JP2006518450A - 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書では、Kosterらによる2003年1月16日出願の標題「CAPTURE COMPOUNDS, COLLECTIONS THEREOF AND METHODS FOR ANALYZING THE PROTEOME AND COMPLEX COMPOSITIONS.」、米国仮特許出願番号60/441,398の優先権を主張する。米国の国内段階のため、および適切な場合には、上記引用出願は引用により本願明細書にすべて含める。
本明細書では生体分子を特異的かつ選択的に分析するための化合物およびその化合物の使用方法が提供される。詳細には、化合物および方法はプロテオームの分析に有用である。
疾病機序の理解ならびに治療的および予防的処置の開発は、今世紀の間に、経験的な知見および実験法からゲノムの広範な突然変異スキャニングへと発展してきた。ゲノムの変化は、疾病のゲノム機序を探すツールを研究者に提供してきた。ヒトゲノムへの取り組みによって、30億塩基対のヒトゲノムの生の配列が得られ、約35,000個の遺伝子が明らかにされた。異なる個体間および集団内および集団間での遺伝子差異が、疾病の素因との関連または薬効および/または副作用との相関を調べるために研究されている。遺伝子マーカーのパネルに基づく個別的な医薬という期待は、医療界をじらしてきたが、医療提供者および患者に診断および治療の選択肢を提供することに重きをおくものには重要な目標を提供している。
本明細書ではプロテオームをハイスループット形式で工業レベルで分析するための方法、捕獲化合物(本明細書では捕獲剤とも呼ぶ)、およびその収集物を提供する。この方法、捕獲化合物および収集物により、生体分子の複合混合物を選別することができる。さらに、それらにより、疾病状態などの特定の表現型を予測するかまたはその指標であるタンパク質構造を同定することができ、それによってランダムSNP分析、発現プロファイリングおよびタンパク質分析法の必要性がなくなる。捕獲化合物、収集物および方法は種々の異なる捕獲剤を提供することによって複合混合物を選別する。さらに、それらを使用して、特定の疾病状態のマーカーとして作用する構造「エピトープ」を同定すること、特定の表現型に関連して個体集団を層別化すること、分子の機能の基礎をなすタンパク質をより詳細に理解すること、および薬剤開発のための標的を提供することができる。標的タンパク質についての理解が増せば、より効率のよい治療薬の設計が可能となる。
図1は、タンパク質の混合物のハイブリダイゼーション、分離および質量スペクトル分析を示す図である。
A.定義
特に断りのない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書の全開示内容を通じて参照された、すべての特許、特許出願、公開出願および出版物、Genbank配列、ウェブサイトおよび他の公開材料は、特に断りのない限り、その全体を参照により組み入れる。本明細書において用語に複数の定義が存在する場合には、この節における定義が優先する。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合には、そのような識別子が変化していたり、インターネット上で特定の情報が定まらないこともあるが、インターネットを検索することによって同等の情報を見出すことはできるということは理解されよう。それを参照することによって、そのような情報の利用の可能性および公に対する普及が証明される。
表1
対応表
1)高ストリンジェンシー:0.1×SSPE、0.1% SDS、65℃
2)中程度のストリンジェンシー:0.2×SSPE、0.1% SDS、50℃
3)低ストリンジェンシー:1.0×SSPE、0.1% SDS、50℃
生体分子、特に、限定するものではないが、細胞溶解物または細胞溶解物からインビトロ翻訳されたポリペプチドなどのサンプル中の生体分子と選択的に結合する捕獲化合物の収集物を提供する。収集物中の各捕獲化合物は特定の群またはクラスの生物ポリマーに結合することができ、サンプル中の全生体分子のサブセットと共有結合または強固に(例えば、質量スペクトル分析による分析に耐えるのに十分に)結合するよう設計されている。例えば、サンプルは1000種のメンバー、例えば、細胞溶解物を含み得る。化合物の収集物は十分な選択性を可能にし、その結果、サンプルのうちの約10〜20種の構成要素が収集物の各メンバーと結合する。正確な数はそれらを同定するための、通常は一段階の、日常的に行われている分析(例えば、質量スペクトル分析)に十分に少ない数である。
捕獲化合物(捕獲剤とも呼ぶ)を提供する。捕獲化合物は1以上の反応性官能基「X」と、必要に応じて少なくとも選択性官能基「Y」および/または選別官能基「Q」およびまた、必要に応じて1以上の溶解性官能基「W」を提示するコア「Z」含む。分子には、さらに、切断可能なリンカーおよび他の官能基も含まれる。官能基がコアまたは足場上に提示される特定の様式が設計選択の重大事であるが、得られる分子が生体分子、特にタンパク質を十分な特異性で、かつ、共有結合か十分な安定性もしくは親和性の結合のいずれかで捕獲し、MALDI質量スペクトル分析をはじめとする質量分析計などによる分析を可能にし、その結果、結合した生体分子の少なくとも一部が結合したままにする(一般に、109、1010、1011、リットル/モル以上の結合親和性、または109、1010、1011、1012以上のKeq)という特性を有するよう選択される。
一般に、すべての化合物は、炭素などの1個の原子であっても、官能基を提示するための官能基を含む。本明細書における特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に用いる捕獲化合物に関しては、Zは、限定されるものではないがタンパク質をはじめとする生体分子の化学構造を変更することなく、生体分子の質量スペクトル分析をはじめとする分析の前またはその間に切断することができる部分である。
そのような1つの実施形態では、ZはMALDI-TOF質量分析計に用いられるレーザーによって切断される光切断が可能な基である。別の実施形態では、Zはハイブリダイズされるなどによって整列させられた化合物−生体分子結合体への質量スペクトル分析のためのマトリックスの適用の際に、または分析の前に蒸気または液体の形態の酸(例えば、トリフルオロ酢酸または塩酸)に曝露することによって切断される酸不安定性基である。この実施形態では、マトリックスがアレイの空間的完全性を維持し、このことによってアレイのアドレス可能な分析が可能となる。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に用いる捕獲化合物は生体分子の、限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型(MALDI-TOF)質量スペクトルなどの質量分析計をはじめとする分析に用いられる条件下で切断されないZ部分を含む。これらの実施形態の捕獲化合物は、例えば、その混合物中の生体分子を同定するための、タンパク質−タンパク質をはじめとする生体分子−生体分子相互作用を調べるための、およびタンパク質−薬剤またはタンパク質−薬剤候補をはじめとする生体分子−小分子相互作用を決定するための本明細書で提供する方法に用いることができる。これらの実施形態では、Z基は分析のために必ずしも切断されるわけではない。
1つの実施形態では、Zは、切断できるか切断できない多価または二価の基であり、一般に、50以下の、または20未満のメンバーを含み、直鎖または分枝鎖アルキレン、直鎖または分枝鎖アルケニレン、直鎖または分枝鎖アルキニレン、直鎖または分枝鎖アルキレンオキシ、直鎖または分枝鎖アルキレンチオ、直鎖または分枝鎖アルキレンカルボニル、直鎖または分枝鎖アルキレンアミノ、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、シクロアルキレンオキシ、シクロアルキレンチオ、シクロアルキレンカルボニル、シクロアルキレンアミノ、ヘテロシクリレン、アリーレン、アリーレンオキシ、アリーレンチオ、アリーレンカルボニル、アリーレンアミノ、ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレンオキシ、ヘテロアリーレンチオ、ヘテロアリーレンカルボニル、ヘテロアリーレンアミノ、オキシ、チオ、カルボニル、カルボニルオキシ、エステル、アミノ、アミド、ホスフィノ、ホスフィンオキシド、ホスホルアミダート、ホスフィンアミダート、スルホンアミド、スルホニル、スルホキシド、カルバマート、ウレイドおよびこれらの組み合わせから選択され、必要に応じて、1、2、3または4個を含む1個以上の、本明細書の別の場所に記載したYから選択される置換基で各々独立に置換されていてもよい。
式中、u、vおよびxは各々独立に0〜5であり、
各dは独立に1〜20または1〜12または1〜6または1〜3の整数であり、
各wは独立に1〜6または1〜3または1〜2から選択される整数であり、そして
各R15は独立に直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アリールアルキル、直鎖または分枝鎖アリールアルケニル、直鎖または分枝鎖アリールアルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖ヘテロアリールアルキル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルキニル、ハロ、直鎖または分枝鎖ハロアルキル、シュードハロ、アジド、シアノ、ニトロ、OR60、NR60R61、COOR60、C(O)R60、C(O)NR60R61、S(O)qR60、S(O)qOR60、S(O)qNR60R61、NR60C(O)R61、NR60C(O)NR60R61、NR60S(O)qR60、SiR60R61R62、P(R60)2、P(O)(R60)2、P(OR60)2、P(O)(OR60)2、P(O)(OR60)(R61)およびP(O)NR60R61から選択される一価の基であり、
qは0〜2の整数であり、
R60、R61、R62は各々独立に水素、直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニルまたは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
各R15は水素およびVR18からなる群から独立に選択される一価の基であり、
各Vは独立に以下の群:直接結合、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、>C(R17)2、C(R17)=C(R17)、>C=C(R23)(R24)、>C(R23)(R24)、C≡C、O、>S(A)u、>P(D)v(R17)、>P(D)v(ER17)、>N(R17)、>N(COR17)、>N+(R23)(R24)、>Si(R17)2および>C(E)のいずれかの組み合わせを有する二価の基であり(式中、uは0、1または2であり、vは0、1、2または3であり、AはOまたはNR17であり、DはSまたはOであり、EはS、OまたはNR17である)、その群はどの順序で組み合わせてもよく、
R17およびR18は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、SiR27R28R25、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20からなる群から選択され、
R19およびR20は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびヘテロシクリルから選択され、
R23およびR24は以下の(i)または(ii)から選択され、
(i)R23およびR24は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択されるか、または
(ii)R23およびR24はともにアルキレン、アルケニレンまたはシクロアルキレンを形成し、
R25、R27およびR28は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20から選択される一価の基であり、
R15、R17、R18、R19、R20、R23、R24、R25、R27およびR28は、Z2から各々独立に選択される1以上の置換基で置換されていてもよく、Z2はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、S(O)hR35(ここで、hは0、1または2である)、NR35R36、COOR35、COR35、CONR35R36、OC(O)NR35R36、N(R35)C(O)R36、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアラルキル、 ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、アルコキシカルボニル、カルボキシアリール、ハロ、シュードハロ、ハロアルキルおよびカルボキサミドから選択され、
R35およびR36は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリル、トリアリールシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アミノ、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノおよびアリールアミノの中から選択される。
1つの実施形態では、Zは切断可能な多価または二価部分であり、かつ、次式:(S1)tM(R15)a(S2)bLを有し、
式中、S1およびS2はスペーサー部分であり、tおよびbは各々独立に0または1であり、Mは2以上の結合点(すなわち、二価以上の結合価)、特定の実施形態では、2〜6の結合点(すなわち、二価〜六価)、他の実施形態では2、3、4または5の結合点(すなわち、二価、三価、四価または五価)を含む中心部分であり、R15は上記のとおりであり、aは0〜4、特定の実施形態では、0、1または2であり、Lはタンパク質などの生体分子の化学構造を変更することなく、生体分子の、質量スペクトル分析をはじめとする分析の前またはその間に切断可能な結合である。
特定の実施形態では、Mはアルキレン、フェニレン、ビフェニレンまたは多価または二価のヘテロ二官能性トリチル誘導体である。Mは非置換であるか、または各々独立にR15から選択される1〜4個の基で置換されている。
必要に応じて、スペーサー領域S1および/またはS2は、例えば、大きな生体分子の表面との反応における立体障害を減少させるため、および/または、選別を容易にするために、化合物の中心部分M(Zに連結されている)の片側または両側に存在させることができる。これらは、通常、捕獲化合物の、および/または捕獲化合物/生体分子複合体の所望の官能特性を変更することなく、間隔を提供するあらゆる基であることができる。当業者は、本明細書の開示内容を考慮して、適切なスペーサーを容易に選択することができる。例示的なスペーサーを以下に示す。
特定の実施形態では、切断可能な基Lをタンパク質などの生体分子の分析の前またはその間のいずれかで切断する。分析は質量スペクトル分析、例えば、MALDI-TOF質量スペクトル分析を含み得る。切断可能な基Lは、基が、生体分子への結合および選別、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドQ部分の相補鎖とのハイブリダイゼーションおよびハイブリッドの洗浄の間は安定であるが、限定されるものではないが、質量スペクトル分析、例えば、MALDI-TOF分析をはじめとする生体分子の分析条件下での切断に敏感であるよう選択する。特定の実施形態では、切断可能な基Lは、化合物(ここで、XはSHである)の、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の表面のシステイン残基のチオール側鎖との反応によって生じたジスルフィド部分であり得る。得られるジスルフィド結合は、限定されるものではないが、ジチオスレイトールおよび2−メルカプトエタノールでの処理をはじめとする種々の還元条件下で切断され得る。
別の実施形態では、Zは切断できない二価部分であり、式:(S1)tM(R15)a(S2)bを有する。式中、S1、M、R15、S2、t、aおよびbは上記で定義した通りである。
別の実施形態では、Zは、複数のQおよびX部分と結合している樹状構造を有する(すなわち、Zは多価デンドリマーである)。特定の実施形態では、Zは約4〜約6、約8、約10、約20、約40、約60以上の結合点を含む(すなわち、Zは四価から六価、八価、十価、二十価、四十価、六十価などである)。これらの実施形態では、樹状部分Zは、上記で定義したような多価のコアMをベースとする。M上の結合点の数は約2から約4、約6、約8、またはそれ以上にまで変動し得る。したがって、1つの実施形態では、Zは以下の構造を有する:
他の実施形態では、Zは、表面が官能基(X、Y、Qおよび必要に応じてW)を提示するような、シリコンまたは他の「ビーズ」または微粒子などの粒状の固体支持体または固体表面などの不溶性支持体または基質であってもよい。これらの実施形態では、Zはその1つまたは複数の(通常は1〜100個、一般的には1〜10個)X部分と、場合によっては少なくとも1個のQおよび/またはY部分、ならびに必要に応じて1個以上のW部分とも結合している。これらの実施形態では、Zは、その表面に10〜100、1000、百万、またはそれ以上の官能性部分(基)を含む場合もある。例えば、捕獲化合物は、その上に基が提示されている、シリコン粒子またはアガロースまたは他の粒子であってもよい。以下で論じるように、さらに、脂質二重層または、例えば、リポソームを作製するために用いられる他の脂質などの疎水性物質でコーティングしてもよい。そのような実施形態では、疎水性表面および必要に応じて疎水性W基を有する得られた粒子を、細胞膜環境および他の細胞内環境をプローブする方法に用いる。細胞を穏やかに溶解させることによって、細胞内区画およびオルガネラを露出させ、こういった疎水性捕獲化合物をそれらと反応させ、そして結合した生体分子を、例えば、質量分析によって評価することができ、あるいは、区画およびオルガネラの内容物を放出するようにさらに処理して、この捕獲化合物または他の捕獲化合物と反応させることもできる。
Zが切断可能な部分である実施形態をはじめとする他の実施形態では、Zは質量改変タグを含む。特定の実施形態では、質量改変タグを切断可能なリンカーLに結合させる。1つの実施形態では、質量が改変されたZ部分は式:(S1)tM(R15)a(S2)bLTを有する。ここで、S1、t、M、R15、a、S2、bおよびLは上記のように選択され、Tは質量改変タグである。本明細書で用いる質量改変タグとして、限定されるものではないが、式X1R10で表される基が挙げられる。ここで、X1はO、OC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(S)NH、OP(O−アルキル)O、OSO2O、OC(O)CH2S、S、NHおよび
反応性官能基(「X」)は、生体分子、特に、その表面に翻訳後に付加された基をはじめとする官能基を含むタンパク質に対して、共有結合するかまたは高い親和性(109より大きい、一般的には1010または1011リットル/モルよりも大きい、通常はモノクローナル抗体よりも大きく、通常はMALDI-TOFなどの質量スペクトル分析について安定である)で結合する能力を化合物に付与する。一般的には、結合は共有結合であるか、MALDI-TOFをはじめとする質量スペクトル分析などの分析条件下で安定であるような親和性のものである。例示的な基を本明細書に示す(例えば、図16および以下の議論を参照)。更なる基には、活性化されるまで、タンパク質のような生体分子との反応に対し不活性である基が含まれる。その基には光活性化可能な基が含まれ、以下に限らないが、アジドおよびジアジリン基が含まれる。他の実施態様では、活性エステル(例えば、NHS)は、酸性条件下、反応性基として使用される。活性エステルは、これらの条件下、アミン基との反応に対し不活性であるが、pHを上昇させることにより反応する。
