KR102101210B1 - 기능성 핵산 분자의 구축법, 및 상기 방법에 사용하는 핵산 조합물 - Google Patents

기능성 핵산 분자의 구축법, 및 상기 방법에 사용하는 핵산 조합물 Download PDF

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Abstract

1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서, 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편을 세포 내에 도입하고, 세포 내에서 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성한다.

Description

기능성 핵산 분자의 구축법, 및 상기 방법에 사용하는 핵산 조합물{METHOD FOR CONSTRUCTING FUNCTIONAL NUCLEIC ACID MOLECULE, AND NUCLEIC ACID COMBINATION TO BE USED IN SAID METHOD}
본 발명은 기능성 핵산 분자를 세포 내에서 구축하는 신규의 방법, 및 상기 방법에 사용하는 핵산 조합물에 관한 것이다.
핵산 분자 내에는 단백질을 코드하지 않지만, 각종 생명 현상에 중요한 기능을 달성하는 것이 알려져 있다. 이러한 핵산 분자로서, 예를 들면 기능성 non-coding RNA 분자(비특허문헌 1), 및 RNA 간섭 작용을 야기하는 RNA의 소분자(비특허문헌 2) 등을 들 수 있다.
예를 들면, RNA 간섭 작용은 세포 내에서 표적 RNA의 작용을 특이적으로 억제하는 중요한 방법(비특허문헌 3)으로서, 시약으로서는 물론 의약으로서의 응용(비특허문헌 4)도 활발히 연구되고 있다.
Ryan J Taft, Ken C Pang, Timothy R Mercer, Marcel Dinger1 and John S Mattick, J Pathol., 2010, 220, 126-139. Fire A, XuS, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C; Nature, 1998, 391, 806-11. Sayda M. Elbashir, Javier Martinez, Agnieszka Patkaniowska, Winfried Lendeckel and Thomas Tuschl; EMBO J. 2001, 20, 6877-6888. John C. Burnett, John J. Rossi and Katrin Tiemann; Biotechnol. J. 2011, 6, 1130-1146.
RNA 간섭 작용을 야기하는 RNA는 소분자임에도 불구하고, 그 효과를 최대한으로 인출하기 위해서 세포막의 투과성을 더 향상시키는 요구, 및 면역계를 부활화하는 것에 의한 독성 발현을 억제하기 위한 새로운 요구가 존재한다.
그러나, 이러한 요구에 대하여 RNA 분자를 더 소분자로 하기 위해서, 그 기능 발휘에 필요 최소한의 서열로 좁히는 노력이 이루어지고 있는 것에 지나지 않는 것이 현재의 상태이다.
본 발명은 상기의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 기능성 핵산 분자를 세포에 받아들이기 용이한 형태로 하여 세포 내에 도입하고, 세포 내에서 기능성 핵산 분자를 구축하는 방법 등을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서, 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편을 세포 내에 도입하는 도입 공정과, 상기 세포 내에서 상기 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성하는 생성 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 사용하는 핵산 조합물로서, 기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 핵산쇄를 구비하여 이루어지고, 상기 핵산쇄 중 적어도 1개가 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편으로서 포함되어 있는 기능성 핵산 분자의 구축용 핵산 조합물을 제공한다.
(발명의 효과)
기능성 핵산 분자를 세포에 받아들이기 용이한 복수의 단편으로서 세포 내에 도입하고, 세포 내에서 기능성 핵산 분자를 구축할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 방법의 일실시형태의 개략을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예에 있어서 사용한 각종 RNA의 서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예에 있어서 in vitro에 있어서의 라이게이션의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예에 있어서 루시페라아제 유전자 발현의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예에 있어서 루시페라아제 유전자 발현의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예에 있어서 면역 응답 측정의 결과를 나타내는 도면이다.
〔1. 기능성 핵산 분자의 구축법〕
(구축법의 개요)
본 발명에 의한 기능성 핵산 분자의 구축법은 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서, 이하의 공정 1) 및 2)를 포함한다.
1) 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편을 세포 내에 도입하는 도입 공정,
2) 상기 세포 내에서 상기 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성하는 생성 공정.
즉, 본 발명에 의한 기능성 핵산 분자의 구축법은 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서, 이하의 공정 1) 및 2)를 포함한다.
1) 상기 핵산쇄 중 적어도 1개를 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편으로 하고, 또한 상기 1개 또는 2개의 핵산쇄(즉, 적어도 1개는 둘 이상의 단편으로 되어 있다)를 세포 내에 도입하는 도입 공정,
2) 상기 세포 내에서 상기 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성하는 생성 공정.
상기 구축법은 기능성 핵산 분자를 구성하는 핵산쇄의 적어도 일부를 복수의 단편으로 해서 세포에 도입하고, 세포 내에서 기능성 핵산 분자를 구축시킨다. 따라서, 기능성 핵산 분자의 세포로의 도입이 향상된다. 또한, 핵산쇄 중 적어도 일부를 보다 짧은 단편으로서 사용하기 때문에 기능성 핵산 분자에 기인하는 면역 독성이 억제될 수 있다.
(기능성 핵산 분자)
본 발명에 있어서, 기능성 핵산 분자란 복수개의 핵산이 쇄상으로 연결되어 이루어지고(즉, 올리고 또는 폴리뉴클레오티드), 단백질을 코드하지 않고 또한 발생·분화 등의 생명 현상에 대하여 소정의 기능을 발휘하는 핵산 분자를 가리킨다. 따라서, 생명 현상에 있어서 특단의 기능을 발휘하지 않고, 단지 표적 특이적으로 하이브리다이즈할 뿐인 프라이머 및 프로브는 본 발명에 있어서의 기능성 핵산 분자의 범주에서 제외된다.
기능성 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 또는 DNA·RNA 하이브리드 분자이다. 기능성 핵산 분자는 1개의 핵산쇄로 구성된 것이어도, 2개의 핵산쇄로 구성된 것이어도 된다. 또한, 기능성 핵산 분자는 그 일부에 비천연의 핵산을 포함하고 있어도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서 용어 「핵산쇄」란, 기능성 핵산 분자를 구성하고 있는 상태에서의 전체 길이 핵산쇄를 가리키고, 상기 「핵산쇄」를 보다 짧게 한 것에 상당하는 용어 「단편」(후술한다)과는 구별되고 있다.
상기 DNA 분자로서는, 예를 들면 DNA 앱타머; CpG 모티프; DNA 자임; 등을 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 베이스가 DNA쇄이며, 일부에 RNA 및/또는 비천연의 핵산 등이 도입되어 있는 것은 DNA 분자로 분류한다.
상기 RNA 분자로서는, 예를 들면 RNA 앱타머; shRNA, siRNA, 및 microRNA 등의 RNA 간섭 작용을 나타내는 RNA 분자(RNAi용 핵산 분자); 안티센스 RNA 분자; RNA 리보자임; 등을 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 베이스가 RNA쇄이며, 일부에 DNA 및/또는 비천연의 핵산 등이 도입되어 있는 것은 RNA 분자로 분류한다.
DNA·RNA 하이브리드 분자로서는, 예를 들면 DNA·RNA 하이브리드 앱타머; 등을 들 수 있다.
기능성 핵산 분자는 바람직하게는 그 기능을 발휘하기 위해서, 상기 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 형성하는 것이다. 그 이유는 후술의 (핵산쇄의 단편의 바람직한 설계의 예)란의 기재도 참조된다.
기능성 핵산 분자는 보다 바람직하게는, 핵산쇄 내 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어진 하이브리다이즈 영역을 갖는 RNAi용 핵산 분자이며, 더욱 바람직하게는 2개의 핵산쇄로 이루어진 RNAi용 핵산 분자이다. 2개의 핵산쇄로 이루어진 RNAi용 핵산 분자의 핵산쇄의 길이(mer)는 예를 들면 15~40mer이고, 바람직하게는 15~35mer이며, 보다 바람직하게는 20~35mer이다.
