JP6126075B2 - 機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物 - Google Patents
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Description
(構築法の概要)
本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、1または2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程1)および2)を含む。
1)化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片を細胞内に導入する導入工程、
2)上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、1または2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
1)上記核酸鎖のうちの少なくとも1本を、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片とし、その上で、上記1または2本の核酸鎖(すなわち、少なくとも1本は2以上の断片とされている)を細胞内に導入する導入工程、
2)上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、1または2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
本発明において、機能性核酸分子とは、複数個の核酸が鎖状に連結してなり(すなわち、オリゴまたはポリヌクレオチド)、タンパク質をコードせず、かつ発生・分化等の生命現象に対して所定の機能を発揮する核酸分子を指す。したがって、生命現象において特段の機能を発揮しない、単に標的特異的にハイブリダイズするだけのプライマーおよびプローブは、本発明における機能性核酸分子の範疇から除かれる。
機能性核酸分子を構成する核酸鎖の「断片」とは、上記「核酸鎖」を2以上に分割した核酸分子に相当する。そして、一つの核酸鎖に由来する全ての「断片」を適切な順序で連結すると当該核酸鎖と同じ核酸配列を有する核酸分子が構築される。ただし、用語「断片」とは、核酸鎖を一度構築した後にこれを分断して当該断片を生成することを意図するものではない。
上記官能基が末端に付された核酸鎖の「断片」の作製方法は特に限定されない。例えば、当該断片のオリゴヌクレオチドの部分は、in vitro transcription合成方法、プラスミドもしくはウイルスベクターを用いる方法、またはPCRカセットによる方法等によって合成することができる。純度の高さ、大量合成可能、in vivoでの使用安全性の高さ、および化学修飾可能等の観点から、化学合成方法が好ましい。化学合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、およびH−ホスホネート法等が挙げられ、市販の核酸合成機を使用することができる。
上記機能性核酸分子が、その機能を発揮するために、核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成するものである場合、当該核酸鎖の断片は、当該断片同士の結合がハイブリダイズ領域で生じるように設計されることが好ましい。以下、図1に基づき、より具体的に説明する。
導入工程は、機能性核酸分子を構成する上記「核酸鎖」のうちの少なくとも1本を、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した2以上の「断片」の形態とした上で、当該機能性核酸分子を構成する全ての核酸鎖を細胞内に導入する工程である。なお、「核酸鎖」、「官能基対」、「対応する末端」、および「断片」の定義は上述の通りである。
1)機能性核酸分子が1本の核酸鎖からなる場合、当該核酸鎖を構築するための2以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量(個数)で含まれていることが好ましい。
2)機能性核酸分子が2本の核酸鎖からなる場合、うち1本の核酸鎖を構築するための2以上の上記「断片」と、他の1本の核酸鎖。全ての核酸分子が略等量(個数)で含まれていることが好ましい。
3)機能性核酸分子が2本の核酸鎖からなる場合、うち1本の核酸鎖を構築するための2以上の上記「断片」と、他の1本の核酸鎖を構築するための2以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量(個数)で含まれていることが好ましい。
生成工程では、上記導入工程で核酸組合せ物を導入した細胞内で、上記「官能基対」を「対応する末端」に付した2以上の「断片」同士を結合させる。すなわち、官能基対の間で化学反応が進行して、「対応する末端」同士が結合(化学ライゲーション=非酵素的なライゲーション)されることで、「断片」として与えられていた核酸鎖が1本の連続した核酸鎖として構築される。あわせて、必要に応じて核酸鎖内または異なる核酸鎖間でハイブリダイゼーションのような相互作用を生じて、機能性核酸分子を生成する。
(核酸組合せ物の概要)
本発明に係る機能性核酸分子の構築法に用いる核酸組合せ物(構築用核酸組合せ物)は、機能性核酸分子を構成する全ての上記「核酸鎖」を備えてなり、当該「核酸鎖」のうちの少なくとも1本が、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した2以上の「断片」として含まれているものである。なお、「核酸組合せ物」の例示は、上記(導入工程)欄で説明した通りのものである。
核酸組合せ物の好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」は、上記「核酸鎖」内でハイブリダイズするか、または異なる「核酸鎖」間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記「断片」同士の結合が、当該ハイブリダイズ領域で生じるように、上記「断片」が設計されている。
本発明に係る核酸組合せ物は、その使用手順が記載された使用説明書(ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない)とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、上記(導入工程)欄、(生成工程)欄で説明したような核酸組合せ物の使用説明が記載される。核酸組合せ物はその用途に応じて、医薬、または試薬キットでありうる。
(機能性核酸分子の構築法の応用)
核酸組合せ物は、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、およびネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体を治療するために用いてもよい。すなわち、非ヒト動物の個体またはヒトの個体に、核酸組合せ物を投与してもよい。投与方法は、上述のin vivoにおける導入方法として挙げたとおりである。
以上のように、本発明は、以下のものを含んでいる。
1)1または2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、1または2本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