(i)メチル、置換メチル(メトキシメチル、メチルチオメチル、(フェニルジメチルシリル)メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、p−メトキシベンジルオキシメチル、p−ニトロベンジルオキシメチル、o−ニトロベンジルオキシメチル、(4−メトキシフェノキシ)メチル、グアヤコールメチル、t−ブトキシメチル、4−ペンテニルオキシメチル、シロキシメチル、2−メトキシエトキシメチル、2,2,2,−トリクロロエトキシメチル、ビス(2−クロロエトキシメチル)、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル、メントキシメチル、テトラヒドロピラニル、3−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、1−メトキシシクロヘキシル、4−メトキシテトラヒドロピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニルS,S−ジオキサイド、1−[(2−クロロ−4−メチル)フェニル]−4−メトキシピペリジン−4−イル、1−(2−フルオロフェニル)−4−メトキシピペリジン−4−イル、1,4−ジオキサン−2−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、2,3,3a,4,5,6,7,7a−オクタヒドロ−7,8,8−トリメチル−4,7−メタノベンゾフラン−2−イル)、置換エチル(1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、1−[2−(トリメチルシリル)エトキシ]エチル、1−メチル−1−メトキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシ−2−フルオロエチル、1−メチル−1−フェノキシエチル、2,2,2−トリクロロエチル、1,1−ジアニシル−2,2,2−トリクロロエチル、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−フェニルイソプロピル、2−トリメチルシリルエチル、2−(ベンジルチオ)エチル、2−(フェニルセレニル)エチル)、t−ブチル、アリル、プロパルギル、p−クロロフェニル、p−メトキシフェニル、p−ニトロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、2,3,5,6−テトラフルオロ−4−(トリフルオロメチル)フェニル、ベンジル、置換ベンジル(p−メトキシベンジル、3,4,−ジメトキシベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、p−ハロベンジル、2,6−ジクロロベンジル、p−フェニルベンジル、p−フェニレンジル、2,6−ジフルオロベンジル、p−アシルアミノベンジル、p−アジドベンジル、4−アジド−3−クロロベンジル、2−トリフルオロメチルベンジル、p−(メチルスルフィニル)ベンジル)、2−および4−ピコリル、3−メチル−2−ピコリルN−オキサイド、2−キノリニルメチル、1−ピレニルメチル、ジフェニルメチル、p,p'−ジニトロベンズヒドリル、5−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、p−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル、トリ(p−メトキシフェニル)メチル、4−(4−'−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル、4,4',4''−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル、4,4',4''−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル、4,4',4''−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル、4,4'−ジメトキシ−3''−[N−(イミダゾリルメチル)]トリチル、4,4'−ジメトキシ−3''−[N−(イミダゾリルエチル)カルバモイル]トリチル、1,1−ビス(4−メトキシフェニル−1'−ピレニルメチル、4−(17−テトラベンゾ[a,c,g.i]フルオレニルメチル)−4,4''−ジメトキシトリチル、9−アントリル、9−(9−フェニル)キサンテニル、9−(9−フェニル−10−オキソ)アントリル、1,3−ベンゾジチオラン−2−イル、ベンズイソチアゾリルs,s−ジオキサイド、シリルエーテル(トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルテキシルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリ−p−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジ−t−ブチルメチルシリル、トリス(トリメチルシリル)シリル(シシル)、(2−ヒドロキシスチリル)ジメチルシリル、(2−ヒドロキシスチリル)ジイソプロピルシリル、t−ブチルメトキシフェニルシリル、t−ブトキシジフェニルシリル)などのエーテル、
(ii)ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、置換アセテート(クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、p−クロロフェノキシアセテート、フェニルアセテート、p−P−フェニルアセテート、ジフェニルアセテート)、ニコチネート、3−フェニルプロピオネート、4−ペンテノエート、4−オキソペンタノエート(レブリネート)、4,4−(エチレンジチオ)ペンタノエート、5−[3−ビス(4−メトキシフェニル)ヒドロキシメチルフェノキシ]レブリネート、ピバロエート、1−アダマントエート、クロトネート、4−メトキシクロトネート、ベンゾエート、p−フェニルベンゾエート、2,4,6−トリメチルベンゾエート(メシトエート)、カルボネート(メチル、メトキシメチル、9−フルオレニルメチル、エチル、2,2,2−トリクロロエチル、1,1,−ジメチル−2,2,2−トリクロロエチル、2−(トリメチルシリル)エチル、2−(フェニルスルホニル)エチル、2−(トリフェニルホスホニオ)エチル、イソブチル、ビニル、アリル、p−ニトロフェニル、ベンジル、p−メトキシベンジル、3,4,−ジメトキシベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、2−ダンシルエチル、2−(4−ニトロフェニル)エチル、2−(2,4−ジニトロフェニル)エチル、2−シアノ−1−フェニルエチル、S−ベンジルチオカルボネート、4−エトキシ−1−ナフチル、メチルジチオカルボネート)、2−ヨードベンゾエート、4−アジドブチレート、4−ニトロ−4−メチルペンタノエート、o−(ジブロモメチル)ベンゾエート、2−ホルミルベンゼンスルホネート、 2−(メチルチオメトキシ)エチルカルボネート、4−(メチルチオメトキシ)ブチレート、2−(メチルチオメトキシメチル)ベンゾエート、2−(クロロアセトキシメチル)ベンゾエート、2−[(2−クロロアセトキシ)エチル]ベンゾエート、2−[2−(ベンジルオキシ)エチル]ベンゾエート、2−[2−(4−メトキシベンジルオキシ)エチル]ベンゾエート、2,6−ジクロロ−4−メチルフェノキシアセトエート、2,6−ジクロロ−4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)フェノキシアセテート、2,4−ビス(1,1−ジメチルプロピル)フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシオノエート、(E)−2−メチル−2−ブテノエート(チグロエート)、o−(メトキシカルボニル)ベンゾエート、p−P−ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルN,N,N',N'−テトラメチルホスホロジアミデート、2−クロロベンゾエート、4−ブロモベンゾエート、4−ニトロベンゾエート、3'5'−ジメトキシベンゾイン、粗製の感光性蛍光エステル、N−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、2,4−ジニトロフェニルスルフェネートなどのエステル、および
(iii)スルホネート(スルフェート、アリルスルホネート、メタンスルホネート(メシレート)、ベンジルスルホネート、トシレート、2−[(4−ニトロフェニル)エチル]スルホネート)。
(i)酵素で切断可能なエステル(ヘプチル、2−N−(モルホリノ)エチル、コリン、(メトキシエトキシ)エチル、メトキシエチル)、メチル、置換メチル(9−フルオレニルメチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、メトキシエトキシメチル、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、フェニルアセトキシメチル、トリイソプロピルシリルメチル、シアノメチル、アセトール、フェナシル、p−ブロモフェナシル、α−メチルフェナシル、p−メトキシフェナシル、デシル、カルボキサミドメチル、p−アゾベンゼンカルボキサミドメチル、N−フタルイミドメチル)、2−置換エチル(2,2,2−トリクロロエチル、2−ハロエチル、ω−クロロアルキル、2−(トリメチルシリル)エチル、2−メチルチオエチル、1,3−ジチアニル−2−メチル、2−(p−ニトロフェニルスルフェニル)エチル、2−(p−トルエンスルホニル)エチル、2−(2'−ピリジル)エチル、2−(p−メトキシフェニル)エチル、2−(ジフェニルホスフィノ)エチル、1−メチル−1−フェニルエチル、2−(4−アセチル−2−ニトロフェニル)エチル、2−シアノエチル)、t−ブチル、3−メチル−3−ペンチル、ジシクロプロピルメチル、2,4−ジメチル−3−ペンチル、ジシクロプロピルメチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アリル、メタリル、2−メチルブト−3−エン−2−イル、3−メチルブタ−2−(プレニル)、3−ブテン−1−イル、4−(トリメチルシリル)−2−ブテン−1−イル、シンナミル、α−メチルシンナミル、プロプ−2−イニル(プロパルギル)、フェニル、2,6−ジアルキルフェニル(2,6,−ジメチルフェニル、2,6,ジイソプロピルフェニル、2,6−ジ−t−ブチル−4−メチルフェニル、2,6−ジ−t−ブチル−4−メトキシフェニル、p−(メチルチオ)フェニル、ペンタフルオロフェニル、ベンジル、置換ベンジル(トリフェニルメチル、ジフェニルメチル、ビス(o−ニトロフェニル)メチル、9−アントリルメチル、2−(9,10−ジオキソ)アントリルメチル、5−ジベンゾスベリル、1−ピレニルメチル、2−(トリフルオロメチル)−6−クロモニルメチル、2,4,6−トリメチルベンジル、p−ブロモベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、p−メトキシベンジル、2,6−ジメトキシベンジル、4−(メチルスルフィニル)ベンジル、4−スルホベンジル、4−アジドメトキシベンジル、4−{N−[1−(4,4,−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)−3−メチルブチル]アミノ}ベンジル、ピペロニル、4−ピコリル、p−P−ベンジル)、シリル(トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、i−プロピルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ジ−t−ブチルメチルシリル、トリイソプロピルシリル)、活性化(チオール)、オキサゾール、2−アルキル−1,3−オキサゾリン、4−アルキル−5−オキソ−1,3−オキサゾリジン、2,2,−ビストリフルオロメチル−4−アルキル−5−オキソ−1,3−オキサゾリジン、5−アルキル−4−オキソ−1,3−ジオキソラン、ジオキサノン、オルトエステル、ブラウンオルトエステル、ペンタアミノコバルト(iii)複合体、スタンニル(トリエチルスタンニル、トリ−N−ブチルスタンニル))などのエステル、
(ii)アミド(N,N−ジメチル、ピロリジニル、ピペリジニル、5,6−ジヒドロフェナントリジニル、o−ニトロアニリド、N−7−ニトロインドリル、N−8−ニトロ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリル、2−(2−アミノフェニル)アセトアルデヒドジメチルアセタールアミド、p−P−ベンゼンスルホンアミド)、
(iii)ヒドラジド(N−フェニル、N,N'−ジイソプロピル)、および
(iv)テトラアルキルアンモニウム塩。
(i)チオエーテル(S−アルキル、S−ベンジル、S−p−メトキシベンジル、S−o−またはp−ヒドロキシ−またはアセトキシベンジル、S−p−ニトロベンジル、S−2,4,6−トリメチルベンジル、S−2,4,6−トリメトキシベンジル、S−4−ピコリル、S−2−キノリニルメチル、S−2−ピコリルN−オキサイド、S−9−アントリルメチル、S−9−フルオレニルメチル、S−キサンテニル、S−フェロセニルメチル)、S−ジフェニルメチル、置換S−ジフェニルメチルおよびS−トリフェニルメチル(S−ジフェニルメチル、S−ビス(4−メトキシフェニル)メチル、S−5−ジベンゾスベリル、S−トリフェニルメチル、S−ジフェニル−4−ピリジルメチル)、S−フェニル、S−2,4−ジニトロフェニル、S−t−ブチル、S−1−アダマンチル、モノチオ、ジチオおよびアミノチオアセタール(S−メトキシメチル、S−イソブトキシメチル、S−ベンジルオキシメチル、S−2−テトラヒドロピラニル、S−ベンジルチオメチル、S−フェニルチオメチル、チアゾリジン、S−アセトアミドメチル、S−トリメチルアセトアミドメチル、S−ベンズアミドメチル、S−アリルオキシカルボニルアミノメチル、S−フェニルアセトアミドメチル、S−フタルイミドメチル、S−アセチル−、S−カルボキシル−、およびS−シアノメチル)をはじめとする置換S−メチル、置換S−エチル(S−(2−ニトロ−1−フェニル)エチル、S−2−(2,4−ジニトロフェニル)エチル、S−2−(4'−ピリジル)エチル、S−2−シアノエチル、S−2−(トリメチルシリル)エチル、S−(1−m−ニトロフェニル−2−ベンゾイル)エチル、S−2−フェニルスルホニルエチル、S−1−(4−メチルフェニルスルホニル)−2−メチルプロプ−2−イル、シリル)、
(ii)チオエステル(S−アセチル、S−ベンゾイル、S−トリフルオロアセチル、S−N−[[(p−ビフェニルイル)イソプロポキシ]カルボニル]−N−メチル−α−アミノチオブチレート、S−N−(t−ブトキシカルボニル−N−メチル−α−アミノチオブチレート)、チオカルボネート(S−2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、S−t−ブトキシカルボニル、S−ベンジルオキシカルボニル、S−p−メトキシベンジルオキシカルボニル)、チオカルバメート(S−(N−エチル)、S−(N−メトキシメチル))、
(iii)非対称ジスルフィド(S−エチル、S−t−ブチル、置換S−フェニルジスルフィド)、
(iv)スルフェニル誘導体(S−スルホネート、S−スルフェニルチオカルボネート、S−3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニルスルフィド、S−[トリカルボニル[1,2,3,4,5−S]−2,4−シクロヘキサジエン−1−イル]−鉄(1+)、オキサチオロン)、および
(v)S−メチルスルホニウム塩、S−ベンジル−およびS−4−メトキシベンジルスルホニウム塩、S−1−(4−フタルイミドブチル)スルホニウム塩、S−(ジメチルホスフィノール)チオイル、S−(ジフェニルホスフィノ)チオイル。
(i)カルバメート(メチル、エチル、9−フルオレニルメチル、9−(2−スルホ)フルオレニルメチル、9−(2,7−ジブロモ)フルオレニルメチル、17−テトラベンゾ[a,c,g.i]フルオレニルメチル、2−クロロ−3−インデニルメチル、ベンズ[f]インデン−3−イルメチル、2,7−ジ−t−ブチル−[9−(10,10−ジオキソ−10,10,10,10−テトラヒドロチオックス、1,1−ジオキソベンゾ[b]チオフェン−2−イルメチル、置換エチル(2,2,2−トリクロロエチル、2−トリメチルシリルエチル、2−フェニルエチル、1−(1−アダマンチル)−1−メチルエチル、2−クロロエチル、1,1−ジメチル−2−ハロエチル、1,1−ジメチル−2,2−ジブロモエチル、1,1−ジメチル−2,2,2−トリクロロエチル、1−メチル−1−(4−ビフェニルイル)エチル、1−(3,5−ジ−t−ブチルフェニル)−1−メチルエチル、2−(2'−および4'−ピリジル)エチル、2,2−ビス(4'−ニトロフェニル)エチル、N−(2−ピバロイルアミノ)−1,1−ジメチルエチル、2−[(2−ニトロフェニル)ジチオ]−1−フェニルエチル、2−(N,N−ジシクロヘキシルカルボキサミド)エチル)、t−ブチル、1−アダマンチル、2−アダマンチル、ビニル、アリル、1−イソプロピルアリル、シンナミル、4−ニトロシンナミル、3−(3'ピリジル)プロプ−2−エニル、8−キノリル、N−ヒドロキシピペリジニル、アルキルジチオ、ベンジル、p−メトキシベンジル、p−ニトロベンジル、p−ブロモベンジル、p−クロロベンジル、2,4−ジクロロベンジル、4−メチルスルフィニルベンジル、9−アントリルメチル、ジフェニルメチル、2−メチルチオエチル、2−メチルスルホニルエチル、2−(p−トルエンスルホニル)エチル、[2−(1,3−ジチアニル)メチル、4−メチルチオフェニル、2,4−ジメチルチオフェニル、2−ホスホニオエチル、1−メチル−1−(トリフェニルホスホニオ)エチル、1,1−ジメチル−2−シアノエチル、2−ダンシルエチル、2−(4−ニトロフェニル)エチル、4−フェニルアセトキシベンジル、4−アジドベンジル、4−アジドメトキシベンジル、m−クロロ−p−アシルオキシベンジル、p−(ジヒドロキシボリル)ベンジル、5−ベンズイソオキサゾリルメチル、2−(トリフルオロメチル)−6−クロモニルメチル、m−ニトロフェニル、3,5−ジメトキシベンジル、1−メチル−1−(3,5−ジメトキシフェニル)エチル、α−メチルニトロピペロニル、o−ニトロベンジル、3,4−ジメトキシ−6−ニトロベンジル、フェニル(o−ニトロフェニル)メチル、2−(2−ニトロフェニル)エチル、6−ニトロベラトリル、4−メトキシフェナシル、3',5'−ジメトキシベンゾイン、尿素(フェノチアジニル−(10)−カルボニル誘導体、N'−p−トルエンスルホニルアミノカルボニル、N'−フェニルアミノチオカルボニル)、t−アミル、S−ベンジルチオカルバメート、ブチニル、p−シアノベンジル、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、p−デシルオキシベンジル、ジイソプロピルメチル、2,2−ジメトキシカルボニルビニル、o−(N'−N'−ジメチルカルボキサミド)ベンジル、1,1−ジメチル−3−(N',N'−ジメチルカルボキサミド)プロピル、1,1−ジメチルプロピニル、ジ(2−ピリジル)メチル)、2−フラニルメチル、2−ヨードエチル、イソボルニル、イソブチル、イソニコチニル、p−(p'−メトキシフェニルアゾ)ベンジル、1−メチルシクロブチル、1−メチルシクロヘキシル、1−メチル−1−シクロプロピルメチル−、1−メチル−1−(p−フェニルアゾフェニル)エチル、1−メチル1−フェニルエチル、1−メチル−1−(4'−ピリジル)エチル、フェニル、p−(フェニルアゾ)ベンジル、2,4,6−トリ−t−ブチルフェニル、4−(トリメチルアンモニウム)ベンジル、2,4,6−トリメチルベンジル)、
(ii)アミド(N−ホルミル、N−アセチル、N−クロロアセチル、N−トリクロロアセチル、N−トリフルオロアセチル、N−フェニルアセチル、N−3−フェニルプロピオニル、N−4−ペンテノイル、N−ピコリノイル、n−3−ピリジルカルボキサミド、N−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、N−ベンゾイル、N−p−フェニルベンゾイル、N−o−ニトロフェニルアセチル、N−o−ニトロフェノキシアセチル、N−3−(o−ニトロフェニル)プロピオニル、N−2−メチル−2−(o−ニトロフェノキシ)プロピオニル、N−3−メチル−3−ニトロブチリル、N−o−ニトロシンナモイル、N−o−ニトロベンゾイル、N−3−(4−t−ブチル−2,6−ジニトロフェニル−2,−2−ジメチルプロピオニル、N−o−(ベンゾイルオキシメチル)ベンゾイル、N−(2−アセトキシメチル)ベンゾイル、N−2−[(t−ブチルジフェニルシロキシ)メチル]ベンゾイル、N−3−(3',6'−ジオキソ−2',4',5'−トリメチルシクロヘキサ−1',4'−ジエン)−3,3−ジメチルプロピオニル、N−o−ヒドロキシ−トランス−シンナモイル、N−2−メチル−2−(o−フェニルアゾフェノキシ)プロピオニル、N−4−クロロブチリル、N−アセトアセチル、N−3−(p−ヒドロキシフェニル)プロピオニル、(N'−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ)アセチル、N−アセチルメチオニン誘導体、4,5−ジフェニル−3−オキサゾリン−2−オン)、環状イミド(N−フタロイル、N−テトラクロロフタロイル、N−4−ニトロフタロイル、N−ジチアスクシノイル、N−2,3−ジフェニルマレオイル、N−2,5−ジメチルピロリル、N−2,5−ビス(トリイソプロピルシロキシ)ピロリル、N−1,1,4,4−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物、N−1,1,3,3−テトラメチル−1,3−ジシライソインドリル、5−置換1,3−ジメチル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、5−置換1,3−ジベンジル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、1−置換3,5−ジニトロ−4−ピリドニル、1,3,5−ジオキサジニル)、
(iii)N−アルキルおよびN−アリールアミン(N−メチル、N−t−ブチル、N−アリル、N−[2−(トリメチルシリル)エトキシ]メチル、N−3−アセトキシプロピル、N−シアノメチル、N−(1−イソプロピル−4−ニトロ−2−オキソ−3−ピロリン−3−イル)、N−2,4−ジメトキシベンジル、N−2−アザノルボルネニル、N−2,4−ジニトロフェニル、第四級アンモニウム塩、N−ベンジル、N−4−メトキシベンジル、N−2,4−ジメトキシベンジル、N−2−ヒドロキシベンジル、N−ジフェニルメチル、N−ビス(4−メトキシフェニル)メチル、N−5−ジベンゾスベリル、N−トリフェニルメチル、N−(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル、N−9−フェニルフルオレニル、N−フェロセニルメチル、N−2−ピコリルアミンN'−オキサイド)、
(iv)イミン(N−1,1−ジメチルチオメチレン、N−ベンジリジン、N−p−メトキシベンジリデン、N−ジフェニルメチレン、N−[(2−ピリジル)メシチル]メチレン、N−(N',N'−ジメチルアミノメチレン)、N−(N',N'−ジベンジルアミノメチレン)、N−(N'−t−ブチルアミノメチレン)、N,N'−イソプロピリデン、N−p−ニトロベンジリデン、N−サリチリデン、N−5−クロロサリチリデン、N−(5−クロロ−2−ヒドロキシフェニル)フェニルメチレン、N−シクロヘキシリデン、N−t−ブチリデン)、
