JP6296434B2 - 機能性核酸分子の構築法 - Google Patents
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1)2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、少なくとも1本を、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として、2本の核酸鎖を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記リンカーを切断して上記環状核酸分子を開環させ、上記2本の核酸鎖をハイブリダイズさせて、機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
2)上記2本の核酸鎖は、何れも、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として導入される、1)に記載の方法。
3)上記2本の核酸鎖は、何れも、RNA分子である、1)または2)に記載の方法。
4)上記機能性核酸分子は、細胞内でRNA干渉作用を有する、1)〜3)の何れかに記載の方法。
5)上記リンカーは、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって切断される、1)〜4)の何れかに記載の方法。
6)上記リンカーは、ジスルフィド結合を有している、1)〜5)の何れかに記載の方法。
7)上記1)〜6)の何れかに記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記2本の核酸鎖を備えてなり、当該2本の核酸鎖のうちの少なくとも1本が、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として含まれている、核酸組合せ物。
8)上記2本の核酸鎖は、何れも、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として含まれている、7)に記載の核酸組合せ物。
9)上記7)または8)に記載の核酸組合せ物が導入されている細胞。
10)ジスルフィド結合を介して閉環している一本鎖の核酸分子。
11)上記10)に記載の核酸分子の製造方法であって、一方の末端にホスホロチオエート基を有し、他方の末端にチオール基を有する1本の直鎖状の核酸分子を合成し、ジスルフィド化合物で処理して閉環させる製造方法。
(構築法の概要)
本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程(1)および(2)を含む。
(1)少なくとも1本を、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として、2本の核酸鎖を細胞内に導入する導入工程、
(2)上記細胞内で上記リンカーを切断して上記環状核酸分子を開環させ、上記2本の核酸鎖をハイブリダイズさせて、機能性核酸分子を生成する生成工程。
本発明において、機能性核酸分子とは、複数個の核酸が鎖状に連結してなり(すなわち、オリゴまたはポリヌクレオチド)、タンパク質をコードせず、かつ発生・分化等の生命現象に対して所定の機能を発揮する核酸分子を指す。したがって、生命現象において特段の機能を発揮しない、単に標的特異的にハイブリダイズするだけのプライマーおよびプローブは、本発明における機能性核酸分子の範疇から除かれる。
本発明における「環状核酸分子」は、機能性核酸分子を構成する2本の核酸鎖のうちの1本を、リンカーを介して閉環した核酸分子に相当する。「環状核酸分子」は、1本の核酸鎖の3’末端と5’末端とが1つのリンカーに結合し、それによって閉環している核酸分子である。したがって、「環状核酸分子」はリンカーにおいて切断されて開環すると、機能性核酸分子を構成する2本の核酸鎖のうちの1本と同じ核酸配列を有する核酸分子となる。開環後の生成する核酸分子は、切断されたリンカーの一部を末端に有していてもよい。
リンカーを介して閉環している「環状核酸分子」の作製方法は特に限定されない。5’末端と3’末端とに相互作用可能な官能基対を付した1本の直鎖の核酸鎖を作製し、当該官能基どうしを結合させて、閉環してもよい(例えば、後述の実施例2)。この場合、官能基どうしが結合することによりリンカーが生成する。あるいは、リンカーが内部に配置された1本の直鎖の核酸鎖を作製し、当該核酸鎖の末端どうしをリガーゼ等の酵素によって結合させてもよい(例えば、後述の実施例1)。この際、鋳型を用いてもよいし、用いなくてもよい。このように、環状核酸分子を作製する際に閉環させる箇所は、生成工程において開環させる箇所と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
導入工程は、少なくとも1本を、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として、2本の核酸鎖を細胞内に導入する工程である。すなわち、導入工程は、機能性核酸分子を構成する2本の核酸鎖のうちの少なくとも1本を上述の環状核酸分子の形態とした上で、この2本の核酸鎖を細胞に導入する工程である。
(1)機能性核酸分子を構成する2本の核酸鎖のうちの1本の核酸鎖に対応する「環状核酸分子」と、他の1本の直鎖状の核酸鎖。2つの核酸鎖が略等量(個数)で含まれていることが好ましい。
(2)機能性核酸分子を構成する2本の核酸鎖のうちの1本の核酸鎖に対応する「環状核酸分子」と、他の1本の核酸鎖に対応する「環状核酸分子」。2つの核酸鎖が略等量(個数)で含まれていることが好ましい。
