降解较不敏感，并且具有显著增加的在细胞中的稳定性。从而，无需使用非天然核酸来增加稳定性。
此外，哑铃形RNA为体内酶如细胞中切酶所特异性识别，从而两侧环区被切割形成天然存在类型的双链RNA(图1)。结果，其可具有相当于双链RNA的活性，并较通过常规的双链RNA的RNA干扰作用发挥更持久或缓慢释放的作用。
本发明的哑铃形RNA在人血清中同样较常规的双链RNA更稳定。
附图简述
图1是本发明的哑铃形RNA的示意图。
图2显示了RNA的结构以及每种RNA的电泳图像。
图3显示了siRNA和哑铃形RNA的结构。
图4显示了被切酶切割的哑铃形RNA和线型双链RNA的电泳图像。
图5显示了转染后24小时每种哑铃形RNA的干扰作用。
图6显示了哑铃形RNA的持久的RNA干扰作用。
图7显示了哑铃形RNA在人血清中的稳定性。
实施发明的最佳方式
本发明的单链环状RNA包括与靶RNA或其部分的核苷酸序列同源的有义链序列、与该有义链序列互补并能与其配对的反义链序列以及在链之间无法形成配对的环序列。
有义链和反义链配对形成茎干。没有特别限制，茎干的长度可取决于靶RNA的类型、结构等来确定。例如，茎干由19-31个碱基对、优选21-25个碱基对、更优选22-24个碱基对以及还更优选23个碱基对组成。
具有未配对核苷酸的核苷酸序列存在于有义链和反义链两者的5’末端和3’末端。有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在5’末端的核苷酸和反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在3’末端的核苷酸连接在一起形成环。有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在3’末端的核苷酸和反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在5’末端的核苷酸连接在一起形成环。环长度优选为2-20个碱基，更优选6-12个碱基。因此，整个单链环状RNA优选由42-102个碱基组成。
在此，在有义链的5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列表示为A，在反义链的3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列表示为B，在有义链的3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列表示为C，以及在反义链的5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列表示为D，举例来说，如果环长度为20个碱基，则A长度为1-19个碱基，B长度为19-1个碱基，C长度为19-1个碱基，以及D长度为1-19个碱基。因此，在A的5’末端的核苷酸和在B的3’末端的核苷酸连接在一起形成20个碱基的环，以及在C的3’末端的核苷酸和在D的5’末端的核苷酸连接在一起形成20个碱基的环。
优选的是，彼此无法形成配对的序列在A和B之间以及在C和D之间的长度变化为例如1个碱基、2个碱基或3个碱基，或者作为选择地，序列具有相同的长度。因此，例如，当环长度为8个碱基时，优选A长度为3-5个碱基，B长度为5-3个碱基，C长度为5-3个碱基以及D长度为3-5个碱基。当环长度为9个碱基时，优选A长度为3-6个碱基，B长度为6-3个碱基，C长度为6-3个碱基以及D长度为3-6个碱基。当环长度为10个碱基时，优选A长度为4-6个碱基，B长度为6-4个碱基，C长度为6-4个碱基以及D长度为4-6个碱基。
此外，A和B形成的环以及C和D形成的环的核苷酸序列可以是相同或不同的。
本发明的单链环状RNA可用于RNA干扰方法。
RNA干扰也被称为RNAi，是一种其中具有与靶RNA互补的序列的小RNA分子结合该靶RNA，从而降解该靶RNA或抑制该靶RNA的翻译的现象。
哑铃形RNA的反义链具有与靶RNA(例如mRNA或其前体RNA)互补的序列。此外，具有未配对核苷酸的核苷酸序列包括但不限于UUCAAGAGA和UGUGCUGUC(M.Miy agishi等，Oligonucleotides2003，Vol.13：pp.1-7)。
此外，哑铃形RNA中的环可以被化学修饰。例如，可通过用分子量为约2000-5000的聚乙二醇修饰增加哑铃形RNA的体内稳定性。通过酶如细胞中的切酶切割要被除去的哑铃形RNA的环。因此，相信当茎干作为siRNA或miRNA发挥其RNA干扰作用时，聚乙二醇具有很小的影响。
