WO2013129663A1 - 機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物 - Google Patents

機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物 Download PDF

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functional
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阿部　洋
伊藤　嘉浩
豪斗 丸山
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独立行政法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for constructing a functional nucleic acid molecule in a cell and a nucleic acid combination used in the method.
  • Nucleic acid molecules are known that do not encode proteins but perform important functions in various life phenomena. Examples of such nucleic acid molecules include functional non-coding RNA molecules (Non-patent Document 1) and small RNA molecules that cause RNA interference (Non-patent Document 2).
  • RNA interference is an important technique (Non-patent Document 3) that specifically suppresses the action of target RNA in cells, and as a reagent, it is also used as a medicine (Non-patent Document 4). Has been studied.
  • RNA that causes RNA interference is a small molecule, in order to maximize its effect, it is necessary to further improve the permeability of the cell membrane and suppress the toxic expression by activating the immune system There is a further need for.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its object is to construct a functional nucleic acid molecule in a cell by introducing the functional nucleic acid molecule into a cell in an easy-to-use form and introducing it into the cell. Is to provide etc.
  • the present invention is a method for constructing a functional nucleic acid molecule comprising one or two nucleic acid strands, wherein two or more functional group pairs that are mutually bonded by a chemical reaction are attached to corresponding ends.
  • a method comprising:
  • the present invention also provides a nucleic acid combination used in the above-described method, comprising the above-described nucleic acid strand constituting a functional nucleic acid molecule, and at least one of the nucleic acid strands is a functional group that is mutually bonded by a chemical reaction.
  • Nucleic acid combinations for the construction of functional nucleic acid molecules are provided which are included as two or more fragments with pairs attached to corresponding ends.
  • a functional nucleic acid molecule can be constructed in a cell by introducing the functional nucleic acid molecule into a cell as a plurality of fragments that can be easily taken into the cell.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an embodiment of a method according to the present invention.
  • it is a figure which shows the arrangement
  • it is a figure which shows the result of the ligation in vitro.
  • it is a figure which shows the result of the expression of a luciferase gene.
  • it is a figure which shows the result of the expression of a luciferase gene.
  • it is a figure which shows the result of an immune response measurement.
  • the method for constructing a functional nucleic acid molecule according to the present invention is a method for constructing a functional nucleic acid molecule composed of one or two nucleic acid strands, and includes the following steps 1) and 2). 1) an introduction step of introducing two or more fragments having functional groups paired together by chemical reaction at the corresponding ends into cells; 2) The production
  • the method for constructing a functional nucleic acid molecule according to the present invention is a method for constructing a functional nucleic acid molecule composed of one or two nucleic acid strands, and includes the following steps 1) and 2). 1) At least one of the nucleic acid strands is made into two or more fragments with functional group pairs that are mutually bonded by a chemical reaction attached to corresponding ends, and then, the one or two nucleic acid strands (ie, An introduction step of introducing at least one fragment into two or more fragments, 2) The production
  • the nucleic acid chain constituting the functional nucleic acid molecule is introduced into the cell as a plurality of fragments, and the functional nucleic acid molecule is constructed in the cell. Therefore, the uptake of functional nucleic acid molecules into cells is improved. Further, since at least a part of the nucleic acid chain is used as a shorter fragment, immunotoxicity caused by the functional nucleic acid molecule can be suppressed.
  • a functional nucleic acid molecule is formed by linking a plurality of nucleic acids in a chain form (that is, oligo or polynucleotide), does not encode a protein, and is predetermined for life phenomena such as development and differentiation. It refers to a nucleic acid molecule that performs the function of Therefore, primers and probes that do not exhibit a particular function in life phenomena and simply hybridize in a target-specific manner are excluded from the category of functional nucleic acid molecules in the present invention.
  • the functional nucleic acid molecule is a DNA molecule, an RNA molecule, or a DNA / RNA hybrid molecule.
  • the functional nucleic acid molecule may be composed of one nucleic acid chain or may be composed of two nucleic acid chains.
  • the functional nucleic acid molecule may contain a non-natural nucleic acid in a part thereof.
  • the term “nucleic acid chain” refers to a full-length nucleic acid chain in a state of constituting a functional nucleic acid molecule, and the term “fragment” corresponding to a shorter version of the “nucleic acid chain”. (To be described later).
  • DNA molecules examples include DNA aptamer; CpG motif; DNAzyme; and the like.
  • DNA aptamer examples include DNA aptamer; CpG motif; DNAzyme; and the like.
  • those whose base is a DNA strand and into which RNA and / or a non-natural nucleic acid are introduced are classified as DNA molecules.
  • RNA molecules examples include RNA aptamers; RNA molecules exhibiting RNA interference (nucleic acid molecules for RNAi) such as shRNA, siRNA, and microRNA; antisense RNA molecules; RNA ribozymes; and the like.
  • RNA molecules those whose base is an RNA chain and into which DNA and / or a non-natural nucleic acid are partially introduced are classified as RNA molecules.
  • DNA / RNA hybrid molecules examples include DNA / RNA hybrid aptamers
  • the functional nucleic acid molecule is preferably one that hybridizes within the above-described nucleic acid strand or hybridizes between different nucleic acid strands in order to exert its function. The reason is also referred to the description in the following column (Example of preferred design of nucleic acid chain fragment).
  • the functional nucleic acid molecule is more preferably an RNAi nucleic acid molecule having a hybridizing region formed by hybridization within a nucleic acid strand or between different nucleic acid strands, and more preferably an RNAi nucleic acid molecule comprising two nucleic acid strands. It is.
  • the length (mer) of the nucleic acid strand of the RNAi nucleic acid molecule comprising two nucleic acid strands is, for example, 15 to 40 mer, preferably 15 to 35 mer, and more preferably 20 to 35 mer.
  • a “fragment” of a nucleic acid chain constituting a functional nucleic acid molecule corresponds to a nucleic acid molecule obtained by dividing the “nucleic acid chain” into two or more. When all “fragments” derived from one nucleic acid chain are linked in an appropriate order, a nucleic acid molecule having the same nucleic acid sequence as that nucleic acid chain is constructed. However, the term “fragment” is not intended to generate a fragment by once constructing a nucleic acid chain and then dividing it.
  • a nucleic acid chain constituting a functional nucleic acid molecule is constructed by binding fragments, the 3 'end and 5' end between different fragments are mutually bonded.
  • the combination of the 3′-end and the 5′-end to be mutually bonded is referred to as “corresponding end”. That is, the “corresponding ends” are ends adjacent to each other when the fragments are aligned so as to constitute a nucleic acid chain from which the fragments are designed.
  • the length of the “fragment” derived from one nucleic acid strand is not particularly limited, but it may be preferable to prevent the difference in length (mer) between different fragments from becoming too large. In this respect, it is preferable that all the remaining fragments have a length of [25% ⁇ longest fragment length (mer)] or more with respect to the longest “fragment” derived from one nucleic acid strand, More preferably, the length is equal to or greater than 30% ⁇ the length of the longest fragment (mer)].
  • a functional group pair (combination of functional groups) bonded to each other by a chemical reaction is bonded to the “corresponding terminal”, and a nucleic acid chain is formed by bonding these fragments by reacting these functional groups.
  • the above functional group pair is not particularly limited, but for example, a combination of an electrophilic group and a nucleophilic group is preferable. That is, an electrophilic group is bonded to one of the “corresponding ends” and a nucleophilic group is bonded to the other of the “corresponding ends”, whereby different fragments are mutually bonded by a chemical reaction.
  • the electrophilic group and nucleophilic group may be bonded to either the 3 'end or the 5' end. That is, the electrophilic group may be bonded to the 3 ′ end and the nucleophilic group may be bonded to the 5 ′ end, or the electrophilic group may be bonded to the 5 ′ end and the nucleophilic group bonded to the 3 ′ end. May be.
  • the electrophilic group is not particularly limited, but includes an iodoacetyl group (reference: Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 327), and a bromoacetyl group (reference: Nucleic Acids.Res., 22, 5076). Halogenated alkyl group; iodo group (reference: Tetrahedron Lett., 1995, 38, 55959) and halogen group such as bromo group; formyl group; In one embodiment, it may be preferred that the electrophilic group is an iodoacetyl group, a bromoacetyl group, or an iodo group.
  • the nucleophilic group is not particularly limited, and examples thereof include phosphorothioate group; thiol group; hydroxy group; amino group; alkylthio group such as thiomethyl group; alkoxy group such as methoxy group; In one embodiment, it may be preferred that the nucleophilic group is a phosphorothioate group.
  • the combination of the electrophilic group and the nucleophilic group constituting the functional group pair is not particularly limited, but a halogenated alkyl group or a combination of a halogen group and a phosphorothioate group, or a halogenated alkyl group or a halogen group and a thiol. Combinations with groups, etc. may be preferred.
  • the combination of the electrophilic group and the nucleophilic group constituting the functional group pair is more preferably an iodoacetyl group, a bromoacetyl group, or a combination of an iodo group and a phosphorothioate group. It may be preferable.
  • sugar indicates only a skeleton portion, and may be ribose or deoxyribose.
  • B in the chemical formula represents various bases constituting the nucleic acid. That is, the following example shows a case where the functional nucleic acid molecule is an RNA molecule, but a DNA molecule can be similarly configured.
  • the nucleophilic group is formed at a desired timing. It is preferably protected by a protecting group capable of deprotection. That is, in one embodiment, the functional group pair is preferably a combination of an electrophilic group and a nucleophilic group protected by a protecting group.
  • the type of protecting group that protects the nucleophilic group may be appropriately selected according to the type of nucleophilic group.
  • Preferred protecting groups include, for example, those that are eliminated from the nucleophilic group by the action of endogenous substances in the cell.
  • the “endogenous substance in the cell” is paired with the “substance introduced from outside the cell” described later, and is intended to be a substance originally held by the cell.
