CN104169422B - 功能性核酸分子的构建方法和该方法中使用的核酸组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段，在细胞内使官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子。

Description

功能性核酸分子的构建方法和该方法中使用的核酸组合物
技术领域
本发明涉及在细胞内构建功能性核酸分子的新方法以及该方法中使用的核酸组合物。
背景技术
人们所知道的是，在核酸分子中，存在着尽管不编码蛋白质，但是在各种生命现象中起着重要作用的物质。作为这种核酸分子，可以列举，例如功能性的非编码RNA分子(非专利文献1)、和引起RNA干扰作用的小分子RNA(非专利文献2)等。
例如，RNA干扰作用，作为在细胞内，特异性地抑制目的RNA的作用的重要技术(非专利文献3)，原先作为试剂，现在作为药物的应用(非专利文献4)也被积极地进行研究。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Ryan J Taft,Ken C Pang,Timothy R Mercer,Marcel Dinger1and John S Mattick,J Pathol.,2010,220,126-139.
非专利文献2:Fire A,XuS,Montgomery M,Kostas S,Driver S,Mello C；Nature,1998,391,806-11.
非专利文献3:Sayda M.Elbashir,Javier Martinez,Agnieszka Patkaniowska,Winfried Lendeckel and Thomas Tuschl；EMBO J.2001,20,6877-6888.
非专利文献4:John C.Burnett,John J.Rossi and Katrin Tiemann；Biotechnol.J.2011,6,1130-1146.
发明内容
发明要解决的问题
尽管引起RNA干扰作用的RNA是小分子，但为了最大限度诱导其效果，存在着使其细胞膜透过性进一步提高的需求，以及抑制由于活化免疫系统导致的毒性表达的进一步的需求。
然而，面对这样的需求，目前的现状只不过是，为了使RNA分子成为更小的分子，而努力引入发挥其功能所需要的最小限度的序列。
本发明正是鉴于上述问题而产生的，本发明的目的在于提供以容易进入细胞的形态将功能性核酸分子导入到细胞内，构建细胞内的功能性核酸分子的方法等。
用于解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明提供一种由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，该方法包括：在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的工序，和在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
本发明还提供一种功能性核酸分子的构建用核酸组合物，该组合物是上述方法中使用的核酸组合物，其具有构成功能性核酸分子的上述核酸链，且该核酸链中的至少一条含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段。
发明的效果
功能性核酸分子，作为容易进入细胞的多个片段导入到细胞内，能够构建出在细胞内的功能性核酸分子。
附图说明
[图1]是表示本发明所涉及方法的一个实施方式的概要图。
[图2]是表示实施例中使用的各种RNA的序列的图。
[图3]是表示实施例中体外连结(ligation)结果的图。
[图4]是表示实施例中荧光素酶基因表达结果的图。
[图5]是表示实施例中荧光素酶基因表达结果的图。
[图6]是表示实施例中免疫应答测定结果的图。
具体实施方式
〔1.功能性核酸分子的构建方法〕
(构建方法的概要)
本发明所涉及的功能性核酸分子的构建方法是由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括以下的工序1)和2)。
1)在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的工序、
2)在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
也就是说，本发明所涉及的功能性核酸分子的构建方法是1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括以下的工序1)和2)：
1)将上述核酸链中的至少1条制成在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段、并且将上述1条或2条核酸链(即，至少1条制成两个以上的片段)导入到细胞内的导入工序、
2)在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
上述的构建方法，将构成功能性核酸分子的核酸链的至少一部分制成多个片段，再导入到细胞中，构建出细胞内的功能性核酸分子。因此，功能性核酸分子向细胞内的吸收得以提高。而且，由于核酸链的至少一部分作为更小的片段来使用，因此能够抑制由于功能性核酸分子而引起的免疫毒性。
(功能性核酸分子)
本发明中所谓功能性核酸分子，是指多个核酸以链状连结(即，寡或多核苷酸)、不编码蛋白质，且对发育分化等生命现象发挥指定功能的核酸分子。因此，在生命现象中不发挥特别功能，只与目标特异性杂交的引物和探针被排除在本发明的功能性核酸分子的范畴之外。
功能性核酸分子是DNA分子、RNA分子、或DNA-RNA杂交分子。功能性核酸分子可以由1条核酸链构成，也可以由2条核酸链构成。而且，功能性核酸分子的一部分可以含有非天然的核酸。而且，在本说明书中，用语“核酸链”，是指构成功能性核酸分子的状态下的全长核酸链，与相当于比该“核酸链”更短的链的用语“片段”(后述)相区别。