2)上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、1)に記載の方法。3)上記機能性核酸分子は第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の2本の上記核酸鎖からなり、かつ異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなる上記ハイブリダイズ領域を有し、上記2本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2つの断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、2)に記載の方法。
4)上記機能性核酸分子は、上記第一の核酸鎖としての第一のRNA鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のRNA鎖とからなり、上記第一のRNA鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第二のRNA鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、3)に記載の方法。
5)上記機能性核酸分子は、細胞内でRNA干渉作用を有する、1)〜4)の何れかに記載の方法。
6)上記化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、1)〜5)の何れかに記載の方法。
7)上記求核基は、ホスホロチオエート基である、6)に記載の方法。
8)上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、6)または7)に記載の方法。
9)上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、6)〜8)の何れかに記載の方法。
10)上記求核基がホスホロチオエート基である場合、上記保護基が下記(a)〜(k)の何れかである、6)、8)または9)に記載の方法。
11)上記1)〜10)の何れかに記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも1本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物。
12)上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、11)に記載の核酸組合せ物。
13)上記機能性核酸分子を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の2本の上記核酸鎖を備えてなり、上記2本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2つの断片として含まれており、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、上記断片が設計されている、12)に記載の核酸組合せ物。
14)上記機能性核酸分子を構成する、上記第一の核酸鎖としての第一のRNA鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のRNA鎖とを備えてなり、上記第一のRNA鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として含まれており、上記第二のRNA鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として含まれており、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、13)に記載の核酸組合せ物。
(RNAの設計および合成)
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するsiRNA1(図2の(a);配列番号1および2)をもとに、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ3’−PS(ホスホロチオエート) RNAおよび5’−アミノ RNAに分割してRNAの合成を行った(図2の(b);配列番号3および4)。
上記で合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖における3’−PS RNAをジフェニルジスルフィドと反応させることによってCaged 3’−PS RNAを合成した(図2の(c))。なお、3’末端のジスルフィド結合は細胞内に導入後、GSHなどの生体内チオール源によって脱離が進行する。3’−PS RNAのジスルフィド化は、表1の組成で調製した混合液を室温で6時間インキュベートすることによって行った。
非修飾siRNA(25mer:図2の(a)に示す配列)を3’−PS RNAおよび5’−アミノ RNAの合成と同様に、ホスホロアミダイト法に基づきDNA合成機(GeneWorld H8-SE)を用いて合成し、変性ポリアクリルアミドゲルによって完全鎖長の生成物を精製した。
(方法)
in vitroにおいて、Caged 3’−PS RNAとヨードアセチルRNAとのライゲーションが行われることを確認するために、表4の組成で反応を行った。表4中のレーン5はGSHを添加していないコントロールである。
泳動の結果を図3に示す。3’−PS RNAとヨードアセチルRNAとのライゲーションが進行し、25merのRNA鎖が生成したことが確認できた(レーン4)。
(方法)
HeLa−Luc細胞(Caliper(PerkinElmer company)から購入)を10% FBSを含むDMEM(Wako製)培地中、37℃、5%CO2下で培養し、96穴プレートに、100μLずつ、4.0×103cells/ウェルとなるよう分注した。さらに37℃、5%CO2下で24時間培養し、約60%コンフルエントの状態で各種RNA(センス鎖およびアンチセンス鎖の3’−PS RNAおよびヨードアセチルRNA)をトランスフェクション試薬Gene Silencer(Genlantis製)を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。RNAの濃度は、25、50または100nMとした。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図4に示す。non−ligatedなCaged 3’−PS RNAとヨードアセチルRNA(IA)とを細胞内に導入した場合には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、十分な阻害活性が観察された。一方、non−ligatedなCaged 3’−PS RNAとアセチルRNA(Ac)とを導入した場合には阻害活性が観察されなかった。この結果は、細胞内で3’−PS RNAとヨードアセチルRNAとのライゲーション反応によって、ligated siRNAが生成し、遺伝子発現を抑制したことを示唆している。
(方法)