  • Examples of endogenous substances in cells include enzymes and peptides. Enzymes, peptides, and the like that are expressed in cells by gene transfer are not “introduced from outside the cell” themselves, and are therefore a category of endogenous substances in cells.
  • those that can be used for protecting phosphorothioate groups include phenylthio groups (a) and other arylthio groups having the following structures. And those capable of disulfide protecting the phosphorothioate group; nitrobenzyl group (b), ester (c, d), thiocarbonyl (e), and amide (f); and derivatives thereof.
  • the nitrobenzyl group may be any of an o-nitrobenzyl group, an m-nitrobenzyl group and a p-nitrobenzyl group, but an m-nitrobenzyl group and a p-nitrobenzyl group are preferable from the viewpoint of reactivity.
  • R, R ′ and R ′′ in (c), (d), and (f) are not particularly limited as long as they do not impair the object of the present invention.
  • a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl may have, for example, 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group.
  • N-butyl group isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, hexyl group, 2-ethylhexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group and decyl group
  • Alkyl group cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctyl group, cyclononyl group, cyclyl
  • examples thereof include cyclic alkyl groups such as a lodecyl group and an adamantyl group, and examples of the aryl group include a phenyl group, a tolyl group, and a naphthyl group.
  • Examples of the substituent of the alkyl group or aryl group include a halogen atom (fluorine, chlorine, bromine, and iodine), a hydroxyl group, and an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms (preferably 1 to 4 carbon atoms) (chain-like). And a cyclic alkyl group), an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 1 to 5 carbon atoms, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group having 2 to 5 carbon atoms, an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, a cyano group, A nitro group etc. are mentioned.
  • chain alkyl groups as substituents When a plurality of chain alkyl groups as substituents are present on the aryl group, these chain alkyl groups may be bonded to each other to form a ring, and 1 to 1 carbon atoms in the ring Several (preferably 1 to 3) may be substituted with oxygen atoms.
  • an alkyl substituent located on adjacent carbon atoms on an aryl group forms a ring, and a 1,3-dioxolane-like ring structure in which two carbon atoms are substituted with an oxygen atom is formed. Is mentioned.
  • alkyl group having a cyclic alkyl group as a substituent examples include a cyclopentylmethyl group, a cyclopentylethyl group, a cyclopentylpropyl group, a cyclohexylmethyl group, a cyclohexylethyl group, and a cyclohexylpropyl group.
  • alkyl group having an aryl group as a substituent include a benzyl group, a phenylethyl group, a phenylpropyl group, a naphthalenylmethyl group, a naphthalenylethyl group, and a naphthalenylpropyl group.
  • a part of the skeleton of the aryl group may be substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom to form a heterocyclic ring.
  • a plurality of hydrogen atoms on the benzene ring in (a), (b), and (e) may be substituted with substituents independently of each other. Accordingly, as derivatives of (a), (b), and (e), for example, hydrogen atoms (eg, 1 to 3) on the benzene ring in (a), (b), or (e) are substituted as described above. What was substituted by what was enumerated as a group is mentioned.
  • the phenylthio group is reduced and eliminated by an in vivo thiol source such as GSH (glutathione) present in cells.
  • GSH glutthione
  • the nitrobenzyl group is reduced and eliminated by nitroreductase present in the cell (reference: Bioorg. Med. Chem., 11, 2453).
  • Esters and thiocarbonyls are eliminated by esterases present in the cells.
  • Amides are eliminated by peptidases present in the cells.
  • the phosphorothioate group is protected by a protecting group such as (a) to (f) above, the phosphorothioate group is not substantially deprotected outside the cell. Therefore, a binding reaction does not occur only by mixing nucleic acid chain fragments outside the cell. Therefore, the possibility that the fragment can be introduced into the cell by a single operation is increased. Furthermore, since the deprotection reaction occurs naturally by the enzyme or peptide present in the cell, both the introduction step and the production step can be performed in one operation.
  • the protecting group for protecting the phosphorothioate group includes those capable of leaving the nucleophilic group by light irradiation.
  • Examples of such protecting groups include the following (g) to (j) and derivatives thereof (reference documents: Molecular Pharmaceuticals, 2009, 6, 669).
  • R 1 , R 2 and n in (g) to (j) are not particularly limited as long as they do not impair the object of the present invention.
  • R 1 and R 2 are independently of each other a hydrogen atom or a carbon number.
  • n represents an integer of 1 to 3, preferably 1 or 2 in (g), preferably 1 in (h) and (j).
  • n is 2 or 3
  • n R 1 s may be different from each other
  • n R 2 s may be different from each other.
  • a plurality of hydrogen atoms on the benzene ring in (g) to (j) may be substituted with substituents independently of each other. Therefore, as derivatives of (g) to (j), for example, those in which hydrogen atoms (for example, 1 to 3) on the benzene ring in (g) to (j) are substituted with those listed above as substituents Is mentioned.
  • the phosphorothioate group is protected by a protecting group such as the above (g) to (j), the phosphorothioate group is substantially eliminated extracellularly under conditions that do not irradiate light having a wavelength necessary for elimination of the protecting group. Not deprotected. Therefore, a binding reaction does not occur only by mixing nucleic acid chain fragments outside the cell. Therefore, the possibility that the fragment can be introduced into the cell by a single operation is increased. Furthermore, the deprotection reaction can be caused at a desired timing by controlling the timing of light irradiation.
  • R 3 and R 4 in the protecting group each independently represent a substituent which may be substituted on the aryl group shown above.
  • Examples of the protecting group for protecting the phosphorothioate group include those other than those described above, which are eliminated by a substance introduced from outside the cell.
  • Examples of such protecting groups include an azidobenzyl group (k) and derivatives thereof.
  • the azidobenzyl group may be any of o-azidobenzyl group, m-azidobenzyl group and p-azidobenzyl group, but p-azidobenzyl group is preferred from the viewpoint of reactivity.
  • a plurality of hydrogen atoms on the benzene ring in (k) may be independently substituted with substituents.
  • examples of the derivative of (k) include those in which hydrogen atoms (for example, 1 to 3) on the benzene ring in (k) are substituted with those listed above as substituents.
  • the azidobenzyl group is eliminated by introducing phosphine into the cell (reference: Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 714).
  • the phosphine is preferably a water-soluble phosphine from the viewpoint of membrane permeability.
  • the phosphorothioate group is protected by a protecting group such as (k) above, the phosphorothioate group is not substantially deprotected outside the cell. Therefore, a binding reaction does not occur only by mixing nucleic acid chain fragments outside the cell. Therefore, the possibility that the fragment can be introduced into the cell by a single operation is increased. Furthermore, the deprotection reaction can be caused to occur at a desired timing by controlling the timing at which the deprotecting agent (phosphine or the like) is taken into the cells.
  • the deprotecting agent phosphine or the like
  • a binding reaction can be caused by introducing cyanogen bromide (BrCN) into the cell.
  • a combination of an amino group and an aldehyde group as the functional group pair (reference document: J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10144; J. Am. Chem. Soc., 1997, 1119, 12420) is also available. Can be mentioned.
  • a binding reaction can be caused by introducing sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ) or potassium cyanoborohydride (KBH 3 CN) into the cell.
  • sugar indicates only a skeleton portion, and may be ribose or deoxyribose.
  • B in the chemical formula represents various bases constituting the nucleic acid. That is, the above example shows the case where the functional nucleic acid molecule is an RNA molecule, but a DNA molecule can be similarly configured.
  • the functional nucleic acid molecule when the functional nucleic acid molecule is composed of two nucleic acid strands, at least one of the functional nucleic acid molecules may be two or more fragments, but it is preferable that both of them are two or more fragments.
  • the method for producing the “fragment” of the nucleic acid chain having the functional group at its end is not particularly limited.
  • the oligonucleotide portion of the fragment can be synthesized by an in vitro transcription synthesis method, a method using a plasmid or a viral vector, a method using a PCR cassette, or the like.
  • the chemical synthesis method is preferable from the viewpoints of high purity, mass synthesis, high in-use safety, and chemical modification. Examples of the chemical synthesis method include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method, and a commercially available nucleic acid synthesizer can be used.
  • a method of attaching a predetermined functional group and protecting group to the 3 ′ end and 5 ′ end (corresponding end) of the oligonucleotide may be performed according to a known method according to the type of the functional group.
  • the nucleic acid constituting the “corresponding terminal” is preferably a deoxyribonucleic acid nucleic acid, regardless of the type of “nucleic acid chain”, and dA, dG, dC, More preferably, it is selected from dT.
  • the fragment produced in this way is preferably purified before the introduction step depending on the use from the viewpoint of in-vivo safety.
  • a cell membrane permeable molecule may be bound to the fragment.
  • membrane-permeable peptides such as TAT peptide, oligoarginine, PENETRATIN, and TP-10; cholesterol; vitamin A and the like.
  • nucleic acid chain fragment When the functional nucleic acid molecule is one that hybridizes within a nucleic acid chain or hybridizes between different nucleic acid chains in order to exert its function,
  • the fragments are preferably designed so that the binding between the fragments occurs in the hybridizing region.
  • FIG. 1 shows an example of a preferred design of siRNA as a functional nucleic acid molecule (see also Examples).
  • siRNA is configured such that a first RNA strand and a second RNA strand are hybridized.
  • the first RNA strand has a first fragment (A in the figure) provided with a phosphorothioate group (one of functional group pairs) at the 3 ′ end and an iodoacetyl group (the other functional group pair) at the 5 ′ end. It is given as a given second fragment (B in the figure).
  • the second RNA strand is composed of a third fragment (C in the figure) to which a phosphorothioate group (one of functional group pairs) is added at the 3 ′ end, and an iodoacetyl group (the other functional group pair) at the 5 ′ end. ) Is given as a fourth fragment (D in the figure). Note that each phosphorothioate group is protected by a phenylthio group (protecting group).