作为上述DNA分子，可以列举，例如DNA适体(aptamer)；CpG motif；DNAzyme等。而且，本说明书中，基础为DNA链，一部分导入了RNA和/或非天然核酸等的也被分类为DNA分子。
作为上述RNA分子，可以列举，例如RNA适体(aptamer)；shRNA、siRNA和microRNA等显示出RNA干扰作用的RNA分子(RNAi用核酸分子)；反义RNA分子；核酶RNA等。而且，本说明书中，基础为RNA链，一部分导入了DNA和/或非天然核酸等的物质也被分类为RNA分子。
作为DNA-RNA杂交分子，可以列举，例如DNA-RNA杂交适体(hybrid aptamer)等。
功能性核酸分子优选：为发挥其功能而形成在上述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间发生杂交而成的杂交区域。其理由也参见后述栏(核酸链片段的优选设计例)中的记载。
功能性核酸分子更优选：具有在核酸链内或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域的RNAi用核酸分子，进一步优选由两条核酸链构成的RNAi用核酸分子。由两条核酸链构成的RNAi用核酸分子的核酸链长度(mer)为例如15～40mer，优选为15～35mer，更优选为20～35mer。
(核酸链的片段)
构成功能性核酸分子的核酸链的所谓“片段”，相当于将上述“核酸链”分割成2个以上的核酸分子。而且，一旦以合适的顺序将来自于一条核酸链的所有“片段”连结，就构建出具有与该核酸链相同核酸序列的核酸分子。但是，用语“片段”并非是指一旦构建核酸链后就将其切断，生成该片段。
在通过结合片段而构建构成功能性核酸分子的核酸链时，使不同的片段之间的3’末端与5’末端相互结合。此时，将要使之相互结合的3’末端和5’末端的组合称之为“对应末端”。也就是说，所谓“对应末端”是按构成作为片段的设计基础的核酸链那样将片段排列时邻接的末端。
需要说明的是，来自于一条核酸链的“片段”的长度虽没有特别限制，但有时优选不同片段间的长度(mer)差异不要显著过大。按照这个观点，相对于来自一条核酸链的最长的“片段”，剩余的所有片段优选为〔25％×最长片段的长度(mer)〕以上的长度，更优选为〔30％×最长片段的长度(mer)〕以上的长度。
通过化学反应相互结合的官能团对(官能团的组合)被结合到上述“对应末端”中通过这些官能团之间相互反应而将片段之间结合，从而构成核酸链。
上述官能团对虽没有特别的限定，但优选，例如亲电子基团和亲核基团的组合。也就是说，使上述“对应末端”之一与亲电子基团结合，使亲核基团结合到另一个“对应末端”，不同的片段之间通过化学反应将会相互结合。而且，还可以使亲电子基团和亲核基团结合在3’末端和5’末端中的任何之一上。即，可以将亲电子基团结合在3’末端上，而将亲核基团结合在5’末端上，或者也可以将亲电子基团结合在5’末端上，而将亲核基团结合在3’末端上。
作为上述的亲电子基团，虽没有特别的限定，但可以列举碘乙酰基(参考文献：Bioconjugate,Chem.2008,19,327)和溴乙酰基(参考文献：Nucleic Acids Res.,22,5076)等卤代烷基；碘基(参考文献：Tetrahedron Lett.,1995,38,55959)和溴基等卤素基；甲酰基等。在一个实施方式中，存在亲电子基团优选是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基的情况。
作为上述的亲核基团，虽没有特别的限定，但可以列举硫代磷酸酯基；巯基；羟基；氨基；甲硫基等烷基硫基；甲氧基等烷氧基等。在一个实施方式中，存在亲核基团优选为硫代磷酸酯基的情况。
此外，构成官能团对的上述亲电子基团和上述亲核基团的组合虽没有特别限定，但存在优选为卤代烷基或卤素基与硫代磷酸酯基的组合，或卤代烷基或卤素基与巯基的组合等情况。而且，在一个实施方式中，存在构成官能团对的上述亲电子基团和上述亲核基团的组合更优选为碘乙酰基、溴乙酰基、或碘基与硫代磷酸酯基的组合的情况。
以下显示了添加在对应末端上的上述亲电子基团与上述亲核基团的优选的组合中的一个例子和这些基团通过化学反应而相互连结的方式。而且，化学式中，糖仅示出了骨架部分，既可以是核糖也可以是脱氧核糖。此外，化学式中的B表示构成核酸的各种碱基。也就是说，在以下的例子中，虽然示出了功能性核酸分子为RNA分子的情况，但是即使是DNA分子也可以以同样方式构成。
[化学式1]
(A)3’末端-硫代磷酸酯基+5’末端-碘乙酰基
(B)3’末端-硫代磷酸酯基+5’末端-溴乙酰基
(C)3’末端-硫代磷酸酯基+5’末端-碘基
(D)3’末端-碘乙酰基+5’末端-硫代磷酸酯基
(E)3’末端-碘乙酰基+5’末端-巯基
尤其是，在系统内同时存在多个要相互结合的片段时，为了进一步减少细胞外相互结合的片段的比例(基本上没有)，上述亲核基团优选被可以在所希望的时机脱保护的保护基来保护。也就是说，在一个实施方式中，官能团对优选是亲电子基团与被保护基保护的亲核基团的组合。
可以根据亲核基团的种类适当采用保护亲核基团的保护基种类。作为优选的保护基，可以列举，例如由于细胞中的内源性物质的作用而从亲核基团脱离的保护基。所谓“细胞中的内源性物质”是指与后述的“由细胞外导入的物质”相对的物质，是该细胞原先所具有的物质。作为细胞中的内源性物质，可以列举，例如酶和肽等。通过导入基因而在细胞内表达的酶和肽等，由于它们本身不是“从细胞外导入”的物质，因此是细胞中的内源性物质的范畴。
在通过细胞中的内源性物质的作用而从亲核基团脱离的保护基中，作为可以用于保护硫代磷酸酯基的保护基，可以列举如下所示结构的苯硫基(a)、除其以外的芳硫基这样的可以对硫代磷酸酯基进行二硫化物保护的基团；硝基苄基(b)、酯(c、d)、硫代羰基(e)、和酰胺(f)；以及它们的衍生物等。而且，上述硝基苄基可以是o-硝基苄基、m-硝基苄基和p-硝基苄基中的任意一个，但是从反应性的观点考虑，优选m-硝基苄基和p-硝基苄基。