生成工程では、導入工程において核酸組合せ物を導入した細胞内で、リンカーを切断して、環状核酸分子を開環させる。すなわち、細胞内に導入した環状核酸分子をリンカーにおいて切断して、当該環状核酸分子を開環させる。次いで、2本の核酸鎖間で相互作用してハイブリダイズし、機能性核酸分子を生成する。
(核酸組合せ物の概要)
本発明に係る機能性核酸分子の構築法に用いる核酸組合せ物は、機能性核酸分子を構成する上記2本の核酸鎖を備えてなり、当該2本の核酸鎖のうちの少なくとも1本が、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として含まれているものである。なお、「核酸組合せ物」の例示は、上記(導入工程)欄で説明したとおりのものである。
本発明に係る核酸組合せ物は、その使用手順が記載された使用説明書(ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない)とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、上記(導入工程)欄、(生成工程)欄で説明したような核酸組合せ物の使用説明が記載される。核酸組合せ物はその用途に応じて、医薬、試薬キットであり得る。
(機能性核酸分子の構築法の応用)
核酸組合せ物は、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体を治療するために用いてもよい。すなわち、非ヒト動物の個体またはヒトの個体に、核酸組合せ物を投与してもよい。投与方法は、上述のin vivoにおける導入方法として挙げたとおりである。
(RNAの設計と合成)
図1の(a)に示されるホタルのルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するsiRNA(配列番号1および配列番号2)に基づき、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれについて、光切断リンカー修飾RNAの合成を行った。各RNAの配列は図1の(b)に示すとおりである。なお、図1中の「PC」は光切断リンカーを表しており、一方のリン酸基が、核酸の5’末端を構成する糖の5’位の炭素原子に結合し、他方のリン酸基が、核酸の3’末端を構成する糖の3’位の炭素原子に結合している。
直鎖のセンス鎖と直鎖のアンチセンス鎖との混合物、直鎖のセンス鎖のみ、直鎖のアンチセンス鎖のみ、環状のセンス鎖と環状のアンチセンス鎖との混合物、環状のセンス鎖のみ、および環状のアンチセンス鎖のみ(何れも21mer)について、20%未変性PAGEを行い、CYBR Green IIで染色した。なお、直鎖のセンス鎖および直鎖のアンチセンス鎖は、図1の(a)のsiRNAと同じ配列を有する光切断リンカーを含まないRNAであり、アミダイト法で合成したものである。
合成した21merの環状のセンス鎖に365nmの光を、0分、5分、10分、または15分照射した。それぞれの照射時間におけるRNAについて、10%PAGEを行い、CYBR Green IIで染色した。また、光切断リンカーを含まない直鎖のRNAおよび光切断リンカー付きの直鎖のRNAを比較として泳動した。
HeLa細胞(ATCCから購入)を、37℃、5%CO2条件下、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞は、RNAをトランスフェクションする際に80%コンフルエントの状態になるように、前日に96wellプレートに10000cell/well播種した。トランスフェクション前に、細胞をPBSで2回洗浄し、opti-MEMで置換した。20ng GL3-Control、20ng pRL-TK、0.25 μl/well Lipofectamine2000および10 nM RNAを総量50μlになるように調製し、トランスフェクションした。トランスフェクション4時間後、培地をDMEM (10% FBS)で置換した。UVランプを用いて細胞に光(365nm)を15分照射し、24時間培養した。ルシフェラーゼの発現量は、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて測定した。
HeLa細胞を、37℃、5%CO2条件下、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞は、ベクターをトランスフェクションする際に80%コンフルエントの状態になるように、前日に24wellプレートに42000cell/well播種した。トランスフェクション前に、細胞をPBSで2回洗浄し、opti-MEMで置換した。84ng GL3-Control、84ng pRL-TK、1.05μl/well Lipofectamine2000を総量210μlになるように調製し、トランスフェクションした。トランスフェクション4時間後、培地をDMEM(10% FBS)に交換し、24時間培養した。hypertonic solution(1.4M スクロース, 10 % PEG1000, 100mM HEPES, DMEM)で0.5μM RNAなるように混合溶液を調整(総量10μl)した。細胞に混合液を添加し、37℃、10分間インキュベートした。10分後、滅菌水を52.9uL加え、37℃、10分間インキュベートした。10分後、細胞をDMEM(10% FBS)で置換した。UVランプ(365nm)で細胞を15分照射し、24時間培養した。ルシフェラーゼの発現量は、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて測定した。
(RNAの設計と合成)