  • the first RNA strand and the second RNA strand are each designed to be two fragments at positions shifted from each other. That is, the first fragment and the second fragment constituting the first RNA strand both hybridize to the third fragment so as to be adjacent to each other. Similarly, the third fragment and the fourth fragment constituting the second RNA strand both hybridize to the first fragment so as to be adjacent to each other.
  • the corresponding ends to which the functional groups are attached are close to each other, and the binding reaction between the functional groups in the production step can be efficiently caused. it can.
  • the binding between the fragments constituting the first RNA strand and the binding between the fragments constituting the second RNA strand occur at different locations (positions shifted from each other) in the hybridizing region.
  • one in which only one of the first RNA strand or the second RNA strand is fragmented is also preferable from the viewpoint that the corresponding ends can be brought close to each other efficiently. It is an example of fragmentation.
  • siRNA was illustrated as a functional nucleic acid molecule in FIG. 1, the design of the fragment
  • the introduction step comprises two or more “fragments” in which “functional group pairs” that mutually bond at least one of the above “nucleic acid strands” constituting a functional nucleic acid molecule are attached to “corresponding ends” by chemical reaction.
  • This is a step of introducing all the nucleic acid chains constituting the functional nucleic acid molecule into cells.
  • the definitions of “nucleic acid chain”, “functional group pair”, “corresponding terminal”, and “fragment” are as described above.
  • nucleic acid combination refers to a combination of two or more nucleic acid molecules, which may be in the form of a mixed composition or stored in separate storage containers. It may be in the form of being isolated (unmixed) from each other. 1) When the functional nucleic acid molecule consists of one nucleic acid chain, two or more “fragments” for constructing the nucleic acid chain. It is preferred that all nucleic acid molecules are contained in approximately equal amounts (numbers).
  • the functional nucleic acid molecule is composed of two nucleic acid strands, two or more of the above “fragments” for constructing one nucleic acid strand and another nucleic acid strand. It is preferred that all nucleic acid molecules are contained in approximately equal amounts (numbers).
  • the functional nucleic acid molecule is composed of two nucleic acid strands, two or more of the “fragments” for constructing one nucleic acid strand and two or more for constructing another nucleic acid strand The above “fragment”. It is preferred that all nucleic acid molecules are contained in approximately equal amounts (numbers).
  • the cell into which the nucleic acid combination is to be introduced is not particularly limited.
  • the target cells may be either prokaryotic cells or eukaryotic cells.
  • eukaryotic cells include cells derived from fungi, plants and animals.
  • Animal cells include non-mammalian cells such as insect cells and mammalian cells.
  • Mammalian cells include rodents such as mice, rats and guinea pigs, non-human animal cells such as rabbits, dogs and cats, or human cells.
  • the cell may be a cultured cell or a living cell (an unisolated cell in the living body).
  • a preferable example of the cell is a cultured human cell, a human living cell, a cultured cell of a non-human disease model animal, or a living cell of a non-human disease model animal.
  • the method for introducing the nucleic acid combination is not particularly limited.
  • Examples of the introduction method in vitro include an electroporation method, a microinjection method, a lipofection method, and a calcium phosphate method.
  • Examples of the introduction method in vivo include local administration, intravenous administration, and a method using a gene gun.
  • a method using no microorganism or the like is preferable from the viewpoint of safety.
  • it is preferable to prepare a sample containing a nucleic acid combination before introduction in vivo so as to be compatible with a living body by dialysis or pH adjustment.
  • nucleic acid molecules constituting the nucleic acid combination may be mixed together and introduced into the cell as a nucleic acid composition by a single operation, or may be introduced into the cell separately for each nucleic acid molecule.
  • two or more fragments for constructing a nucleic acid chain may be introduced into a cell by a single operation, or each may be separately introduced into a cell.
  • a nucleic acid combination (construction nucleic acid combination) used in the method for constructing a functional nucleic acid molecule according to the present invention comprises all the above-mentioned “nucleic acid strands” constituting the functional nucleic acid molecule. At least one of them is included as two or more “fragments” in which “functional group pairs” that are mutually bonded by chemical reaction are attached to “corresponding ends”. Examples of the “nucleic acid combination product” are as described in the above (Introduction step) column.
  • the “functional nucleic acid molecule” has a hybridizing region that hybridizes within the “nucleic acid strand” or hybridizes between different “nucleic acid strands”.
  • the “fragment” is designed so that the binding between the “fragments” occurs in the hybridizing region.
  • the first “nucleic acid strand” and the second “nucleic acid strand” capable of hybridizing, which constitute the above “functional nucleic acid molecule”, are provided.
  • Each of the “nucleic acid strands” is included as two “fragments” in which “functional group pairs” that are mutually bonded by a chemical reaction are attached to “corresponding ends”. Further, the bonds between the “fragments” constituting the “first nucleic acid chain” and the bonds between the “fragments” constituting the “second nucleic acid chain” occur at different locations in the hybridizing region. Each fragment has been designed (see also FIG. 1 and the examples).
  • the “functional nucleic acid molecule” is composed of a “first RNA strand” and a “second RNA strand” that can be hybridized.
  • the “RNA strand” is included as “first fragment” and “second fragment” in which “functional group pairs” that are mutually bonded by chemical reaction are attached to “corresponding ends”.
  • the “second RNA strand” is included as “third fragment” and “fourth fragment” in which “functional group pairs” that are mutually bonded by chemical reaction are attached to “corresponding ends”.
  • the “first fragment” or the “second fragment” can hybridize with both the “third fragment” and the “fourth fragment”, and the “third fragment” or the “fourth fragment”.
  • the “fragment” can hybridize with both the “first fragment” and the “second fragment” (see also (Example of preferred design of fragments of nucleic acid chain) column, FIG. 1 and Examples).
  • the nucleic acid combination according to the present invention may be packaged together with an instruction manual (however, the recording medium is not limited to a paper medium but also a recording medium including those stored in an electronic medium) in which the usage procedure is described. Good.
  • the instructions for use include, for example, instructions for using the nucleic acid combination as described in the above (Introduction step) column and (Generation step) column.
  • the nucleic acid combination can be a medicine or a reagent kit depending on its use.
  • the nucleic acid combination may be used to treat rodents such as mice, rats, guinea pigs, non-human animals such as rabbits, dogs, and cats, or human individuals. That is, the nucleic acid combination may be administered to a non-human animal individual or a human individual.
  • the administration method is as described above as the introduction method in vivo.
  • nucleic acid combinations for rodents such as mice, rats and guinea pigs, non-human animals such as rabbits, dogs and cats or human individuals.
  • cells into which the nucleic acid combination has been introduced holds the above-described nucleic acid combination inside.
  • the cells into which the nucleic acid combination has been introduced are packaged together with instructions for use (however, recording media including those stored in electronic media as well as paper media are not particularly limited). May be.
  • the instructions for use include, for example, instructions for using the cells as described in the (generation process) column.
  • the cell may be a medicine or a reagent kit depending on its use.
  • the present invention includes the following. 1) A method for constructing a functional nucleic acid molecule consisting of one or two nucleic acid strands, wherein two or more fragments having functional group pairs that are mutually linked by chemical reaction are attached to the corresponding ends and introduced into cells. And a generating step of reacting the functional groups in the cell to bond the fragments together to generate a functional nucleic acid molecule composed of one or two nucleic acid strands. 2)
  • the functional nucleic acid molecule has a hybridizing region that hybridizes within the nucleic acid strand or hybridizes between different nucleic acid strands, and the binding between the fragments is the hybridizing region.
  • the method according to 1) wherein the fragment is designed to occur.
  • the functional nucleic acid molecule is composed of the two nucleic acid strands of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand, and has the hybridizing region obtained by hybridizing between different nucleic acid strands.
  • Each of the nucleic acid strands of this book is introduced into a cell as two fragments with functional group pairs that are mutually bonded by a chemical reaction attached to the corresponding ends, and between the fragments constituting the first nucleic acid strand.
  • the method according to 2) wherein the binding and the binding of the fragments constituting the second nucleic acid chain occur at different locations in the hybridizing region.
  • the functional nucleic acid molecule is composed of a first RNA strand as the first nucleic acid strand and a second RNA strand as the second nucleic acid strand.
  • the first RNA strand is chemically
  • a pair of functional groups that are mutually bonded by reaction is introduced into the cell as a first fragment and a second fragment that are attached to the corresponding ends, and the second RNA strand has a function that is mutually bonded by a chemical reaction.
  • a third fragment and a fourth fragment having a base pair attached to the corresponding ends; and the first fragment or the second fragment is the third fragment and the fourth fragment.
  • the functional group pair that is mutually bonded by the chemical reaction is a combination of an electrophilic group and a nucleophilic group protected by a protecting group.
  • the nucleophilic group is a phosphorothioate group.
  • R, R ′ and R ′′ represent a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group.
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • N represents an integer of 1 to 3.
  • n is 2 or 3
  • n R 1 s may be different from each other
  • n R 2 s may be different from each other.
  • a plurality of hydrogen atoms on the benzene ring in (a), (b), (e), (g), (h), (i), (j), and (k) are independent of each other.
  • the functional nucleic acid molecule has a hybridizing region that hybridizes within the nucleic acid strand or hybridizes between different nucleic acid strands, and the binding between the fragments is the hybridizing region.
  • the first RNA comprising the first RNA strand as the first nucleic acid strand and the second RNA strand as the second nucleic acid strand constituting the functional nucleic acid molecule
  • the strand is included as a first fragment and a second fragment with functional group pairs that are mutually bonded by a chemical reaction
  • the second RNA strand is a functional group that is mutually bonded by a chemical reaction.
  • a third fragment and a fourth fragment, which are paired at corresponding ends, and the first fragment or the second fragment hybridizes with both the third fragment and the fourth fragment.
  • the nucleic acid combination according to 13), wherein the third fragment or the fourth fragment is capable of hybridizing with both the first fragment and the second fragment.