[化学式2]
需要说明的是，只要是不会损害本发明目的的范围，则(c)、(d)、(f)中的R、R’和R”没有特别限定，例如，表示取代或非取代的烷基或芳基。烷基或芳基例如碳数为1～15，优选碳数为1～10。作为烷基，例如，可以列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、己基、2-乙基己基、庚基、辛基、壬基和癸基等链状烷基；环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基和金刚烷基等环状烷基。此外，作为芳基，例如，可以列举苯基、甲苯基和萘基等。
作为烷基或芳基具有的取代基，例如，可以列举卤原子(氟、氯、溴和碘)、羟基、碳数为1～10(优选碳数为1～4)的烷基(链状和环状烷基)、碳数为1～4的烷氧基、碳数为1～5的酰氧基、羧基、碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为6～10的芳基、氰基、硝基等。需要说明的是，当多个链状的上述烷基作为取代基存在于芳基上时，这些链状的烷基可以彼此结合构成环，该环中碳原子的1～数个(优选为1～3个)可以被取代为氧原子。作为一例，可以列举位于芳基上相邻碳原子上的烷基取代基彼此形成环，并且形成2个碳原子被氧原子取代的1,3-二氧戊环式的环结构。
作为具有环状烷基作为取代基的烷基，例如，可以列举环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环己基甲基、环己基乙基和环己基丙基等。此外，作为具有芳基作为取代基的烷基，例如，可以列举苄基、苯乙基、苯丙基、萘甲基、萘乙基和萘丙基等。
此外，芳基可以通过将骨架的一部分取代为氮原子、氧原子或硫原子等而形成杂环。此外，(a)、(b)和(e)中苯环上的多个氢原子也可以互相独立地被取代基取代。因此，作为(a)、(b)和(e)的衍生物，可以例举，例如(a)、(b)或(e)中苯环上的氢原子(例如1～3个)被上述例举的取代基取代而形成的物质。
苯硫基被存在于细胞内的GSH(谷胱甘肽)等生物体内巯基源还原而脱离。硝基苄基被存在于细胞内的硝基还原酶还原而脱离(参考文献：Bioorg.Med.Chem.,11,2453)。酯基和硫代羰基被存在于细胞内的酯酶脱离。酰胺被存在于细胞内的肽酶脱离。
如果用上述(a)～(f)这样的保护基保护硫代磷酸酯基，该硫代磷酸酯基在细胞外基本上不会被脱保护。正因为如此，核酸链的片段只是在细胞外混合，不会发生结合反应。因此，短片段可按原样通过1次操作导入到细胞内的可能性提高。进而，由于通过细胞内存在的酶或肽自然地发生脱保护反应，因此可以通过一次操作进行导入工序和生成工序这两个工序。
作为保护硫代磷酸酯基的保护基，除上述保护基外，还可以例举由于光照射而从亲核基团上脱离的保护基。作为这种保护基，例如，可以列举下述(g)～(j)和它们的衍生物等(参考文献：Molecular Pharmaceutics,2009,6,669)。
[化学式3]
(g)～(j)中的R1、R2和n，只要是不损害本发明目的的范围，就没有特别限定，例如，R1和R2彼此独立地表示氢原子或碳数为1～4的烷基，n表示1～3的整数，优选在(g)中表示1或2，优选在(h)和(j)中表示1。需要说明的是，当n为2或3时，具有的n个R1可以彼此不同，具有的n个R2也可以彼此不同。此外，(g)～(j)中的苯环上的多个氢原子彼此独立地任选被取代基取代。因此，作为(g)～(j)的衍生物，例如，可以列举(g)～(j)中苯环上的氢原子(例如1～3个)被上述例举的取代基取代的衍生物。
如果用上述(g)～(j)这种保护基来保护硫代磷酸酯基，在不照射该保护基脱离所必须的波长的光的条件下，该硫代磷酸酯基在细胞外基本不被脱保护。正因为如此，只是在细胞外混合核酸链片段，不会发生结合反应。因此，短片段就可按原样通过1次操作导入到细胞内的可能性提高。而且，通过控制光照射的时机，可以使脱保护反应在所希望的时间点发生。
作为上述(g)或其衍生物的具体例子，可以例举例如以下的基团。
[化学式4]
作为上述(h)的具体例子，可以列举例如以下的基团。
[化学式5]
作为上述(i)的具体例子，可以列举例如以下的基团。
[化学式6]
作为上述(j)的具体例子，可以列举例如以下的基团。
[化学式7]
其中，上述保护基中的R3和R4彼此独立地表示在上述所示芳基上任选取代的取代基。
作为保护硫代磷酸酯基的保护基，除上述外，还可以例举通过从细胞外导入的物质而脱离的保护基。作为这种保护基，可以列举，例如叠氮基苄基(k)和其衍生物等。而且，叠氮基苄基可以是o-叠氮基苄基、m-叠氮基苄基和p-叠氮基苄基中的任意一种，但从反应性的观点来看，优选p-叠氮基苄基。而且，(k)中苯环上的多个氢原子彼此独立地可以被取代基取代。因此，作为(k)的衍生物，例如，可以列举(k)中苯环上的氢原子(例如1～3个)被上述例举的取代基取代的衍生物。
[化学式8]
叠氮基苄基通过在细胞内导入磷化氢而脱离(参考文献：Bioconjugate,Chem.2008,19,714)。从膜透过性的观点考虑，磷化氢优选水溶性磷化氢。
如果用上述(k)这样的保护基保护硫代磷酸酯基，该硫代磷酸酯基在在细胞外基本上不会被脱保护。正因为如此，核酸链的片段只是在细胞外混合，不会发生结合反应。因此，短片段可按原样通过1次操作导入到细胞内的可能性提高。此外，通过控制脱保护的作用物质(磷化氢等)被吸收至细胞内的时机，就可以在所希望的时机使脱保护反应发生。
而且，作为只在指定的条件下相互反应而结合的官能团对，除了上述利用脱保护反应的官能团对之外，可以列举磷酸二酯基与碘基的组合(参考文献：J.Mol.Evol.,2003,56,607)。在使用该组合时，通过在细胞内导入溴化氰(BrCN)可以发生结合反应。
[化学式9]
此外，作为上述官能团对，还可以例举氨基和醛基的组合(参考文献：J.Am.Chem.Soc.,2005,127,10144；J.Am.Chem.Soc.,1997,1119,12420)。在使用该组合时，可以通过在细胞内导入氰基硼氢化钠(NaCNBH3)或氰基硼氢化钾(KBH3CN)，发生结合反应。