与其靶RNA的表达水平被设定为1的对照细胞(没有引入哑铃形RNA)相比，使用本发明的哑铃形RNA，在将哑铃形RNA引入细胞后24小时，其中已引入哑铃形RNA的细胞中的表达优选为0.4或更低。
根据本发明，细胞是真核细胞，优选动物细胞和植物细胞。
可通过例如用报道基因(如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或绿色荧光蛋白(GFP)基因)转化细胞，并测定报道基因-衍生的蛋白的颜色或荧光以检查通过该哑铃形RNA抑制靶RNA表达的水平，从而检验靶RNA的表达，其中报道基因的mRNA可被用作靶RNA。
此外，本发明的哑铃形RNA表现出在人血清中8小时后其70％或更多被保留而不被降解的特征。例如，可通过在人血清中温育哑铃形RNA并通过使用电泳等测定分子量来检测其是否随时间降解，从而证实这一特征。
制备本发明的哑铃形单链环状RNA的方法包括合成有义链和反义链，两者都包含在5’末端和3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列，以及同时使用连接酶将有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在5’末端的核苷酸与反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在3’末端的核苷酸连接，反之亦然。
基于靶基因的核苷酸序列，有义链和反义链可设计成能抑制靶基因的作用。可通过制备多条有义和反义链并测试每条的抑制有效性来证实这一设计。例如，可实施使用了用于siRNA设计的算法等的设计(参考文献：J.A.Jaeger等，Methods in Enzymology(1989)183：281-306；D.H.Mathews等，J.Mol.Biol.(1999)288：911-940)。在进行设计时，优选链不抑制除靶基因以外的基因的表达，该基因具有类似于靶基因的序列(其被认为是偏靶效应)。有义链和反义链的长度优选被设计在例如19-31个碱基、优选21-25个碱基、更优选22-24个碱基的范围内，以及还更优选23个碱基。
靶基因包括但不限于abl/bcr基因(对于白血病)、VEGF基因(对于老年性黄斑变性)和HCV基因(对于肝炎)。
将随后形成环的序列，例如上述序列UUCAAGAGA，在任意位置分成两条片段以形成具有未配对核苷酸的核苷酸序列(其中该序列为9个碱基，并且在分成两条片段时，如上所述，长度差异优选在1-3个碱基范围内)。如此设计序列，使得一条片段被连接到反义链的3’末端，以及另一条片段被连接到有义链的5’末端。通过相同的方法，设计另一条序列，使得一条片段被连接到有义链的3’末端，另一条片段被连接到反义链的5’末端。将具有这两条被设计的序列的单链核酸分开合成。在合成过程中，优选通过使用化学磷酸化试剂进行5’末端磷酸化。此外，优选设计序列以形成环，其长度例如为2-20个碱基，优选6-12个碱基。
存在着多种合成核酸的方法，例如体外转录合成法、使用质粒或病毒载体的方法和使用PCR盒的方法。尽管并不特别限制合成核酸的方法，但依据高纯度、大量制备的能力、体内使用的安全性、化学修饰的能力等，优选化学合成法，化学合成法的实例包括但不限于H-膦酸酯法和亚磷酰胺法。为了该目的，可使用市售自动化核酸合成仪。
用连接酶(例如T4RNA连接酶或T4DNA连接酶)连接在有义链和反义链两个末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列的末端以同时形成两个环。反应条件包括例如在低温下于含聚乙二醇(PEG)、BSA等的缓冲液中温育20小时。可通过常规方法(例如高效液相色谱和PAGE法)收集并纯化所合成的哑铃形单链环状RNA。
此外，可用聚乙二醇(PEG)等化学修饰单链环状RNA，其中优选在环区进行该化学修饰。为了结合，修饰PEG的两末端以引入与碱基中的氨基反应的官能团，例如甲酰基或N-羟基琥珀酰亚胺酯基。
以下描述使用通过上述方法制备的哑铃形RNA的RNA干扰方法。
根据本发明，可将本发明的单链环状RNA引入细胞中并以一种持续的方式减弱靶RNA以抑制该靶RNA翻译成蛋白质，其中人细胞或非人动物或植物细胞可被用作这样的细胞。
当在体外进行RNA干扰方法时，通过例如电穿孔法、显微注射法、脂质转染法或磷酸钙转染将哑铃形RNA引入细胞。