  • RNA design and synthesis Based on siRNA 1 (FIG. 2 (a); SEQ ID NOS: 1 and 2) that suppresses the expression of the luciferase gene, the sense strand and the antisense strand are converted into 3′-PS (phosphorothioate) RNA and 5′-amino RNA, respectively.
  • 3'-PS RNA and 5'-amino RNA were all synthesized using a DNA synthesizer (GeneWorld® H8-SE) based on the phosphoramidite method.
  • amidite reagents 2′-O-TOM protector (Glen Research) was used for RNA, and 3′-Phosphate CPG (Glen Research) and Sulfurizing Reagent (Glen Research) were used for phosphorylation at the 3 ′ end. .
  • 5'-Amino dT Phosphoroamidite was used for introduction of 5'-terminal amino dT.
  • the RNA was deprotected according to a conventional method, and 3'-PS RNA and 5'-amino RNA were used in the next reaction with crude purification.
  • iodoacetyl RNA was synthesized by reacting 5′-amino RNA in the sense strand and antisense strand with N-succinimidyl iodoacetate (FIG. 2 (d)).
  • the iodoacetylation of 5′-amino RNA was carried out by incubating a mixture prepared with the composition shown in Table 2 for 2 hours at room temperature.
  • RNA used for comparison A non-modified siRNA (25mer: sequence shown in FIG. 2 (a)) was prepared using a DNA synthesizer (GeneWorld H8-SE) based on the phosphoramidite method in the same manner as the synthesis of 3′-PS RNA and 5′-amino RNA. And the full chain product was purified by denaturing polyacrylamide gel.
  • acetyl RNA having no reactivity with 3'-PS RNA was synthesized by reacting 5'-amino RNA in the sense strand and antisense strand with sodium acetate ((e) of FIG. 2). Acetylation of 5'-amino RNA was performed by incubating a mixture prepared with the composition shown in Table 3 at room temperature for 2 hours.
  • ligated siRNA generated when 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA are ligated was also synthesized by ligating 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA in vitro (cell-free system) ( FIG. 2 (f); SEQ ID NOs: 5 and 6).
  • composition of HBSS is 1.8 mM CaCl 2 , 0.49 mM MgCl 2 , 0.41 mM MgSO 4 , pH 7.4.
  • a loading buffer (100% formamide, 0.5% XC) was added and incubated at 90 ° C. for 5 minutes.
  • the reaction was run on a 20% denaturing acrylamide gel and analyzed by staining with CYBR Green II for 30 minutes. As markers, 25 mer RNA strands are loaded in lane 1, 19 mer caged 3'-PS RNA (sense strand) in lane 2, and 18 mer caged 3'-PS RNA (antisense strand) in lane 3 in the same manner. did.
  • RNA interference effect using cultured mammalian cell system 1 (Method) HeLa-Luc cells (purchased from Caliper (PerkinElmer company)) were cultured in DMEM (manufactured by Wako) medium containing 10% FBS at 37 ° C. under 5% CO 2 , and 100 ⁇ L each in a 96-well plate, 4.0 It dispensed so that it might become * 10 ⁇ 3 > cells / well. The cells were further cultured at 37 ° C.
  • RNAs sense strand and antisense strand 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA
  • concentration of RNA was 25, 50 or 100 nM.
  • the following transfection mixed solution was added in a state where 50 ⁇ L of HBSS (+) was added to the cells.
  • the composition of the mixed solution for transfection is as shown in Table 5.
  • Luciferase Assay System Promega was used to quantify the luciferase expression level according to the attached protocol (conditions: reagent amount 50 ⁇ L, delay time 2 seconds, read time 10 seconds, instrument: Muthras LB 940 (Made by BERTHOLD)).
  • scrambled 25 nM
  • unmodified siRNA 25 nM
  • ligated siRNA 25 nM
  • Caged 3′-PS RNA + acetyl RNA 25 nM, 50 nM or 100 nM
  • Caged 3′-PS RNA only 100 nM
  • iodoacetyl RNA alone 100 nM
  • acetyl RNA alone 100 nM
  • RNA interference effect using cultured mammalian cell system 2 transfection by osmotic shock
  • Methods HeLa-Luc cells were cultured in DMEM (manufactured by Wako) medium containing 10% FBS at 37 ° C. under 5% CO 2 , collected in a state of about 60% confluence, and washed with PBS. Next, the cells were suspended in a mixture (10 ⁇ L) of hypertonic buffer and various RNAs (sense strand and antisense strand 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA), and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • DMEM manufactured by Wako
  • various RNAs sense strand and antisense strand 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA
  • the composition of hypertonic buffer is 2.1M sucrose, 7.5% PEG (2000), 150 mM HEPES (pH 7.3) in HBSS buffer.
  • Table 6 shows the composition of a mixture (10 ⁇ L) of hypertonic buffer and various RNAs.
  • the cells were incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, and Luciferase Assay System (Promega) was used to quantify the luciferase expression level according to the attached protocol (conditions: reagent amount 30 ⁇ L, delay time 2 seconds, read time 10 seconds, equipment: Muthras LB 940 (made by BERTHOLD).
  • the amount of protein was quantified using a BCA protein assay kit (Thermo Scientific) according to the attached protocol, and the expression level of luciferase was corrected.
  • siRNA For comparison, scrambled and unmodified siRNA were transfected in the same manner as described above, and the luciferase expression level was quantified and corrected.
  • T98G cells obtained from RIKEN BioResource Center
  • RPMI-1640 medium manufactured by Wako
  • FBS 10% FBS
  • RPMI-1640 medium manufactured by Wako
  • FBS 10% FBS
  • RNAs sense strand and antisense strand 3′-PS RNA and iodoacetyl RNA
  • RNA lipofectamine 2000 invitrogen
  • RNA, poly I: C unmodified siRNA were similarly transfected.
  • concentration of RNA was 100 nM (final volume 300 ⁇ L).
  • the composition of the mixed solution for transfection is as shown in Table 7.
  • the composition of the reaction solution used for real-time PCR is as shown in Table 8.
  • the reaction conditions for real-time PCR are as shown in Table 9.
  • the present invention can be used in the fields of medicines and reagents using functional nucleic acid molecules.

Abstract

　１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入して、細胞内で官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する。

Description

機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物
　本発明は、機能性核酸分子を細胞内で構築する新規な方法、および当該方法に用いる核酸組合せ物に関するものである。
　核酸分子の中には、タンパク質をコードしないが、各種の生命現象に重要な機能を果たすものが知られている。このような核酸分子として、例えば、機能性のｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ分子（非特許文献１）、およびＲＮＡ干渉作用を引き起こすＲＮＡの小分子（非特許文献２）等が挙げられる。
　例えば、ＲＮＡ干渉作用は、細胞内で、標的ＲＮＡの作用を特異的に抑制する重要な手法（非特許文献３）として、試薬としては元より、医薬としての応用（非特許文献４）も盛んに研究されている。
Ryan J Taft, Ken C Pang, Timothy R Mercer, Marcel Dinger1 and John S Mattick, J Pathol., 2010, 220, 126-139. Fire A, XuS, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C; Nature, 1998, 391, 806-11. Sayda M. Elbashir, Javier Martinez, Agnieszka Patkaniowska, Winfried Lendeckel and Thomas Tuschl; EMBO J. 2001, 20, 6877-6888. John C. Burnett, John J. Rossi and Katrin Tiemann; Biotechnol. J. 2011, 6, 1130-1146.