(v)エナミン(N−(5,5−ジメチル−3−オキソ−1−シクロヘキセニル、N−2,7−ジクロロ−9−フルオレニルメチレン、n−2−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル、N−4,4,4−トリフルオロ−3−オキソ−1−ブテリル、N−1−イソプロピル−4−ニトロ−2−オキソ−3−ピロリン−3−イル)、
(vi)N−ヘテロ原子誘導体(N−ボラン誘導体、N−ジフェニルボリン酸誘導体、N−ジエチルボリン酸誘導体、N−ジフルオロボリン酸誘導体、N,N'−3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸誘導体、N−[フェニル(ペンタカルボニルクロミウムまたはタングステン)]カルベニル、N−銅またはN−亜鉛キレート、18−クラウン−6誘導体、N−ニトロ、N−ニトロソ、N−オキサイド、トリアゼン誘導体、N−ジフェニルホスフィニル、N−ジメチル−およびジフェニルチオホスフィニル、N−ジアルキルホスホリル、N−ジベンジルおよびジフェニルホスホリル、イミノトリフェニルホスホラン誘導体、N−ベンゼンスルフェニル、N−o−ニトロベンゼンスルフェニル、N−2,4−ジニトロベンゼンスルフェニル、N−ペンタクロロベンゼンスルフェニル、N−2−ニトロ−4−メトキシベンゼンスルフェニル、N−トリフェニルメチルスルフェニル、N−1−(2,2,2−トリフルオロ−1,1−ジフェニル)エチルスルフェニル、N−3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル、N−p−トルエンスルホニル、N−ベンゼンスルホニル、N−2,3−6−トリメチル−4−メトキシベンゼンスルホニル、N−2,4,6−トリメトキシベンゼンスルホニル、N−2,6−ジメチル−4−メトキシベンゼンスルホニル、N−ペンタメチルベンゼネルスルホニル、N−2,3,5,6−テトラメチル−4−メトキシベンゼンスルホニル、N−4−メトキシベンゼンスルホニル、N−2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニル、N−2,6−ジメトキシ−4−メチルベンゼンスルホニル、N−3−メトキシ−4−t−ブチルベンゼンスルホニル、N−2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル、N−2−および4−ニトロベンゼンスルホニル、N−2,4−ジニトロベンゼンスルホニル、N−ベンゾチアゾール−2−スルホニル、N−ピリジン−2−スルホニル、N−メタンスルホニル、N−2−(トリメチルシリル)エタンスルホニル、N−9−アントラセンスルホニル、N−4−(4',8'−ジメトキシナフチルメチル)ベンゼンスルホニル、N−ベンジルスルホニル、N−トリフルオロメチルスルホニル、N−フェナシルスルホニル、N−t−ブチルスルホニル)、
(vii)N−スルホニル誘導体(N,N−ジメチルスルホニル、N−メシチレンスルホニル、N−p−メトキシフェニルスルホニル、N−ベンゼンスルホニル、N−p−トルエンスルホニル)、カルバメート(2,2,2−トリクロロエチル、2−(トリメチルシリル)エチル、t−ブチル、2,4−ジメチルペント−3−イル、シクロヘキシル、1,1−ジメチル−2,2,2−トリクロロエチル、1−アダマンチル、2−アダマンチル)、N−アルキルおよびN−アリール誘導体(N−ビニル、N−2−クロロエチル、N−(1−エトキシ)エチル、N−2−(2'−ピリジル)エチル、N−2−(4'−ピリジル)エチル、N−2−(4'−ニトロフェニル)エチル)、N−トリアルキルシリル誘導体(N−t−ブチルジメチルシリル、N−トリイソプロピルシリル)、N−アリル、N−ベンジル、N−p−メトキシベンジル、N−3,4−ジメトキシベンジル、N−3−メトキシベンジル、N−3,5−ジメトキシベンジル、N−2−ニトロベンジル、N−4−ニトロベンジル、N−2,4−ジニトロフェニル、N−ピフェナシル、N−トリフェニルメチル、N−ジフェニルメチル、N−(ジフェニル−4−ピリジルメチル)、N−(n',n'−ジメチルアミノ))、アミノアセタール誘導体(N−ヒドロキシメチル、N−メトキシメチル、N−ジエトキシメチル、N−エトキシメチル、N−(2−クロロエトキシ)メチル、N−[2−(トリメチルシリル)エトキシ]メチル、N−t−ブトキシメチル、N−t−ブチルジメチルシロキシメチル、N−ピバロイルオキシメチル、N−ベンジルオキシメチル、N−ジメチルアミノメチル、N−2−テトラヒドロピラニル)、アミド(二酸化炭素付加物、N−ホルミル、N−(n',n'−ジエチルウレイジル)、N−ジクロロアセチル、N−ピバロイル、N−ジフェニルチオホスフィニル)をはじめとするイミダゾール保護基、および
(viii)アミド(N−アリル、N−t−ブチル、N−ジシクロプロピルメチル、N−メトキシメチル、N−メチルチオメチル、N−ベンジルオキシメチル、N−2,2,2−トリクロロエトキシメチル、N−t−ブチルジメチルシロキシメチル、N−ピバロイルオキシメチル、N−シアノメチル、N−ピロリジノメチル、N−メトキシ、N−ベンジルオキシ、N−メチルチオ、N−トリフェニルメチルチオ、N−t−ブチルジメチルシリル、N−トリイソプロピルシリル、N−4−メトキシフェニル、N−3,4−ジメトキシフェニル、N−4−(メトキシメトキシ)フェニル、N−2−メトキシ−1−ナフチル、N−ベンジル、N−4−メトキシベンジル、N−2,4−ジメトキシベンジル、N−3,4−ジメトキシベンジル、N−o−ニトロベンジル、N−ビス(4−メトキシフェニル)メチル、N−ビス(4−メトキシフェニル)フェニルメチル、N−ビス(4−メチルスルフィニルフェニル)メチル、N−トリフェニルメチル、N−9−フェニルフルオレニル、N−ビス(トリメチルシリル)メチル、N−t−ブトキシカルボニル、N−ベンジルオキシカルボニル、N−メトキシカルボニル、N−エトキシカルボニル、N−p−トルエンスルホニル、N,O−イソプロピリデンケタール、N,O−ベンジリデンアセタール、N,O−ホルミリデンアセタール、N−ブテニル、N−エテニル、N−[(e)−(2−メトキシカルボニル)ビニル]、N−ジエトキシメチル、N−(1−メトキシ−2,2−ジメチルプロピル)、N−2−(4−メチルフェニルスルホニル)エチル)をはじめとするアミドNH保護基。
選択性官能基(「Y」)は、例えば、立体障害または他の相互作用によって、反応性官能基が結合する基の数を減少させることによって反応性官能基を調節するように働く。それは捕獲化合物の立体的および/または電子的(例えば、メソメリー、誘導効果)特性ならびに得られる親和性を改変する基である。選択性官能基としては、反応基の選択性を高め、その結果、選択性官能基が存在しない場合よりも少数の種々の生体分子に結合するか、またはそれが存在しない場合よりも大きな親和性で生体分子に結合する、任意の官能基が含まれる。本明細書で提供する捕獲化合物において、Yは、存在する場合には、切断可能な結合Lと反応性官能基Xの反応性の調節に関係するような立体障害および電子的因子に関して達成されるべき目標にしたがって、広い範囲で変化させることが可能である。例えば、反応性官能基Xは、タンパク質上のアミン基と結合するよう選択することができる。選択性官能基は、表面上に露出されている基のみが接触され得ることを確実にするよう選択することができる。選択性官能基は、化合物が、それが分子の一部である場合には、それが存在しない場合よりも少数の種々の生体分子に結合するかまたは(反応性官能基を介して)それと反応するような化合物、および/または、化合物がより大きな特異性およびより高い親和性で結合する化合物である。選択性官能基は化合物に直接結合することができるか、あるいは、CH2CO2またはCH2−O−(CH2)n−O(ここで、nは1〜12、または1〜6、または2〜4の整数である)などのリンカーを介して結合することができる。例示的な選択性官能基については、例えば、図17および図21および以下の議論を参照。特定の実施態様では、リンカーは、選択性官能基が標的または非標的タンパク質の結合ポケットに到達し得るように選択される。他の実施態様では、選択性官能基はキラル基であり、それによって、生体分子の立体選択的捕獲を可能とする。
R60、R61、R62は各々独立に水素、直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、あるいは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
本明細書で提供される化合物は、化合物が2−Dアレイにおける捕獲などによってアドレス指定されることを可能にする選別官能基(「Q」)を含むことができる。特定の実施態様では、選別官能基は、サンプル中の生体分子(例えば、標的および非標的タンパク質)と相互作用しないように選択される。選別官能基とは、化合物を適切な結合条件下で固体支持体、例えば、ビーズ、チップに連結させた相補的なオリゴヌクレオチドのアレイ上に浴びせると、そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドタグのような「タグ」である。捕獲化合物の実体はアレイ中のその位置によって知ることができる。他の選別官能基は、分離することができるカラーコードまたはバーコードをつけたビーズとしてなど、光学的にコードしてもよいし、電子タグをつけたマイクロリアクター支持体またはバーコードをつけた支持体(例えば、米国特許第6,025,129号、同6,017,496号、同5,972,639号、同5,961,923号、同5,925,562号、同5,874,214号、同5,751,629号、同5,741,462号参照)を提供することによるなど電子工学的にタグをつけてもよいし、あるいは物理的にアドレス指定可能なアレイに代えて使用できる化学タグ(例えば、米国特許第5,432,018号、同5,741,462号、同5,547,839号参照)または着色タグまたは他のそのようなアドレス指定法であってもよい。選別官能基は、分析、特に、MALDIをはじめとする質量スペクトル分析に適切な物理的アレイまたは他のアドレス指定可能な分離法が可能となるように選択する。
N1 mBiN2 n
を有する場合がある。式中、N1およびN2は保存された配列の領域であり、Bは配列並べ替えの領域であり、m、iおよびnはそれぞれN1、BおよびN2の単位数であり、m、nおよびiの合計は、相補核酸配列とハイブリダイズして安定なハイブリッドを形成できる単位数である。したがって、Bが一本鎖DNAまたはRNAである実施形態では、配列並べ替えの数は4iと等しい。1つの実施形態では、m、nおよびiの合計は約5〜約10、15、25、30、35、40、45または50である。特定の実施形態では、mおよびnは各々独立に0〜約48であるか、または各々独立に約1〜約25または約1〜約10もしくは15、または約1〜約5である。他の実施形態では、iは約2〜約25であるか、または約3〜約12であるか、または約3〜約5、6、7もしくは8である。
本明細書で提供される化合物は、所望の溶解性、例えば、疎水性環境または親水性環境における溶解性を付与して、膜などの生理学的環境において生体分子をプローブすることを可能にする溶解性官能基Wを含むことができる。本明細書で提供される化合物において用いるための例示的な溶解性官能基としては、ポリエチレングリコール、スルフェート、ポリスルフェート、ホスフェート、スルホネート、ポリスルホネート、カルボヒドレート、デキストリン、ポリホスフェート、ポリカルボン酸、トリエタノールアミン、アルコール、水溶性ポリマー、アルキルおよびアリールカルボン酸塩、ならびにグリコールが挙げられる。
以下は上記の特性を示す例示的な捕獲化合物を提供する。これらは単なる例であり、生体分子と共有結合により、または分析条件、例えば、質量スペクトル分析条件に対して安定な他の高度に安定な相互作用によって反応することができ、そして選別され得るか、又は別の方法で同定することができるあらゆる化合物が収集物に用いることが意図されることが理解される。
1つの実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は次式:
QZXまたはQ−Z−Y
を有する。式中、Qは、塩基相補的一本鎖核酸分子とハイブリダイズできる、最大50単位からなる、一本鎖の、保護されていないかまたは適切に保護されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体(例えば、ペプチド核酸(PNA))を含む選別官能基であり、Zは、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の構造を変化させることなく、質量スペクトル分析をはじめとする生体分子の分析の前またはその間に切断可能である部分であり、Xは、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の表面上の官能基と相互作用および/または反応して、共有結合または質量スペクトル分析、特にMALDI分析の条件下で安定である結合を形成する反応性官能基であり、そしてYは、標的タンパク質と非共有的に相互作用する官能基を導入することによって特有の選択性を与えることにより、相互作用および/または反応する選択性官能基である。
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は式:
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は式:
Zは、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の構造を変化させることなく、質量スペクトル分析をはじめとする生体分子の分析の前またはその間に切断可能である部分であり、
Xは、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の表面上の官能基と相互作用および/または反応して、共有結合または質量スペクトル分析、特にMALDI分析の条件下で安定である結合を形成する官能基であり、そして
Yは、標的タンパク質と非共有的に相互作用する官能基を導入することによって特有の選択性を与えることにより、相互作用および/または反応する官能基である。
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は式:
を有する。式中、Q、Z、XおよびYは上記で定義した通りであり、mは1〜100、1つの実施形態では1〜10、別の実施形態では1〜3、4または5の整数であり、nは1〜100、1つの実施形態では1〜10、別の実施形態では1〜3、4または5の整数である。
他の実施形態では、Xは医薬品である。これらの実施形態の化合物は、医薬品に結合する、限定されるものではないがタンパク質をはじめとする生体分子を捕獲することによる薬剤スクリーニングに用いることができる。医薬品への結合を妨害する生体分子中の突然変異を同定し、それにより可能性ある薬剤耐性機構が決定される。例えば、Hesslerら(2001年11月9〜11日)Ninth Foresight Conference on Molecular Nanotechnology(要約)(http://www.foresight.org/Conferences/MNT9/Abstracts/Hessler/)を参照。
特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物は式:
N1 mBiN2 n(S1)tM(R15)a(S2)bLX
を有する。式中、N1、B、N2、S1、M、S2、L、X、m、i、n、t、aおよびbは上記で定義した通りである。さらなる実施形態では、本明細書で提供する方法に用いるための化合物は質量改変タグを含み、式:
N1 mBiN2 n(S1)tM(R15)a(S2)bLTX
を有する。式中、N1、B、N2、S1、M、S2、L、T、X、m、i、n、t、aおよびbは上記で定義した通りである。
N1 mBiN2 n(S1)tM(R15)a(S2)bX
を有する。式中、N1、B、N2、S1、M、S2、X、m、i、n、t、aおよびbは上記で定義した通りである。
捕獲化合物は標的生体分子および反応条件を評価することによって設計する。例えば、標的生体分子がタンパク質である場合には、タンパク質に共有結合するかまたはタンパク質へ高い親和性で結合するために適切なX官能基を選択する。Yは標的混合物の複雑性およびXによる結合の所望の特異性にしたがって選択する。Qは望まれる混合物の分割数にしたがって選択し、Wはプローブされる生体分子の環境に基づいて選択する。種々の捕獲化合物をこのような基準にしたがって設計する。
本明細書で提供される捕獲化合物は、限定されるものではないが、タンパク質混合物をはじめとする生体分子混合物の構成要素の分析、定量、精製および/または同定に用いることができる。これらは、薬剤候補を同定するための小分子のライブラリーのスクリーニングに用いることが可能であり、またこれらは、生体分子−生体分子相互作用を評価するため、ならびに生体分子複合体および中間体(例えば、生化学経路の中にあるものおよび他の生物学的中間体)を同定するために用いることもできる。
本明細書で提供される収集物には、収集物を混合物と接触させて混合物中の分子を共有結合させることによって、分子、特に生体分子の混合物の複雑性を低下させることをはじめ、広範な種々の用途がある。捕獲化合物は、接触の前、その間またはその後のいずれかに選別官能基によって整列させることができる。接触および整列の後、アレイの位置は各々、混合物中の分子のサブセットを含んでいる。次いで、アレイを、例えば質量スペクトル計を用いて分析することができる。
捕獲の収集物は、プロテオームおよび他の生体分子を分析するためのトップダウン全体論的アプローチを可能にする。上記のように、有用な収集物および方法は生体分子を分析するための不偏的(unbiased)方法を提供するが、これは本方法が必ずしも特定のクラスの標的を評価するのではなく、むしろサンプル中の変化を検出または同定するからである。同定される変化としては、一次配列および翻訳後修飾をはじめとする修飾と関連している構造変化が挙げられる。さらに、捕獲化合物は、疎水条件での反応のために設計することもできる溶解性官能基を含むことができるので、膜結合型および膜会合型分子、特に、タンパク質の分析が可能となる。
1)疾病に関係しているか疾病のマーカーである、タンパク質または他の生体分子を同定するための、病変対健常細胞または組織由来のサンプル、
2)応答を示す生体分子を同定するための、薬剤レスポンダーおよびノンレスポンダー(すなわち、悪性メラノーマ患者の20〜30%に関してはαインターフェロンに応答するが、他は応答しない)由来のサンプル、
3)応答と関連している生体分子または応答のマーカーを同定するための、薬剤または環境条件に対する毒性プロフィールを有する細胞または組織由来のサンプル、および
4)応答または表現型と関連しているか、またはそのマーカーであるタンパク質などの生体分子を同定するための、いずれかの条件に曝されたかまたはいずれか表現型を示す細胞または組織由来のサンプル。
1)フローサイトメトリー、
2)特異的捕獲、
3)望まない細胞を捕獲し、標的細胞を上清中に残し、生存している細胞を分析のために回収するネガティブパニング、および
4)Laser Capture Microdissection(LCM)(Arcturus, Inc Mountain View, CA)。
1)Laser Capture Microdissection
Laser Capture Microdissection(LCM)(Arcturus, Inc Mountain View, CA)では、目的の選択した細胞上でプラスチックキャプチャーフィルムを活性化するための低エネルギーIRレーザーと組み合わせた顕微鏡プラットホームを用いる。次いで、細胞を周囲の組織からゆっくりと持ち上げる。このアプローチはマイクロダイセクションされた細胞または周囲の組織によるあらゆるレーザー照射の吸収を防ぐことによって、下流での分析のためにマイクロダイセクションされたサンプルから調製された、RNA、DNAおよびタンパク質の完全性を確実なものとする。
フローサイトメトリーは蛍光顕微鏡観察と幾分か類似している方法であり、ここでは、最大1秒当たり数千粒子までの速度で、集束レーザービームを通って一度に1個が流れる液体懸濁液中の粒子(細胞)について測定を実施する。粒子(細胞)による光の散乱および発生する蛍光を集め、フィルターに通し、デジタル化し、分析のためにコンピューターに送る。通常は、フローサイトメトリーは蛍光色素標識したプローブの細胞への結合を測定し、得られた蛍光を染色されていない細胞のバックグラウンド蛍光と比較する。細胞はフローサイトメトリーの変法、フローソーティングを用いて分離することもでき、ここでは、粒子(細胞)を、懸濁液からフロー中で測定された特性に基づいて分離回収する。フローソーティングによって回収される細胞は生存可能であり、滅菌条件下で回収することができる。通常は、回収される小集団は99.5%を超えて純粋である(図19aおよび19b参照)。
蛍光パラメーター測定では、直接染色、蛍光色素標識したプローブ(例えば、抗体)との反応、または蛍光タンパク質の発現に基づいて細胞構造および機能を調べることができる。蛍光シグナルは、異なるレーザー励起および蛍光発光波長に相当する単一のパラメーターとして測定してもよいし、複数のパラメーターとして測定することもできる。異なる蛍光色素を同時に用いる場合には、蛍光チャンネルの間に単一の溢流が生じ得る。これは補償によって補正する。蛍光色素の特定の組み合わせは同時に用いることができないが、当業者であればそのような組み合わせは特定できる。
免疫蛍光は、FITC(フルオレセイン)、PE(フィコエリトリン)、APC(アロフィコシアニン)およびPEベースのタンデム結合体(R670、CyChromeなど)などの蛍光色素に結合した抗体での細胞の染色を含む。細胞表面抗原がこのアッセイの通常の標的であるが、抗体を、同様に、細胞質中の抗原またはサイトカインに対して指向させることもできる。