当在体内进行RNA干扰方法时，首先，对含哑铃形RNA的样品进行透析、pH调节等，以使其能适合于活体。将哑铃形RNA引入动物或植物体中的方法包括但不限于局部施用、静脉施用和使用基因枪的方法。当施用于人时，基于安全性使用微生物等并不是优选的。
通过细胞中的切酶切割引入细胞中的哑铃形RNA，产生具有RNA干扰作用的双链RNA(siRNA)(图1)。siRNA的末端可以是平端或突出端。siRNA变成单链，形成RNA-核酸酶复合物(RNA诱导的沉默复合物(RISC))，其识别具有与该siRNA互补的序列的靶mRNA，并降解该靶mRNA，从而抑制相应的靶基因的表达。
本发明的单链环状RNA可用于任何植物、动物(例如人、宠物、哺乳动物包括家畜)以及它们的细胞。可预计到在医学和农业领域中广泛应用。例如，本发明的单链环状RNA可用于不同的用途，包括通过使用例如基因敲除方法，在植物或动物中、或在植物或动物细胞水平上阐释特定基因或蛋白的功能。
此外，本发明包括药物组合物，其包含作为活性成分的单链环状RNA。
可根据组合物的类型和用途调节配制于药物组合物中的单链环状RNA的量。例如，相对于组合物的总量，该RNA的量包括但不限于1wt％、3wt％、5wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％或100wt％。
本发明的药物组合物的实例包括液体制剂(例如溶液、混悬液、乳剂)、固体制剂(例如能在使用前重建的冻干制剂)、脂质体(优选地，阳离子脂质体)-包埋制剂。此外，优选的给药途径是肠胃外给药，其包括例如在受影响部位直接施用制剂的局部给药、肺部给药、转化粘液质给药(transmucosal administration)例如经鼻给药(nasal administration)以及静脉给药。
取决于配方或剂型，本发明的药物组合物可包括赋形剂(盐水、无菌水、林格氏溶液等)、缓冲剂、张度剂、稳定剂等。
此外，本发明的药物组合物的剂量可依患者的性别、体重、年龄、严重程度、症状等而改变。
本发明的药物组合物例如可适用于治疗疾病例如癌症(如抑制在癌细胞中特异性表达的基因或蛋白质的功能)。
本发明将通过下列实施例在下文中进一步具体描述。然而，需要理解本发明的范围并不限于特定的实施例。
具体实施方式
实施例1：制备哑铃形RNA
按照亚磷酰胺(phosphoroamidite)法，在DNA合成仪(GeneWorldH8-SE)上全合成用作哑铃形RNAs原料的5’-磷酸化的RNAs。保护的TBDMS(Proligo Corp.)用于RNA酰胺(RNA amidite)，以及化学磷酸化试剂(Chemical Phosphorylation Reagent)(Glen Research Corp.)用于5’-磷酸化。通过常规方法进行脱保护，然后进行PAGE-纯化。合成的RNA的序列示于SEQ ID NO：1(有义链，28mer)、SEQ ID NO：2(反义链，28mer)、SEQ ID NO：3(56mer)和图2中。此外，在图2所示的RNA序列中，加下划线的序列是形成哑铃形RNA的环区的序列。
其后，在25μl总体积的2μM RNA双链、2.0单位/μl T4RNA连接酶、0.006％BSA、25％PEG6000、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、10mM DTT和1mM ATP的混合物中进行酶促反应。
更具体地说，首先，以4μM的浓度，将5’-磷酸化的双链RNA溶解在12.5μl含100mM Tris-HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、20mM DTT和2mM ATP的缓冲液(2x缓冲液)中。在65℃下加热溶液5分钟，然后缓慢地冷却至室温。接着，添加BSA溶液、PEG6000溶液和T4RNA连接酶(Takara Bio Inc.)以得到上述组合物和反应体积。然后在11℃下温育溶液20小时。通过乙醇沉淀收集RNA并通过PAGE进行分析。
图2中PAGE每一泳道的样品如下。
泳道1：28个碱基有义链和28个碱基反义链的混合物(标准参照物)
泳道2：57个碱基RNA(标准参照物)
泳道3：由28个碱基有义链和28个碱基反义链形成的哑铃形RNA
泳道4：由56个碱基形成的哑铃形RNA(单链)
泳道5：用RNA连接酶处理的28个碱基有义链(参比)
泳道6：用RNA连接酶处理的28个碱基反义链(参比)