[化学式10]
此外，作为上述官能团对，可以列举叠氮基和炔基的组合(参考文献：PNAS,2010,vol.107,15329-15334、ChemBioChem,2011,12,125-131)。在使用该组合时，可以通过在细胞内导入铜发生结合反应。
[化学式11]
而且，上述化学式中，糖只示出骨架部分，既可以是核糖也可以是脱氧核糖。而且，化学式中的B表示构成核酸的各种碱基。也就是说，以上例子中，功能性核酸分子虽然表示的是RNA分子的情况，但是对于DNA分子，也可以同样方式构成。
而且，功能性核酸分子由2条核酸链构成时，只要至少1条为2个以上片段即可，但优选2条都是2个以上的片段。
(核酸链的片段的制作方法)
在末端添加了上述官能团的核酸链的“片段”的制作方法没有特别限定。例如，该片段的寡核苷酸部分可以通过体外转录合成法、使用质粒或病毒载体的方法、或PCRcassette法等方法合成。从纯度高，可以大量合成，在体内使用安全性高以及可以进行化学修饰等观点考虑，优选化学合成方法。作为化学合成方法，可以例举例如，亚磷酰胺法和H-磷酸盐法等，可以使用市售的核酸合成机。
而且，在寡核苷酸的3’末端和5’末端(对应末端)上添加指定的官能团和保护基方法可以根据官能团的种类，按照公知方法进行。而且，从官能团等导入更容易的观点考虑，构成“对应末端”的核酸，无论“核酸链”的种类，优选脱氧核糖体的核酸，更优选选自于dA、dG、dC、dT。
按照上述制作的片段，从体内使用安全性等观点考虑，优选根据用途在导入工序前进行纯化。此外，为了提高片段的细胞膜透过性，可以使细胞膜透过性分子结合到该片段上。作为这种分子，可以例举，例如TAT肽、寡聚精氨酸、PENETRATIN、和TP-10等膜透过性肽；胆固醇；维生素A等。
(核酸链片段的优选设计例)
上述功能性核酸分子，为了发挥其功能而形成在核酸链内杂交或不同的核酸链之间发生杂交而成的杂交区域时，优选该核酸链的片段被设计成这些片段之间的结合在杂交区域中发生。下面，基于图1，更具体地进行说明。
图1表示的是作为功能性核酸分子的siRNA的一个优选的设计例(也参照实施例)。在该例中，siRNA以第一RNA链与第二RNA链杂交的方式被构成。
第一RNA链，作为3’末端添加了硫代磷酸酯基(官能团对之一)的第一片段(图中A)和在5’末端添加了碘乙酰基(官能团对的另一个)的第二片段(图中B)被提供。此外，第二RNA链作为3’末端添加了硫代磷酸酯基(官能团对之一)的第三片段(图中C)和5’末端添加了碘乙酰基(官能团对中的另一个)的第四片段(图中D)被提供。而且，硫代磷酸酯基均被苯硫基(保护基)保护。
第一RNA链和第二RNA链被设计成在相互错开的位置上分别形成2个片段。也就是说，构成第一RNA链的第一片段和第二片段均以相邻的方式与第三片段杂交。同样，构成第二RNA链的第三片段和第四片段均以相邻的方式与第一片段杂交。由此，第一RNA链和第二RNA链这二者中，添加了官能团的对应末端之间彼此靠近，在生成工序中能够有效引起官能团之间的结合反应。
而且，图1中例示了，构成第一RNA链的片段之间的结合和构成第二RNA链的片段之间的结合发生在杂交区域的不同位置(互相错开的位置)，例如，在图1中，从能够使对应末端之间彼此有效地靠近这一观点考虑，仅第一RNA链或第二RNA链之一被片段化是一个优选的片段化的例子。
此外，图1中尽管例示了作为功能性核酸分子的siRNA，但该图中所示的片段的设计可以广泛地适用于形成在核酸链内杂交或在不同的核酸链间杂交而成的杂交区域的功能性核酸分子。
(导入工序)
导入工序是如下工序：在构成功能性核酸分子的上述“核酸链”中的至少1条形成在“对应末端”添加了通过化学反应相互结合的“官能团对”的2个以上的“片段”的形态之后，再将构成功能性核酸分子的所有核酸链导入细胞的工序。并且，“核酸链”、“官能团对”、“对应末端”和“片段”的定义如上所述。
更具体的是，通过导入工序，将例如以下的1)～3)中的任意一种“核酸组合物”导入到细胞内。而且，所谓“核酸组合物”是指2个以上的核酸分子的组合，它们可以制成混合的组合物的形态，或者也可以制成通过被保管在不同的保存容器中等方式相互隔离(不混合)的形态。
1)功能性核酸分子由1条核酸链构成时，用于构建该核酸链的2个以上的上述“片段”。所有核酸分子优选含有大致相等的量(个数)。
2)功能性核酸分子由2条核酸链构成时，用于构建其中1条核酸链的2个以上的上述“片段”和另一条核酸链。所有核酸分子优选含有大致相等的量(个数)。
3)功能性核酸分子由2条核酸链构成时，用于构建其中1条核酸链的2个以上的上述“片段”和用于构建另一条核酸链的2个以上的上述“片段”。所有核酸分子优选含有大致相等的量(个数)。
成为核酸组合物导入对象的细胞没有特别限制。成为对象的细胞可以是原核细胞和真核细胞中任意一种。作为真核细胞，可以列举来自于菌类、植物和动物等中的细胞。作为动物细胞，可以列举昆虫细胞等非哺乳类细胞和哺乳类细胞。作为哺乳类细胞，可以列举小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类、兔、狗、和猫等非人动物细胞或人细胞。而且，细胞可以是培养细胞，也可以是活体细胞(存在于生物体中未被分离的细胞)。细胞的一个优选例子是，人的培养细胞、人的活体细胞、非人疾病模式动物的培养细胞、非人病态模式动物的活体细胞。
核酸组合物的导入方法没有特别限定。作为在体外的导入方法，例如，可以列举电穿孔法、显微注射法、脂质转染法(lipofection)和磷酸钙法等。作为在体内导入的方法，可以列举，例如局部施用，静脉内施用和使用基因枪的方法等。在应用于人或非人动物的活体时，从安全性的观点考虑，优选不使用微生物等的方法。而且，优选的是，在体内导入前，通过进行透析或pH调节等，将含有核酸组合物的试样调制成适合生物体。此外，在体内应用时，可以根据需要，与药学上可接受的载体组合在一起制成药物组合物(例如，脂质体制剂等)。