アポトーシスの初期段階にある細胞を同定するために、アネキシン−Vを種々の蛍光色素で標識することができる。CFSEは細胞膜に結合し、細胞が分裂する際に均等に分配される。その結果、一定時間内に細胞が受ける分裂数を計数することができる。CFSEは免疫蛍光のための特定の蛍光色素と組み合わせて用いることができる。ヨード−1マーカーを用いてカルシウム流入を測定することができる。これは免疫蛍光染色と組み合わせることもできる。カルセイン(calcein)またはヒドロエチジン(hydroethidine)などの色素の組み合わせを用いて細胞間結合アッセイを行うこともできる。
選別した細胞または分離した細胞を得た後、これらを培養し、そして同調化または特定の代謝状態で凍結することができる。これによって、表現型特異的生体分子を同定する能力が増強される。そのような細胞はフローサイトメトリーによってをはじめとする上記の方法によって分離することができる。さらに、同一の細胞周期、同一の代謝状態、または他の同調化された状態にある細胞をフローサイトメトリーを用いてグループ分けすることもできる(図19c参照)。
1)遺伝子発現の制御、
2)酵素反応の調節、
3)負の制御:フィードバック阻害または最終産物抑制および酵素誘導がタンパク質の転写の減少をもたらす負の制御のメカニズムである、
4)正の制御:代謝産物の抑制が、タンパク質の転写の増加に影響を及ぼすために、正の制御の一形態と考えられている、
5)個々のタンパク質翻訳の制御、
a)5'キャップ部位にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドがmRNAとリボソーム40Sサブユニット間の最初の相互作用を阻害することによってタンパク質合成を阻害する、
b)翻訳開始コドンを含む5'UTRまでとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、40S(または30S)サブユニットのスキャニングまたは全リボソーム(真核細胞については80Sもしくは細菌系については70S)の組み立てを阻害する、
6)翻訳後修飾の制御、
7)活性部位が酵素の基質と結合し、産物に変換する、アロステリック酵素の制御。アロステリック部位が、基質ではないいくつかの小分子によって占有される。タンパク質が酵素である場合には、アロステリック部位が占有されると、酵素は不活性である、すわなち、エフェクター分子が酵素の活性を低下させる。数箇所の部位が、条件範囲にわたって酵素活性を調節する種々のエフェクター分子によって占有される多成分性アロステリック酵素もある。
重要な疾病関連マーカーおよび標的が、質量分析計によって検出されない可能性がある低量タンパク質である場合もある。確実に検出するために、第1の捕獲化合物提示実験を行うことができる。得られた捕獲されたタンパク質のアレイを、光を発する、すなわちアレイ上のより多くのタンパク質を可視的にする蛍光色素などの非選択性色素と反応させる。色素はタンパク質量の半定量的推定値を提供し得る。色素によって検出された種々のタンパク質の数を決定し、次いで、質量スペクトル分析によって検出された数と比較することができる。色素を用いた場合により多くのタンパク質が検出される場合には、質量スペクトル分析によって低量タンパク質を検出および同定できるように、より多数の出発細胞を用いて実験を繰り返すことができる。
収集物および/またはそのメンバーは、タンパク質の特異的な配座異性体を検出または識別するために用いることができる。したがって、例えば、タンパク質の特定のコンホメーションが疾病と(または健常状態と)関係している場合には、収集物またはそのメンバーは、収集物中の捕獲化合物との結合パターンに基づいて1つの配座異性体を検出または識別することができる。したがって、収集物および/またはそのメンバーを、疾病に関係しているタンパク質またはポリペプチドが疾病に関係しているコンホメーションを有する、高次構造が変化しているタンパク質病(またはタンパク質凝集の疾病)を検出するために用いることができる。本明細書に提供される方法および収集物により、検出される疾病に関係している配座異性体の検出が可能となる。これらの疾病としては、限定されるものではないが、アミロイド病および神経変性疾病が挙げられる。他の疾病、および2以上の異なるコンホメーションを示し、そのうちの少なくとも1種のコンホメーションが疾病に関係している関連タンパク質としては、以下の表に示されるものが挙げられる。
生体分子、例えば、タンパク質を、固定化した捕獲化合物との共有的または非共有的相互作用を用いて選別する。次いで、収集物、例えば、細胞溶解物由来のものなどの生体分子に結合した捕獲化合物のアレイを、薬剤候補のライブラリーまたは他の混合物をスクリーニングするために、あるいは結合した生体分子に結合するものを探すために生体分子の混合物をさらにスクリーニングするために用いることができる。捕獲生体分子−生体分子複合体または生体分子−薬剤候補複合体を分析して、生化学経路を同定すること、また候補薬剤を用いて標的を同定することもできる。
多くの医薬品が、生理学的条件下、薬物の非標的生体分子と、薬物、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグとの相互作用から生じ得る副作用を有する。
殆どの薬物開発プロジェクトの重要な目的は、良好(positive)な治療結果をもたらす薬物とその標的との相互作用を最大限とし、その一方、他のタンパク質との相互作用を最小限とすることである。目的とする標的以外のタンパク質との相互作用は、副作用を生ずる細胞性イベントのカスケードを誘発する。本明細書で提供するのは、目的の標的と相互作用するが他の相互作用は最小限とする薬物の設計が可能な方法である。ここで、捕獲化合物の選択性官能基は、薬物分子またはその代謝物のうちの1つであり、それは、化学的に関連する異なる向きで結合する。上記の手順後、薬物と相互作用するタンパク質(標的および非標的)およびそのそれぞれの推定機能が同定され、治療または副作用関連経路に含まれる可能性のあるすべての細胞型についてスクリーニングする。以前に患者で観察された薬物の治療効果および副作用の知識は、どの捕獲タンパク質が望ましい治療効果を生じ、どれがその副作用に関与するかについての仮定の形成を容易にする。
(1)糖尿病
糖尿病およびその主な危険要因の肥満は、今後十年間、欧米人が直面する、増大する健康危機となろう。リズリン(Rezulin)(トログリタゾン(Troglitazone))は市場から回収され、MK-767は、最近、フェーズIII試験から撤退し、他の薬物(例えば、アクトス(Actos)、アバンディア(Avandia))の販売は、全部、副作用のために、障害となっている。
ほぼ100万人のアメリカ人が、血流中のコレステロールのレベルの上昇が原因の動脈の閉塞により、毎年、心臓血管疾患で、心臓発作および発作ではより多くが死亡している。しかし、Lipitorを含むスタチンの処方の割合は副作用に影響される:これらの薬物を服用する患者に、肝臓の損傷といった毒性の効果が生じていないことを医師が監視すべきである。
胃腸およびある場合には冠状動脈での副作用の報告が、抗-炎症性 COX-2 インヒビター、ビオックスおよびセレブレックスの販売を制限している。なぜなら、多くの医師が、イブプロフェンのような遙かに効果の低い薬物を軽い炎症徴候に処方することを除き、患者により安全な策を講じるように進めるためである。
さらなる実施形態では、本明細書に記載された化合物および方法を、以下の処理ステップを標準化し、自動化する総合的なシステムの中に位置付けられるよう設計する:
・細胞溶解物からのタンパク質の単離をはじめとする、生体分子の生物学的供給源からの単離(溶解、酵素消化、沈殿、洗浄)
・必要に応じて、低分子量物質の除去
・必要に応じて、生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物のアリコート作製
・生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物の、本明細書で提供する種々の化学反応性(X)および配列多様性(B)の化合物との反応(このステップは生体分子混合物のアリコートを用いて並行して実施することができる)
・必要に応じて、過剰の化合物の除去
・化合物−生体分子結合体、例えば、化合物−タンパク質結合体の、化合物のQ部分に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーション;一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は必要に応じてアレイ形式で提示されていてもよいし、必要に応じて不溶性支持体上に固定化されていてもよい
・必要に応じて、続いて、タンパク質アレイの化学的または酵素的処理
・限定されるものではないが、(i)マトリックスの脱離、および(ii)アレイ質量分析計(較正および定量のための内部分子量標準、例えば、オンチップ分子量標準を含むかまたは含まない)を用いるスポット毎(spot-by-spot)のMALDI−TOF質量分析というステップを含む、生体分子アレイの分析。
細胞溶解物からのタンパク質の単離をはじめとする、生体分子の生物学的供給源からの単離(溶解、酵素消化、沈殿、洗浄)
必要に応じて、低分子量物質の除去
必要に応じて、生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物のアリコート作製
生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物の、本明細書で提供する種々の化学反応性(X)および配列多様性(B)の化合物との反応(このステップは生体分子混合物のアリコートを用いて並行して実施することができる)
必要に応じて、過剰の化合物の除去
タンパク質アレイの化学的または酵素的処理
続いて、化合物−生体分子結合体、例えば、化合物−タンパク質結合体の、化合物のQ部分に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーション;一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は必要に応じてアレイ形式で提示されていてもよいし、必要に応じて不溶性支持体上に固定化されていてもよい
限定されるものではないが、(i)マトリックスの脱離、および(ii)アレイ質量分析計(較正および定量のための内部分子量標準、例えば、オンチップ分子量標準を含むかまたは含まない)を用いるスポット毎(spot-by-spot)のMALDI−TOF質量分析というステップを含む、生体分子アレイの分析。
化合物−タンパク質種の質量スペクトル分析のような分析により得られた生データをバックグラウンド減算、ノイズ減少、分子量較正およびピークリファインメント(例えば、ピーク積分)によって処理する。切断されたタンパク質または消化産物の分子量値を解釈し、既存のタンパク質データベースと比較して当該タンパク質が既に知られているかどうか、またそうである場合には、どんな修飾が存在するか(グリコシル化されているかグリコシル化されていないか、リン酸化されているかリン酸化されていないかなど)を決定する。化合物の1つのセットに属する実験の種々のセットを構成し、比較し、解釈する。例えば、1セットの実験では1種のX部分および種々のQ部分を含む1セットの化合物を用いる。このセットの実験からはプロテオームの一部のデータが得られるが、これはプロテオーム中のすべてのタンパク質が所定のX部分と反応するわけではないからである。このセットの実験によるデータを、異なるX部分を用いた他のセットの実験によるデータと重ね合わせることで完全なプロテオームについてのデータが得られる。
DNAアレイ上でのタンパク質の分離
N1 mBiN2 n(S1)tM(R15)a(S2)bLXタンパク質(ここで、Bは三量体)、
m=n=4、i=3、t=b=1、下線を引いた配列はN1およびN2である
I. 細胞からの、または細胞もしくは組織から調製されたcDNAライブラリーのタンパク質翻訳によるタンパク質混合物の調製
タンパク質混合物は物理的または生化学的分離技術によって選択的に分離することができる。
1. 細胞培養物または組織を用いる、複雑度が限定されたタンパク質プールの調製
タンパク質は当業者に周知の方法に従って細胞培養物または組織から単離することができる。単離したタンパク質は、当業者に周知の方法(例えば、TPAE、示差的タンパク質沈殿(塩、pHおよびイオン性ポリマーによる沈殿)、差示的タンパク質結晶バルク分画、電気泳動(PAGE、等電点電気泳動、キャピラリー)およびクロマトグラフィー(イムノアフィニティー、HPLC、LC))を用いて精製する。複雑性が限定されたタンパク質混合物を含有する個々のカラム画分を抗原として用いるために回収する。
a. RNA単離
i. 全RNAの単離
培養細胞または組織を、4Mのグアニジンチオシアネートを含有する変性溶液中でホモジナイズする。次いで、ホモジネートを順に、2Mの酢酸ナトリム(pH4)、フェノールおよび最後にクロロホルム/イソアミルアルコールまたはブロモクロロプロパンと混合する。得られた混合物を遠心分離し、全RNAを含有する上側の水層を得る。イソプロパノール沈殿の後、RNAペレットを変性溶液(4Mのグアニジンチオシアネートを含有する)に溶解させ、イソプロパノールで沈殿させ、75%エタノールで洗浄する。
細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、その後のすべての操作のために氷上に維持する。回収した細胞のペレットを、非イオン性界面活性剤Nonidet P−40を含有する溶解バッファーに再懸濁する。原形質膜の溶解がほぼ瞬時に生じる。短時間微量遠心機で回転させることによって無傷の核を除去し、細胞質上清にドデシル硫酸ナトリウムを加えてタンパク質を変性させる。タンパク質をプロテアーゼで消化し、フェノール/クロロホルムおよびクロロホルム抽出によって除去する。細胞質RNAをエタノール沈殿によって回収する。
メッセンジャーRNAを、標準的な手順を用いて全RNAまたは細胞質RNA沈殿から精製する。mRNAのポリ(A)テールへのオリゴ(dT)結合によってポリ(A)+RNAを全RNAから分離することができる。ポリ(A)(ポリアデニル化)テールを露出させるために全RNAを変性させる。次いで、ポリ(A)を含有しているRNAをオリゴ(dT)でコーティングされている磁性ビーズに結合させ、磁力によって全RNAまたは細胞質RNAから分離する(spirited)。mRNA集団は、5'キャップを含有しているmRNA種の選択によって全長分子の存在についてさらに濃縮することができる。
種々の種類のプライマーを、単離したmRNAから全長または5'末端を含有しているcDNAライブラリーを合成するために用いることができる。
i. オリゴ(dT)プライマー、これにより全mRNA種についてのcDNAが得られる(図7)
適応させたオリゴdTをプライマーとするcDNAライブラリーの作製の一例を図7に提供する。
適応させた配列モチーフ特異的cDNAライブラリーの作製の一例を図8に提供する。
cDNA作製に用いるオリゴヌクレオチドはさらなる配列、1)組換えタンパク質の精製を容易にするためのタンパク質タグ特異的配列(6×His)、2)制限酵素部位、3)cDNA精製またはDNA構築の目的のために改変された5'末端(図10)を含むことができる。
アダプター分子を平滑末端化した二本鎖cDNAの両末端に、またはこのcDNAの一方の末端にのみ連結することができる。部位特異的なアダプター連結は、cDNA合成の際に、cDNAの3'末端とのアダプター連結を妨げる、5'修飾(例えば、ビオチン化、アミノ化)されたオリゴヌクレオチドにより行うこともできる。得られるcDNA分子は5'非翻訳領域、メチオニンをコードする翻訳開始コドンAUG、次いで、遺伝子(単数または複数)のコード領域からなる5'末端cDNAライブラリーを含む。cDNA分子には、その5'および3'末端に既知のDNA配列が隣接している(図14、15および16)。
既知の5'および3'末端配列または既知の内部配列に対するPCRプライマーを合成し、伸長した5'または3'増幅プライマーをcDNA分子の反対側に位置するプライマーと組み合わせて用いるcDNAの完全ライブラリーまたは特定の小集団のいずれかの増幅に用いることができる(図11)。
小集団プライマーは2つの部分(図12)を含む。プライマーの5'部分は既知配列の配列に対して相補的であり、その3'末端は未知のcDNA配列へと伸びている。ライブラリーのcDNA部分のそれぞれのヌクレオチドはアデノシン、シチジン、グアノシンまたはチミジン残基を含むことができるので、各ヌクレオチド位置には4種の異なるヌクレオチドが存在する可能性がある。各々が同一の既知配列を含み、1個のヌクレオチドがライブラリーのcDNA領域へと伸びている、4種の異なる増幅プライマーを合成することができる。4種のプライマーはその3'末端ヌクレオチドのみが異なっており、A、C、GまたはTのいずれかである。各ヌクレオチド(A、C、G、T)がDNAのひと続きの中に等しく現れると考えると、4種の増幅プライマーの各々はcDNAライブラリー中に提示される全遺伝子の四分の1を増幅することとなる。増幅プライマー配列をさらに伸ばし、増幅プライマーの数を増加させることにより、増幅産物の複雑性をさらに低下させることができる。配列を2ヌクレオチド伸ばすためは16種のプライマーの合成が必要であり、これにより複雑性は16倍低下し、3ヌクレオチドには64種のプライマーが必要であり、ヌクレオチドの伸長にはn4種の異なるプライマーが必要である。
PCR増幅には、鋳型DNAを2種の適切なオリゴヌクレオチドプライマー(相補的な方向に向けられた、既知の付加配列中に位置する5'および3'末端プライマー)、Tagまたは他の熱安定性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびバッファーを混合することが必要である。PCR産物を、サイクリング後に、DNAゲル上でまたはジーンスキャン分析ソフトウェアを用いるABI377での分析によって分析する。これらの分析法により、増幅されたcDNAプールの複雑度を決定することができる。
それぞれの増幅されたcDNAライブラリー小集団を細菌(E. coliなど)または真核生物(バキュロウイルス、酵母、哺乳類)タンパク質発現系に5'から3'の方向でクローニングする。遺伝子を、3つのフレーム全てに、その自身の翻訳開始シグナルおよび6×Hisタグとともに導入する。例えば、cDNAを2種の異なる、レアカッティング制限酵素(5'末端BgIIIおよび3'末端NotI)で処理し、バキュロウイルストランスファーベクターpVL1393の、多角体プロモーターの直接制御下に5'から3'方向にクローニングする。
直鎖状にしたバキュロウイルスDNAおよび組換えトランスファーベクターDNAを、リン酸カルシウムを用いて感受性Sf9昆虫細胞に同時トランスフェクトする。同時トランスフェクションのために、10μgの精製プラスミドDNAを準備する。最初の組換えバキュロウイルスストックを準備し、組換えタンパク質の生産のためにSf9細胞を感染させる。
発現された組換えタンパク質はアフィニティータグ(例としては6×Hisタグがある)を含む。これらをNi−NTAアガロース上で精製する。通常は、1リットルの昆虫細胞培養液当たり、約1〜2mgの6×His組換え融合タンパク質を得る。
発現ベクターまたは増幅プライマーがトロンビンのタンパク質分解性切断部位を含むように構築されている場合には、タンパク質のアフィニティー精製ステップの後に組換えタンパク質から精製タグを除去することができる。
3. 抗体タンパク質捕獲試薬の調製
cDNAのプールから翻訳された精製タンパク質調製物を、アジュバントの存在下で、選択した種の動物(ウサギ)に筋内、皮内または皮下注射する。追加免疫を初回免疫の4〜8週間後に開始し、2〜3週間間隔で続ける。ポリクローナル抗血清を当業者に公知の標準法を用いて精製する。
複合タンパク質混合物を固相上で選別するための二官能性捕獲/選別分子の作製。
ポリクローナル抗体のグリコシル化CH 2ドメインを標準的な結合法を用いて5'修飾オリゴヌクレオチドに結合させる。得られた分子は1つのタンパク質捕獲部分(抗体)と1つの核酸部分(オリゴヌクレオチド)を含む(図13)。
固体支持体に結合させたオリゴヌクレオチドを作製するために、2種の異なる方法が開発されている。これらは、in situで合成することができ、また予め合成し、支持体に結合させることもできる。いずれの場合でも、二本鎖を形成させるために、液相中でのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応に支持体に結合させたオリゴヌクレオチドを用いることができ、次いで、溶液中の過剰のオリゴヌクレオチドを洗い流すことができる。
アミン官能性を持たせたガラス支持体上で既定の配列のオリゴヌクレオチドを合成する。アミン官能基を、10mlの95%エタノール中の700μlのH2N(CH2)3Si(OCH2CH3)3の溶液を用いて、室温にて3時間スライドガラス上の別個の位置に結合させた。処理した支持体をメタノールで1回、次いで、エチルエーテルで1回洗浄する。支持体を室温で乾燥させ、次いで110℃にて15時間ベーキングした。次いで、水、メタノールと水で洗浄し、さらに乾燥させた。
オリゴヌクレオチド合成のために、3mlの無水ピリジンに溶かした400mgの無水コハク酸および244mgの4−ジメチルアミノピリジンで室温にて18時間処理することによってアミン官能性を持たせた固体支持体を調製した。この固体支持体を3ミリモル(330mg)のDCCおよび3ミリモル(420mg)のp−ニトロフェノールを含有する2mlのDMFで室温にて一晩処理した。このスライドをDMF、CH3CN、CH2Cl2およびエチルエーテルで洗浄した。2mlのDMFに溶かした2ミリモル(234mg)のH2N(CH2)6OHの溶液をスライドと一晩反応させた。この反応の生成物を支持体、−O(CH2)3NHCO(CH2)2CONH(CH2)5CH2OHとした。このスライドをDMF、CH3CN、メタノールおよびエチルエーテルで洗浄した。