通过合成具有56个碱基的单链(SEQ ID NO：3)，形成茎干区和发夹环区，并用T4连接酶连接第一个核苷酸和最后一个核苷酸，制备在泳道4上的哑铃形RNA。
泳道3上圈起来的条带代表通过本发明的方法制备的哑铃形RNA，产率为大约80％。泳道4上的哑铃形RNA具有大约5％或更少的产率。
实施例2：哑铃形RNA的茎干长度的调查
通过上述DNA合成仪合成SEQ ID NOS：4-13所示的RNAs。SEQ IDNOS：4和5形成双链RNA，其形成18个碱基对(siRNA-1)，SEQ ID NOS：6和7形成其茎干长度为19个碱基的哑铃形RNA(Db-19)，SEQ ID NOS：8和9形成其茎干长度为23个碱基的哑铃形RNA(Db-23)，SEQ ID NOS：10和11形成其茎干长度为27个碱基的哑铃形RNA(Db-27)，以及SEQ IDNOS：12和13形成其茎干长度为31个碱基的哑铃形RNA(Db-31)(图3)。
在反应体积为1.5-2.5ml的2μM RNA双链、1.0单位/μl T4RNA连接酶、0.006％BSA、25％PEG6000、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mMMgCl2、10mM DTT和1mM ATP的组合物中进行酶促反应。
更具体地说，以4μM的浓度，将5’-磷酸化的双链RNA溶解在含100mM Tris-HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、20mM DTT和2mM ATP的缓冲液(2x缓冲液，一半量的最终反应溶液)中。在65℃下加热溶液5分钟，然后缓慢冷却至室温。接着，添加BSA溶液、PEG6000溶液和T4RNA连接酶(Takara Bio Inc.)以得到上述组合物和反应体积。然后在11℃下温育溶液20小时。
通过从反应溶液中乙醇沉淀收集RNA，并通过使用PAGE分离环化的产物。通过UV金属增影法显影含目的物质的条带，切下条带，碾碎成小片，并用4ml洗脱缓冲液(0.2M NaCl，1mM EDTA(pH 8.0))提取3次。提取物用Sep-Pak盒脱盐(用6ml 50％乙腈水溶液洗脱)，用离心蒸发器浓缩，并在乙酸铵的存在下进一步进行乙醇沉淀。通过测定UV光谱确定目的物质。
将2单位的ColdShock-DICER(Takara Bio Inc.)添加到处于含20mM Tris-HCl(pH 8.5)、150mM NaCl和2.5mM MgCl2的缓冲液中的2μg每种上述哑铃形RNAs中(反应体积：20μl)，然后在37℃下温育所得到的溶液。在1、6和18小时后，收集3μl反应溶液作为样品。将每种样品与2μl120mM EDTA溶液混合以终止酶促反应。然后通过非变性PAGE(10％PAGE，1x TBE)分析这些样品(在用1x SYBR Green I染色后，在BioRad MolecularImager FX上成像并定量样品)。
图4显示了每种哑铃形RNA的PAGE。作为对照，通过相同的方法调查使用在哑铃反应前的双链RNA作为底物的切割反应。结果，1小时后该Db-19的切割反应进行了大约5％，并证实产生了20个碱基长度的双链RNAs。在6和18小时后，在20个碱基范围内的Db-19的切割片段保持着几乎相同的浓度水平。与此相反，在1小时后几乎100％的对照包括19个碱基对线型链(Liner)被切割，并观察到20个碱基长度的双链RNAs。随后，经过一段时间，产物的双链RNAs被降解并消失。对于Db-23，在1小时后大约8％被切割，产生了20个碱基长度的双链RNAs。这也为随着茎干长度增加，1小时后Db-27和Db-31的切割速度分别增加10％和20％所证实。18小时后，大约75％的Db-19保持完整，而Db-31完全消失。根据这些结果，揭示了具有较短茎干长度的哑铃形RNAs能更稳定地抵抗酶。
实施例3：哑铃形RNA的RNA干扰作用
通过荧火虫荧光素酶报道基因pGL3表达的抑制实验评估上述哑铃形RNAs(Db-19、Db-23、Db-27和Db-31)的RNA干扰作用。
在5％CO2中，于37℃在含10％FCS的DMEM(GIBCO)培养基中培养NIH 3T3细胞(Riken Cell Bank)，以1.6×104个细胞/孔的浓度将100μl等分试样的培养物接种到96-孔板的每个孔中。在5％CO2中于37℃进一步培养样品39小时，从而达到大约70％汇合。然后依据附在转染试剂上的实验方案，使用转染试剂GeneSilencer(Genlantis Inc.)，用2种质粒载体(pGL3-对照和pRL-TK(用作内标)，来自Promega Corp.)和每种RNAs共转染细胞。转染时的浓度条件如下。