(핵산쇄의 단편)
기능성 핵산 분자를 구성하는 핵산쇄의 「단편」이란, 상기「핵산쇄」를 둘 이상으로 분할한 핵산 분자에 상당한다. 그리고, 하나의 핵산쇄로부터 유래되는 모든 「단편」을 적절한 순서로 연결하면 상기 핵산쇄와 같은 핵산 서열을 갖는 핵산 분자가 구축된다. 단, 용어 「단편」이란 핵산쇄를 한번 구축한 후에 이것을 분단해서 상기 단편을 생성하는 것을 의도하는 것은 아니다.
단편을 결합하여 기능성 핵산 분자를 구성하는 핵산쇄를 구축할 경우, 다른 단편 사이의 3'측 말단과 5'측 말단을 상호 결합시킨다. 이때, 상호 결합시켜야 할 3'측 말단과 5'측 말단의 조합을 「대응하는 말단」이라고 칭한다. 즉, 「대응하는 말단」이란, 단편의 디자인의 바탕이 되는 핵산쇄를 구성하도록 단편을 정렬화했을 때에 이웃하는 말단이다.
또한, 하나의 핵산쇄로부터 유래되는 「단편」의 길이는 특별하게 한정되지 않지만, 다른 단편 사이의 길이(mer)의 차가 현저하게 너무 커지지 않도록 하는 것이 바람직한 경우가 있다. 이 관점에서는, 하나의 핵산쇄로부터 유래되는 최장의「단편」에 대하여 남는 모든 단편이〔25%×최장 단편의 길이(mer)〕이상의 길이인 것이 바람직하고, 〔30%×최장 단편의 길이(mer)〕이상의 길이인 것이 보다 바람직하다.
상기 「대응하는 말단」에는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍(관능기의 조합)이 결합되어 있어서, 이들 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합함으로써 핵산쇄가 구성된다.
상기의 관능기 쌍은 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 친전자성기와 친핵성기의 조합이 바람직하다. 즉, 상기 「대응하는 말단」의 한쪽에 친전자성기를 결합시키고 「대응하는 말단」의 다른쪽에 친핵성기를 결합시킴으로써, 다른 단편끼리를 화학 반응에 의해 상호 결합한다. 또한, 친전자성기 및 친핵성기는 3' 말단 및 5' 말단 모두에 결합시켜도 된다. 즉, 친전자성기를 3' 말단에 결합하고 친핵성기를 5' 말단에 결합해도 되고, 또는 친전자성기를 5' 말단에 결합하고 친핵성기를 3' 말단에 결합해도 된다.
상기 친전자성기로서는 특별하게 한정되지 않지만, 요오드아세틸기(참고 문헌 : Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 327), 및 브로모아세틸기(참고 문헌 : Nucleic Acids Res., 22, 5076) 등의 할로겐화 알킬기; 요오드기(참고 문헌 : Tetrahedron Lett., 1995, 38, 55959), 및 브로모기 등의 할로겐기; 포르밀기; 등을 들 수 있다. 일실시형태에 있어서 친전자성기는 요오드아세틸기, 브로모아세틸기, 또는 요오드기인 것이 바람직한 경우가 있다.
상기 친핵성기로서는 특별하게 한정되지 않지만, 포스포로티오에이트기; 티올기; 히드록시기; 아미노기; 티오메틸기 등의 알킬티오기; 메톡시기 등의 알콕시기; 등을 들 수 있다. 일실시형태에 있어서 친핵성기는 포스포로티오에이트기인 것이 바람직한 경우가 있다.
또한, 관능기 쌍을 구성하는 상기 친전자성기와 상기 친핵성기의 조합도 특별하게 한정되지 않지만, 할로겐화 알킬기 또는 할로겐기와 포스포로티오에이트기의 조합, 또는 할로겐화 알킬기 또는 할로겐기와 티올기의 조합 등이 바람직한 경우가 있다. 또한, 일실시형태에 있어서 관능기 쌍을 구성하는 상기 친전자성기와 상기 친핵성기의 조합은 요오드아세틸기, 브로모아세틸기, 또는 요오드기와 포스포로티오에이트기의 조합인 것이 보다 바람직한 경우가 있다.
이하에, 대응하는 말단에 붙여지는 상기 친전자성기와 상기 친핵성기의 바람직한 조합의 일례, 및 이들 기가 화학 반응에 의해 서로 연결되는 형태를 나타낸다. 또한, 화학식 중에서 당은 골격 부분만을 나타내고 있고, 리보스여도 디옥시리보스여도 된다. 또한, 화학식 중 B는 핵산을 구성하는 각종 염기를 나타낸다. 즉, 이하의 예에서는 기능성 핵산 분자가 RNA 분자인 경우를 나타내고 있지만, DNA 분자에서도 마찬가지로 구성할 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00001
특히, 상호 결합시켜야 할 복수의 단편을 동시에 계 내에 존재시킬 경우, 세포 밖에서 상호 결합하는 단편의 비율을 보다 저감하기(실질적으로 없애기) 위해서, 상기 친핵성기는 소망의 타이밍에서 탈보호가 가능한 보호기에 의해 보호되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 일실시형태에 있어서 관능기 쌍은 친전자성기와 보호기에 의해 보호되어 있는 친핵성기의 조합인 것이 바람직하다.
친핵성기를 보호하는 보호기의 종류는 친핵성기의 종류에 따라 적당하게 채용하면 된다. 바람직한 보호기로서는 예를 들면, 세포 내의 내인성 물질의 작용에 의해 친핵성기로부터 탈리되는 것을 들 수 있다. 「세포 내의 내인성 물질」이란, 후술의 「세포 밖으로부터 도입되는 물질」과 쌍을 이루는 것이며, 그 세포가 원래 유지하고 있는 물질을 의도하고 있다. 세포 내의 내인성 물질로서는, 예를 들면 효소 및 펩티드 등을 들 수 있다. 유전자 도입에 의해 세포 내에서 발현시킨 효소 및 펩티드 등은 그 자체가 「세포 밖으로부터 도입되는」 것이 아니기 때문에, 세포 내의 내인성 물질의 범주이다.
세포 내의 내인성 물질의 작용에 의해 친핵성기로부터 탈리되는 보호기 중 포스포로티오에이트기의 보호에 사용 가능한 것으로서는, 이하에 구조를 나타내는 페닐티오기(a) 기타 아릴티오기와 같은 포스포로티오에이트기를 디술파이드 보호할 수 있는 것; 니트로벤질기(b), 에스테르(c,d), 티오카르보닐(e), 및 아미드(f); 및 이것들의 유도체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 니트로벤질기는 o-니트로벤질기, m-니트로벤질기 및 p-니트로벤질기의 어느 것이라도 좋지만, 반응성의 관점에서 m-니트로벤질기 및 p-니트로벤질기가 바람직하다.
Figure 112014094531124-pct00002
또한, (c), (d), (f)에 있어서의 R, R' 및 R"는 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위이면 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 치환 또는 비치환의 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다. 알킬기 또는 아릴기는, 예를 들면 탄소수 1~15, 바람직하게는 탄소수 1~10일 수 있다. 알킬기로서는 예를 들면 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기, 2-에틸헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기 및 데실기 등의 쇄상 알킬기; 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기, 시클로노닐기, 시클로데실기 및 아다만틸기 등 환상 알킬기를 들 수 있다. 또한, 아릴기로서는 예를 들면 페닐기, 톨릴기 및 나프틸기 등을 들 수 있다.
알킬기 또는 아릴기가 갖는 치환기로서는, 예를 들면 할로겐 원자(불소, 염소, 브롬, 및 요오드), 히드록실기, 탄소수 1~10(바람직하게는 탄소수 1~4)의 알킬기(쇄상 및 환상 알킬기), 탄소수 1~4의 알콕시기, 탄소수 1~5개의 아실옥시기, 카르복실기, 탄소수 2~5의 알콕시카르보닐기, 탄소수 6~10의 아릴기, 시아노기, 니트로기 등을 들 수 있다. 또한, 치환기로서 복수의 쇄상의 상기 알킬기가 아릴기 상에 존재할 경우, 이들 쇄상의 알킬기끼리는 서로 결합해서 환을 구성해도 되고, 상기 환에 있어서의 탄소 원자의 1~수개(바람직하게는 1~3개)가 산소 원자로 치환되어 있어도 된다. 일례로서, 아릴기 상의 인접하는 탄소 원자 상에 위치하는 알킬 치환기끼리가 환을 형성하고, 또한 2개의 탄소 원자가 산소 원자에 의해 치환된 1,3-디옥솔란 같은 환 구조를 형성하는 것을 들 수 있다.