HeLa−Luc細胞を10% FBSを含むDMEM(Wako製)培地中、37℃、5%CO2下で培養し、約60%コンフルエントの状態で回収し、PBSで洗浄した。次いで、hypertonic bufferと各種RNA(センス鎖およびアンチセンス鎖の3’−PS RNAおよびヨードアセチルRNA)との混合液(10μL)で細胞を懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。そこへ滅菌水(52.9μL)を加え、さらに37℃で10分間インキュベーションした。その後、細胞を回収し、PBSで洗浄した。次いで、回収した細胞を10% FBSを含むDMEM(400μL)で懸濁し、96穴プレートに100μLずつ分注した。hypertonic bufferの組成は、2.1M スクロース、7.5%PEG(2000)、150mM HEPES(pH7.3)in HBSS bufferである。hypertonic bufferと各種RNAとの混合液(10μL)の組成は表6の通りである。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図5に示す。non−ligatedなCaged 3’−PS RNAとヨードアセチルRNA(IA)とを細胞内に導入した場合には、非修飾siRNAを細胞内に導入した場合と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、より阻害されていることがわかった。この結果は、siRNAをCaged 3’−PS RNAとIAとに断片化して導入することによって、細胞膜透過性が向上したことを示唆している。
(方法)
T98G細胞(理化学研究所バイオリソースセンターから入手)を10% FBSを含むRPMI−1640(Wako製)培地中、37℃、5%CO2下で培養し、24穴プレートに、300μLずつ、4.0×104cells/ウェルとなるよう分注した。さらに37℃、5%CO2下で24時間培養し、約70%コンフルエントの状態で各種RNA(センス鎖およびアンチセンス鎖の3’−PS RNAおよびヨードアセチルRNA)をトランスフェクション試薬lipofectamine 2000(invitrogen製)を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。比較として、RNAなし、ポリI:C、非修飾siRNAを同様にトランスフェクションした。RNAの濃度は100nM(final volume 300μL)とした。トランスフェクション用混合溶液の組成は表7の通りである。
結果を図6に示す。RNAをトランスフェクションしなかったNegative Control(NC)と比較して、siRNAまたはポリI:Cを細胞内に導入した場合にはIFN−βの発現量の増加が確認された。一方、non−ligatedなCaged 3’−PS RNAとヨードアセチルRNA(IA)とを細胞内に導入した場合には、IFN−βの発現量の変化は観察されなかった。この結果は、siRNAを断片として細胞内に導入することで、断片化されていないsiRNAによって誘導される免疫応答を回避可能であることを示している。
Claims (16)
- 機能性核酸分子を、ヒト体内細胞を除く細胞内で構築する方法であって、
細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、
上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、上記機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含み、
上記細胞内化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、方法。 - 上記機能性核酸分子は、同一の核酸鎖内でハイブリダイズするハイブリダイズ領域を有するか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じる、請求項1に記載の方法。 - 上記機能性核酸分子は、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の2本の核酸鎖からなり、該2本の核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
上記2本の核酸鎖は何れも、細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2つの断片として細胞内に導入されるものであり、
上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、請求項2に記載の方法。 - 上記求核基は、ホスホロチオエート基である、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 上記保護基が下記(a)〜(k)の何れかである、請求項4に記載の方法。
- 上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- siRNAを、ヒト体内細胞を除く細胞内で構築する方法であって、
該siRNAを構成する第一のRNA鎖と第二のRNA鎖の少なくとも一方を、細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片として細胞内に導入する導入工程、ここで該断片は20mer未満の長さである、
上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、上記siRNAを生成する生成工程、ここで該siRNAは20merよりも長い、
と、を含み、
上記細胞内化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、方法。 - 上記siRNAは、上記第一のRNA鎖と上記第二のRNA鎖とが二本鎖を形成するハイブリダイズ領域を有し、
上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じる、請求項8に記載の方法。 - 上記第一のRNA鎖と上記第二のRNA鎖は何れも、細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片として細胞内に導入されるものであり、
上記第一のRNA鎖を構成する断片同士の結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、請求項9に記載の方法。 - 上記求核基は、ホスホロチオエート基である、請求項8〜10の何れか1項に記載の方法。
- 上記保護基が下記(a)〜(k)の何れかである、請求項11に記載の方法。
- 上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、請求項8〜10の何れか1項に記載の方法。
- 上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、請求項8〜10の何れか1項に記載の方法。
- 請求項8に記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、
siRNAを構成する上記第一のRNA鎖と上記第二のRNA鎖を備えてなり、ここで該siRNAは20merよりも長い、
当該上記第一のRNA鎖と当該第二のRNA鎖のうちの少なくとも1方が、細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片として含まれている、ここで該断片は20mer未満の長さである、siRNAの細胞内構築用核酸組合せ物。 - 上記第一のRNA鎖と上記第二のRNA鎖は何れもが、細胞内化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した2以上の断片として含まれ、
上記siRNAは、上記第一のRNA鎖と上記第二のRNA鎖とが二本鎖を形成するハイブリダイズ領域を有し、
当該第一のRNA鎖を構成する断片同士の結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、請求項15に記載の核酸組合せ物。
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