精製抗体バッチは1)固体支持体に直接結合させられており、タンパク質サンプルとともにインキュベートしてもよいし、2)サンプルとともにインキュベートし、次いで捕獲化合物を用いずに固体支持体に結合させてもよいし、または3)捕獲化合物を用いてサンプル中のその対応するタンパク質を捕獲し、次いで、特異的ヌクレオチドハイブリダイゼーションによって捕獲されたタンパク質を選別するのいずれであってもよい(図14)。
6. 捕獲アレイ表面の調製
5'アミノ化オリゴヌクレオチドをホスホルアミデート化学を用いて合成し、N−オキシスシンイミド(N−oxysussinimide)エステルに結合させる。結合させたオリゴヌクレオチド配列は二官能性抗体分子の選別オリゴヌクレオチドと相補的である(図13)。タンパク質を、固体表面上に結合させた相補配列オリゴヌクレオチドへのこれらの選別オリゴヌクレオチドの核酸ハイブリダイゼーションによって捕獲する。
7. 捕獲化合物/タンパク質捕獲および選別
抗体がその対応する抗原に結合することを可能にする条件下で二官能性抗体をタンパク質サンプルとともにインキュベートする。捕獲されたタンパク質を含む二官能性抗体分子をオリゴヌクレオチドを調製した捕獲アレイに加える。抗原−抗体結合を変化させない標準的なDNAアニーリング条件下では、二官能性抗体はその核酸部分で相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
8. 捕獲タンパク質の分析
結合したタンパク質を標準的なタンパク質分析法、例えば、質量分析を用いて分析する。
トリチルをベースとするタンパク質捕獲化合物の合成(図15参照)
A. 2−(4−ブロモフェニル)−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリン、1の合成
還流冷却器をつけた500mLの丸底フラスコに入れた4−ブロモ安息香酸(50g、0.25M)に150mLの塩化チオニルをを加え、8時間還流した。真空下で過剰の塩化チオニルを除去し、得られた白色固体を100mlの無水CH2Cl2に溶解し、氷浴中で維持した。塩化ブロモベンゾイルのこの氷冷溶液に別の100mLの無水CH2Cl2中に溶解させた45gの2−アミノ−2−メチルプロパン−1−オールを、攪拌しながら1時間かけて滴下した。氷浴を取り去り、反応混合物を室温にて一晩攪拌した。沈殿した白色固体を濾過し、CH2Cl2(4×100mL)で数回洗浄した。混合したCH2Cl2を回転式エバポレーター下で除去し、得られた固体を150mLの塩化チオニルにゆっくりと溶解させ、3時間還流した。過剰のSOCl2を蒸発させて1/6容積とし、氷浴中で冷却した500mLの無水エーテルに注ぎ入れ、冷蔵庫で一晩維持した。エーテルを除去し、沈殿した塩酸塩を500mLの冷水に溶解させた。水溶液を冷条件で(氷浴)20%KOH溶液を用いて注意深く中和し、分離した褐色の油性残渣をCH2Cl2(3×200mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を除去すると、黄色のオイルとして42g(67%)の2−(4−ブロモフェニル)−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリンが得られた。1H−NMR(500 MHz, CDCl3)δ ppm:1.36(s, 6H), 4.08(s, 2H), 7.52(d, 2H), 7.79(d, 2H)。質量:254.3(M+)。
1. 方法A:アルゴン雰囲気下、20mLの乾燥DMFに溶かした550mg(8mM)のNaOEtを入れた100mLの二首丸底フラスコに3−ヒドロキシベンゾフェノン(1g、5mM)を加えた。反応物を室温にて10分間攪拌し、5mLの乾燥DMF中に溶解させた2−ブロモエトキシテトラヒドロピラン(1g、5mM)を滴下した。この反応混合物を60℃にて一晩加熱し、冷却し、氷水に注ぎいれ、CH2Cl2(2×50mL)で抽出した。混合した溶媒を無水Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させた。得られた粗残渣を、溶出剤としてヘキサン/EtOAc(9:1)混合物を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量:680mg(42%)。
還流冷却器をつけた100mLの二首丸底フラスコに、活性化したMg粉(720mg、30mM)、I2の結晶および少量のモレキュラーシーブ(molecular sieves)(A4)を、アルゴン下で入れた。この混合物に10mLのTHFを加えた。混合物を50℃に加熱し、攪拌しながら15mLの乾燥THF中に溶解させた2−(4−ブロモフェニル)−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリン(6.5g、26mM)、触媒量のCH3I、RED−AIおよびCCl4を加え、3時間還流した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、15mLの乾燥THF中に溶解させたフェニル−{3−[2−(テトラヒドロピラン−2−イルオキシ)−エトキシ]−フェニル}−メタノン(5.1g、15.6mM)を加え、再度3時間還流し、冷却し、3mLの水を加えた。回転式エバポレーター下で溶媒を除去し、CHCl3(3×100mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を除去して得られた残渣を、溶出剤としてヘキサン/EtOAc(7:3)を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離した。カラム画分を蒸発させると、黄色の結晶性固体(1.4g、18%)として2−{4'−(3−(2−テトラヒドロピラン−2−イルオキシ)エトキシ)フェニル−4''−フェニル)}−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリン(3)が得られた。1H−NMR(500MHz, CDCl3)δ ppm:1.37(s, 6H),1.5−1.63(m, 4H), 1.68(m, 1H), 1.80(m, 1H), 2.85(s, 1H, −OH), 3.49(m, 1H), 3.75(m, 1H), 3.85(m, 1H), 3.97(m, 1H), 4.09(m, 4H), 4.66(t, 1H), 6.80(d, 1H), 6.84(d, 1H), 6.88(s, 1H), 7.18−7.31(m, 6H), 7.34(d, 2H), 7.87(d, 2H)。質量:502.6(M+1)、524.5(M+Na+)。
室温にて、3mLの乾燥DMFに溶かした2−{4'−(3−(2−テトラヒドロピラン−2−イルオキシ)エトキシ)フェニル−4''−フェニル}}−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリン(3、200mg、0.4mM)およびNaH(100mg、4mM)の攪拌混合物に、2−(2−ブロモエトキシ)テトラヒドロ−2H−ピラン(500mg、2.4mM)を加え、この反応物を室温にて2時間攪拌した。次いで、反応混合物を氷水に注ぎいれ、CH2Cl2(3×20mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させると黄色の油状残渣として4が定量的収率で得られた。
3mLの80%酢酸水溶液に溶かした4(360mg)の溶液を75℃にて12時間加熱した。次いで、この溶液を蒸発させ、得られた残渣を20%のNaOH/EtOH(1:1、v/v、3mL)とともに2時間還流した。溶媒を除去し、残渣に10mLの氷冷水を加え、水溶液を1NのHClで酸性化した。沈殿した黄色固体を濾別し、水で数回洗浄し、高真空下で乾燥させた。収量:270mg(100%、定量的)。
1. 方法A:乾燥1,4−ジオキサン(2mL)に溶かしたトリチル酸5(110mg、0.26mM)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(80mg、0.7mM)の攪拌溶液に、2mLの水に溶解させた1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC、105mg、0.5mM)を加えた。この反応混合物を室温にて12時間攪拌し、CHCl3(3×10mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させて得られた固体を分取TLCプレートによって精製した。収量5mg。
室温にて、3mLの乾燥DMFに溶かした2−{4'−(3−(2−テトラヒドロピラン−2−イルオキシ)エトキシ)フェニル−4''−フェニル)}−4,4−ジメチル−1,3−オキサゾリン(3、300mg、0.6mM)およびNaH(100mg、4mM)の攪拌混合物に3−ブロモ−1−フェニルプロパン(250mg、1.2mM)を加え、反応物を室温にて2時間攪拌した。次いで、反応混合物を氷水に注ぎ入れ、CH2Cl2(3×20mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させると黄色の残渣として7が定量的収率で得られた。
3mLの80%酢酸水溶液に溶かした7(550mg)の溶液を75℃にて一晩加熱した。次いで、溶液を蒸発させ、得られた残渣を20%のNaOH/EtOH(1:1、v/v、3mL)とともに2時間還流した。溶媒を除去し、残渣に10mLの氷冷水を加え、水溶液を1NのHClで酸性化し、CH2Cl2(60 mL)で抽出し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させると黄色の固体が得られた。収量:485mg(定量的)。
乾燥THF(6mL)に溶かしたトリチル酸8(200mg、0.42mM)の攪拌溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC、206mg、1mM)を加えた。この反応混合物を室温にて30分間攪拌し、N−ヒドロキシスクシンイミド(70mg、0.6mM)および触媒量のDMAPを加え一晩攪拌した。回転式エバポレーター下で溶媒を除去し、得られた固体を乾燥エーテル中に溶解させた。沈殿したDCUを濾別し、溶媒であるエーテルを蒸発させた。得られた粗固体をCH2Cl2を用いるシリカカラムクロマトグラフィーによって分離した。収量:約120mg。1H−NMR(500MHz, CDCl3)δ ppm:1.70(m, 2H), 1.9(t, 2H), 2.9(s, 4H), 3.5(m, 2H), 3.9(t, 2H), 4.0(t, 2H), 6.85(m, 4H), 7.25(m, 4H), 7.32(m, 5H), 7.51(m, 3H), 8.09(d, 2H)。
乾燥THF(6mL)に溶かしたトリチル酸8(280mg、0.42mM)の攪拌溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド(DDC、400mg、1.95mM)を加えた。この反応混合物を室温にて30分間攪拌し、マレイミド(100mg、1.1mM)および触媒量のDMAPを加え、一晩攪拌した。回転式エバポレーター下で溶媒を除去し、得られた固体を乾燥エーテル中に溶解させた。沈殿したDCUを濾別し、溶媒であるエーテルを蒸発させた。生成物の一部を分取TLCによって精製した。収量:12mg。1H−NMR(500MHz, CDCl3)δ ppm:1.78(m, 2H), 1.95(m 2H), 2.9(s, 4H), 3.51(m, 2H), 3.93(t, 2H), 4.02(t, 2H), 6.8(m, 5H), 7.25(m, 5H), 7.29(m, 5H), 7.37(m, 3H), 7.48(d, 2H)。質量:561.3(M+)。
この実施例は、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル反応性官能基を保有している捕獲化合物への選択性官能基の付加を示す。選別基を有する化合物は、以下の化合物11の適切な類似体を用いて調製することができる。
細胞の同調化
癌細胞集団をG0/G1に濃縮することができる、シムバスタチンおよびロバスタチン(HMG−CoAレダクターゼ阻害剤)を用いてH460肺癌およびSW480大腸癌細胞をG0/G1に同調化した。G2/M期で停止した細胞をノコダゾールでの処理によって得た。
SW480細胞株をダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で培養し、H460細胞株(ATCC Manassas, VA)をRPMI 1640で培養し、FK101は5%のCO2を用いて37℃にて血清を含まない培地(SFM)で培養した。細胞培養培地には10%のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL−グルタミン、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100U/ml)を補充した。
血清を含まない培地を用いて48時間インキュベーションした後、またはU026、ロバスタチンもしくはシムバスタチンでの処理後に、G1期に濃縮されたH460およびSW480細胞が得られた。S期の細胞を、血清を含まない培地で細胞を24時間インキュベートし、次いで、20時間アフィディコリン処理(2μg/ml)し、細胞をアフィディコリンから3時間解放することによって同調化した。G2/M期で停止した細胞を、ノコダゾール(0.4〜0.8mg/ml)で16〜20時間処理することによって得た。
(4,4'−ビスフェニル−ヒドロキシメチル)ベンゾイルマレイミド誘導体の合成
スクシンイミジルエステルトリチル捕獲化合物の合成
手順1
この実施例は例示的捕獲結合アッセイ、結合に対する選択性官能基の作用を示す。この実施例は、選択性を変化させることによって捕獲化合物の反応性を変更することができ、それによって収集物を用いて生体分子の構造をプローブし選別するか、または多様性を減少させるための手段を提供することができることを示す。この実施例では、捕獲化合物のコア基はトリチル基であり、反応基は、第一級アミンと相互作用するスクシンイミドである。化合物1341は、反応基を含むが選択基を含まない非選択性化合物である。化合物1343(図20参照)は選択基が−OHである化合物の例である。選択基を変更すると、標的タンパク質(リゾチーム、チトクロムCおよびユビキチン)に対する反応性に相違が表れる。
3種の異なる捕獲化合物(HKC1343、1349、1365と命名したもの;各化合物の化学構造は化合物名の下に記載されている)をリゾチーム(受託番号P00698;図20b)と個別に反応させた。捕獲実験はMALDI−TOF質量分析計を用いて分析した。結合は20μLのサンプル容量で、25mM HEPESバッファー溶液(pH7.0)中で5μMのリゾチーム濃度を用いて実施した。タンパク質溶液にトリチルをベースとする捕獲化合物を10μMの濃度で加えた。結合反応物を室温にて30分間インキュベートした。反応を1μLの100mM TRIZMA base溶液を用いて停止させた。
4種の異なる捕獲化合物(HKC 1341、1343、1349、1365と命名したもの;各化合物の化学構造は化合物名の下に記載されている)をチトクロムC(受託番号:P00006、図20c)と個別に反応させた。捕獲実験はMALDI−TOF質量分析計を用いて分析した。結合は20μLのサンプル容量で、25mM HEPESバッファー溶液(pH7.0)中で5μMのチトクロムC濃度を用いて実施した。タンパク質溶液にトリチルをベースとする捕獲化合物を10μMの濃度で加えた。結合反応物を室温にて30分間インキュベートした。反応を、1μLの100mM TRIZMA base溶液を用いて停止させた。捕獲化合物−タンパク質結合混合物を、1μLのアリコートの結合反応物を1μLの30%アセトニトリルに溶かした10mg/mLのシナピン酸水溶液と混合することによって質量分析のために準備した。このサンプルを500nLのスポットとして質量標的プレートの表面にデポジットし、続いて、質量スペクトル分析の前に風乾させた。図20cに示す質量スペクトル分析の結果は、化合物に選択基を付加することにより捕獲化合物の結合特異性を変更することができることを証明している。
例示的捕獲化合物の1種(HKC1343)を3種の異なるタンパク質(ユビキチン[P02248]、チトクロムC[P00006]およびリゾチーム[P00698])の混合物とともにインキュベートした(図20d参照)。捕獲実験はMALDI−TOF質量分析計を用いて分析した。結合反応は20μLのサンプル容量で、25mM HEPESバッファー溶液(pH7.0)中で3種すべてのタンパク質を5μMの濃度で用いて実施した。タンパク質溶液にトリチルをベースとする捕獲化合物を25μMの濃度で加えた。結合反応物を室温にて30分間インキュベートし、反応を、1μLの100mM TRIZMA base溶液を用いて停止させた。捕獲化合物−タンパク質結合混合物を、1μLのアリコートの結合反応物を1μLの30%アセトニトリルに溶かした10mg/mLのシナピン酸水溶液と混合することによって質量分析のために準備した。このサンプルを500nLのスポットとして質量標的プレートの表面にデポジットし、質量スペクトル分析の前に風乾させた。図20dに示す質量スペクトル分析の結果は、選択的である単一の捕獲剤に結合した複数の化合物を質量スペクトル分析によって同定できることを証明している。
別の例示的な捕獲化合物(HKC 1365)を3種の異なるタンパク質(ユビキチン[P02248]、チトクロムC[P00006]およびリゾチーム[P00698])の混合物とともにインキュベートした(図20d参照)。捕獲実験はMALDI−TOF質量分析計を用いて分析した。結合反応は20μLのサンプル容量で、25mM HEPESバッファー溶液(pH7.0)中で3種すべてのタンパク質を5μMの濃度で用いて実施した。タンパク質溶液にトリチルをベースとする捕獲化合物を15μMの濃度で加えた。結合反応物を室温にて30分間インキュベートし、反応を、1μLの100mM TRIZMA base溶液を用いて停止させた。捕獲化合物−タンパク質結合混合物を、1μLのアリコートの結合反応物を1μLの30%アセトニトリルに溶かした10mg/mLのシナピン酸水溶液と混合することによって質量分析のために準備した。このサンプルを500nLのスポットとして質量標的プレートの表面にデポジットし、質量スペクトル分析の前に風乾させた。図20eに示す質量スペクトル分析の結果は、選択的である単一の捕獲剤に結合した複数の化合物を質量スペクトル分析によって同定できることを証明している。
図20fはチトクロムCと非特異的化合物(HKC 1341)との経時的な反応の質量スペクトルを示す。スクシンアミド反応基はチトクロムCのリジンと特異性および反応性を示す。上段のスペクトルは0時点で修飾がないということを示し、中段のスペクトルは30分後のHKC1341の結合により生じた1〜9の修飾を示し、下部のスペクトルは24時間後の17および18の修飾を示し、これはチトクロムC中のリジンの数(18)に相当する。
この実施例は、捕獲化合物の混合物およびタンパク質の混合物と反応する捕獲化合物の選択性を示す
材料:
反応バッファー: 25mM HEPES、pH7.0
タンパク質: ユビキチン、チトクロムcおよびリゾチーム(モル比は1/5/6)、タンパク質ストックは反応バッファー中の5mg/ml(全タンパク質)として作製する。
捕獲化合物: HKC 1343およびHKC 1365、ストック溶液はアセトニトリル中の1mMである。
タンパク質希釈液(混合物)を反応バッファー中でユビキチン、チトクロムcおよびリゾチームそれぞれについて0.5、2.5および3μMの濃度で調製する。19.5μlを1つの捕獲反応に用いる。各反応は0.5μlの1mM 化合物ストック溶液を加えることによって開始する(最終25μM)。反応混合物を室温にて30分間インキュベートし、その後、5mM TRIZMAを加えることによって反応を停止する。
4-{ヒドロキシ-[3-(3-{6-[5-(2-オキソ-ヘキサヒドロ-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)-ペンタノイルアミノ]-ヘキサノイルアミノ}-プロポキシ)-フェニル]-フェニル-メチル}-安息香酸スクシンイミジルエステル(6)の合成
2-(4-ブロモフェニル)-4,4-ジメチル-1,3-オキサゾリン 1は実施例4に記載のように調製した。-78 ℃の無水 THF (10 mL)中の2-(4-ブロモフェニル)-4,4-ジメチル-1,3-オキサゾリン (1.5 g, 6 mM)の撹拌した溶液に、ヘキサン中のn-BuLi (384 mg, 6 mM)を20 分かけてゆっくりと加えた。その後、反応混合物を-78℃で更に30 分間撹拌した。この撹拌した溶液に、anhy. THF (10 mL)に溶解した3-ヒドロキシベンゾフェノン (534 mg, 2.7 mM)を、-78 ℃で滴下し、室温にて一夜撹拌し得る。この反応混合物に水20 mLを加え、反応物をクエンチし、CH2Cl2 (3x50 mL)で抽出し、合わせた抽出物を無水 Mg2SO4で乾燥させた。溶媒の蒸発で得られた油性の残渣を、ヘキサン/EtOAc (1:1) 混合物を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色結晶固体として3-{[4-(4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-オキサゾール-2-イル)-フェニル]-ヒドロキシ-フェニル-メチル}-フェノール (2)を得た。収量: 0.855 g (85%). 質量: 374 (MH+), 372 (M-H).