치환기로서 환상 알킬기를 갖는 알킬기로서는, 예를 들면 시클로펜틸메틸기, 시클로펜틸에틸기, 시클로펜틸프로필기, 시클로헥실메틸기, 시클로헥실에틸기 및 시클로헥실프로필기 등을 들 수 있다. 또한, 치환기로서 아릴기를 갖는 알킬기로서는, 예를 들면 벤질기, 페닐에틸기, 페닐프로필기, 나프탈레닐메틸기, 나프탈레닐에틸기 및 나프탈레닐프로필기 등을 들 수 있다.
또한, 아릴기는 골격의 일부가 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자 등으로 치환되어 복소환을 형성해도 된다. 또한, (a), (b), 및 (e)에 있어서의 벤젠환 상의 복수의 수소 원자는 서로 독립하여 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 따라서, (a), (b), 및 (e)의 유도체로서, 예를 들면 (a), (b), 또는 (e)에 있어서의 벤젠환 상의 수소 원자(예를 들면 1~3개)가 상기에서 치환기로서 열거한 것으로 치환된 것을 들 수 있다.
페닐티오기는 세포 내에 존재하는 GSH(글루타티온) 등의 생체 내 티올원에 의해 환원되어 탈리된다. 니트로벤질기는 세포 내에 존재하는 니트로리덕타아제에 의해 환원되어 탈리된다(참고 문헌 : Bioorg. Med. Chem., 11, 2453). 에스테르 및 티오카르보닐은 세포 내에 존재하는 에스테라아제에 의해 탈리된다. 아미드는 세포 내에 존재하는 펩티다아제에 의해 탈리된다.
상기 (a)~(f)와 같은 보호기에 의해 포스포로티오에이트기를 보호하면, 상기 포스포로티오에이트기는 세포 밖에서 실질적으로 탈보호되지 않는다. 그 때문에, 핵산쇄의 단편을 세포 밖에서 혼합한 것 만으로는 결합 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 짧은 단편인 채로 1회의 조작으로 세포 내에 도입할 수 있는 가능성이 높아진다. 또한, 세포 내에 존재하는 효소 또는 펩티드에 의해 탈보호 반응이 자연스럽게 일어나기 때문에, 1회의 조작으로 도입 공정 및 생성 공정의 양쪽을 행할 수 있다.
포스포로티오에이트기를 보호하는 보호기로서는, 상기 외에 광 조사에 의해 친핵성기로부터 탈리되는 것을 들 수 있다. 그러한 보호기로서는, 예를 들면 하기의 (g)~(j) 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다(참고 문헌 : Molecular Pharmaceutics, 2009, 6, 669).
Figure 112014094531124-pct00003
(g)~(j)에 있어서의 R1, R2 및 n은 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위이면 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 R1 및 R2는 서로 독립하여 수소 원자 또는 탄소수 1~4의 알킬기를 나타내고, n은 1~3의 정수, 바람직하게는 (g)에서는 1 또는 2를 나타내고, 바람직하게는 (h) 및 (j)에서는 1을 나타낸다. 또한, n이 2 또는 3일 때, n개 있는 R1끼리는 서로 달라도 되고, n개 있는 R2끼리는 서로 달라도 된다. 또한, (g)~(j)에 있어서의 벤젠환 상의 복수의 수소 원자는 서로 독립하여 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 따라서, (g)~(j)의 유도체로서 예를 들면 (g)~(j)에 있어서의 벤젠환 상의 수소 원자(예를 들면 1~3개)가 상기에서 치환기로서 열거한 것으로 치환된 것을 들 수 있다.
상기 (g)~(j)과 같은 보호기에 의해 포스포로티오에이트기를 보호하면, 상기 보호기의 탈리에 필요한 파장의 광을 조사하지 않는 조건 하에서, 상기 포스포로티오에이트기는 세포 밖에서 실질적으로 탈보호되지 않는다. 그 때문에, 핵산쇄의 단편을 세포 밖에서 혼합한 것 만으로는 결합 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 짧은 단편인 채로 1회의 조작으로 세포 내에 도입할 수 있는 가능성이 높아진다. 또한, 광 조사의 타이밍을 제어함으로써 소망의 타이밍에서 탈보호 반응을 일으키게 할 수 있다.
상기 (g) 또는 그 유도체의 구체예로서는, 예를 들면 이하의 기를 들 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00004
상기 (h)의 구체예로서는, 예를 들면 이하의 기를 들 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00005
상기 (i)의 구체예로서는, 예를 들면 이하의 기를 들 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00006
상기 (j)의 구체예로서는, 예를 들면 이하의 기를 들 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00007
여기서, 상기 보호기 내의 R3 및 R4는 서로 독립하여 상기에서 나타낸 아릴기 상에서 치환되어도 되는 치환기를 나타낸다.
포스포로티오에이트기를 보호하는 보호기로서는, 상기 외에 세포 밖으로부터 도입되는 물질에 의해 탈리되는 것을 들 수 있다. 그러한 보호기로서는 예를 들면, 아지드벤질기(k) 및 이것의 유도체 등을 들 수 있다. 또한, 아지드벤질기는 o-아지드벤질기, m-아지드벤질기 및 p-아지드벤질기의 어느 것이라도 좋지만, 반응성의 관점에서 p-아지드벤질기가 바람직하다. 또한, (k)에 있어서의 벤젠환 상의 복수의 수소 원자는 서로 독립하여 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 따라서, (k)의 유도체로서 예를 들면 (k)에 있어서의 벤젠환 상의 수소 원자(예를 들면 1~3개)가 상기에서 치환기로서 열거한 것으로 치환된 것을 들 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00008
아지드벤질기는 포스핀을 세포 내에 도입함으로써 탈리된다(참고 문헌 : Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 714). 포스핀은 막 투과성의 관점에서 수용성 포스핀인 것이 바람직하다.
상기 (k)와 같은 보호기에 의해 포스포로티오에이트기를 보호하면, 상기 포스포로티오에이트기는 세포 밖에서 실질적으로 탈보호되지 않는다. 그 때문에, 핵산쇄의 단편을 세포 밖에서 혼합한 것 만으로는 결합 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 짧은 단편인 채로 1회의 조작으로 세포 내에 도입할 수 있는 가능성이 높아진다. 또한, 탈보호의 작용 물질(포스핀 등)을 세포 내에 받아들이게 하는 타이밍을 제어함으로써 소망의 타이밍에서 탈보호 반응을 일으키게 할 수 있다.
또한, 소정의 조건 하에서만 서로 반응해서 결합하는 관능기 쌍으로서는, 상기한 탈보호 반응을 이용하는 것 외에 포스포로디에스테르기와 요오드기의 조합(참고 문헌 : J. Mol. Evol., 2003, 56, 607)을 들 수 있다. 이 조합을 사용할 경우, 브롬화시안(BrCN)을 세포 내에 도입함으로써 결합 반응을 일으킬 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00009
또한, 상기 관능기 쌍으로서 아미노기와 알데히드기의 조합(참고 문헌 : J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10144; J. Am. Chem. Soc., 1997, 1119, 12420)도 들 수 있다. 이 조합을 사용할 경우, 시아노붕소화 수소나트륨(NaCNBH3) 또는 시아노붕소화 수소칼륨(KBH3CN)을 세포 내에 도입함으로써 결합 반응을 일으킬 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00010
또한, 상기 관능기 쌍으로서 아지드기와 알키닐기의 조합(참고 문헌 : PNAS, 2010, vol.107, 15329-15334, ChemBioChem, 2011, 12, 125-131)을 들 수 있다. 이 조합을 사용할 경우, 구리를 세포 내에 도입함으로써 결합 반응을 일으킬 수 있다.
Figure 112014094531124-pct00011
또한, 상기의 화학식 중에서 당은 골격 부분만을 나타내고 있고, 리보스여도 디옥시리보스여도 된다. 또한, 화학식 중의 B는 핵산을 구성하는 각종 염기를 나타낸다. 즉, 이상의 예에서는 기능성 핵산 분자가 RNA 분자인 경우를 나타내고 있지만, DNA 분자에서도 마찬가지로 구성할 수 있다.