　ＲＮＡ干渉作用を引き起こすＲＮＡは小分子であるにもかかわらず、その効果を最大限に引き出すために、細胞膜の透過性をさらに向上させる要求、および免疫系を賦活化することによる毒性発現を抑制するためのさらなる要求が存在する。
　しかし、このような要求に対して、ＲＮＡ分子をさらに小分子とするため、その機能発揮に必要最小限な配列に絞りこむ努力がなされているに過ぎないのが現状である。
　本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、機能性核酸分子を細胞に取り込み容易な形態にして細胞内に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築する方法等を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法を提供する。
　本発明はまた、上記方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物を提供する。
　機能性核酸分子を細胞に取り込み容易な複数の断片として細胞内に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築することができる。
本発明に係る方法の一実施形態の概略を示す図である。 実施例において、用いた各種ＲＮＡの配列を示す図である。 実施例において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるライゲーションの結果を示す図である。 実施例において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を示す図である。 実施例において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を示す図である。 実施例において、免疫応答測定の結果を示す図である。
　〔１．機能性核酸分子の構築法〕
　（構築法の概要）
　本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程１）および２）を含む。
１）化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程、
２）上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
　つまり、本発明に係る機能性核酸分子の構築法は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程１）および２）を含む。
１）上記核酸鎖のうちの少なくとも１本を、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片とし、その上で、上記１または２本の核酸鎖（すなわち、少なくとも１本は２以上の断片とされている）を細胞内に導入する導入工程、
２）上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程。
　上記の構築法は、機能性核酸分子を構成する核酸鎖の少なくとも一部を複数の断片として細胞に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築させる。したがって、機能性核酸分子の細胞への取り込みが向上する。また、核酸鎖の少なくとも一部をより短い断片として用いるために、機能性核酸分子に起因する免疫毒性が抑制されうる。
　（機能性核酸分子）
　本発明において、機能性核酸分子とは、複数個の核酸が鎖状に連結してなり（すなわち、オリゴまたはポリヌクレオチド）、タンパク質をコードせず、かつ発生・分化等の生命現象に対して所定の機能を発揮する核酸分子を指す。したがって、生命現象において特段の機能を発揮しない、単に標的特異的にハイブリダイズするだけのプライマーおよびプローブは、本発明における機能性核酸分子の範疇から除かれる。
　機能性核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド分子である。機能性核酸分子は、１本の核酸鎖から構成されるものであっても、２本の核酸鎖から構成されるものであってもよい。また、機能性核酸分子は、その一部に非天然の核酸を含んでいてもよい。なお、本明細書において、用語「核酸鎖」とは、機能性核酸分子を構成している状態での全長核酸鎖を指し、当該「核酸鎖」をより短くしたものに相当する用語「断片」（後述する）とは区別されている。
　上記ＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡアプタマー；ＣｐＧモチーフ；ＤＮＡザイム；等が挙げられる。なお、本明細書において、ベースがＤＮＡ鎖であり、一部にＲＮＡおよび／または非天然の核酸等が導入されているものは、ＤＮＡ分子に分類する。
　上記ＲＮＡ分子としては、例えば、ＲＮＡアプタマー；ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ等のＲＮＡ干渉作用を示すＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ用核酸分子）；アンチセンスＲＮＡ分子；ＲＮＡリボザイム；等が挙げられる。なお、本明細書において、ベースがＲＮＡ鎖であり、一部にＤＮＡおよび／または非天然の核酸等が導入されているものは、ＲＮＡ分子に分類する。
　ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド分子としては、例えば、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドアプタマー；等が挙げられる。
　機能性核酸分子は、好ましくは、その機能を発揮するために、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成するものである。その理由は、後述の（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄の記載も参照される。
　機能性核酸分子は、より好ましくは、核酸鎖内または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を持つＲＮＡｉ用核酸分子であり、さらに好ましくは２本の核酸鎖からなるＲＮＡｉ用核酸分子である。２本の核酸鎖からなるＲＮＡｉ用核酸分子の核酸鎖の長さ（ｍｅｒ）は、例えば、１５～４０ｍｅｒであり、好ましくは１５～３５ｍｅｒであり、より好ましくは２０～３５ｍｅｒである。
　（核酸鎖の断片）
　機能性核酸分子を構成する核酸鎖の「断片」とは、上記「核酸鎖」を２以上に分割した核酸分子に相当する。そして、一つの核酸鎖に由来する全ての「断片」を適切な順序で連結すると当該核酸鎖と同じ核酸配列を有する核酸分子が構築される。ただし、用語「断片」とは、核酸鎖を一度構築した後にこれを分断して当該断片を生成することを意図するものではない。
　断片を結合して、機能性核酸分子を構成する核酸鎖を構築する場合、異なる断片間の３’側末端と、５’側末端とを相互結合させる。このとき、相互結合させるべき３’側末端と５’側末端との組合せを「対応する末端」と称する。すなわち、「対応する末端」とは、断片のデザインの元となる核酸鎖を構成するように断片を整列化したときに隣り合う末端である。
　なお、一つの核酸鎖に由来する「断片」の長さは特に限定されないが、異なる断片間の長さ（ｍｅｒ）の差が著しく大きくなり過ぎないようにすることが好ましい場合がある。この観点では、一つの核酸鎖に由来する最長の「断片」に対して、残る全ての断片が〔２５％×最長の断片の長さ（ｍｅｒ）〕以上の長さであることが好ましく、〔３０％×最長の断片の長さ（ｍｅｒ）〕以上の長さであることがより好ましい。
　上記「対応する末端」には、化学反応により相互結合する官能基対（官能基の組合せ）が結合されていて、これら官能基同士を反応させて断片同士を結合することにより核酸鎖が構成される。
　上記の官能基対は特に限定されないが、例えば、求電子基と、求核基との組合せが好ましい。すなわち、上記「対応する末端」の一方に求電子基を結合させ、「対応する末端」の他方に求核基を結合させることにより、異なる断片同士を化学反応により相互結合する。なお、求電子基および求核基は、３’末端および５’末端の何れに結合させてもよい。すなわち、求電子基を３’末端に結合し、求核基を５’末端に結合してもよいし、あるいは、求電子基を５’末端に結合し、求核基を３’末端に結合してもよい。
　上記の求電子基としては、特に限定されないが、ヨードアセチル基（参考文献：Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 327）、およびブロモアセチル基（参考文献：Nucleic Acids Res., 22, 5076）等のハロゲン化アルキル基；ヨード基（参考文献：Tetrahedron Lett., 1995, 38, 55959）、およびブロモ基等のハロゲン基；ホルミル基；等が挙げられる。一実施形態において、求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、またはヨード基であることが好ましい場合がある。
　上記の求核基としては、特に限定されないが、ホスホロチオエート基；チオール基；ヒドロキシ基；アミノ基；チオメチル基等のアルキルチオ基；メトキシ基等のアルコキシ基；等が挙げられる。一実施形態において、求核基は、ホスホロチオエート基であることが好ましい場合がある。
　また、官能基対を構成する上記求電子基と上記求核基との組合せも特に限定されないが、ハロゲン化アルキル基またはハロゲン基とホスホロチオエート基との組合せ、またはハロゲン化アルキル基またはハロゲン基とチオール基との組合せ、等が好ましい場合がある。また、一実施形態において、官能基対を構成する上記求電子基と上記求核基との組合せは、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、またはヨード基と、ホスホロチオエート基との組合せであることがより好ましい場合がある。
　以下に、対応する末端に付される上記求電子基と上記求核基との好ましい組合せの一例、およびこれらの基が化学反応により相互連結する形態を示す。なお、化学式中で、糖は骨格部分のみを示しており、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。また、化学式中のＢは核酸を構成する各種の塩基を示す。すなわち、以下の例では、機能性核酸分子がＲＮＡ分子の場合を示しているが、ＤＮＡ分子でも同様に構成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　特に、相互結合させるべき複数の断片を同時に系内に存在させる場合、細胞外で相互結合する断片の割合をより低減する（実質的になくす）ために、上記求核基は、所望のタイミングで脱保護が可能な保護基によって保護されていることが好ましい。すなわち、一実施形態において、官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せであることが好ましい。
　求核基を保護する保護基の種類は、求核基の種類に応じて適宜採用をすればよい。好ましい保護基としては、例えば、細胞中の内因性物質の作用によって求核基から脱離するものが挙げられる。「細胞中の内因性物質」とは、後述の「細胞外から導入される物質」と対をなすものであり、その細胞が元々保持している物質を意図している。細胞中の内因性物質としては、例えば、酵素およびペプチド等が挙げられる。遺伝子導入により細胞内で発現させた酵素およびペプチド等は、それ自体が「細胞外から導入される」ものではないため、細胞中の内因性物質の範疇である。
　細胞中の内因性物質の作用によって求核基から脱離する保護基のうち、ホスホロチオエート基の保護に使用可能なものとしては、以下に構造を示す、フェニルチオ基（ａ）その他のアリールチオ基のような、ホスホロチオエート基をジスルフィド保護できるもの；ニトロベンジル基（ｂ）、エステル（ｃ、ｄ）、チオカルボニル（ｅ）、およびアミド（ｆ）；ならびにこれらの誘導体等が挙げられる。なお、上記ニトロベンジル基は、ｏ－ニトロベンジル基、ｍ－ニトロベンジル基およびｐ－ニトロベンジル基の何れでもよいが、反応性の観点からｍ－ニトロベンジル基およびｐ－ニトロベンジル基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　なお、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）におけるＲ、Ｒ’およびＲ”は、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に限定されないが、例えば、置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。アルキル基またはアリール基は、例えば、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０であり得る。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、２－エチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基等の鎖状アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基およびアダマンチル基等の環状アルキル基が挙げられる。また、アリール基としては、例えば、フェニル基、トリル基およびナフチル基等が挙げられる。
　アルキル基またはアリール基が有する置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素）、ヒドロキシル基、炭素数１～１０（好ましくは炭素数１～４）のアルキル基（鎖状および環状アルキル基）、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～５個のアシルオキシ基、カルボキシル基、炭素数２～５のアルコキシカルボニル基、炭素数６～１０のアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。なお、置換基として複数の鎖状の上記アルキル基がアリール基上に存在する場合、これら鎖状のアルキル基同士は互いに結合して環を構成してもよく、該環における炭素原子の１～数個（好ましくは１～３個）が酸素原子に置換されていてもよい。一例として、アリール基上の隣接する炭素原子上に位置するアルキル置換基同士が環を形成し、かつ２つの炭素原子が酸素原子で置換された１，３－ジオキソラン様の環構造を形成することが挙げられる。
　置換基として環状アルキル基を有するアルキル基としては、例えば、シクロペンチルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基およびシクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。また、置換基としてアリール基を有するアルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフタレニルメチル基、ナフタレニルエチル基およびナフタレニルプロピル基等が挙げられる。
　また、アリール基は骨格の一部が窒素原子、酸素原子または硫黄原子等に置換されて複素環を形成してもよい。また、（ａ）、（ｂ）、および(ｅ)におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ａ）、（ｂ）、および(ｅ)の誘導体として、例えば、（ａ）、（ｂ）、または(ｅ)におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１～３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
　フェニルチオ基は、細胞内に存在するＧＳＨ（グルタチオン）等の生体内チオール源によって還元され脱離する。ニトロベンジル基は、細胞内に存在するニトロレダクターゼによって還元され脱離する（参考文献：Bioorg. Med. Chem., 11, 2453）。エステルおよびチオカルボニルは、細胞内に存在するエステラーゼによって脱離する。アミドは、細胞内に存在するペプチダーゼによって脱離する。