室温の無水DMSO (2.5 mL)中の粉末KOH (45 mg, 0.8 mM)の溶液に、3-{[4-(4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-オキサゾール-2-イル)-フェニル]-ヒドロキシ-フェニル-メチル}-フェノール (2, 150 mg, 0.4 mM)および(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(96 mg, 0.4 mM)を加えた。その反応混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、該反応混合物を酢酸エチル(3x25 mL)で抽出し、合わせた抽出物を無水Mg2SO4で乾燥させた。溶媒の蒸発により得られた残渣を、溶出液としてヘキサン/EtOAc (1:1)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。溶媒の蒸発により、3を得た。収量: >220 mg (定量的収量). 質量: 531 (MH+).
[3-(3-{[4-(4,4-ジメチル-4,5-ジヒドロ-オキサゾール-2-イル)-フェニル]-ヒドロキシ-フェニル-メチル}-フェノキシ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル(3, 220 mg)を入れた50 mL丸底フラスコに、80% 水性 AcOH 3 mLを加え、反応混合物を75℃で一夜加熱した。次いで、反応混合物を濃縮し、乾燥させ、20% NaOH/EtOH (1:1, v/v) 3 mLを加え、三時間還流した。溶媒の蒸発で得られた残渣をCH3OH/CHCl3 混合物に溶解し、シリカゲルに吸着させ、乾燥させた。乾燥した化合物を有するシリカゲルを、Et2O 溶液中の1% NH4OHで既にフラッシュしたシリカゲルカラムにより精製した。50% CH3OH/CH2Cl2でのカラムの溶出により、無色のゲル固体として4-{[3-(3-アミノ-プロポキシ)-フェニル]-ヒドロキシ-フェニル-メチル}-安息香酸、4を得た。収量: 96%. 質量: 378 (MH+), 376 (M-H), 360(M-OH).
トリチルアミノ酸(4, 100 mg, 0.26 mM)およびビオチン-X-NHS(113mg, 0.25 mM)の混合物を、無水DMF 3 mL中、室温で一夜撹拌した。その後、DMFを高真空で除去し、得られた残渣を、溶媒として50% CH3OH/CHCl3を用いシリカゲルカラムに通過させた。溶媒の蒸発により、ビオチニル化トリチル酸 5を得た。(97.8%). 質量: 739(M Na+), 715 (M-H).
無水DMF(3 mL)中のビオチニル化トリチル酸 (5, 175 mg, 0.244 mM)の溶液に、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(4 mg, 0.35 mM)を加え、5 分間、反応混合物を撹拌させた。この反応混合物に、N-ヒドロキシスクシンイミド(40mg, 0.32 mM)を加え、室温で一夜撹拌した。溶媒を高真空で除去し、得られた残渣を、溶媒系としてCH3OH/CH2Cl2, 3:7)混合物を用いシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。溶媒の蒸発により、白色結晶固体として6を得た。収量: 80 mg (41%). 1H-NMR (CD3OD) δ ppm:
1.29-1.71 (m, 12H), 1.90-193 (m, 2H), 2.15 (q, 4H), 2.49 (t, 1H), 2.8-2.91 (m 2H,), 2.90 (s, 4H), 3.17(m, 4H), 3.94 (q, 3H), 4.27 (dd, 1H), 4.46 (d of d , 2H), 4.59 (br. S, 4H), 6.77(s, 1H), 6.86 (m, 2H), 7.18-7.39 (m, 5H), 7.51 (d, 2H), 8.05 (m, 2H). 質量: 836.6(Mna+), 812.4 (M-H).
4-[ブトキシ-(3-ヒドロキシ-フェニル)-フェニル-メチル]-安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルの合成
ドープしたカルボニックアンヒドラーゼ IIを伴うHEK293細胞性画分からの標的タンパク質の捕獲およびプルダウン(pull-down)
20 mM Hepes 緩衝液、pH 7.2.
200 μl 20 mM Hepes、pH 7.2を加え、凍結乾燥化カルボニックアンヒドラーゼ II(Sigma)を元に戻す。エッペンドルフ(登録商標)チューブに移す。ワーキングストックの濃度を算出し(以下のプロトコール参照)、同じ緩衝液を用いストックを作成し、マスターストックを作成する。マスターストックを長期保存のため凍結させる。
Sigma mass quality water
A. 反応プレート上のウェルに、25 μl FT293、x μlのカルボニックアンヒドラーゼ IIストック、y μlの化合物ストック溶液、および25-x-y μlの20 mM Hepes 緩衝液、pH 7.2をピペットする。50μlの反応ではyの値は2.5μl以内とする。混合物中のFT画分を最終混合物で2倍に希釈する。S100では、3倍を超える希釈を必要とする。特定の実施態様では、50μl反応のS100では15μlを用い、従って、緩衝液体積を変える。
結合強度の決定(解離定数)
このアプローチは、光分解は、共有結合架橋に対する活性化により、非常に早い時間スケールで生ずるという観察に基づいている(ナノ秒からミリ秒、光活性化部分に依存)。それ故、平衡での酵素-基質複合混合物のスナップショットを生ずる光分解を用いることが考えられ得る。共有結合的に架橋した酵素-基質の量は、平衡での酵素-結合基質(捕獲化合物)の量に直接比例する。最も重要なことに、開始酵素の僅かな量ぐらいのこの量は、プルダウン工程後にoff-the-shelf Maldi Machineを用いることにより、非常に容易で信頼のある測定が可能となる。
分析の始めは解離定数の定義である。
K d = [ S ] [ E ] / [ SE ]
式中、[S]、[E]および[SE]は、遊離基質、遊離酵素および基質-酵素複合体のそれぞれの濃度である。この等式をより有用にするために、以下のようなより直ちに測定可能である変数を用いる等式で書き換えることができる:
[S 0] = 基質の初期濃度
[E 0] = 酵素の初期濃度
K d = ([S 0] - [SE]) ([ E 0] - [SE]) / [ SE].
基質濃度が複合体濃度よりも遙かに高くなる、すなわち、( [S 0 ] >> [SE] )という仮定により等式を更に単純化し得る。この場合、以下のように単純化する。
[SE] = E 0 /( 1 +K d / [S 0])
中心となる仮定は、光分解工程が非常に迅速な工程であり、そのため、共有結合的に架橋した基質酵素複合体が平衡にある複合体の量と直接比例するというものである。すなわち、我々は平衡濃度のスナップショットを実際にとっているのである。
基質がビオチニル化化合物であるならば、プルダウン実験で、共有結合的に捕獲した複合体が単離されるだろう。プルダウン効率をβとする。Maldi内のこの複合体のピーク面積、Aにより、プルダウン複合体の直接の測定濃度が得られる。
A = β * α * E 0 / ( 1 + K d / [S 0])
上記等式から、Aと基質の初期濃度との間には非常に単純な関係がある:
ln(A) = ln(β) + ln(α) + ln(E 0) - ln(1 + K d / [S 0])
ln(A) = ln(β) + ln(α) + ln(E 0) - K d / [S 0]
外部標準の使用ができず、または望ましくない場合、K dの差を測定することもできる。捕獲され、プルダウンされ、およびマススペクトルされる2種の酵素があると想定する。非常に選択的な化合物の場合、光分解およびプルダウン効率も非常に似ていると見なされるのは理にかなっている。その解離定数がK d 1 および K d 2であるとすると、それぞれ、初期酵素濃度はE 0 1 および E 0 2 であり、それぞれのMaldi ピーク面積はA1およびA2である。以下の等式が得られる。
ln(A1/ A2) = ln(E 0 1/ E 0 2) - ( K d 1 - K d 2 )/ [S 0].
経口血糖降下薬/抗糖尿病薬:
チアゾリジンジオン(グリタゾン(Glitazone)): トログリタゾン(リズリン(商標)) ロシグリタゾン (アバンディア(商標))およびピオグリタゾン(Pioglitazone)(アクトス(商標))
I. 開発および薬理学
トログリタゾン(リズリン(商標))は、上市された最初のチアゾリジンジオンであり、インスリンを受けている、また、単剤療法として受けているインスリン-耐性患者の治療に適応された。トログリタゾンは、肝障害への関与から市場から回収されるまで、用いられていた。しかし、2つの新しい「グリタゾン」が近年認可され、これらの薬物は特にインスリン耐性を標的とする。これら新しいグリタゾン、それぞれはまた、副作用を有している。
最小限の低血糖症: 今日、低血糖症は、比較的少数のグリタゾン-治療患者で観察された。グリタゾンと組み合わせる積極的なインスリン投薬は、更なるHbA1cの減少と関係するが、低血糖症のリスクの増大とも関係する。
心臓および腎臓の機能が弱い6人の男性患者において、アバンディア(登録商標)およびアクトス(登録商標)が、心不全の要因であった。
構造的な分類(すなわち、チアゾリジンジオン)および下位分類(すなわち、生成物)
薬理的/治療的プロファイルおよび構造的下位分類内での活性の差異に関与する鍵となる構造的特長の同定(すなわち、チアゾリジンジオン)
各薬物/薬物クラスの作用機構の詳細な理解
- インスリン依存または非依存作用
- 機構に関する種々の構造クラスの薬物の比較
構造シリーズ(すなわち、チアゾリジンジオン)内での、およびシリーズを通した相対的効力
鍵となる素質要因(タンパク質結合)
機構または他の要因への作用および関係の相対的開始
代謝工程および代謝物の活性(治療作用への関与)
排泄プロファイル: 親薬物および/または代謝物として腎性および/または非腎性か?