또한, 기능성 핵산 분자가 2개의 핵산쇄로 이루어질 경우, 그 적어도 1개가 둘 이상의 단편으로 되어 있으면 되지만, 2개 모두가 둘 이상의 단편으로 되어 있는 것이 바람직하다.
(핵산쇄의 단편의 작성 방법)
상기 관능기가 말단에 붙여진 핵산쇄의 「단편」의 제작 방법은 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 단편의 올리고뉴클레오티드의 부분은 in vitro 전사 합성 방법, 플러스미드 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 또는 PCR 카세트에 의한 방법 등에 의해 합성할 수 있다. 순도의 높이, 대량 합성 가능, in vivo에서의 사용 안정성이 높음, 및 화학 수식 가능 등의 관점에서 화학 합성 방법이 바람직하다. 화학 합성 방법으로서는, 예를 들면 포스포로아미다이트법, 및 H-포스포네이트법 등을 들 수 있고, 시판의 핵산 합성기를 사용할 수 있다.
또한, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 및 5' 말단(대응하는 말단)에 소정의 관능기 및 보호기를 붙이는 방법은, 관능기의 종류에 따른 공지의 방법에 따라 행하면 된다. 또한, 관능기 등의 도입이 보다 용이하다는 관점에서는, 「대응하는 말단」을 구성하는 핵산은 「핵산쇄」의 종류에 관계없이 디옥시리보체의 핵산이 바람직하고, dA, dG, dC, dT에서 선택되는 것이 보다 바람직하다.
이와 같이 제작한 단편은 in vivo에서의 사용 안전성 등의 관점에서, 용도에 따라서는 도입 공정 전에 정제되는 것이 바람직하다. 또한, 단편의 세포막 투과성을 높이기 위해서, 상기 단편에 세포막 투과성 분자를 결합시켜도 된다. 이러한 분자로서는, 예를 들면 TAT 펩티드, 올리고아르기닌, 페너트라틴(PENETRATIN), 및 TP-10 등의 막 투과성 펩티드; 콜레스테롤; 비타민 A 등을 들 수 있다.
(핵산쇄의 단편의 바람직한 설계의 예)
상기 기능성 핵산 분자가 그 기능을 발휘하기 위해서, 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 형성하는 것일 경우, 상기 핵산쇄의 단편은 상기 단편끼리의 결합이 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 설계되는 것이 바람직하다. 이하, 도 1에 의거하여 더 구체적으로 설명한다.
도 1은 기능성 핵산 분자로서의 siRNA의 바람직한 설계의 일례를 나타낸다(실시예도 참조). 이 예에 있어서, siRNA는 제 1 RNA쇄와 제 2 RNA쇄가 하이브리다이즈하도록 구성되어 있다.
제 1 RNA쇄는 3' 말단에 포스포로티오에이트기(관능기 쌍의 한쪽)를 부여받은 제 1 단편(도면 중 A)과, 5' 말단에 요오드아세틸기(관능기 쌍의 다른쪽)를 부여받은 제 2 단편(도면 중 B)으로서 주어져 있다. 또한, 제 2 RNA쇄는 3' 말단에 포스포로티오에이트기(관능기 쌍의 한쪽)를 부여받은 제 3 단편(도면 중 C)과, 5' 말단에 요오드아세틸기(관능기 쌍의 다른쪽)를 부여받은 제 4 단편(도면 중 D)으로서 주어져 있다. 또한, 포스포로티오에이트기는 모두 페닐티오기(보호기)에 의해 보호되어 있다.
제 1 RNA쇄 및 제 2 RNA쇄는 서로 어긋난 위치에서 각각 2개의 단편으로 되도록 설계되어 있다. 즉, 제 1 RNA쇄를 구성하는 제 1 단편과 제 2 단편은 모두 이웃하도록 제 3 단편에 대하여 하이브리다이즈한다. 마찬가지로, 제 2 RNA쇄를 구성하는 제 3 단편과 제 4 단편은, 모두 이웃하도록 제 1 단편에 대하여 하이브리다이즈한다. 이것에 의해, 제 1 RNA쇄 및 제 2 RNA쇄의 어느 것에 있어서나 관능기가 붙여진 대응하는 말단끼리가 근접하여 생성 공정에 있어서의 관능기끼리의 결합 반응을 효율적으로 일으킬 수 있다.
또한, 도 1에서는 제 1 RNA쇄를 구성하는 단편끼리의 결합과, 제 2 RNA쇄를 구성하는 단편끼리의 결합이 하이브리다이즈 영역의 다른 개소(서로 어긋난 위치)에서 생기는 것을 예시했지만, 예를 들면 도 1에 있어서 제 1 RNA쇄 또는 제 2 RNA쇄의 한쪽만이 단편화되어 있는 것도, 대응하는 말단끼리를 효율적으로 근접시킬 수 있는 관점에서 바람직한 단편화의 일례이다.
또한, 도 1에서는 기능성 핵산 분자로서 siRNA를 예시했지만, 이 도면에서 나타낸 단편의 설계는 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 형성하는 기능성 핵산 분자에 널리 적용 가능하다.
(도입 공정)
도입 공정은 기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 「핵산쇄」 중 적어도 1개를, 화학 반응에 의해 상호 결합하는 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 둘 이상의 「단편」의 형태로 한 후에, 상기 기능성 핵산 분자를 구성하는 모든 핵산쇄를 세포 내에 도입하는 공정이다. 또한, 「핵산쇄」, 「관능기 쌍」, 「대응하는 말단」, 및 「단편」의 정의는 상술한 바와 같다.
보다 구체적으로는, 도입 공정에서는 예를 들면 이하의 1)~3) 중 어느 하나의 「핵산 조합물」이 세포 내에 도입된다. 또한, 「핵산 조합물」이란, 둘 이상의 핵산 분자를 조합시킨 것을 가리키고, 이것들은 혼합된 조성물의 형태를 취하고 있어도 되고, 또는 각각의 보존 용기에 보관되거나 하여 서로 격리된(혼합되어 있지 않은) 형태를 취하고 있어도 된다.
1) 기능성 핵산 분자가 1개의 핵산쇄로 이루어질 경우, 상기 핵산쇄를 구축하기 위한 둘 이상의 상기 「단편」. 모든 핵산 분자가 대략 등량(개수)으로 포함되어 있는 것이 바람직하다.
2) 기능성 핵산 분자가 2개의 핵산쇄로 이루어질 경우, 그 중 1개의 핵산쇄를 구축하기 위한 둘 이상의 상기 「단편」과 다른 1개의 핵산쇄. 모든 핵산 분자가 대략 등량(개수)으로 포함되어 있는 것이 바람직하다.
3) 기능성 핵산 분자가 2개의 핵산쇄로 이루어질 경우, 그 중 1개의 핵산쇄를 구축하기 위한 둘 이상의 상기 「단편」과, 다른 1개의 핵산쇄를 구축하기 위한 둘 이상의 상기 「단편」. 모든 핵산 분자가 대략 등량(개수)으로 포함되어 있는 것이 바람직하다.
핵산 조합물의 도입 대상이 되는 세포는 특별하게 한정되지 않는다. 대상이 되는 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포 모두 된다. 진핵 세포로서는 균류, 식물 및 동물 등으로부터 유래되는 세포를 들 수 있다. 동물 세포로서는 곤충 세포 등의 비포유류 세포 및 포유류 세포를 들 수 있다. 포유류 세포로서는 마우스, 래트, 모르모트 등의 설치류, 토끼, 개, 및 고양이 등의 비인간 동물의 세포 또는 인간의 세포를 들 수 있다. 또한, 세포는 배양 세포여도 되고, 생체 세포(생체 내에 있는 단리되어 있지 않은 세포)여도 된다. 세포의 바람직한 일례는 인간의 배양 세포, 인간의 생체 세포, 비인간 병태 모델 동물의 배양 세포, 비인간 병태 모델 동물의 생체 세포이다.