　上記（ａ）～（ｆ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、細胞内の存在する酵素またはペプチドによって脱保護反応が自然に起こるため、１回の操作で導入工程および生成工程の両方を行うことができる。
　ホスホロチオエート基を保護する保護基としては、上記の他に、光照射によって求核基から脱離するものが挙げられる。そのような保護基としては、例えば、下記の（ｇ）～（ｊ）およびこれらの誘導体等が挙げられる（参考文献：Molecular Pharmaceutics, 2009, 6, 669）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　（ｇ）～（ｊ）におけるＲ１、Ｒ２およびｎは、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に限定されないが、例えば、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、ｎは１～３の整数、好ましくは（ｇ）では１または２を表し、好ましくは（ｈ）および（ｊ）では１を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ｇ）～（ｊ）におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ｇ）～（ｊ）の誘導体として、例えば、（ｇ）～（ｊ）におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１～３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
　上記（ｇ）～（ｊ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該保護基の脱離に必要な波長の光を照射しない条件下において、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、光照射のタイミングを制御することによって、所望のタイミングで脱保護反応を起こさせることができる。
　上記（ｇ）またはその誘導体の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　上記（ｈ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　上記（ｉ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　上記（ｊ）の具体例としては、例えば以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　ここで、上記保護基中のＲ３およびＲ４は、互いに独立して、上記で示したアリール基上で置換されてもよい置換基を表す。
　ホスホロチオエート基を保護する保護基としては、上記の他に、細胞外から導入される物質によって脱離するものが挙げられる。そのような保護基としては、例えば、アジドベンジル基（ｋ）およびこれの誘導体等が挙げられる。なお、アジドベンジル基は、ｏ－アジドベンジル基、ｍ－アジドベンジル基およびｐ－アジドベンジル基の何れでもよいが、反応性の観点からｐ－アジドベンジル基が好ましい。また、（ｋ)におけるベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。したがって、（ｋ）の誘導体として、例えば、（ｋ）におけるベンゼン環上の水素原子（例えば１～３個）が上記で置換基として列挙したものに置換されたものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　アジドベンジル基は、ホスフィンを細胞内に導入することによって脱離する（参考文献：Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 714）。ホスフィンは、膜透過性の観点から、水溶性ホスフィンであることが好ましい。
　上記（ｋ）のような保護基によってホスホロチオエート基を保護すれば、当該ホスホロチオエート基は細胞外で実質的に脱保護されない。それゆえ、核酸鎖の断片を細胞外で混合しただけでは結合反応が起こらない。したがって、短い断片のまま１回の操作で細胞内に導入できる可能性が高まる。さらに、脱保護の作用物質（ホスフィン等）を細胞内に取り込ませるタイミングを制御することによって、所望のタイミングで脱保護反応を起こさせることができる。
　また、所定の条件下のみで互いに反応して結合する官能基対としては、上記した脱保護反応を利用するものの他に、ホスホロジエステル基とヨード基との組合せ（参考文献：J. Mol. Evol., 2003, 56, 607）が挙げられる。この組合せを用いる場合、臭化シアン（ＢｒＣＮ）を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　さらに、上記官能基対としてアミノ基とアルデヒド基との組合せ（参考文献：J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10144；J. Am. Chem. Soc., 1997, 1119, 12420）も挙げられる。この組合せを用いる場合、シアノホウ素化水素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）またはシアノホウ素化水素カリウム（ＫＢＨ３ＣＮ）を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　さらに、上記官能基対としてアジド基とアルキニル基との組合せ（参考文献：PNAS, 2010, vol. 107, 15329-15334、ChemBioChem, 2011, 12, 125-131）が挙げられる。この組合せを用いる場合、銅を細胞内に導入することによって結合反応を起こすことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　なお、上記の化学式中で、糖は骨格部分のみを示しており、リボースであってもデオキシリボースであってもよい。また、化学式中のＢは核酸を構成する各種の塩基を示す。すなわち、以上の例では、機能性核酸分子がＲＮＡ分子の場合を示しているが、ＤＮＡ分子でも同様に構成することができる。
　なお、機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、その少なくとも１本が２以上の断片となっていればよいが、２本ともが２以上の断片となっていることが好ましい。
　（核酸鎖の断片の作成方法）
　上記官能基が末端に付された核酸鎖の「断片」の作製方法は特に限定されない。例えば、当該断片のオリゴヌクレオチドの部分は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ合成方法、プラスミドもしくはウイルスベクターを用いる方法、またはＰＣＲカセットによる方法等によって合成することができる。純度の高さ、大量合成可能、ｉｎ　ｖｉｖｏでの使用安全性の高さ、および化学修飾可能等の観点から、化学合成方法が好ましい。化学合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、およびＨ－ホスホネート法等が挙げられ、市販の核酸合成機を使用することができる。
　また、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端（対応する末端）に、所定の官能基および保護基を付する方法は、官能基の種類に応じた公知の方法に従い行えばよい。なお、官能基等の導入がより容易であるという観点では、「対応する末端」を構成する核酸は、「核酸鎖」の種類に係らず、デオキシリボ体の核酸が好ましく、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴから選択されることがより好ましい。
　このように作製した断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの使用安全性等の観点から、用途によっては、導入工程前に精製されることが好ましい。また、断片の細胞膜透過性を高めるために、当該断片に細胞膜透過性分子を結合させてもよい。このような分子としては、例えば、ＴＡＴペプチド、オリゴアルギニン、PENETRATIN、およびTP-10等の膜透過性ペプチド；コレステロール；ビタミンＡ等が挙げられる。
　（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）
　上記機能性核酸分子が、その機能を発揮するために、核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成するものである場合、当該核酸鎖の断片は、当該断片同士の結合がハイブリダイズ領域で生じるように設計されることが好ましい。以下、図１に基づき、より具体的に説明する。
　図１は、機能性核酸分子としてのｓｉＲＮＡの好ましい設計の一例を示す（実施例も参照）。この例において、ｓｉＲＮＡは、第一のＲＮＡ鎖と第二のＲＮＡ鎖とがハイブリダイズするように構成されている。
　第一のＲＮＡ鎖は、３’末端にホスホロチオエート基（官能基対の一方）を付与された第一の断片（図中Ａ）と、５’末端にヨードアセチル基（官能基対の他方）を付与された第二の断片（図中Ｂ）として与えられている。また、第二のＲＮＡ鎖は、３’末端にホスホロチオエート基（官能基対の一方）を付与された第三の断片（図中Ｃ）と、５’末端にヨードアセチル基（官能基対の他方）を付与された第四の断片（図中Ｄ）として与えられている。なお、ホスホロチオエート基は何れもフェニルチオ基（保護基）によって保護されている。
　第一のＲＮＡ鎖および第二のＲＮＡ鎖は、互いにずれた位置でそれぞれ２つの断片になるよう設計されている。すなわち、第一のＲＮＡ鎖を構成する第一の断片と第二の断片とは、何れも、隣り合うように第三の断片に対してハイブリダイズする。同様に、第二のＲＮＡ鎖を構成する第三の断片と第四の断片とは、何れも、隣り合うように第一の断片に対してハイブリダイズする。これにより、第一のＲＮＡ鎖および第二のＲＮＡ鎖の何れにおいても、官能基が付された対応する末端同士が近接して、生成工程における官能基同士の結合反応を効率的に起こすことができる。
　なお、図１では、第一のＲＮＡ鎖を構成する断片同士の結合と、第二のＲＮＡ鎖を構成する断片同士の結合とが、ハイブリダイズ領域の異なる箇所（互いにずれた位置）で生じるものを例示したが、例えば、図１において、第一のＲＮＡ鎖または第二のＲＮＡ鎖の一方のみが断片化されているものも、対応する末端同士を効率的に近接させることができる観点で好ましい断片化の一例である。
　また、図１では機能性核酸分子としてｓｉＲＮＡを例示したが、この図で示した断片の設計は、核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を形成する機能性核酸分子に広く適用可能である。
　（導入工程）
　導入工程は、機能性核酸分子を構成する上記「核酸鎖」のうちの少なくとも１本を、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」の形態とした上で、当該機能性核酸分子を構成する全ての核酸鎖を細胞内に導入する工程である。なお、「核酸鎖」、「官能基対」、「対応する末端」、および「断片」の定義は上述の通りである。
　より具体的には、導入工程では、例えば、以下の１）～３）の何れかの「核酸組合せ物」が細胞内に導入される。なお、「核酸組合せ物」とは、２以上の核酸分子を組み合わせたものを指し、これらは混合された組成物の形態をとっていてもよく、あるいは、別々の保存容器に保管されるなどして互いに隔離された（混合されていない）形態をとっていてもよい。
１）機能性核酸分子が１本の核酸鎖からなる場合、当該核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
２）機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、うち１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」と、他の１本の核酸鎖。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
３）機能性核酸分子が２本の核酸鎖からなる場合、うち１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」と、他の１本の核酸鎖を構築するための２以上の上記「断片」。全ての核酸分子が略等量（個数）で含まれていることが好ましい。
　核酸組合せ物の導入対象となる細胞は、特に限定されない。対象となる細胞は、原核細胞および真核細胞の何れでもよい。真核細胞としては、菌類、植物および動物等に由来する細胞が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞等の非哺乳類細胞および哺乳類細胞が挙げられる。哺乳類細胞としては、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、およびネコ等の非ヒト動物の細胞またはヒトの細胞が挙げられる。また、細胞は、培養細胞でもよいし、生体細胞（生体内にある単離されていない細胞）でもよい。細胞の好ましい一例は、ヒトの培養細胞、ヒトの生体細胞、非ヒト病態モデル動物の培養細胞、非ヒト病態モデル動物の生体細胞である。
　核酸組合せ物の導入方法は特に限定されない。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、およびリン酸カルシウム法等が挙げられる。ｉｎ　ｖｉｖｏにおける導入方法としては、例えば、局所投与、静脈内投与、および遺伝子銃を用いる方法等が挙げられる。ヒトまたは非ヒト動物の生体に適用する場合、安全性の観点から微生物等を用いない方法が好ましい。また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける導入前に核酸組合せ物を含む試料を、透析またはｐＨ調節等を行うことによって生体に適合するように調製することが好ましい。また、ｉｎ　ｖｉｖｏに適用する場合、必要に応じて、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて薬学的組成物（例えば、リポソーム製剤等）を製造してもよい。
　また、核酸組合せ物を構成する核酸分子は、全てを混合して核酸組成物として一度の操作で細胞内に導入してもよいし、核酸分子毎に別々に細胞内に導入してもよい。また、核酸鎖を構築するための２以上の断片を、一度の操作で細胞内に導入してもよいし、それぞれを別々に細胞内に導入してもよい。
　（生成工程）
　生成工程では、上記導入工程で核酸組合せ物を導入した細胞内で、上記「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」同士を結合させる。すなわち、官能基対の間で化学反応が進行して、「対応する末端」同士が結合（化学ライゲーション＝非酵素的なライゲーション）されることで、「断片」として与えられていた核酸鎖が１本の連続した核酸鎖として構築される。あわせて、必要に応じて核酸鎖内または異なる核酸鎖間でハイブリダイゼーションのような相互作用を生じて、機能性核酸分子を生成する。
　上記の（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄で説明したケースでは、図１に示すように、導入工程後に、ハイブリダイゼーションによる断片の適切な整列化、「官能基」の脱保護、および「官能基対」の間での化学反応の進行（化学ライゲーション）、が同時進行的に生じて、２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子が生成する。
　〔２．核酸組合せ物〕
　（核酸組合せ物の概要）
　本発明に係る機能性核酸分子の構築法に用いる核酸組合せ物（構築用核酸組合せ物）は、機能性核酸分子を構成する全ての上記「核酸鎖」を備えてなり、当該「核酸鎖」のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２以上の「断片」として含まれているものである。なお、「核酸組合せ物」の例示は、上記（導入工程）欄で説明した通りのものである。