此外，构成核酸组合物的核酸分子可以全部混合在一起，作为核酸组合物通过一次操作导入到细胞内，也可以将每个核酸分子单独导入到细胞内。而且，用于构建核酸链的2个以上的片段既可以通过一次操作导入到细胞内，也可以分别各自导入到细胞内。
(生成工序)
在生成工序中，在通过上述导入工序导入了核酸组合物的细胞内，使在“对应末端”添加了上述“官能团对”的2个以上的“片段”之间彼此结合。也就是说，通过官能团对之间进行化学反应，“对应末端”彼此之间被结合(化学连结＝非酶的连结)，作为“片段”被提供的核酸链构建成一条连续的核酸链。同时，根据需要，核酸链内或不同的核酸链之间发生杂交这样的相互作用，生成功能性核酸分子。
上述(核酸链的片段的优选设计例)栏中说明的例子中，如图1所示，在导入工序后，杂交导致的片段的适当的整列化、“官能团”的脱保护、和“官能团对”之间的化学反应同时进行，从而生成由2条核酸链构成的功能性核酸分子。
〔2.核酸组合物〕
(核酸组合物的概要)
本发明涉及的功能性核酸分子的构建方法中使用的核酸组合物(构建用核酸组合物)具备构成功能性核酸分子的所有上述“核酸链”，该“核酸链”中的至少1条含有在“对应末端”上添加有通过化学反应将会相互结合的“官能团对”的2个以上的“片段”。而且，“核酸组合物”的例示如上述(导入工序)栏中说明所示。
(核酸组合物的优选方式)
核酸组合物的优选方式中，上述“功能性核酸分子”具有在上述“核酸链”内杂交或在不同的“核酸链”间杂交形成的杂交区域，上述“片段”被设计成上述“片段”彼此之间的结合在该杂交区域发生。
在核酸组合物的更优选方式中，具有构成上述“功能性核酸分子”的，可以杂交的第一“核酸链”和第二“核酸链”，这两条“核酸链”均含有在“对应末端”上添加有通过化学反应将会相互结合的“官能团对”的2个“片段”。而且，各个片段被设计成，构成“第一核酸链”的“片段”之间的结合以及构成“第二核酸链”的“片段”之间的上述结合是在杂交区域的不同位置发生(也参照图1和实施例)。
在核酸组合物进一步优选的方式中，具有构成上述“功能性核酸分子”的且可以杂交的“第一RNA链”和“第二RNA链”，“第一RNA链”含有在“对应末端”添加有通过化学反应将会相互结合的“官能团对”的“第一片段”和“第二片段”。而且，“第二RNA链”含有在“对应末端”添加有通过化学反应将会相互结合的“官能团对”的“第三片段”和“第四片段”。此外，“第一片段”或“第二片段”可与“第三片段”和“第四片段”这二者杂交，“第三片段”或“第四片段”可与“第一片段”和“第二片段”这二者杂交(也参照(核酸链片段的优选设计例)栏，图1和实施例)。
(核酸组合物的应用)
本发明中涉及的核酸组合物可以与记载了其使用次序的使用说明书(其中，纸质媒体就不用说了，还包括存储于电子媒体中的记录媒体，没有特别限定)一起包装。该使用说明书中记载了例如如在上述(导入工序)栏、(生成工序)栏中说明的那样的核酸组合物的使用说明。核酸组合物根据其用途，可能是药物或试剂盒。
〔3.其它〕
(功能性核酸分子的构建方法的应用)
核酸组合物可以用于治疗小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类、兔、狗、和猫等非人动物个体或人的个体。也就是说，可对非人动物的个体或人的个体给予核酸组合物。给予方法如作为上述在体内的导入方法所例举的那样。
此外还提供了对小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类、兔、狗、和猫等非人动物个体或人的个体使用核酸组合物。而且还提供了导入了核酸组合物的细胞。导入了核酸组合物的细胞内部保持上述核酸组合物。导入了核酸组合物的细胞可以与记载了其使用次序的使用说明书(其中，纸制媒体就不用说了，还包括存储于电子媒体中的记录媒体没有特别限定)一起包装。该使用说明书中记载了例如在(生成工序)栏中说明的那样的细胞的使用说明。细胞根据其用途，可能是药物或试剂盒。
〔4.小结〕
如上所述，本发明包含以下内容。
1)由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的构建方法，其包括在细胞内导入在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的导入工序，以及在上述细胞内使上述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成由1条或2条核酸链构成的功能性核酸分子的生成工序。
2)根据1)中记载的方法，上述功能性核酸分子具有在上述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域，上述片段被设计成上述片段之间的上述结合发生在上述杂交区域。
3)根据2)中记载的方法，上述功能性核酸分子由第一核酸链和第二核酸链这两条上述核酸链构成，而且具有在不同的核酸链间杂交而形成的上述杂交区域，上述两条核酸链均作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个片段而被导入到细胞内，构成上述第一核酸链的片段之间的上述结合和构成上述第二核酸链的片段之间的上述结合发生在上述杂交区域的不同位置。
4)根据3)中记载的方法，上述功能性核酸分子由作为上述第一核酸链的第一RNA链和作为上述第二核酸链的第二RNA链构成，上述第一RNA链作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第一片段和第二片段被导入到细胞内，上述第二RNA链作为在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第三片段和第四片段被导入到细胞内，上述第一片段或第二片段可与上述第三片段和第四片段这二者杂交，上述第三片段或第四片段可与上述第一片段和第二片段这二者杂交。
5)根据1)～4)中任一项记载的方法，上述功能性核酸分子在细胞内具有RNA干扰作用。