핵산 조합물의 도입 방법은 특별하게 한정되지 않는다. in vitro에 있어서의 도입 방법으로서는 예를 들면 전기천공법, 현미주입법, 리포펙션법, 및 인산 칼슘법 등을 들 수 있다. in vivo에 있어서의 도입 방법으로서는 예를 들면 국소 투여, 정맥내 투여, 및 유전자총을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 인간 또는 비인간 동물의 생체에 적용할 경우, 안전성의 관점에서 미생물 등을 사용하지 않는 방법이 바람직하다. 또한, in vivo에 있어서의 도입 전에 핵산 조합물을 포함하는 시료를, 투석 또는 pH 조절 등을 행함으로써 생체에 적합하도록 조제하는 것이 바람직하다. 또한, in vivo에 적용할 경우, 필요에 따라서 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합해서 약학적 조성물(예를 들면, 리포솜 제제 등)을 제조해도 된다.
또한, 핵산 조합물을 구성하는 핵산 분자는 모두를 혼합해서 핵산 조성물로 해서 한번의 조작으로 세포 내에 도입해도 되고, 핵산 분자마다 따로 따로 세포 내에 도입해도 된다. 또한, 핵산쇄를 구축하기 위한 둘 이상의 단편을 한번의 조작으로 세포 내에 도입해도 되고, 각각을 따로 따로 세포 내에 도입해도 된다.
(생성 공정)
생성 공정에서는 상기 도입 공정에서 핵산 조합물을 도입한 세포 내에서, 상기 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 둘 이상의 「단편」끼리를 결합시킨다. 즉, 관능기 쌍 사이에서 화학 반응이 진행되어 「대응하는 말단」끼리가 결합(화학 라이게이션 = 비효소적인 라이게이션)됨으로써, 「단편」으로서 주어져 있었던 핵산쇄가 1개의 연속된 핵산쇄로서 구축된다. 아울러, 필요에 따라서 핵산쇄 내 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이제이션과 같은 상호 작용이 생겨 기능성 핵산 분자를 생성한다.
상기 (핵산쇄의 단편의 바람직한 설계의 예)란에서 설명한 케이스에서는, 도 1에 나타내는 바와 같이 도입 공정 후에 하이브리다이제이션에 의한 단편의 적절한 정렬화, 「관능기」의 탈보호, 및 「관능기 쌍」 사이에서의 화학 반응의 진행(화학 라이게이션)이 동시 진행적으로 발생하여 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자가 생성된다.
〔2. 핵산 조합물〕
(핵산 조합물의 개요)
본 발명에 의한 기능성 핵산 분자의 구축법에 사용하는 핵산 조합물(구축용 핵산 조합물)은 기능성 핵산 분자를 구성하는 모든 상기 「핵산쇄」를 구비하여 이루어지고, 상기 「핵산쇄」 중 적어도 1개가 화학 반응에 의해 상호 결합하는 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 둘 이상의 「단편」으로서 포함되어 있는 것이다. 또한, 「핵산 조합물」의 예시는 상기 (도입 공정)란에서 설명한 바와 같다.
(핵산 조합물의 바람직한 형태)
핵산 조합물의 바람직한 형태로는, 상기 「기능성 핵산 분자」는 상기 「핵산쇄」 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 「핵산쇄」 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 갖고, 상기 「단편」끼리의 결합이 상기 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 상기 「단편」이 설계되어 있다.
핵산 조합물의 보다 바람직한 형태로는, 상기 「기능성 핵산 분자」를 구성하는 하이브리다이즈가 가능한 제 1 「핵산쇄」 및 제 2 「핵산쇄」를 구비하는 이들 2개의 「핵산쇄」는 모두, 화학 반응에 의해 상호 결합하는 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 2개의 「단편」으로서 포함되어 있다. 그리고, 「제 1 핵산쇄」를 구성하는 「단편」끼리의 결합과, 「제 2 핵산쇄」를 구성하는 「단편」끼리의 상기 결합이 하이브리다이즈 영역의 다른 개소에서 생기도록, 각각의 단편이 설계되어 있다(도 1 및 실시예도 참조).
핵산 조합물의 더욱 바람직한 형태로는, 상기 「기능성 핵산 분자」를 구성하는 하이브리다이즈가 가능한 「제 1 RNA쇄」와 「제 2 RNA쇄」를 구비하여 이루어지고, 「제 1 RNA쇄」는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 「제 1 단편」와 「제 2 단편」으로서 포함되어 있다. 또한, 「제 2 RNA쇄」는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 「관능기 쌍」을 「대응하는 말단」에 붙인 「제 3 단편」과 「제 4 단편」으로서 포함되어 있다. 그리고, 「제 1 단편」 또는 「제 2 단편」은 「제 3 단편」 및 「제 4 단편」의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하고, 「제 3 단편」 또는 「제 4 단편」은 「제 1 단편」 및 「제 2 단편」의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하다((핵산쇄의 단편의 바람직한 설계의 예)란, 도 1 및 실시예도 참조).
(핵산 조합물의 응용)
본 발명에 의한 핵산 조합물은 그 사용 순서가 기재된 사용 설명서(단, 종이매체는 물론, 전자 매체에 격납된 것도 포함하고 기록 매체는 특별하게 한정되지 않는다)와 함께 패키지화되어 있어도 된다. 상기 사용 설명서에는 예를 들면 상기 (도입 공정)란, (생성 공정)란에서 설명한 바와 같은 핵산 조합물의 사용 설명이 기재된다. 핵산 조합물은 그 용도에 따라 의약, 또는 시약 키트일 수 있다.
〔3. 기타〕
(기능성 핵산 분자의 구축법의 응용)
핵산 조합물은 마우스, 래트, 모르모트 등의 설치류, 토끼, 개, 및 고양이 등의 비인간 동물의 개체 또는 인간의 개체를 치료하기 위해서 사용해도 된다. 즉, 비인간 동물의 개체 또는 인간의 개체에 핵산 조합물을 투여해도 된다. 투여 방법은 상술의 in vivo에 있어서의 도입 방법으로서 예시한 바와 같다.
또한, 마우스, 래트, 모르모트 등의 설치류, 토끼, 개, 고양이 등의 비인간 동물의 개체 또는 인간의 개체에 대한 핵산 조합물의 사용이 제공된다. 또한, 핵산 조합물이 도입되어 있는 세포가 제공된다. 핵산 조합물이 도입되어 있는 세포는 상술의 핵산 조합물을 내부에 유지하고 있다. 핵산 조합물이 도입되어 있는 세포는 그 사용 순서가 기재된 사용 설명서(단, 종이 매체는 물론, 전자 매체에 격납된 것도 포함하고 기록 매체는 특별하게 한정되지 않는다)와 함께 패키지화되어 있어도 된다. 상기 사용 설명서에는 예를 들면 (생성 공정)란에서 설명한 바와 같은 세포의 사용 설명이 기재된다. 세포는 그 용도에 따라 의약, 시약 키트일 수 있다.
〔4. 정리〕
이상과 같이, 본 발명은 이하의 것을 포함하고 있다.
1) 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서, 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편을 세포 내에 도입하는 도입 공정과, 상기 세포 내에서 상기 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성하는 생성 공정을 포함하는 방법.
2) 상기 기능성 핵산 분자는 상기 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 갖고, 상기 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 1)에 기재된 방법.
3) 상기 기능성 핵산 분자는 제 1 핵산쇄 및 제 2 핵산쇄의 2개의 상기 핵산쇄로 이루어지고, 또한 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 상기 하이브리다이즈 영역을 갖고, 상기 2개의 핵산쇄는 모두 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 2개의 단편으로서 세포 내에 도입되는 것이며, 상기 제 1 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합과 상기 제 2 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역의 다른 개소에서 생기는 2)에 기재된 방법.
4) 상기 기능성 핵산 분자는 상기 제 1 핵산쇄로서의 제 1 RNA쇄와 상기 제 2 핵산쇄로서의 제 2 RNA쇄로 이루어지고, 상기 제 1 RNA쇄는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 1 단편과 제 2 단편으로서 세포 내에 도입되는 것이며, 상기 제 2 RNA쇄는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 3 단편과 제 4 단편으로서 세포 내에 도입되는 것이며, 상기 제 1 단편 또는 제 2 단편은 상기 제 3 단편 및 제 4 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하고, 상기 제 3 단편 또는 제 4 단편은 상기 제 1 단편 및 제 2 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능한 3)에 기재된 방법.