非標的タンパク質結合が原因の腎臓または肝臓に障害のある患者での使用/注意
副作用:
- 作用などの間の、低血糖症の相対的発生および作用機構との関係
- 体重増加
- GI 効果
- 腎臓生理機能に対する効果
- 他の鍵となる薬剤: すなわち、乳酸アシドーシス
- シリーズ(すなわち、チアゾリジンジオン)内での、および鍵となる副作用における構造的シリーズ間での類似および差異
効力を含み得る重要な薬物相互作用:
- 薬物動力学に基づく相互作用: 吸収による障害、
代謝/シトクロムに基づく相互作用、排泄の競争など
- 薬理学: 低血糖または高血糖作用を有する他の薬物との使用
- 鍵となる薬物相互作用についての、シリーズ(すなわち、チアゾリジンジオン)内での、および構造的シリーズ間での類似および差異
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体-γ(PPAR-γ): インスリン耐性およびβ-細胞機能の可能性ある役割
チアゾリジンジオンは、前糖尿病者と糖尿病患者の両方でインスリン耐性を減少する薬理学的化合物である。チアゾリジンジオンはPPAR-γ2のリガンドである。PPAR-γ2は、含脂肪細胞、腸、およびマクロファージにおいて優性的に発現する。低レベルの発現がまた、筋細胞で生じ得る証明が幾つかある。PPAR-γ 受容体は、多くの遺伝子の発現を調整する転写因子である。インスリン感受性におけるチアゾリジンジオンの効果が、PPAR-γ 2-依存遺伝子の発現の変化を介すると考えられる。
Claims (170)
- 生体分子の混合物中の薬物の非標的生体分子を同定する方法であって、生体分子の混合物と捕獲化合物の収集物とを接触させることを含む該方法、ここで、該収集物は、捕獲化合物のセットを含む複数の捕獲化合物を含有しており、捕獲化合物の各セットが、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X、捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y、ならびにXおよびYを提示する部分Zとを含む。
- 生体分子の混合物中の薬物の非標的生体分子を同定する方法であって、
生体分子の混合物と捕獲化合物とを接触させること、ここで、
該捕獲化合物が、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X、捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y、ならびにXおよびYを提示する部分Zとを含む;および
捕獲した生体分子を分析し、薬物の非標的物を同定すること、
を含む、該方法。 - 捕獲化合物の各セットが更に部分Z上に部分Qを含み、それによって、各セットは異なるQを含む、ここでQは各セットを分離する、請求項1の方法。
- 部分Yが医薬品、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグである、請求項1−3の何れかの方法。
- 部分Yが、Z部分の種々の連結点を介し異なる向きで該部分に連結する、請求項1−4の何れかの方法。
- 生体分子がタンパク質である、請求項1−5の方法。
- 生体分子が受容体である、請求項1−6の何れかの方法。
- (なし)
- 生体分子が酵素である、請求項1−8の何れかの方法。
- Qが、固体支持体上で、その表面またはその上にある分子と結合することによって捕獲化合物を整列させることによって分離を可能にする、請求項3−9の何れかの方法。
- 捕獲化合物のセットが少なくとも10種の異なる捕獲化合物を含む、請求項1、3−10の何れかの方法。
- 捕獲化合物のセットが少なくとも50種の異なる捕獲化合物を含む、請求項1、3−10の方法。
- 捕獲化合物のセットが少なくとも100種の異なる捕獲化合物を含む、請求項1、3−10の何れかの方法。
- Qが、固体支持体上のアドレス可能な位置に整列させるための化学基である、請求項3−13の何れかの方法。
- Qが塩基相補的な一本鎖核酸分子または類似体と安定なハイブリッドを形成するために十分な長さの一本鎖部分を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である、請求項3〜20の何れかの方法。
- Qが次式N1 sBiN2 u、
{式中、N1、BおよびN2はそれぞれs、tおよびu個のメンバーを含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であり、
Bは少なくとも2個の塩基を含む、配列並べ替え領域であり、かつ
s、iおよびuの合計が少なくとも5である}
を有する、請求項3〜21の何れかの方法。 - s、iおよびuの合計が約5から約50までである、請求項22に記載の方法。
- N1、BおよびN2の各メンバーがデオキシリボ核酸、リボ核酸、タンパク質核酸およびその類似体の単量体構築ブロックの中から独立に選択される、請求項22または請求項23に記載の方法。
- Zが光切断可能な、酸切断可能な、アルカリ切断可能な、酸化的に切断可能なまたは還元的に切断可能な基である、請求項1〜24の何れかの方法。
- Zが不溶性支持体を含んでなり、それにX、YおよびQ各々が直接またはリンカーを介してのいずれかで結合している、請求項1〜25の何れかの方法。
- 不溶性支持体がビーズ、キャピラリー、プレート、メンブラン、ウエハー、コーム、ピン、ピンを備えたウエハー、ピットまたはナノリットルウェルのアレイ、および別々の位置でサンプルを受容するかそれと結合する平坦な表面からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 支持体がシリコン、シリカゲル、ガラス、ナイロン、ワング(Wang)樹脂、メリフィールド(Merrifield)樹脂、エピクロロヒドリンと架橋しているデキストラン、アガロース、セルロース、磁性ビーズ、ダイナビーズ(Dynaビーズ)、金属表面またはプラスチック材料を含む、請求項26または請求項27に記載の方法。
- Zがポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンもしくはテフロン(登録商標)を含む疎水性ビーズ、またはセルロース、エピクロロヒドリンと架橋しているデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、シリカゲルおよび制御された細孔性ガラスを含む親水性ビーズを含む、請求項26〜28の何れかの方法。
- Z部分がスペーサー基S1および/またはS2、ならびに切断可能な結合を含み、S1および/またはS2部分は不溶性支持体に連結されており、かつ、切断可能な結合は、存在する場合にはS2に、そうでない場合には不溶性支持体に連結されている、請求項26〜29の何れかの方法。
- Zが少なくとも三価部分であり、かつ、直鎖または分枝鎖アルキレン、直鎖または分枝鎖アルケニレン、直鎖または分枝鎖アルキニレン、直鎖または分枝鎖アルキレンオキシ、直鎖または分枝鎖アルキレンチオ、直鎖または分枝鎖アルキレンカルボニル、直鎖または分枝鎖アルキレンアミノ、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、シクロアルキレンオキシ、シクロアルキレンチオ、シクロアルキレンカルボニル、シクロアルキレンアミノ、ヘテロシクリレン、アリーレン、アリーレンオキシ、アリーレンチオ、アリーレンカルボニル、アリーレンアミノ、ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレンオキシ、ヘテロアリーレンチオ、ヘテロアリーレンカルボニル、ヘテロアリーレンアミノ、オキシ、チオ、カルボニル、カルボニルオキシ、エステル、アミノ、アミド、ホスフィノ、ホスフィンオキシド、ホスホルアミダート(phosphoramidato)、ホスフィンアミダート(phosphinamidato)、スルホンアミド、スルホニル、スルホキシド、カルバマート(carbamato)、ウレイドおよびこれらの組み合わせから選択され、かつ、非置換であるかまたは各々独立にR15から選択される1個以上の置換基で置換されており、
各R15は独立に直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アリールアルキル、直鎖または分枝鎖アリールアルケニル、直鎖または分枝鎖アリールアルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖ヘテロアリールアルキル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルキニル、ハロ、直鎖または分枝鎖ハロアルキル、シュードハロ、アジド、シアノ、ニトロ、OR60、NR60R61、COOR60、C(O)R60、C(O)NR60R61、S(O)qR60、S(O)qOR60、S(O)qNR60R61、NR60C(O)R61、NR60C(O)NR60R61、NR60S(O)qR60、SiR60R61R62、P(R60)2、P(O)(R60)2、P(OR60)2、P(O)(OR60)2、P(O)(OR60)(R61)およびP(O)NR60R61から選択される一価の基であり、
qは0〜2の整数であり、
R60、R61、R62は各々独立に水素、直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニルまたは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである
(ただし、Zは生体分子の分析の前またはその間に切断することができる)、請求項1〜25の何れかの方法。 - Zが少なくとも三価部分であり、かつ、直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、(C(R15)2)d、O、S、(CH2)d、(CH2)dO、(CH2)dS、>N(R15)、(S(O)u)、(S(O)2)w、>C(O)、(C(O))w、(C(S(O)u))w、(C(O)O)w、(C(R15)2)dO、(C(R15)2)dS(O)u、O(C(R15)2)d、S(O)u(C(R15)2)d、(C(R15)2)dO(C(R15)2)d、(C(R15)2)dS(O)u(C(R15)2)d、N(R15)(C(R15)2)d、(C(R15)2)dNR15、(C(R15)2)dN(R15)(C(R15)2)d、-(CH2)dC(O)N(CH2)d-、-(CH2)dC(O)N(CH2)dC(O)N(CH2)d-、(S(R15)(Ou)w、(C(R15)2)d、(C(R15)2)dO(C(R15)2)d、(C(R15)2)d(C(O)O)w(C(R15)2)d)、(C(O)O)w(C(R15)2)d、(C(R15)2)d(C(O)O)w、(C(S)(R15)w、(C(O))w(CR15 2)d、(CR15)d(C(O))w(CR15)d、(C(R15)2)d(C(O))w、N(R15)(C(R15)2)w、OC(R15)2C(O)、O(R15)2C(O)N(R15)、(C(R15)2)wN(R15)(C(R15)2)w、(C(R15)2)wN)R15)、>P(O)v(R15)x、>P(O)u(R15)3、>P(O)u(C(R15)2)d、>Si(R15)2およびこれらの基のいずれかの組み合わせから選択され
u、vおよびxは各々独立に0〜5であり、
各dは独立に1〜20または1〜12または1〜6または1〜3の整数であり、
各wは独立に1〜6または1〜3または1〜2から選択される整数である
(ただし、Zは生体分子の分析の前またはその間に切断することができる)、請求項1〜25および31の何れかの方法。 - Zがアリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、>C(R15)2、C(R15)=C(R15)、>C=C(R23)(R24)、>C(R23)(R24)、C≡C、O、>S(A)u、>P(D)v(R15)、>P(D)v(ER15)、>Si(R15)2、>N(R15)、>N+(R23)(R24)および>C(E);(ここで、uは0、1または2であり、vは0、1、2または3であり、AはOまたはNR15であり、DはSまたはOであり、かつ、EはS、OまたはNR15である)、からなる群より選択される基のいずれかの組み合わせを含む三価部分であり、その基はどの順序で組み合わせてもよく、
各R15は水素およびY1R18からなる群より独立に選択される一価の基であり、
各Y1は独立に以下の群:直接結合、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、>C(R17)2、C(R17)=C(R17)、>C=C(R23)(R24)、>C(R23)(R24)、C≡C、O、>S(A)u、>P(D)v(R17)、>P(D)v(ER17)、>N(R17)、>N(COR17)、>N+(R23)(R24)、>Si(R75)2および>C(E);(ここで、uは0、1または2であり、vは0、1、2または3であり、AはOまたはNR17であり、DはSまたはOであり、かつ、EはS、OまたはNR17である)のいずれかの組み合わせを有する二価の基であり、その基はどの順序で組み合わせてもよく、
R17およびR18は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、-SiR27R28R25、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20からなる群より選択され、
R19およびR20は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびヘテロシクリルから選択され、
R23およびR24は以下の(i)または(ii);
(i)R23およびR24は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される、または
(ii)R23およびR24はともにアルキレン、アルケニレンまたはシクロアルキレンを形成する
から選択され、
R25、R27およびR28は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20から選択される一価の基であり、
R15、R17、R18、R19、R20、R23、R24、R25、R27およびR28は、Z2から各々独立に選択される1以上の置換基で置換されていてもよく、Z2はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、-S(O)hR35(ここで、hは0、1または2である)、NR35R36、COOR35、COR35、CONR35R36、OC(O)NR35R36、N(R35)C(O)R36、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアラルキル、 ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、アルコキシカルボニル、カルボキシアリール、ハロ、シュードハロ、ハロアルキルおよびカルボキサミドから選択され、
R35およびR36は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリル、トリアリールシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アミノ、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノおよびアリールアミノの中から選択される、
(ただし、Zは、当該化合物の質量スペクトル分析を含む分析の前またはその間に切断することができる)、請求項1〜25および31〜32の何れかの方法。 - Zが次式
(S1)tM(R15)a(S2)bL、
{式中、S1およびS2はスペーサー部分であり、
tおよびbは各々独立に0または1であり、
aは0〜4の整数であり、
Mは3以上の結合点を含む中心部分であり、
各R15はY2R18から独立に選択される一価の基であり、
各Y2は以下の基:直接結合、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、>C(R17)2、C(R17)=C(R17)、>C=C(R23)(R24)、>C(R23)(R24)、C≡C、O、>S(A)u、>P(D)v(R17)、>P(D)v(ER17)、>N(R17)、>N(COR17)、>N+(R23)(R24)、>Si(R17)2および>C(E);(ここで、uは0、1または2であり、vは0、1、2または3であり、AはOまたはNR17であり、DはSまたはOであり、かつ、EはS、OまたはNR17であり、その基はどの順序で組み合わせてもよい)のいずれかの組み合わせを独立に含む二価の基であり、
R17およびR18は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、SiR27R28R25、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20からなる群より選択され、
R19およびR20は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびヘテロシクリルから選択され、
R23およびR24は以下の(i)または(ii);
(i)R23およびR24は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される、または
(ii)R23およびR24はともにアルキレン、アルケニレンまたはシクロアルキレンを形成する
から選択され、
R25、R27およびR28は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20から選択される一価の基であり、
R15、R17、R18、R19、R20、R23、R24、R25、R27およびR28は、Z2から各々独立に選択される1以上の置換基で置換されていてもよく、Z2はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、S(O)hR35(ここで、hは0、1または2である)、NR35R36、COOR35、COR35、CONR35R36、OC(O)NR35R36、N(R35)C(O)R36、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアラルキル、 ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、アルコキシカルボニル、カルボキシアリール、ハロ、シュードハロ、ハロアルキルおよびカルボキサミドから選択され、
R35およびR36は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリル、トリアリールシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アミノ、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノおよびアリールアミノの中から選択され、かつ
Lは化合物の質量スペクトル分析の前またはその間に切断可能な基である}
を有する、請求項1〜25および31〜33の何れかの方法。 - Mが四価アルキレン、四価フェニレン、四価ビフェニレンまたは四価ヘテロ二官能性トリチル誘導体であり、かつ、非置換であるかまたは各々独立にR15から選択される1〜4個の基で置換されている、請求項34に記載の方法。
- Lがジスルフィド部分、光切断可能な基、酸切断可能な基、アルカリ切断可能な基、酸化的に切断可能な基、または還元的に切断可能な基である、請求項34〜37の何れかの方法。
- Lがトリチルエーテル、オルトニトロ置換されたアリール基、o-ニトロベンジル、フェナシル、ニトロフェニルスルフェニル基である、請求項34〜38の何れかの方法。
- Lが以下の式I、IIまたはIII
R21は水素、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびカルボキシから選択され、
R22は水素であり、tは0〜3であり、
R50はアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシであり、
X20は水素、アルキルまたはOR20であり、
R1は水素であり、
R2はω-ヒドロキシアルコキシ、ω-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)アルコキシ、ω-ヒドロキシアルキルおよびω-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)アルキルの中から選択され、かつ、非置換であるかまたはアルキルまたはアルコキシ鎖が1以上のアルキル基で置換されており、かつ
cおよびeは各々独立に0〜4である}
を有する、請求項34〜39の何れかの方法。 - LがSS、OP(=O)(OR51)NH、pMeoNO2PhCH2、OC(=O)、および
yは0〜4の整数である}
の中から選択される、請求項34〜40の何れかの方法。 - R15がH、OH、OR51、SH、SR51、NH2、NHR51、N(R51)2、F、Cl、Br、I、SO3H、PO2 4、CH3、CH2CH3、CH(CH3)2またはC(CH3)3であり、R51が直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルキニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルケニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、あるいは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである、請求項34〜41の何れかの方法。
- 各Xが活性エステル、活性ハロ部分、アミノ酸側鎖特異的官能基、酵素の活性部位と結合する試薬、受容体と結合するリガンド、生体分子表面に結合する特異的ペプチド、レクチン、抗体、抗原、ビオチン;ストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項1〜42の何れかの方法。
- Xがα-ハロエーテル、α-ハロカルボニル基、マレイミド、金属錯体、エクスポキシド、イソチオシアネートまたはリン酸化されたかまたはグリコシル化されたペプチド/タンパク質に対する抗体である、請求項1〜43の何れかの方法。
- XがC(=O)OPhpNO2、C(=O)OC6F5、C(=O)O(Nスクシンイミジル)、OCH2I、OCH2Br、OCH2Cl、C(O)CH2I、C(O)CH2BrまたはC(O)CH2Clである、請求項1〜44の何れかの方法。
- メンバーである化合物がZに連結された質量改変タグを含む、請求項1〜46の何れかの方法。
- メンバーである化合物が質量改変タグを含み、かつ、その質量改変タグがZに連結されているか、またはS2である、請求項30に記載の方法。
- 質量改変されたZ部分が次式
(S1)tM(R15)a(S2)bLT
を有し、かつ、
Tは質量改変タグである、
請求項34〜48の何れかの方法。 - 質量改変タグが次式X1R10を有する二価の基であり、かつ、以下の(i)〜(vii):
(i)X1はO、OC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(S)NH、OP(O-アルキル)O、OSO2O、OC(O)CH2S、S、NHおよび
R10は(CH2CH2O)zCH2CH2O、(CH2CH2O)zCH2CH2Oアルキレン、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、(CH2)zCH2O、(CH2)zCH2Oアルキレン、(CH2CH2NH)zCH2CH2NH、CH2CH(OH)CH2O、Si(R12)(R13)、CHFおよびCF2から選択される二価の基であり、yは1〜20の整数であり、zは0〜200の整数であり、R11は天然に生ずるαアミノ酸の側鎖であり、かつ、R12およびR12は各々独立にアルキル、アリールおよびアラルキルから選択され、
(ii)SS、
(iii)S、
(iv)(NH(CH2)yNHC(O)(CH2)yC(O))zNH(CH2)yNHC(O)-(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)、
(v)(NH(CH2)yC(O))zNH(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)、
(vi)(NHCH(R11)C(O))zNHCH(R11)C(O)O(ここで、R11およびzは(i)と同様に選択される)、あるいは
(vii)(O(CH2)yC(O))zNH(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)
から選択される、請求項47〜49の何れかの方法。 - S2が次式X1R10を有し、X1R10が以下の(i)〜(vii):
(i)X1はO、OC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)(CH2)yC(O)O、NHC(S)NH、OP(O-アルキル)O、OSO2O、OC(O)CH2S、S、NHおよび
R10は(CH2CH2O)zCH2CH2O、(CH2CH2O)zCH2CH2Oアルキレン、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、(CH2)zCH2O、(CH2)zCH2Oアルキレン、(CH2CH2NH)zCH2CH2NH、CH2CH(OH)CH2O、Si(R12)(R13)、CHFおよびCF2から選択される二価の基であり、yは1〜20の整数であり、zは0〜200の整数であり、R11は天然に生ずるαアミノ酸の側鎖であり、かつ、R12およびR12は各々独立にアルキル、アリールおよびアラルキルから選択され、
(ii)SS、
(iii)S、
(iv)(NH(CH2)yNHC(O)(CH2)yC(O))zNH(CH2)yNHC(O)-(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)、
(v)(NH(CH2)yC(O))zNH(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)、
(vi)(NHCH(R11)C(O))zNHCH(R11)C(O)O(ここで、R11およびzは(i)と同様に選択される)、あるいは
(vii)(O(CH2)yC(O))zNH(CH2)yC(O)O(ここで、yおよびzは(i)と同様に選択される)
から選択される、請求項48に記載の方法。 - Qが少なくとも「j」個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、収集物が、約10〜4j種(jはオリゴヌクレオチドの一本鎖部分の塩基数である)の化合物を含む、請求項1〜51の何れかの方法。
- Zが化合物の質量スペクトル分析の間に切断することができる部分である、請求項52に記載の方法。
- Zが化合物の質量スペクトル分析の間に切断できない部分である、請求項52に記載の方法。
- 捕獲化合物の収集物を含む組成物が、各Qと相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、複数のオリゴヌクレオチドまたはその類似体とハイブリダイズする、請求項3〜55の何れかの収集物を含む方法。
- Qと相補的であるオリゴヌクレオチドまたはその類似体がアレイとして固体支持体上に固定化されている、請求項55に記載の方法。
- 支持体がアドレス可能なアレイである、請求項56に記載の方法。
- 生体分子が捕獲化合物と共有結合する、請求項1〜57の何れかの方法。
- 生体分子にはタンパク質が含まれる、請求項58に記載の方法。
- 生体分子には受容体が含まれる、請求項58に記載の方法。
- 生体分子には酵素が含まれる、請求項58に記載の方法。
- 捕獲化合物が、
反応機能性 Xおよび選択性官能基性 Yに連結する中心コアZ、それにより、捕獲化合物は、混合物中の生体分子と共有結合を形成するか、または高い安定性で相互作用し、そのため、選択性官能基の存在下での、反応性官能基による、捕獲化合物の生体分子との結合親和性が、選択性官能基が存在しない場合よりも少なくとも10倍高い、
を含む、請求項1〜61の何れかの方法。 - 収集物中の化合物が、発光アッセイの試薬または比色アッセイで検出される基および一本鎖オリゴヌクレオチドを有している選別基Qを含有しているZを含む、請求項3〜62の何れかの方法。
- Zが固体支持体である、請求項19の方法。
- Zが粒子性の支持体である、請求項19の方法。
- 捕獲化合物が、捕獲化合物の溶解性に影響を及ぼす溶解性基Wをさらに含む、請求項1〜65の何れかの方法。
- 選択性官能基Yが図17に示されるものから選択され、および/または反応性官能基Xが図16に示されるものから選択される、請求項1〜3および5〜66の何れかの方法。
- 選択性官能基Yが図21に示されるものから選択され、および/または反応性官能基Xが図16に示されるものから選択される、請求項1〜3および5〜66の何れかの方法。
- 選択性官能基Yがアトルバスタチン、セレコキシブ、レフェコキシブおよびセリバスタチンから選択される医薬品である、請求項1〜66の何れかの方法。
- n3が2である、請求項36の方法。
- X部分がスペーサーを介しZ部分に連結する、請求項1〜71の何れかの方法。
- スペーサーが(CH2)r、(CH2O)、(CH2CH2O)r、(NH(CH2)rC(=O))s、(O(CH)rC(=O))s、-((CH2)r1-C(O)NH-(CH2)r2)s-または-(C(O)NH-(CH2)r)s-であり、ここで、r、r1、r2およびsは各々独立しており、1から10の整数である、請求項72の方法。
- Qがビオチン、6-His、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗体、免疫毒素結合体、接着ペプチド、レクチン、リポソーム、タンパク質核酸、活性化デキストランまたはペプチドである、請求項3〜14および25〜73の何れかの方法。
- Qがビオチンである、3、10、14、15〜24および74の何れかの方法。
- 生体分子の混合物において薬物の非標的生体分子を同定する方法であって、
生体分子の混合物を捕獲化合物と相互作用させること、ここで、該捕獲化合物は、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択される部分X; 選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも捕獲化合物が少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y; 部分Q、ここで、Qは選別を可能とする; およびX、YおよびQを提示するための部分Zを含む、ならびに
捕獲した生体分子を分析し、薬物の非標的物を同定すること、.