6)根据1)～5)中任一项记载的方法，上述通过化学反应将会相互结合的官能团对是亲电子基团和被保护基保护的亲核基团的组合。
7)根据6)中记载的方法，上述亲核基团是硫代磷酸酯基。
8)根据6)或7)中记载的方法，上述亲电子基团是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基。
9)根据6)～8)中任一项记载的方法，上述保护基通过上述细胞中的内源性物质或光照射而脱离。
10)根据6)、8)或9)中记载的方法，上述亲核基团为硫代磷酸酯基时，上述保护基为下述(a)～(k)中任意一个。
[化学式12]
(而且，上述式中，R、R’和R”表示取代或非取代的烷基或芳基。R1和R2相互独立地表示氢原子或碳数为1～4的烷基，n表示1～3的整数。需要说明的是，当n为2或3时，存在的n个R1可以彼此不同，存在的n个R2也可以彼此不同。另外，(a)、(b)、(e)、(g)、(h)、(i)、(j)、和(k)中的苯环上的多个氢原子相互独立，且可以被取代基取代。)
11)功能性核酸分子构建用核酸组合物，其是上述1)～10)任一项中记载的方法中使用的核酸组合物，其具有构成功能性核酸分子的上述核酸链，该核酸链中的至少1条含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上的片段。
12)根据11)中记载的核酸组合物，上述功能性核酸分子具有在上述核酸链内杂交、或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域，上述片段被设计成上述片段之间的上述结合发生在上述杂交区域。
13)根据12)中记载的核酸组合物，其具有构成上述功能性核酸分子且可以杂交的第一核酸链和第二核酸链的两条上述核酸链，上述这两条核酸链均含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的2个片段，上述片段被设计成构成上述第一核酸链的片段之间的上述结合和构成上述第二核酸链的片段之间的上述结合发生在上述杂交区域的不同的位置。
14)根据13)中记载的核酸组合物，其具有构成上述功能性核酸分子的、作为上述第一核酸链的第一RNA链和作为上述第二核酸链的第二RNA链，上述第一RNA链含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第一片段和第二片段，上述第二RNA链含有在对应末端添加了通过化学反应将会相互结合的官能团对的第三片段和第四片段，上述第一片段或第二片段可与上述第三片段和第四片段这二者杂交，上述第三片段或第四片段可与上述第一片段和第二片段这二者杂交。
下面，示出实施例，对本发明的实施方式进行更详细的说明。当然，本发明并不限于以下实施例，其细节当然也可以是各种方式。需要说明的是，本发明不限于上述实施方式，可以在权利要求中所示的范围内进行各种改变，通过对各种公开的技术手段进行适当组合而获得的实施方式也包含在本发明的技术范围内。而且，本说明书中记载的所有文献均作为参考引入本文。
实施例
〔1.RNA的制备〕
(RNA的设计和合成)
以抑制荧光素酶基因表达的siRNA1(图2的(a)；序列编号1和2)为基础，通过将有义链和反义链分别分配成3’-PS(硫代磷酸酯)RNA和5’-氨基RNA，进行RNA合成(图2的(b)；序列编号3和4)。
3’-PS RNA和5’-氨基RNA均基于亚磷酰胺法，用DNA合成机(GeneWorld H8-SE)来合成。作为amidite试剂，RNA中使用2’-O-TOM保护体(Glen Research)，3’末端的磷酸化时使用3’-Phosphate CPG(Glen Research)和硫化剂(Glen Research)。而且，5’-末端的氨基dT导入时，使用5’-Amino dT Phosphoroamidite(Glen Research)。RNA的脱保护按照常规方法，3’-PS RNA和5’-氨基RNA以粗纯化的状态直接用于接下来的反应。
(合成的RNA的化学修饰)
上述合成的有义链和反义链中，通过使3’-PS RNA与二苯基二硫化物反应，合成Caged3’-PS RNA(图2的(c))。此外，3’末端的二硫键在导入到细胞内后，被GSH等生物体内的巯基源脱离。3’-PS RNA的二硫化是通过在室温下对以表1的组成制备的混合液培养6小时而进行的。
[表1]
而且，通过使有义链和反义链中的5’-氨基RNA与碘乙酸N-琥珀酰亚胺反应来合成碘乙酰基RNA(图2的(d))。5’-氨基RNA的碘乙酰化是通过在室温下对以表2的组成制备的混合液培养2小时而进行的。
[表2]
(用于比较的RNA的制备)
与3’-PS RNA和5’-氨基RNA的合成一样，基于亚磷酰胺法，使用DNA合成机(GeneWorld H8-SE)合成非修饰siRNA(25mer：图2(a)中所示序列)，通过改性聚丙烯酰胺凝胶纯化完全链长的生成物。
此外，通过使有义链和反义链中的5’-氨基RNA与醋酸钠反应，合成与3’-PS RNA不具有反应性的乙酰基RNA(图2的(e))。5’-氨基RNA的乙酰基化是通过在室温下对以表3的组成制备的混合液培养2小时而进行的。
[表3]
此外，就3’-PS RNA与碘乙酰基RNA连接时生成的经连接的siRNA而言，是通过在体外(无细胞系)连接3’-PS RNA和碘乙酰基RNA来合成(图2的(f)；序列编号5和6)。
通过HPLC(B.conc.0～40％、A液：50mM TEAA、5％乙腈(在水中)、B液：100％乙腈)分析并纯化上述合成的Caged3’-PS RNA、碘乙酰基RNA、乙酰基RNA和经连接的siRNA。然后，用Sep-Pak cartridges脱盐(用6mL 50％乙腈水洗脱)，用离心蒸发器浓缩。将获得的RNA溶解于超纯水中，适当稀释后测定UV吸收光谱，定量溶液浓度。
〔2.体外(无细胞系)中连接的确认〕
(方法)
在体外，为了确认Caged3’-PS RNA与碘乙酰基RNA之间进行了连接，按表4的组成进行反应。表4中的泳道5是未添加GSH的对照。
[表4]