5) 상기 기능성 핵산 분자는 세포 내에서 RNA 간섭 작용을 갖는 1)~4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
6) 상기 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍은 친전자성기와 보호기에 의해 보호되어 있는 친핵성기의 조합인 1)~5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
7) 상기 친핵성기는 포스포로티오에이트기인 6)에 기재된 방법.
8) 상기 친전자성기는 요오드아세틸기, 브로모아세틸기 또는 요오드기인 6) 또는 7)에 기재된 방법.
9) 상기 보호기는 상기 세포 내의 내인성 물질, 또는 광 조사에 의해 탈리되는 6)~8) 중 어느 하나에 기재된 방법.
10) 상기 친핵성기가 포스포로티오에이트기일 경우, 상기 보호기가 하기 (a)~(k) 중 어느 하나인 6), 8) 또는 9)에 기재된 방법.
Figure 112014094531124-pct00012
(또한, 상기 식 중에서 R, R' 및 R"는 치환 또는 비치환의 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다. R1 및 R2는 서로 독립하여 수소 원자 또는 탄소수 1~4의 알킬기를 나타내고, n은 1~3의 정수를 나타낸다. 또한, n이 2 또는 3일 때, n개 있는 R1끼리는 서로 달라도 되고, n개 있는 R2끼리는 서로 달라도 된다. 또한 (a), (b), (e), (g), (h), (i), (j), 및 (k) 중 벤젠환 상의 복수의 수소 원자는 서로 독립하여 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다.)
11) 상기 1)~10) 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하는 핵산 조합물로서, 기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 핵산쇄를 구비하여 이루어지고, 상기 핵산쇄 중 적어도 1개가 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편으로서 포함되어 있는 기능성 핵산 분자의 구축용 핵산 조합물.
12) 상기 기능성 핵산 분자는 상기 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어진 하이브리다이즈 영역을 갖고, 상기 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 11)에 기재된 핵산 조합물.
13) 상기 기능성 핵산 분자를 구성하는 하이브리다이즈가 가능한 제 1 핵산쇄 및 제 2 핵산쇄의 2개의 상기 핵산쇄를 구비하여 이루어지고, 상기 2개의 핵산쇄는 모두 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 2개의 단편으로서 포함되어 있고, 상기 제 1 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합과 상기 제 2 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역의 다른 개소에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 12)에 기재된 핵산 조합물.
14) 상기 기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 제 1 핵산쇄로서의 제 1 RNA쇄와 상기 제 2 핵산쇄로서의 제 2 RNA쇄를 구비하여 이루어지고, 상기 제 1 RNA쇄는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 1 단편과 제 2 단편으로서 포함되어 있고, 상기 제 2 RNA쇄는 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 3 단편과 제 4 단편으로서 포함되어 있고, 상기 제 1 단편 또는 제 2 단편은 상기 제 3 단편 및 제 4 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하고, 상기 제 3 단편 또는 제 4 단편은 상기 제 1 단편 및 제 2 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능한 13)에 기재된 핵산 조합물.
이하에 실시예를 나타내고, 본 발명의 실시형태에 대해서 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니고, 세부에 대해서는 여러 가지 형태가 가능한 것은 말할 필요도 없다. 또한, 본 발명은 상술한 실시형태에 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지의 변경이 가능하고, 각각 개시된 기술적 수단을 적당하게 조합시켜서 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 내에 기재된 문헌의 모두가 참고로서 원용된다.
실시예
〔1. RNA의 조제〕
(RNA의 설계 및 합성)
루시페라아제 유전자의 발현을 억제하는 siRNA1(도 2의 (a); 서열 번호 1 및 2)을 바탕으로, 센스쇄 및 안티센스쇄를 각각 3'-PS(포스포로티오에이트） RNA 및 5'-아미노 RNA로 분할해서 RNA의 합성을 행하였다(도 2의 (b); 서열 번호 3 및 4).
3'-PS RNA 및 5'-아미노 RNA는 모두 포스포로아미다이트법에 의거해 DNA 합성기(GeneWorld H8-SE)를 이용하여 합성했다. 아미다이트 시약으로서는 RNA에는 2'-O-TOM 보호체(Glen Research)를 사용하고, 3' 말단의 인산화에는 3'-포스페이트 CPG(Glen Research) 및 침황 시약(Sulfurizing Reagent)(Glen Research)를 사용했다. 또한, 5'-말단의 아미노 dT의 도입에는 5'-아미노 dT 포스포로아미다이트(Glen Research)를 사용했다. RNA의 탈보호는 정법에 따라, 3'-PS RNA 및 5'-아미노 RNA 는 조정제인 채로 다음 반응에 사용했다.
(합성한 RNA의 화학 수식)
상기에서 합성한 센스쇄 및 안티센스쇄에 있어서의 3'-PS RNA를 디페닐디술파이드와 반응시킴으로써 케이지드(Caged) 3'-PS RNA를 합성했다(도 2의 (c)). 또한, 3' 말단의 디술파이드 결합은 세포 내에 도입 후, GSH 등의 생체 내 티올원에 의해 탈리가 진행된다. 3'-PS RNA의 디술파이드화는 표 1의 조성으로 조제한 혼합액을 실온에서 6시간 인큐베이트함으로써 행하였다.
Figure 112014094531124-pct00013
또한, 센스쇄 및 안티센스쇄에 있어서의 5'-아미노 RNA를 요오드아세트산 N-숙신이미딜과 반응시킴으로써 요오드아세틸 RNA를 합성했다(도 2의 (d)). 5'-아미노 RNA의 요오드아세틸화는 표 2의 조성으로 조제한 혼합액을 실온에서 2시간 인큐베이트함으로써 행하였다.
Figure 112014094531124-pct00014
(비교를 위해 사용하는 RNA의 조제)
비수식 siRNA(25mer : 도 2의 (a)에 나타내는 서열)를 3'-PS RNA 및 5'-아미노 RNA의 합성과 마찬가지로, 포스포로아미다이트법에 의거해 DNA 합성기 (GeneWorld H8-SE)를 이용하여 합성하고, 변성 폴리아크릴아미드겔에 의해 완전 쇄장의 생성물을 정제했다.
또한, 센스쇄 및 안티센스쇄에 있어서의 5'-아미노 RNA를 아세트산 나트륨과 반응시킴으로써 3'-PS RNA와의 반응성을 갖지 않는 아세틸 RNA를 합성했다(도 2의 (e)). 5'-아미노 RNA의 아세틸화는 표 3의 조성으로 조제한 혼합액을 실온에서 2시간 인큐베이트함으로써 행하였다.
Figure 112014094531124-pct00015
또한, 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA가 라이게이션했을 경우에 생성되는 라이게이션된(ligated) siRNA에 대해서도, 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA를 in vitro(무세포계)에 있어서 라이게이션함으로써 합성했다(도 2의 (ｆ); 서열 번호 5 및 6).
상기에서 합성한 케이지드 3'-PS RNA, 요오드아세틸 RNA, 아세틸 RNA, 및 라이게이션된 siRNA를 HPLC(B. conc. 0~40%, A액 : 50mM TEAA, 5% 아세토니트릴 in H2O, B액 : 100% 아세토니트릴)에 의해 해석해 정제했다. 그 후, Sep-Pak 카트리지를 이용하여 탈염(50% 아세토니트릴수 6mL에 의해 용출)하고, 원심 이배퍼레이터를 이용하여 농축했다. 얻어진 RNA를 초순수에 용해하고, 적당하게 희석 후 UV 흡수 스펙트럼을 측정하고, 용액 농도를 정량했다.
〔2. in vitro(무세포계)에 있어서의 라이게이션의 확인〕
(방법)
in vitro에 있어서, 케이지드 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA의 라이게이션이 행하여지는 것을 확인하기 위해서, 표 4의 조성으로 반응을 행하였다. 표 4 내의 레인 5는 GSH를 첨가하지 않는 컨트롤이다.
Figure 112014094531124-pct00016
또한, HBSS의 조성은 1.8mM CaCl2, 0.49mM MgCl2, 0.41mM MgSO4, pH7.4이다.