図6の(a)に示されるホタルのルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するsiRNA(配列番号1および配列番号2)に基づき、センス鎖およびアンチセンス鎖(21mer)について直鎖RNAの合成を行った(図6の(b))。なお、図6中、ホスホロチオエート基は、核酸の5’末端を構成する糖の5’位の炭素原子に結合し、−O−(CH2)3−SHは、核酸の3’末端を構成する糖の3’位の炭素原子に結合している。
合成した環状のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれについて、還元化反応を評価した。0.25μM 環状RNAに10mM GSHを加え、37℃で30分間インキュベートした。また、0.25μM 環状RNAに10mM DTT(dithiothreitol)を加え、37℃で30分間インキュベートした。10%PAGEを行い、CYBR Green IIで染色した。
HeLa細胞を、37℃、5%CO2条件下、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞は、RNAをトランスフェクションする際に80%コンフルエントの状態になるように、前日に96wellプレートに10000cell/well播種した。トランスフェクション前に、細胞をHBSSで2回洗浄した。細胞をHBSSで置換し、20 ng GL3-Control、20 ng pRL-TK、0.25 μl/well Lipofectamine2000および5 nM RNAを総量50 μlになるように調製し、トランスフェクションした。トランスフェクション4時間後、培地をDMEM (10% FBS)で置換し、24時間培養した。ルシフェラーゼの発現量は、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて測定した。
HeLa細胞は、37℃、5%CO2条件下、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞は、ベクターをトランスフェクションする際に80%コンフルエントの状態になるように、前日に24wellプレートに42000cell/well播種した。トランスフェクション前に、細胞をPBSで2回洗浄し、opti-MEMで置換した。84ng GL3-Control、84ng pRL-TK、1.05μl/well Lipofectamine2000を総量210μlになるように調製し、トランスフェクションした。トランスフェクション4時間後、培地をDMEM(10% FBS)に交換し、24時間培養した。hypertonic solution(1.4M スクロース, 10 % PEG1000, 100mM HEPES, HBSS)で0.5μM RNAなるように混合溶液を調整(総量10μl)した。細胞に混合液を添加し、37℃、10分間インキュベートした。10分後、滅菌水を52.9uL加え、37℃、10分間インキュベートした。細胞を2回HBSSで洗浄した後、細胞をDMEM(10% FBS)で置換し、24時間培養した。ルシフェラーゼの発現量は、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて測定した。
Claims (11)
- 2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、
少なくとも1本を、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として、2本の核酸鎖をそれぞれ一本鎖の状態で細胞内に導入する導入工程と、
上記細胞内で上記リンカーを切断して上記環状核酸分子を開環させ、上記2本の核酸鎖をハイブリダイズさせて、機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。 - 上記2本の核酸鎖は、何れも、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として導入される、請求項1に記載の方法。
- 上記2本の核酸鎖は、何れも、RNA分子である、請求項1または2に記載の方法。
- 上記機能性核酸分子は、細胞内でRNA干渉作用を有する、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 上記リンカーは、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって切断される、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 上記リンカーは、ジスルフィド結合を有している、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、
機能性核酸分子を構成する上記2本の核酸鎖をそれぞれ一本鎖の状態で備えてなり、当該2本の核酸鎖のうちの少なくとも1本が、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として含まれている、核酸組合せ物。 - 上記2本の核酸鎖は、何れも、両末端に結合したリンカーを介して閉環している環状核酸分子として含まれている、請求項7に記載の核酸組合せ物。
- 請求項7または8に記載の核酸組合せ物が導入されている細胞。
- 下記の結合を介して閉環している一本鎖のRNA分子またはDNA・RNAハイブリッド分子。
- ジスルフィド結合を介して閉環している一本鎖の核酸分子の製造方法であって、
一方の末端にホスホロチオエート基を有し、他方の末端にチオール基を有する1本の直鎖状の核酸分子を合成し、ジスルフィド化合物で処理して閉環させる製造方法。
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