而且，HBSS的组成为1.8mM CaCl2，0.49mM MgCl2，0.41mM MgSO4，pH7.4。
将上述混合液于37℃下培养30分钟后，加入上样缓冲液(loading buffer)(100％甲酰胺、0.5％XC)，于90℃下培养5分钟。将反应液在20％改性丙烯酰胺凝胶中泳动，再用CYBR Green II染色30分钟进行分析。作为标记物，同样地，在泳道1中加入25mer的RNA链、泳道2中加入19mer的Caged3’-PS RNA(有义链)、泳道3中加入18mer的Caged3’-PSRNA(反义链)。
(结果)
泳动结果示于图3。能够确认3’-PS RNA与碘乙酰基RNA之间进行了连接，且生成了25mer的RNA链(泳道4)。
此外，在4μL仅为有义链的Caged3’-PS RNA和4μL碘乙酰基RNA中加入2μL GSH，使之同样发生连接反应时，也生成了25mer的一条链的RNA链。
〔3.使用哺乳动物培养细胞系的RNA干扰效果的测定1〕
(方法)
37℃、5％CO2下，在含有10％FBS的DMEM(Wako制)培养基中培养HeLa-Luc细胞(购自Caliper(PerkinElmer company))，以每个100μL，4.0×103细胞/孔的方式加入到96孔板中。接着，在37℃、5％CO2下培养24小时，在约60％汇合的状态下，使用转染试剂GeneSilencer(Genlantis制)，按照转染试剂所附带的规程，转染各种RNA(有义链和反义链的3’-PS RNA和碘乙酰基RNA)。RNA的浓度为25、50或100nM。
具体而言，通过在细胞中加入了50μL HBSS(+)的状态下，添加下述转染用混合溶液来进行。转染用混合溶液的组成如表5所示。
[表5]
转染后，在37℃、5％CO2下培养6小时，将培养基替换成含有10％FBS的DMEM培养基。于37℃再培养18小时后，使用Luciferase Assay System(Promega制)，按照附带的规程来定量荧光素酶表达量(条件：试剂量50μL、延迟时间2秒、读取时间10秒、机器：MuthrasLB940(BERTHOLD制))。
作为比较，以上述同样方式转染Scramble(25nM)、非修饰siRNA(25nM)、经连接的siRNA(25nM)、Caged3’-PS RNA+乙酰基RNA(25nM、50nM或100nM)、仅仅是Caged3’-PS RNA(100nM)、仅仅是碘乙酰基RNA(100nM)和仅仅是乙酰基RNA(100nM)，定量荧光素酶表达量。
(结果)
荧光素酶基因表达结果示于图4。在细胞内导入未连接的Caged3’-PS RNA和碘乙酰基RNA(IA)时，观察到荧光素酶基因的表达低，充分的阻碍活性。另一方面，在导入未连接的Caged3’-PS RNA和乙酰基RNA(Ac)时，未观察到阻碍活性。该结果提示，在细胞内通过3’-PS RNA与碘乙酰基RNA的连接反应，生成经连接的siRNA，抑制了基因表达。
由此明确，将功能性RNA作为片段导入到细胞内，可以在细胞内构建功能性RNA。
〔4.使用哺乳动物培养细胞系的RNA干扰效果的测定2(通过渗透压冲击(osmoticshock)进行的转染)〕
(方法)
于37℃、5％CO2，在含有10％FBS的DMEM(Wako制)培养基中培养HeLa-Luc细胞，以约60％汇合的状态下回收，用PBS清洗。然后，将细胞悬浮于高渗缓冲液与各种RNA(有义链和反义链的3’-PS RNA和碘乙酰基RNA)的混合液(10μL)，于37℃下培养10分钟。向其中加入灭菌水(52.9μL)，再于37℃培养10分钟。然后，回收细胞，用PBS清洗。然后，将回收的细胞悬浮于含有10％FBS的DMEM(400μL)中，以每100μL分注于96孔板中。高渗缓冲液的组成为2.1M蔗糖、7.5％PEG(2000)、150mM位于HBSS缓冲液中的HEPES(pH7.3)。高渗缓冲液与各种RNA的混合液(10μL)的组成如表6。
[表6]
1.5×高渗缓冲液 6.7μL
RNA(30μM) 0.33μL
DDW 至10μL
转染后，于37℃、5％CO2下培养24小时，用Luciferase Assay System(Promega制)，按照附带的规程定量荧光素酶表达量(条件：试剂量30μL、延迟时间2秒、读取时间10秒、机器：Muthras LB 940(BERTHOLD制))。并且，使用BCA蛋白质检测试剂盒(ThermoScientific制)，按照附带的规程定量蛋白质的量，补正荧光素酶表达量。
作为比较，以与上述同样方式转染Scramble和非修饰siRNA，定量和补正荧光素酶表达量。
(结果)
荧光素酶基因表达结果示于图5。在细胞内导入未连接的Caged3’-PS RNA和碘乙酰基RNA(IA)时，与在细胞内导入了非修饰siRNA时相比，荧光素酶基因的表达低，受到更多阻碍。该结果提示通过将siRNA片段化成Caged3’-PS RNA和IA后再导入，细胞膜透过性得到提高。
由此明确，通过在细胞内导入作为片段的功能性RNA，使细胞膜透过性提高，可以在细胞内有效导入更多量的功能性RNA。
〔5.使用哺乳动物培养细胞系的免疫应答测定〕
(方法)
于37℃、5％CO2下，在含有10％FBS的RPMI-1640(Wako制)培养基中培养T98G细胞(由理化学研究所BioResource Center获得)，按照每300μL，4.0×104细胞/孔将其分注到24孔板上。然后，于37℃、5％CO2下培养24小时，在约70％汇合的状态下，使用转染试剂lipofectamine2000(invitrogen制)，按照转染试剂附带的规程，转染各种RNA(有义链和反义链的3’-PS RNA和碘乙酰基RNA)。作为比较，以同样方式转染非RNA、聚I：C、非修饰siRNA。RNA浓度为100nM(终体积300μL)。转染用混合溶液的组成如表7所示。
[表7]