상기 혼합액을 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 로딩 버퍼(100% 포름아미드, 0.5% XC)를 추가해 90℃에서 5분간 인큐베이션했다. 반응액을 20% 변성 아크릴아미드겔로 영동하고, CYBR Green Ⅱ로 30분간 염색함으로써 분석했다. 마커로서 레인 1에는 25mer의 RNA쇄, 레인 2에는 19mer의 케이지드 3'-PS RNA(센스쇄), 레인 3에는 18mer의 케이지드 3'-PS RNA(안티센스쇄)를 마찬가지로 로드했다.
(결과)
영동의 결과를 도 3에 나타낸다. 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA의 라이게이션이 진행되고, 25mer의 RNA쇄가 생성된 것을 확인할 수 있었다(레인 4).
또한, 센스쇄만의 케이지드 3'-PS RNA 4㎕ 및 요오드아세틸 RNA 4㎕에 GSH 2㎕를 추가해서 마찬가지로 라이게이션 반응시킨 경우에도, 25mer의 단일쇄인 RNA쇄가 생성됐다.
〔3. 포유 동물 배양 세포계를 사용한 RNA 간섭 효과의 측정 1〕
(방법)
HeLa-Luc 세포(Caliper(PerkinElmer company)로부터 구입)를 10% FBS를 포함하는 DMEM(Wako제) 배지 중 37℃, 5% CO2 하에서 배양하고, 96웰 플레이트에 100㎕씩, 4.0×103cells/웰이 되도록 분주했다. 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 더 배양하고, 약 60% 융합의 상태에서 각종 RNA(센스쇄 및 안티센스쇄의 3'-PS RNA 및 요오드아세틸 RNA)를 트랜스펙션 시약 Gene Silencer(Genlantis제)를 사용하여 트랜스펙션 시약 첨부의 프로토콜에 따라 코트랜스펙션했다. RNA의 농도는 25, 50 또는 100nM로 했다.
구체적으로는, 세포에 50㎕의 HBSS(+)를 첨가한 상태에서, 하기의 트랜스펙션용 혼합 용액을 첨가함으로써 행하였다. 트랜스펙션용 혼합 용액의 조성은 표 5와 같다.
Figure 112014094531124-pct00017
트랜스펙션 후, 37℃, 5% CO2 하에서 6시간 인큐베이트하고, 미디움을 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교환했다. 37℃에서 18시간 더 인큐베이트 후, 루시페라아제 어세이 시스템(프로메가제)을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라 루시페라아제 발현량을 정량했다(조건 : 시약량 50㎕, 지연시간 2초, 판독시간 10초, 기기 : Muthras LB 940(BERTHOLD제)).
비교로서 스크램블(25nM), 비수식 siRNA(25nM), 라이게이션된 siRNA(25nM), 케이지드 3'-PS RNA + 아세틸 RNA(25nM, 50nM 또는 100nM), 케이지드 3'-PS RNA만(100nM), 요오드아세틸 RNA만(100nM), 및 아세틸 RNA만(100nM)을 상기와 마찬가지로 트랜스펙션하고, 루시페라아제 발현량을 정량했다.
(결과)
루시페라아제 유전자 발현의 결과를 도 4에 나타낸다. 비라이게이션된 케이지드 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA(IA)를 세포 내에 도입했을 경우에는, 루시페라아제 유전자의 발현이 낮고, 충분한 저해 활성이 관찰되었다. 한편, 비라이게이션된 케이지드 3'-PS RNA와 아세틸 RNA(Ac)를 도입했을 경우에는 저해 활성이 관찰되지 않았다. 이 결과는, 세포 내에서 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA의 라이게이션 반응에 의해 라이게이션된 siRNA가 생성되어 유전자 발현을 억제한 것을 시사하고 있다.
이와 같이, 기능성 RNA를 단편으로 해서 세포 내에 도입하고, 세포 내에서 기능성 RNA를 구축하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔4. 포유 동물 배양 세포계를 사용한 RNA 간섭 효과의 측정 2(침투압 쇼크에 의한 트랜스펙션)〕
(방법)
HeLa-Luc 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM(Wako제) 배지 중, 37℃, 5% CO2 하에서 배양하고, 약 60% 융합 상태에서 회수하여 PBS로 세정했다. 이어서, 고장 버퍼(hypertonic buffer)와 각종 RNA(센스쇄 및 안티센스쇄의 3'-PS RNA 및 요오드아세틸 RNA)의 혼합액(10㎕)으로 세포를 현탁하고, 37℃에서 10분간 인큐베이트했다. 거기에 멸균수(52.9㎕)를 첨가하고, 37℃에서 10분간 더 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 회수하고, PBS로 세정했다. 이어서, 회수한 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM(400㎕)으로 현탁하고, 96웰 플레이트에 100㎕씩 분주했다. 고장 버퍼의 조성은 HBSS 버퍼 중 2.1M 수우크로스, 7.5% PEG(2000), 150mM HEPES(pH7.3)이다. 고장 버퍼와 각종 RNA의 혼합액(10㎕)의 조성은 표 6 과 같다.
Figure 112014094531124-pct00018
트랜스펙션 후, 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 인큐베이트하고, 루시페라아제 어세이 시스템(프로메가제)을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라 루시페라아제 발현량을 정량했다(조건 : 시약량 30㎕, 지연시간 2초, 판독시간 10초, 기기 : Muthras LB 940(BERTHOLD제)). 또한, BCA 프로테인 어세이 키트(Thermo Scientific제)를 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라 단백질 양을 정량하고, 루시페라아제 발현량을 보정했다.
비교로서, 스크램블 및 비수식 siRNA를 상기와 마찬가지로 트랜스펙션하고, 루시페라아제 발현량을 정량 및 보정했다.
(결과)
루시페라아제 유전자 발현의 결과를 도 5에 나타낸다. 비라이게이션된 케이지드 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA(IA)를 세포 내에 도입했을 경우에는, 비수식 siRNA를 세포 내에 도입했을 경우와 비교하여 루시페라아제 유전자의 발현이 낮고, 보다 저해되어 있는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 siRNA를 케이지드 3'-PS RNA와 IA에 단편화해서 도입함으로써 세포막 투과성이 향상된 것을 시사하고 있다.
이와 같이, 기능성 RNA를 단편으로 해서 세포 내에 도입함으로써 세포막 투과성을 향상시켜, 보다 다량의 기능성 RNA를 세포 내에 효율적으로 도입하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔5. 포유 동물 배양 세포계를 사용한 면역 응답 측정〕
(방법)
T98G 세포(리카가쿠켄큐쇼 바이오리소스센터로부터 입수)를 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640(Wako제) 배지 중 37℃, 5% CO2 하에서 배양하고, 24웰 플레이트에 300㎕씩, 4.0×104cells/웰이 되도록 분주했다. 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 더 배양하고, 약 70% 융합 상태에서 각종 RNA(센스쇄 및 안티센스쇄의 3'-PS RNA 및 요오드아세틸 RNA)를 트랜스펙션 시약 리포펙타민 2000(invitrogen제)을 사용하여 트랜스펙션 시약 첨부의 프로토콜에 따라 코트랜스펙션했다. 비교로서, RNA 없음, 폴리 I:C, 비수식 siRNA를 마찬가지로 트랜스펙션했다. RNA의 농도는 100nM(최종 용량 300㎕)로 했다. 트랜스펙션용 혼합 용액의 조성은 표 7과 같다.
Figure 112014094531124-pct00019
트랜스펙션 후, 37℃, 5% CO2 하에서 6시간 인큐베이트하고, 20% 세럼을 포함하는 RPMI-1640 배지 300㎕를 각 웰에 첨가했다. 37℃에서 18시간 더 인큐베이트 후, ISOGEN(니폰·진제)을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라, 총 RNA를 회수했다. 회수한 RNA 및 One Step PrimeScript(등록상표）RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(Takara제)를 이용하여, IFN-β 및 β-액틴의 발현량을 측정했다. 얻어진 결과로부터 ΔΔCt법을 이용하여 IFN-β 발현량을 β-액틴 발현량으로 보정하고, 상대적인 IFN-β 발현량을 산출했다. 실시간 PCR에 사용한 반응액의 조성은 표 8과 같다. 또한, 실시간 PCR의 반응 조건은 표 9와 같다.