　（核酸組合せ物の好ましい形態）
　核酸組合せ物の好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」は、上記「核酸鎖」内でハイブリダイズするか、または異なる「核酸鎖」間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記「断片」同士の結合が、当該ハイブリダイズ領域で生じるように、上記「断片」が設計されている。
　核酸組合せ物のより好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の「核酸鎖」および第二の「核酸鎖」を備えてなり、これら２本の「核酸鎖」は何れも、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した２つの「断片」として含まれている。そして、「第一の核酸鎖」を構成する「断片」同士の結合と、「第二の核酸鎖」を構成する「断片」同士の上記結合とが、ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、それぞれの断片が設計されている（図１および実施例も参照）。
　核酸組合せ物のさらに好ましい形態では、上記「機能性核酸分子」を構成する、ハイブリダイズが可能な「第一のＲＮＡ鎖」と「第二のＲＮＡ鎖」とを備えてなり、「第一のＲＮＡ鎖」は、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した「第一の断片」と「第二の断片」として含まれている。また、「第二のＲＮＡ鎖」は、化学反応により相互結合する「官能基対」を「対応する末端」に付した「第三の断片」と「第四の断片」として含まれている。そして、「第一の断片」または「第二の断片」は、「第三の断片」および「第四の断片」の双方とハイブリダイズ可能であり、「第三の断片」または「第四の断片」は、「第一の断片」および「第二の断片」の双方とハイブリダイズ可能である（（核酸鎖の断片の好ましい設計の例）欄、図１および実施例も参照）。
　（核酸組合せ物の応用）
　本発明に係る核酸組合せ物は、その使用手順が記載された使用説明書（ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない）とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、上記（導入工程）欄、（生成工程）欄で説明したような核酸組合せ物の使用説明が記載される。核酸組合せ物はその用途に応じて、医薬、または試薬キットでありうる。
　〔３．その他〕
　（機能性核酸分子の構築法の応用）
　核酸組合せ物は、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、およびネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体を治療するために用いてもよい。すなわち、非ヒト動物の個体またはヒトの個体に、核酸組合せ物を投与してもよい。投与方法は、上述のｉｎ　ｖｉｖｏにおける導入方法として挙げたとおりである。
　また、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ等の非ヒト動物の個体またはヒトの個体に対する核酸組合せ物の使用が提供される。また、核酸組合せ物が導入されている細胞が提供される。核酸組合せ物が導入されている細胞は、上述の核酸組合せ物を内部に保持している。核酸組合せ物が導入されている細胞は、その使用手順が記載された使用説明書（ただし、紙媒体はもとより、電子媒体に格納されたものも含み記録媒体は特に限定されない）とともにパッケージ化されていてもよい。当該使用説明書には、例えば、（生成工程）欄で説明したような細胞の使用説明が記載される。細胞はその用途に応じて、医薬、試薬キットであり得る。
　〔４．まとめ〕
　以上のように、本発明は、以下のものを含んでいる。
１）１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
２）上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、１）に記載の方法。３）上記機能性核酸分子は第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖からなり、かつ異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなる上記ハイブリダイズ領域を有し、上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、２）に記載の方法。
４）上記機能性核酸分子は、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とからなり、上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として細胞内に導入されるものであり、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、３）に記載の方法。
５）上記機能性核酸分子は、細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する、１）～４）の何れかに記載の方法。
６）上記化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、１）～５）の何れかに記載の方法。
７）上記求核基は、ホスホロチオエート基である、６）に記載の方法。
８）上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、６）または７）に記載の方法。
９）上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、６）～８）の何れかに記載の方法。
１０）上記求核基がホスホロチオエート基である場合、上記保護基が下記（ａ）～（ｋ）の何れかである、６）、８）または９）に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （なお、上記式中で、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、(ｊ)、および（ｋ）中のベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。）
１１）上記１）～１０）の何れかに記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物。
１２）上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、１１）に記載の核酸組合せ物。
１３）上記機能性核酸分子を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖を備えてなり、上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として含まれており、上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、上記断片が設計されている、１２）に記載の核酸組合せ物。
１４）上記機能性核酸分子を構成する、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とを備えてなり、上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として含まれており、上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として含まれており、上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、１３）に記載の核酸組合せ物。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　〔１．ＲＮＡの調製〕
　（ＲＮＡの設計および合成）
　ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ１（図２の（ａ）；配列番号１および２）をもとに、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ３’－ＰＳ（ホスホロチオエート）　ＲＮＡおよび５’－アミノ　ＲＮＡに分割してＲＮＡの合成を行った（図２の（ｂ）；配列番号３および４）。
　３’－ＰＳ　ＲＮＡおよび５’－アミノ　ＲＮＡは、全てホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（GeneWorld H8-SE）を用いて合成した。アミダイト試薬としては、ＲＮＡには２’－Ｏ－ＴＯＭ保護体（Glen Research）を用い、３’末端のリン酸化には３’－Phosphate ＣＰＧ（Glen Research）およびSulfurizing Reagent（Glen Research）を用いた。また、５’－末端のアミノｄＴの導入には、５’－Amino dT Phosphoroamidite（Glen Research）を用いた。ＲＮＡの脱保護は定法に従い、３’－ＰＳ　ＲＮＡおよび５’－アミノ　ＲＮＡは粗精製のまま次の反応に用いた。
　（合成したＲＮＡの化学修飾）
　上記で合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖における３’－ＰＳ　ＲＮＡをジフェニルジスルフィドと反応させることによってＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡを合成した（図２の（ｃ））。なお、３’末端のジスルフィド結合は細胞内に導入後、ＧＳＨなどの生体内チオール源によって脱離が進行する。３’－ＰＳ　ＲＮＡのジスルフィド化は、表１の組成で調製した混合液を室温で６時間インキュベートすることによって行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　また、センス鎖およびアンチセンス鎖における５’－アミノ　ＲＮＡをヨード酢酸Ｎ－スクシンイミジルと反応させることによってヨードアセチルＲＮＡを合成した（図２の（ｄ））。５’－アミノＲＮＡのヨードアセチル化は、表２の組成で調製した混合液を室温で２時間インキュベートすることによって行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　（比較のために用いるＲＮＡの調製）
　非修飾ｓｉＲＮＡ（２５ｍｅｒ：図２の（ａ）に示す配列）を３’－ＰＳ　ＲＮＡおよび５’－アミノ　ＲＮＡの合成と同様に、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（GeneWorld H8-SE）を用いて合成し、変性ポリアクリルアミドゲルによって完全鎖長の生成物を精製した。
　また、センス鎖およびアンチセンス鎖における５’－アミノ　ＲＮＡを酢酸ナトリウムと反応させることによって、３’－ＰＳ　ＲＮＡとの反応性を有さないアセチルＲＮＡを合成した（図２の（ｅ））。５’－アミノＲＮＡのアセチル化は、表３の組成で調製した混合液を室温で２時間インキュベートすることによって行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　さらに、３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとがライゲーションした場合に生成するｌｉｇａｔｅｄ　ｓｉＲＮＡについても、３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとをｉｎ　ｖｉｔｒｏ（無細胞系）においてライゲーションすることによって合成した（図２の（ｆ）；配列番号５および６）。
　上記で合成したＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡ、ヨードアセチルＲＮＡ、アセチルＲＮＡ、およびｌｉｇａｔｅｄ　ｓｉＲＮＡを、ＨＰＬＣ（Ｂ．ｃｏｎｃ．０～４０％、Ａ液：５０ｍＭ　ＴＥＡＡ、５％　アセトニトリル　ｉｎ　Ｈ２Ｏ、Ｂ液：１００％　アセトニトリル）によって解析し精製した。その後、Ｓｅｐ－Ｐａｋカートリッジを用いて脱塩（５０％アセトニトリル水　６ｍＬによって溶出）し、遠心エバポレーターを用いて濃縮した。得られたＲＮＡを超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、溶液濃度を定量した。
　〔２．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（無細胞系）におけるライゲーションの確認〕
　（方法）
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーションが行われることを確認するために、表４の組成で反応を行った。表４中のレーン５はＧＳＨを添加していないコントロールである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 　なお、ＨＢＳＳの組成は、１．８ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．４９ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．４１ｍＭ　ＭｇＳＯ４，ｐＨ７．４である。
　上記混合液を３７℃で３０分間インキュベートした後、ローディングバッファー（１００％　ホルムアミド、０．５％　ＸＣ）を加え、９０℃で５分間インキュベーションした。反応液を２０％変性アクリルアミドゲルで泳動し、CYBR Green IIで３０分間染色することによって分析した。マーカーとして、レーン１には２５ｍｅｒのＲＮＡ鎖、レーン２には１９ｍｅｒのＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡ（センス鎖）、レーン３には１８ｍｅｒのＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡ（アンチセンス鎖）を同様にロードした。
　（結果）
　泳動の結果を図３に示す。３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーションが進行し、２５ｍｅｒのＲＮＡ鎖が生成したことが確認できた（レーン４）。
　また、センス鎖のみのＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡ４μＬおよびヨードアセチルＲＮＡ４μＬにＧＳＨ２μＬを加えて同様にライゲーション反応させた場合でも、２５ｍｅｒの一本鎖のＲＮＡ鎖が生成した。
　〔３．哺乳動物培養細胞系を用いたＲＮＡ干渉効果の測定１〕
　（方法）
　ＨｅＬａ－Ｌｕｃ細胞（Caliper（PerkinElmer company）から購入）を１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、９６穴プレートに、１００μＬずつ、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、約６０％コンフルエントの状態で各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’－ＰＳ　ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）をトランスフェクション試薬Gene Silencer（Genlantis製）を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。ＲＮＡの濃度は、２５、５０または１００ｎＭとした。