0.2μg pGL3-对照/0.02μg pRL-TK/25nM RNA(终体积100μl)
GeneSilencer       1μl
DMEM培养基         25μl
siRNA稀释溶液      2.5μl
DMEM培养基         15μl
RNA(5pmol/μl)     0.5μl
pGL3-对照(1μg/μl)0.2μl
pRL-TK(0.1μg/μl) 0.2μl
                   44.4μl
转染后，在5％CO2中于37℃温育培养物4小时。然后，将100μl含20％血清的DMEM培养基添加到每个孔中。在37℃下进一步温育20小时后，依据所附的实验方案(条件：试剂量30μl，延迟时间2秒，阅读时间10秒。设备：Wallac ARVO SX 1420多标记计数器(MultilabelCounter))，使用双-荧光素酶报道基因测定系统(Dual-luciferase ReporterAssay System)(Promega Corp.)，溶解细胞以定量荧光素酶的表达水平。
为了比较，通过相同的方法评估对照(仅有缓冲液)。对作为内标的海肾(renilla)荧光素酶的荧光强度校正荧火虫荧光素酶的荧光强度。结果示于图5中。24小时后，在哑铃形RNAs中间，Db-23显示最高的活性，并具有低至0.24的抑制效果。从这些结果中，将最优选的双链长度设定为23个碱基。
实施例4：RNA干扰作用的持续性
比较Db-23和siRNA-1的RNA干扰作用的持续性。
在5％CO2-湿室中，在补充有10％胎牛血清(FCS，Invitro/Gibco)的Dulbeco氏改良的Eagles培养基(DMEM，Gibco)中培养NIH 3T3细胞。在转染前40小时，在约70％汇合下，以1.6×104个细胞/孔(100μl)的密度将细胞接种到96-孔板中。如厂商对于粘附细胞系所述，使用GeneSilencer(Gene Therapy systems，Inc.)进行报道质粒和RNA的共转染。每个孔施加(100μl)用转染试剂配制的16ng/μl或1.6ng/μl pGL3-对照(Promega Corp.)、1.6ng/μl pRL-TK(Promega Corp.)和25nM RNA。在4小时温育后，添加100μl处于DMEM中的20％FCS。为了超过3天的长时间温育，视需要更换培养基。在依据Wallac ARVO SX 1420多标记计数器(Multilabel Counter)(Perkin-Elmer，Inc.)上提供的说明书，使用双-荧光素酶报道基因测定系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega Corp.)24小时、72小时和120小时后，监测荧光素酶表达(图6)。使用不含有RNA的样品作为对照。
在24小时后，Db-23和siRNA-1都显示几乎相同水平的荧光素酶活性。然而，在120小时后，Db-23显示更高的基因表达抑制作用。从这些结果中，显示了哑铃形RNA的缓慢释放作用和长效活化作用两者。
实施例5：哑铃形RNA在人血清中的稳定性
比较Db-23和siRNA在人血清中的稳定性。
将处于退火缓冲液(100mM乙酸钾，30mM HEPES-KOH(pH7.4)，2mM乙酸镁)中的4μl预退火的dsRNA(siRNA-1，20μM)或哑铃形RNA(Db-23，20μM)与在37℃下温育的32μl PBS、4μl标准人血清(Chemicon International，Inc.)混合。在0.5、1、1.5、3、8和20小时后取等分试样(5μl)。通过15％非变性PAGE分析反应，用SYBR Green I染色并用MolecularImager FX(BioRad Laboratories，Inc.)显像。
结果，在3小时后高达50％的siRNA被降解，而在3小时后80％或更多的Db-23仍保留，以及甚至在8小时后仍保留70％或更多的Db-23。因此，可预计到Db-23在体内的高稳定性。
工业实用性
本发明可被用作适用于活体的核酸分子并可以高产率制备这样的分子。
序列表
<110>RIKEN
Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.