を含む、該方法。 - Xは図16に示される群から選択される、請求項76または請求項77の方法。
- Yは図17に示される群から選択される、請求項76〜78の何れかの方法。
- Qは塩基相補的な一本鎖核酸分子または類似体と安定なハイブリッドを形成するために十分な長さ「j」の一本鎖部分を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である、請求項76〜79の何れかの方法。
- 捕獲化合物のセットを含む複数の捕獲化合物を含有する捕獲化合物の収集物、ここで、捕獲化合物の各セットは、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X、捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y、ならびにXおよびYを提示する部分Zとを含み、ここで、該部分Zは、
である。 - 図 23から選択される、捕獲化合物。
- 生体分子を分析するための方法であって、
a)生体分子を含む組成物を、請求項81または請求項82の捕獲化合物または捕獲化合物の収集物と接触させ、捕獲化合物-生体分子複合体を形成すること; および
b)結合した生体分子を同定または検出すること
を含む、該方法。 - 生体分子がタンパク質である、請求項83の方法。
- 捕獲化合物にはビオチン部分が含まれる、請求項83または請求項84の方法。
- 捕獲化合物がアドレス可能なアレイ中にあり、アレイ中の各位置が異なる捕獲化合物のセットを含む、請求項83〜85の何れかの方法。
- 同定が結合した生体分子の質量スペクトル分析を含む、請求項83〜86の何れかの方法。
- 生体分子がタンパク質である、請求項83〜86の何れかの方法。
- 生体分子が受容体である、請求項88の方法。
- 生体分子が酵素である、請求項88の方法。
- 捕獲化合物に結合した生体分子を、質量スペクトル分析の前にプロテアーゼで処理する、請求項87〜90の何れかの方法。
- 収集物中の化合物の各セットが同一の反応性官能基を含むが、選択性官能基とは異なっている、請求項87〜91の何れかの方法。
- 収集物中の化合物の各セットが異なる反応性官能基、選択性官能基および選別官能基を含む、請求項87〜92の何れかの方法。
- 収集物中の化合物の各セットが異なる反応性官能基および選択性官能基を含む、請求項87〜93の何れかの方法。
- タンパク質配座異性体を分離する方法であって、生体分子を含む組成物を、請求項81または請求項82の何れかの捕獲化合物の収集物と接触させること、
収集物のメンバーを分離すること、および
結合したタンパク質を混合物から同定し、これにより各配座異性体が収集物のメンバーに対して異なる結合特異性を有すること
を含む方法。 - 同定を質量分析計によって行う、請求項95に記載の方法。
- 少なくとも1種の配座異性体が疾病に関係している、請求項95または請求項96に記載の方法。
- 生体分子の複合体混合物の多様性を減少させる方法であって、
混合物を、請求項81または82の捕獲化合物の収集物と接触させて捕獲化合物と結合生体分子との複合体を形成すること、および接触の前、その間または後のいずれかに、
捕獲化合物と生体分子との複合体の各セットを他のセットから分離すること
を含む方法。 - 表現型特異的生体分子を同定する方法であって、
所定の表現型によって細胞を単一の対象から選別して少なくとも2つの異なる細胞セットを作製すること、
選別された細胞の各セット由来の生体分子の混合物を、請求項81または請求項82の捕獲化合物の収集物と接触させること、および
各セット由来の生体分子の結合パターンを比較して、各セットで異なる生体分子を同定し、それによって表現型特異的生体分子を同定すること
を含む方法。 - 選別前および/または選別後に、細胞を同調化するかまたはある代謝状態で凍結する、請求項99に記載の方法。
- 生体分子がタンパク質を含む、請求項99または請求項100に記載の方法。
- 結合した生体分子を質量分析計によって同定する、請求項99〜101の何れかの方法。
- 各捕獲化合物がタンパク質と共有結合する選択性官能基、捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にはそれが存在しない場合よりも少ないタンパク質と結合するように結合の選択性を高める部分を含む、請求項99〜102の何れかの方法。
- 各捕獲化合物が捕獲化合物を固体支持体上の異なる位置に整列させるための選別官能基をさらに含む、請求項99〜103の何れかの方法。
- 捕獲化合物がタンパク質と共有結合する反応性官能基、および表面またはその上にある分子と結合することによって、捕獲化合物を固体支持体上に整列させることを可能にする選別官能基を含む、請求項99〜104の何れかの方法。
- 表現型が疾病表現型および健常表現型である、請求項99〜105の何れかの方法。
- 細胞の疾病表現型が腫瘍であり、かつ、健常表現型が非腫瘍である、請求項106に記載の方法。
- 接触ステップを水性媒体中で行い、かつ、生体分子が親水性である、請求項83〜107の何れかの方法。
- 接触ステップを疎水性媒体中で行い、かつ、生体分子が疎水性である、請求項83〜107の何れかの方法。
- 同定または検出を生体分子-捕獲化合物複合体の質量スペクトル分析によって行う、請求項83〜109の何れかの方法。
- 質量分析計の形式がマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析計である、請求項110の方法。
- 生体分子にはタンパク質が含まれる、請求項83〜111の何れかの方法。
- 結合した生体分子の質量スペクトル分析が
(i)生体分子-捕獲剤複合体にマトリックスを加えること、
(ii)スポット毎のマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析
を含む、請求項110に記載の方法。 - 一部を除去または切断するための、生体分子-捕獲化合物複合体の化学的または酵素的処理
をさらに含む、請求項83〜113の何れかの方法。 - 結合した生体分子の質量スペクトル分析が
(i)生体分子-捕獲剤複合体のセットにマトリックスを加えること、および
(ii)生体分子-捕獲剤複合体の各セットの、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析
を含む、請求項87、96、102および105の何れかの方法。 - 生体分子を含む組成物が細胞溶解物である、請求項83〜115の何れかの方法。
- 溶解物が得られた細胞が同調化されているか、またはある代謝状態で凍結されている、請求項116に記載の方法。
- 生体分子の混合物を分析するシステムであって、
請求項81または請求項82の捕獲化合物の収集物、
収集物を用いる生体分子の分析を制御および行うための指令がプログラムされたコンピューター、
質量分析計、および
質量分析計によって得られたデータの分析のためのソフトウェア
を含むシステム。 - 自動化システムである、請求項118に記載のシステム。
- 液体クロマトグラフィー装置をさらに含む、請求項113または請求項114に記載のシステム。
- 請求項82〜85および91、97および105の何れかの方法によって得られた質量分析データを処理する方法であって、
(a)あらゆるバックグラウンドも差し引くこと、
(b)ノイズを減少させること、
(c)分子量を較正すること、および
(d)ピークをリファインすること
を含む方法。 - ステップ(d)がピーク積分を含む、請求項122に記載の方法。
- (e)処理したデータを既存のタンパク質データベースまたはオープンリーディングフレームを含むDNAデータベースと比較してタンパク質が既知のものであるかどうかを調べること、および
(f)タンパク質が既知である場合には、修飾を同定すること
をさらに含む、請求項121または請求項122に記載の方法。 - 健常および病気の個体の組織による、あるいは種々の生理学的または発達段階による、あるいは組織の種々の部分によるデータを比較すること
をさらに含む、請求項121〜123の何れかの方法。 - 分析が直交飛行時間型(O-TOF)質量分析である、請求項87、96、102および110の何れかの方法。
- 分析がエレクトロスプレー(ES)質量分析である、請求項87、96、102および110の何れかの方法。
- 生体分子相互作用を分析する方法であって、
a)生体分子の混合物を、請求項81または請求項82の捕獲化合物の収集物と接触させて化合物-生体分子複合体を形成させること、
(ここで、中心コアは捕獲化合物に結合した生体分子の質量スペクトル分析の前またはその間に切断できない部分であり、かつ
複合体はマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析条件に対して安定である)、
b)捕獲化合物-生体分子複合体を、生体分子と小分子試験化合物の混合物からなる群より選択される化合物を含む混合物と接触させること(ここで、混合物中の化合物は複合体中の生体分子に結合する)、
c)ステップb)の前または後に、捕獲化合物の各セットの選別基を介して、捕獲化合物を固体支持体上に固定化すること、
d)結合した化合物を質量分析計によって分析すること
を含む方法。 - 小分子試験化合物が候補薬であり、かつ、有機小分子、ペプチド、ペプチドミメティックス、アンチセンス分子またはdsRNA、抗体、抗体の断片および組換えまたは合成抗体およびその断片からなる群より選択され、そして
方法が生体分子に結合する候補薬を同定するための方法である、請求項127に記載の方法。 - ステップa)で捕獲化合物-生体分子複合体を、生体分子の混合物と接触させて生体分子複合体の構成要素または生化学的経路を同定する、請求項127または請求項128に記載の方法。
- 生体分子がタンパク質である、請求項127〜129の何れかの方法。
- 生体分子の分析の方法であって、
a)捕獲化合物のセットを含む複数の、収集物である捕獲化合物と、生体分子を含む組成物とを接触させること、ここで、各捕獲化合物のセットが、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X; 捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y;部分Q、ここで、各セットが異なるQを含み、Qは各セットの分離を可能とする;ならびにX、YおよびQを提示するための部分Zを含む、
b)捕獲した生体分子を化学的または酵素学的処理により消化すること、
c)捕獲した化合物の各セットを選別部分Qに基づき分離すること、および
d)捕獲化合物の各セットを分析し、該生体分子を同定すること
を含む、該方法。 - 生体分子の分析の方法であって、
a)収集物である捕獲化合物と、生体分子を含む組成物とを接触させること、ここで、各捕獲化合物が、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X; 捕獲化合物が、選択性部分が存在する場合にそれが存在しない場合よりも少ない生体分子と結合するようXによる結合の選択性を高める部分Y;部分Q、ここでQは選別を可能とする;ならびにX、YおよびQを提示するための部分Zを含む、
b)捕獲した化合物の各セットを選別部分Qに基づき分離すること、
c)捕獲した生体分子を化学的または酵素学的処理により消化すること、および
d)捕獲化合物の各セットを分析し、該生体分子を同定すること
を含む該方法。 - 捕獲化合物が、化合物を固体支持体上に整列させるための選別官能基を含み、
接触ステップの前、その間または後に捕獲化合物を固体支持体上に整列させることをさらに含む方法であって、
得られる生体分子-捕獲化合物複合体が固体支持体上の別々のスポットにある、
請求項83〜132の何れかの方法。 - 結合した生体分子の質量スペクトル分析が
(i)生体分子-捕獲剤複合体にマトリックスを加えること、
(ii)スポット毎のマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析
を含む、請求項133に記載の方法。 - 化合物の各セットが単一の位置に整列させられる、請求項81または請求項82の化合物の収集物を含む固体支持体。
- アレイがアドレス可能なアレイである、請求項135の固体支持体。
- Zが次式
(S1)tM(R15)a(S2)bL、
{式中、S1およびS2はスペーサー部分であり、
tおよびbは各々独立に0または1であり、
aは0〜4の整数であり、
Mは3以上の結合点を含む中心部分であり、
各R15はY2R18から独立に選択される一価の基であり、
各Y2は以下の基:直接結合、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、>C(R17)2、C(R17)=C(R17)、>C=C(R23)(R24)、>C(R23)(R24)、C≡C、O、>S(A)u、>P(D)v(R17)、>P(D)v(ER17)、>N(R17)、>N(COR17)、>N+(R23)(R24)、>Si(R17)2および>C(E);(ここで、uは0、1または2であり、vは0、1、2または3であり、AはOまたはNR17であり、DはSまたはOであり、かつ、EはS、OまたはNR17であり、その基はどの順序で組み合わせてもよい)のいずれかの組み合わせを独立に含む二価の基であり、
R17およびR18は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、SiR27R28R25、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20からなる群より選択され、
R19およびR20は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびヘテロシクリルから選択され、
R23およびR24は以下の(i)または(ii);
(i)R23およびR24は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される、または
(ii)R23およびR24はともにアルキレン、アルケニレンまたはシクロアルキレンを形成する
から選択され、
R25、R27およびR28は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびNR19R20から選択される一価の基であり、
R15、R17、R18、R19、R20、R23、R24、R25、R27およびR28は、Z2から各々独立に選択される1以上の置換基で置換されていてもよく、Z2はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、S(O)hR35(ここで、hは0、1または2である)、NR35R36、COOR35、COR35、CONR35R36、OC(O)NR35R36、N(R35)C(O)R36、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアラルキル、 ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、アルコキシカルボニル、カルボキシアリール、ハロ、シュードハロ、ハロアルキルおよびカルボキサミドから選択され、
R35およびR36は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリル、トリアリールシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アミノ、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノおよびアリールアミノの中から選択され、かつ
Lは化合物の質量スペクトル分析の前またはその間に切断可能な基である}
を有する、請求項1〜25および31〜33の何れかの方法。 - 生体分子の混合物において薬物の非標的生体分子を同定する方法であって、
生体分子の混合物を、請求項1の捕獲化合物の収集物と相互作用させること、および
捕獲した生体分子を分析し、薬物の非標的物を同定すること、.
を含む該方法。 - Xが光活性化可能な基である、請求項1〜80および83〜138の何れかの方法。
- 捕獲化合物が、光活性化可能な基の活性化前に生体分子混合物と相互作用する、請求項139の方法。
- 光活性化可能な基がアリールアジドである、請求項139または請求項140の方法。
- 光活性化可能な基がフェニルアジドである、請求項139〜141の何れかの方法。
- 薬物を含む捕獲化合物を、生体分子を含むサンプルと接触させ、該サンプル中の生体分子の捕獲すること、
その捕獲した生体分子を単離し、同定すること、および
捕獲した生体分子との結合相互作用を取り除くか変化させる薬物を再設計すること
を含む、方法。 - 捕獲した生体分子の機能を同定することを更に含む請求項143の方法。
- 結合の変化が結合の増大である、請求項143〜144の何れかの方法。
- 結合の変化が結合の減少である、請求項143〜144の何れかの方法。
- 結合が変化した生体分子が非標的生体分子である、請求項143〜146の何れかの方法。
- 生体分子にはタンパク質が含まれる、請求項143〜147の何れかの方法。
- サンプルには体組織または体液が含まれる、請求項143〜148の何れかの方法。
- 捕獲化合物が、得られる生体分子/捕獲化合物の複合体が質量スペクトル分析の条件下で安定であるように生体分子と共有結合するかまたは十分に高い親和性を有して結合するように選択された部分X、薬物である部分Y、部分Q、ここでQは選別を可能とする;ならびにX、YおよびQを提示するための部分Zを含み、
ここで、Xには、生体分子との接触後の活性化が潜在的に必要であり、それによって、該生体分子と反応し得る、
請求項143〜149の何れかの方法。 - サンプルが捕獲化合物の収集物と接触する、請求項143〜150の何れかの方法。
- 化合物がアジド、ジアジリン、または活性化後、生体分子のヒドロキシ、アミノ、チオールまたはカルボキシ基と反応する基を含み、請求項143〜151の何れかの方法。
- 捕獲化合物に連結した再設計薬物を用い、方法を繰り返し、更にその修飾を行う、請求項143〜152の方法。
- 捕獲化合物が複数部位で薬物と結合する、請求項143〜153の何れかの方法。
- 捕獲したタンパク質が、薬物である標的タンパク質である、請求項143〜154の何れかの方法。
- 捕獲タンパク質が、非薬物である標的タンパク質である、請求項143〜154の何れかの方法。
- サンプルとの平衡においてタンパク質と薬物との相互作用による条件下で接触ステップを行う、請求項143〜156の何れかの方法。
- 平衡後、混合物を処理し、捕獲剤とタンパク質との間に共有結合を形成する、請求項157の方法。
- 処理に、捕獲化合物の活性化が含まれ、ここで、該捕獲化合物には、活性化前の不活性反応基が含まれている、請求項158の方法。
- 捕獲化合物の濃度が複数の種々の反応によって変わる、請求項143〜159の何れかの方法。
- Kd値が決定されている、請求項160の方法。
- 生体分子の構造決定または同定を質量スペクトル分析により行う、請求項143〜161の何れかの方法。
- 質量分析計形式がマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、連続またはパルスエレクトロスプレー(ES)イオン化、イオンスプレー、サーモスプレーおよびマッシブクラスター衝撃質量分析計から選択される、請求項162の方法。
- 検出形式が直線型飛行時間型(TOF)、反射飛行時間型、シングル四重極、多重四重極、シングル磁場型、多重磁場型、フーリエ変換、イオンサイクロトン共鳴(ICR)、またはイオントラップである、請求項163の方法。
- 生体分子の機能を、コンピューター内、インビトロ、またはインビボの方法により決定する、請求項143〜164の何れかの方法。
- 生体分子の機能を、配列アライメント、薬理作用団、相同モデルおよびタンパク質モチーフ相関、肝臓ミドロソーム代謝経路、cDNA-発現した酵素、酵母経路に対するシグナル経路およびバック-マッピング、取り出したタンパク質の刺激およびタンパク質/タンパク質相互作用、天然の多形性、ノックアウト/ノックイン、フローサイトメトリー、薬物の治療活性、または予測遺伝子型決定および予測表現型決定により決定する、請求項165の方法。
- 薬物の再設計により、第一の薬物と比較すると、副作用がより少ないか、治療指数が増大する第二の薬物を生ずる、請求項143〜166の何れかの方法。
- 薬物がトログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、メトトレキサート、アトルバスタチン、セレコキシブ、レフェコキシブおよびセリバスタチンから選択される、請求項143〜167の何れかの方法。
- 化合物が活性化エステル基、アルキル化剤、活性化ハロゲン化物または活性化偽ハロゲン化物を含む、請求項152の方法。
- 処理にpHの変化が含まれる、請求項158の方法。
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