　具体的には、細胞に５０μＬのＨＢＳＳ（＋）を加えた状態で、下記のトランスフェクション用混合溶液を添加することで行った。トランスフェクション用混合溶液の組成は表５の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 　トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートし、メディウムを１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へと交換した。３７℃でさらに１８時間インキュベート後、Luciferase Assay System（プロメガ製）を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量５０μＬ、delay time ２秒、read time１０秒、機器：Muthras LB 940（BERTHOLD製））。
　比較として、スクランブル（２５ｎＭ）、非修飾ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）、ｌｉｇａｔｅｄ　ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）、Ｃａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡ＋アセチルＲＮＡ（２５ｎＭ、５０ｎＭまたは１００ｎＭ）、Ｃａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡのみ（１００ｎＭ）、ヨードアセチルＲＮＡのみ（１００ｎＭ）、およびアセチルＲＮＡのみ（１００ｎＭ）を上記と同様にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現量を定量した。
　（結果）
　ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図４に示す。ｎｏｎ－ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、十分な阻害活性が観察された。一方、ｎｏｎ－ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとアセチルＲＮＡ（Ａｃ）とを導入した場合には阻害活性が観察されなかった。この結果は、細胞内で３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡとのライゲーション反応によって、ｌｉｇａｔｅｄ　ｓｉＲＮＡが生成し、遺伝子発現を抑制したことを示唆している。
　このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入し、細胞内で機能性ＲＮＡを構築することが可能であることが明らかとなった。
　〔４．哺乳動物培養細胞系を用いたＲＮＡ干渉効果の測定２（浸透圧ショックによるトランスフェクション）〕
　（方法）
　ＨｅＬａ－Ｌｕｃ細胞を１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、約６０％コンフルエントの状態で回収し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、hypertonic bufferと各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’－ＰＳ　ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）との混合液（１０μＬ）で細胞を懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。そこへ滅菌水（５２．９μＬ）を加え、さらに３７℃で１０分間インキュベーションした。その後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、回収した細胞を１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（４００μＬ）で懸濁し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。hypertonic bufferの組成は、２．１Ｍ　スクロース、７．５％ＰＥＧ（２０００）、１５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）ｉｎ　ＨＢＳＳ　ｂｕｆｆｅｒである。hypertonic bufferと各種ＲＮＡとの混合液（１０μＬ）の組成は表６の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートし、Luciferase Assay System（プロメガ製）を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量３０μＬ、delay time ２秒、read time １０秒、機器：Muthras LB 940（BERTHOLD製））。また、BCA protein assay kit（Thermo Scientific製）を用い、添付のプロトコールに従いタンパク量を定量し、ルシフェラーゼ発現量を補正した。
　比較として、スクランブル、および非修飾ｓｉＲＮＡを上記と同様にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発現量を定量および補正した。
　（結果）
　ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果を図５に示す。ｎｏｎ－ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、非修飾ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した場合と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が低く、より阻害されていることがわかった。この結果は、ｓｉＲＮＡをＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとＩＡとに断片化して導入することによって、細胞膜透過性が向上したことを示唆している。
　このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、細胞膜透過性を向上させ、より多量の機能性ＲＮＡを細胞内に効率的に導入することが可能であることが明らかとなった。
　〔５．哺乳動物培養細胞系を用いた免疫応答測定〕
　（方法）
　Ｔ９８Ｇ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターから入手）を１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０（Wako製）培地中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、２４穴プレートに、３００μＬずつ、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、約７０％コンフルエントの状態で各種ＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の３’－ＰＳ　ＲＮＡおよびヨードアセチルＲＮＡ）をトランスフェクション試薬lipofectamine 2000（invitrogen製）を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従いコトランスフェクションした。比較として、ＲＮＡなし、ポリＩ：Ｃ、非修飾ｓｉＲＮＡを同様にトランスフェクションした。ＲＮＡの濃度は１００ｎＭ（final volume ３００μＬ）とした。トランスフェクション用混合溶液の組成は表７の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 　トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートし、２０％ Serumを含むＲＰＭＩ－１６４０培地 ３００μＬを各ウェルに加えた。３７℃でさらに１８時間インキュベート後、ISOGEN（ニッポン・ジーン製）を用い、添付のプロトコールに従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡおよびOne Step PrimeScript（登録商標） RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Takara製）を用いて、ＩＦＮ－βおよびβ－Ａｃｔｉｎの発現量を測定した。得られた結果からΔΔCt法を用いて、ＩＦＮ－β発現量をβ－Ａｃｔｉｎ発現量で補正し、相対的なＩＦＮ－β発現量を算出した。リアルタイムＰＣＲに使用した反応液の組成は表８の通りである。また、リアルタイムＰＣＲの反応条件は表９の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　（結果）
　結果を図６に示す。ＲＮＡをトランスフェクションしなかったNegative Control（ＮＣ）と比較して、ｓｉＲＮＡまたはポリＩ：Ｃを細胞内に導入した場合にはＩＦＮ－βの発現量の増加が確認された。一方、ｎｏｎ－ｌｉｇａｔｅｄなＣａｇｅｄ　３’－ＰＳ　ＲＮＡとヨードアセチルＲＮＡ（ＩＡ）とを細胞内に導入した場合には、ＩＦＮ－βの発現量の変化は観察されなかった。この結果は、ｓｉＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、断片化されていないｓｉＲＮＡによって誘導される免疫応答を回避可能であることを示している。
　このように、機能性ＲＮＡを断片として細胞内に導入することで、断片化されていない機能性ＲＮＡによって誘導される免疫応答を回避可能であることが明らかになった。
　本発明は、機能性核酸分子を用いた医薬および試薬等の分野に利用することができる。

Claims (14)

  1. 　１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、
    　化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片を細胞内に導入する導入工程と、
    　上記細胞内で上記官能基同士を反応させて断片同士を結合し、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子を生成する生成工程と、を含む方法。
  2. 　上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
    　上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　上記機能性核酸分子は第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖からなり、かつ異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなる上記ハイブリダイズ領域を有し、
    　上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として細胞内に導入されるものであり、
    　上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じる、請求項２に記載の方法。
  4. 　上記機能性核酸分子は、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とからなり、
    　上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として細胞内に導入されるものであり、
    　上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として細胞内に導入されるものであり、
    　上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、請求項３に記載の方法。
  5. 　上記機能性核酸分子は、細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　上記化学反応により相互結合する官能基対は、求電子基と、保護基によって保護されている求核基との組合せである、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
  7. 　上記求核基は、ホスホロチオエート基である、請求項６に記載の方法。
  8. 　上記求電子基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基またはヨード基である、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　上記保護基は、上記細胞中の内因性物質、または光照射によって脱離する、請求項６～８の何れか１項に記載の方法。
  10. 　上記求核基がホスホロチオエート基である場合、上記保護基が下記（ａ）～（ｋ）の何れかである、請求項６、８または９に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （なお、上記式中で、Ｒ、Ｒ’およびＲ”は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ１およびＲ２は互いに独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、ｎは１～３の整数を表す。なお、ｎが２または３のとき、ｎ個あるＲ１同士は互いに異なっていてもよく、ｎ個あるＲ２同士は互いに異なっていてもよい。また、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、(ｊ)、および（ｋ）中のベンゼン環上の複数の水素原子は互いに独立して置換基によって置換されていてもよい。）
  11. 　請求項１～１０の何れか１項に記載の方法に用いる核酸組合せ物であって、
    　機能性核酸分子を構成する上記核酸鎖を備えてなり、当該核酸鎖のうちの少なくとも１本が、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２以上の断片として含まれている、機能性核酸分子の構築用核酸組合せ物。
  12. 　上記機能性核酸分子は、上記核酸鎖内でハイブリダイズするか、または異なる核酸鎖間でハイブリダイズしてなるハイブリダイズ領域を有し、
    　上記断片同士の上記結合が、上記ハイブリダイズ領域で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１１に記載の核酸組合せ物。
  13. 　上記機能性核酸分子を構成する、ハイブリダイズが可能な第一の核酸鎖および第二の核酸鎖の２本の上記核酸鎖を備えてなり、
    　上記２本の核酸鎖は何れも、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した２つの断片として含まれており、
    　上記第一の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合と、上記第二の核酸鎖を構成する断片同士の上記結合とが、上記ハイブリダイズ領域の異なる箇所で生じるように、上記断片が設計されている、請求項１２に記載の核酸組合せ物。
  14. 　上記機能性核酸分子を構成する、上記第一の核酸鎖としての第一のＲＮＡ鎖と、上記第二の核酸鎖としての第二のＲＮＡ鎖とを備えてなり、
    　上記第一のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第一の断片と第二の断片として含まれており、
    　上記第二のＲＮＡ鎖は、化学反応により相互結合する官能基対を対応する末端に付した第三の断片と第四の断片として含まれており、
    　上記第一の断片または第二の断片は、上記第三の断片および第四の断片の双方とハイブリダイズ可能であり、上記第三の断片または第四の断片は、上記第一の断片および第二の断片の双方とハイブリダイズ可能である、請求項１３に記載の核酸組合せ物。
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