转染后，于37℃、5％CO2下培养6小时，在各孔中加入300μL含有20％血清的RPMI-1640培养基。在37℃中再培养18小时后，使用ISOGEN(NIPPON GENE制)，按照添加的规程，回收总RNA。使用回收的RNA和One Step PrimeScript(注册商标)RT-PCR试剂盒(PerfectReal Time)(Takara制)，测定IFN-β和β-Actin的表达量。使用ΔΔCt法，根据所获得的结果，用β-Actin表达量补正IFN-β表达量，计算出相对的IFN-β表达量。实时PCR中使用的反应液的组成如表8所示。此外，实时PCR的反应条件如表9所示。
[表8]
[表9]
(结果)
结果示于图6。与未转染RNA的阴性对照(NC)相比，在细胞内导入siRNA或聚I：C时，确认了IFN-β的表达量增加。另一方面，在细胞内导入未连接的Caged 3’-PS RNA和碘乙酰基RNA(IA)时，未观察到IFN-β表达量的变化。该结果表明通过将siRNA作为片段导入到细胞内，可以避免未片段化的siRNA所诱导的免疫应答。
由此明确，通过在细胞内导入作为片段的功能性RNA，可以避免未片段化的功能性RNA诱导的免疫应答。
工业实用性
本发明可以应用于采用功能性核酸分子的药物和试剂等领域。

Claims (12)

1.非疾病的诊断和治疗用的在细胞内构建功能性核酸分子的方法，其包括：
在细胞内导入在对应末端添加了通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的导入工序，以及
在所述细胞内使所述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成所述功能性核酸分子的生成工序，
所述通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对是亲电子基团和被保护基保护的亲核基团的组合，
所述保护基通过所述细胞中的内源性物质或光照射而脱离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述功能性核酸分子具有在同一核酸链内杂交的杂交区域、或在不同的核酸链间杂交而形成的杂交区域，
所述片段之间的所述结合发生在所述杂交区域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述功能性核酸分子由第一核酸链和第二核酸链这两条核酸链构成，具有在该两条核酸链间杂交而形成的杂交区域，
所述两条核酸链均作为在对应末端添加了通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对的2个片段被导入到细胞内，
构成所述第一核酸链的片段之间的结合和构成所述第二核酸链的片段之间的结合发生在所述杂交区域的不同位置。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述亲核基团是硫代磷酸酯基。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述保护基为下述(a)～(k)中的任意一种，
在所述式中，R、R’和R”表示取代或非取代的烷基或芳基，
R1和R2彼此独立地表示氢原子或碳数为1～4的烷基，
n表示1～3的整数，
当n为2或3时，具有的n个R1任选彼此不同，具有的n个R2任选彼此不同，
(a)、(b)、(e)、(g)、(h)、(i)、(j)和(k)中的苯环上的多个氢原子彼此独立地任选被取代基取代。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述亲电子基团是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基。
7.非疾病的诊断和治疗用的在细胞内构建siRNA的方法，其包括：
在细胞内导入构成该siRNA的第一RNA链和第二RNA链的至少之一作为在对应末端添加了通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段的导入工序，以及
在所述细胞内使所述官能团之间发生反应，从而使片段之间结合，生成所述siRNA的生成工序，其中，
所述siRNA的长度为20～35mer，
所述通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对是亲电子基团和被保护基保护的亲核基团的组合，
所述保护基通过所述细胞中的内源性物质或光照射而脱离。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述siRNA的所述第一RNA链和所述第二RNA链具有形成两条链的杂交区域，
所述片段之间的所述结合发生在所述杂交区域。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一RNA链和所述第二RNA链均作为在对应末端添加了通过细胞内化学反应将会相互结合的官能团对的2个以上片段被导入到细胞内，
构成所述第一RNA链的片段之间的结合和构成所述第二RNA链的片段之间的结合发生在所述杂交区域的不同位置。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，所述亲核基团是硫代磷酸酯基。
11.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，所述保护基为下述(a)～(k)中的任意一种，
在所述式中，R、R’和R”表示取代或非取代的烷基或芳基，
R1和R2彼此独立地表示氢原子或碳数为1～4的烷基，
n表示1～3的整数，
当n为2或3时，具有的n个R1任选彼此不同，具有的n个R2任选彼此不同，
(a)、(b)、(e)、(g)、(h)、(i)、(j)和(k)中的苯环上的多个氢原子彼此独立地任选被取代基取代。
12.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，所述亲电子基团是碘乙酰基、溴乙酰基或碘基。
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