Figure 112014094531124-pct00020
Figure 112014094531124-pct00021
(결과)
결과를 도 6에 나타낸다. RNA를 트랜스펙션하지 않은 네거티브 컨트롤(NC)과 비교하여, siRNA 또는 폴리 I:C를 세포 내에 도입했을 경우에는 IFN-β의 발현량의 증가가 확인되었다. 한편, 비라이게이션된 케이지드 3'-PS RNA와 요오드아세틸 RNA(IA)를 세포 내에 도입했을 경우에는, IFN-β의 발현량의 변화는 관찰되지 않았다. 이 결과는, siRNA를 단편으로서 세포 내에 도입함으로써 단편화되어 있지 않은 siRNA에 의해 유도되는 면역 응답을 회피 가능한 것을 나타내고 있다.
이와 같이, 기능성 RNA를 단편으로서 세포 내에 도입함으로써 단편화되어 있지 않은 기능성 RNA에 의해 유도되는 면역 응답을 회피 가능한 것이 명확해졌다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명은 기능성 핵산 분자를 사용한 의약 및 시약 등의 분야에 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> method for constructing nucleic acid molecule, and combination of nucleic acid for the method <130> RK1864PCT <150> JP 2012-047367 <151> 2012-03-02 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Firefly <400> 1 ccucauagaa cugccugcgu gagau 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Firefly <400> 2 aucucacgca ggcaguucua ugagg 25 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> 1-18:RNA, 19:DNA <400> 3 ccucauagaa cugccugcg 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> 1-17:RNA, 18:DNA <400> 4 aucucacgca ggcaguuc 18 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> 1-18:RNA, 19-20:DNA, 21-25:RNA <400> 5 ccucauagaa cugccugcgt gagau 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> 1-17:RNA, 18-19:DNA, 20-25:RNA <400> 6 aucucacgca ggcaguucta ugagg 25

Claims (14)

1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자의 구축법으로서,
세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편을, 인간의 생체(in vivo) 세포를 제외한 세포 내에 도입하는 도입 공정과,
상기 세포 내에서 상기 관능기끼리를 반응시켜서 단편끼리를 결합하여 1개 또는 2개의 핵산쇄로 이루어진 기능성 핵산 분자를 생성하는 생성 공정을 포함하고,
상기 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍은, 친전자성기와 보호기에 의해 보호되어 있는 친핵성기의 조합인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자는 상기 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 갖고,
상기 단편끼리의 상기 결합은 상기 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자는 제 1 핵산쇄 및 제 2 핵산쇄의 2개의 상기 핵산쇄로 이루어지고, 또한 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 상기 하이브리다이즈 영역을 갖고,
상기 2개의 핵산쇄는 모두 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 2개의 단편으로서, 인간의 생체(in vivo) 세포를 제외한 세포 내에 도입되는 것이고,
상기 제 1 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합과, 상기 제 2 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역의 다른 개소에서 생기는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자는 상기 제 1 핵산쇄로서의 제 1 RNA쇄와 상기 제 2 핵산쇄로서의 제 2 RNA쇄로 이루어지고,
상기 제 1 RNA쇄는 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 1 단편과 제 2 단편으로서, 인간의 생체(in vivo) 세포를 제외한 세포 내에 도입되는 것이며,
상기 제 2 RNA쇄는 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 3 단편과 제 4 단편으로서, 인간의 생체(in vivo) 세포를 제외한 세포 내에 도입되는 것이며,
상기 제 1 단편 또는 제 2 단편은 상기 제 3 단편 및 제 4 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하고, 상기 제 3 단편 또는 제 4 단편은 상기 제 1 단편 및 제 2 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자는 세포 내에서 RNA 간섭 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 친핵성기는 포스포로티오에이트기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 친전자성기는 요오드아세틸기, 브로모아세틸기 또는 요오드기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 보호기는 상기 세포 내의 내인성 물질, 또는 광 조사에 의해 탈리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 친핵성기가 포스포로티오에이트기일 경우, 상기 보호기가 하기 (a)~(k) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
Figure 112019049446573-pct00029

(또한, 상기 식 중에서 R, R' 및 R"은 치환 또는 비치환의 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다. R1 및 R2는 서로 독립하여 수소 원자 또는 탄소수 1~4의 알킬기를 나타내고, n은 1~3의 정수를 나타낸다. 또한, n이 2 또는 3일 때, n개 있는 R1끼리는 서로 달라도 되고, n개 있는 R2끼리는 서로 달라도 된다. 또한, (a), (b), (e), (g), (h), (i), (j), 및 (k) 중 벤젠환 상의 복수의 수소 원자는 서로 독립하여 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다.)
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하는 핵산 조합물로서,
기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 핵산쇄를 구비하여 이루어지고, 상기 핵산쇄 중 적어도 1개가 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 둘 이상의 단편으로서 포함되어 있고,
상기 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍은, 친전자성기와 보호기에 의해 보호되어 있는 친핵성기의 조합인, 기능성 핵산 분자의 구축용 핵산 조합물.
제 11 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자는 상기 핵산쇄 내에서 하이브리다이즈하거나, 또는 다른 핵산쇄 사이에서 하이브리다이즈해서 이루어지는 하이브리다이즈 영역을 갖고,
상기 단편끼리의 상기 결합이 상기 하이브리다이즈 영역에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 조합물.
제 12 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자를 구성하는 하이브리다이즈가 가능한 제 1 핵산쇄 및 제 2 핵산쇄의 2개의 상기 핵산쇄를 구비하여 이루어지고,
상기 2개의 핵산쇄는 모두 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 2개의 단편으로서 포함되어 있고,
상기 제 1 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합과 상기 제 2 핵산쇄를 구성하는 단편끼리의 상기 결합은, 상기 하이브리다이즈 영역의 다른 개소에서 생기도록 상기 단편이 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 조합물.
제 13 항에 있어서,
상기 기능성 핵산 분자를 구성하는 상기 제 1 핵산쇄로서의 제 1 RNA쇄와 상기 제 2 핵산쇄로서의 제 2 RNA쇄를 구비하여 이루어지고,
상기 제 1 RNA쇄는 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 1 단편과 제 2 단편으로서 포함되어 있고,
상기 제 2 RNA쇄는 세포 내 화학 반응에 의해 상호 결합하는 관능기 쌍을 대응하는 말단에 붙인 제 3 단편과 제 4 단편으로서 포함되어 있고,
상기 제 1 단편 또는 제 2 단편은 상기 제 3 단편 및 제 4 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능하고, 상기 제 3 단편 또는 제 4 단편은 상기 제 1 단편 및 제 2 단편의 쌍방과 하이브리다이즈 가능한 것을 특징으로 하는 핵산 조합물.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6296434B2 (ja) * 2013-01-25 2018-03-20 国立研究開発法人理化学研究所 機能性核酸分子の構築法
JP6703948B2 (ja) * 2014-08-26 2020-06-03 国立研究開発法人科学技術振興機構 非酵素的核酸鎖結合方法
EP3617314B1 (en) * 2017-04-28 2023-02-15 Kyowa Kirin Co., Ltd. Oligonucleotide derivative or salt thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004515245A (ja) 2000-12-13 2004-05-27 ボーリアン ファーマ アクティーゼルスカブ Ｃ型レクチン様ドメインの骨格構造を有する蛋白質のコンビナトリアルライブラリ
JP2006518450A (ja) 2003-01-16 2006-08-10 フーベルト・ケスター 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
US6184037B1 (en) * 1996-05-17 2001-02-06 Genemedicine, Inc. Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
JP2008259453A (ja) * 2007-04-12 2008-10-30 Toyobo Co Ltd 核酸の検出方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004515245A (ja) 2000-12-13 2004-05-27 ボーリアン ファーマ アクティーゼルスカブ Ｃ型レクチン様ドメインの骨格構造を有する蛋白質のコンビナトリアルライブラリ
JP2006518450A (ja) 2003-01-16 2006-08-10 フーベルト・ケスター 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical Communications,제50권,11호,1284-87면 (2014.02.09)
The FEBS Journal,277권,23호,4814-4827면(2010.12.)

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