Hayashi Kasei Co.，Ltd.
<120>单链环状RNA及制备该单链环状RNA的方法
<130>PH-3542PCT
<150>JP 2007-125045
<150>2007-05-09
<160>13
<170>PatentIn 3.4版
<210>1
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>1
gagacuuacg cugaguacuu cgauucaa    28
<210>2
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>2
gagaucgaag uacucagcgu aaguucaa    28
<210>3
<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>3
gagacuuacg cugaguacuu cgauucaaga gaucgaagua cucagcguaa guucaa    56
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>4
gugcgcugcu ggugccaacu u                                           21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>5
guuggcacca gcagcgcacu u                                           21
<210>6
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>6
gagagugcgc ugcuggugcc aacuucaa    28
<210>7
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>7
gagaguuggc accagcagcg cacuucaa    28
<210>8
<211>32
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>8
gagaagugcg cugcuggugc caacccuuuc aa 32
<210>9
<211>32
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>9
gagaagggug ggcaccagca gcgcacuuuc aa  32
<210>10
<211>36
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>10
gagaaaagug cgcugcuggu gccaacccua uuucaa              36
<210>11
<211>36
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>11
gagaauaggg uuggcaccag cagcgcacuu uuucaa              36
<210>12
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>12
gagaucaaag ugcgcugcug gugccaaccc uauucuucaa          40
<210>13
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>13
gagagaauag gguuggcacc agcagcgcac uuugauucaa    40

Claims (11)

1.一种具有持续或缓慢释放的RNA干扰作用的单链环状RNA，其特征在于所述单链环状RNA包含有义链序列、与所述有义链序列互补的反义链序列、在所述有义链和反义链之间连接这两条链的相同或不同的两条环序列，其中所述有义链和反义链配对形成茎干。
2.根据权利要求1的单链环状RNA，其中与其靶RNA的表达水平被设定为1的对照细胞相比，在将所述单链环状RNA引入真核细胞后24小时，靶RNA的表达为0.4或更低。
3.根据权利要求1或2的单链环状RNA，其中在人血清中8小时后，70％或更多的所述单链环状RNA被保留。
4.一种制备根据权利要求1-3任一项的单链环状RNA的方法，其包括合成有义链和反义链，两者都包含在5’末端和3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列，以及同时使用连接酶将所述有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在5’末端的核苷酸与所述反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的在3’末端的核苷酸连接，反之亦然，
其中所述有义链的在5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列和所述反义链的在3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列彼此连接形成环，所述有义链的在3’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列和所述反义链的在5’末端具有未配对核苷酸的核苷酸序列彼此连接形成环，以及所述有义链和反义链配对形成茎干。
5.根据权利要求4的方法，其进一步包括磷酸化所述有义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列和所述反义链中具有未配对核苷酸的核苷酸序列的每个5’末端。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述环序列彼此相同或不同。
7.根据权利要求4-6任一项的方法，其中所述环长度为2-20个核苷酸。
8.根据权利要求4-7任一项的方法，其中所述茎干长度为19-31个核苷酸。
9.一种体外抑制编码蛋白质的基因表达的方法，其包括将根据权利要求1-3任一项的单链环状RNA引入人源细胞中，并以一种持续的方式通过所述单链环状RNA减弱靶RNA，从而抑制所述靶RNA翻译成蛋白质。
10.一种抑制编码蛋白质的基因表达的方法，其包括将根据权利要求1-3任一项的单链环状RNA引入非人动物、植物或它们的细胞中，并以一种持续的方式通过所述单链环状RNA减弱靶RNA，从而抑制所述靶RNA翻译成蛋白质。
11.一种药物组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求1-3任一项的单链环状RNA。
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