ES2213823T3 - Codificacion y analisis cualitativo de bibliotecas combinatorias basadas en masa. - Google Patents

Abstract

LA INSERCION DE PORCIONES MARCADAS CON ISOTOPOS EN CONSTRUCCIONES DE LA SINTESIS DE QUIMIOTECAS COMBINATORIAS SEGUIDA POR ANALISIS MEDIANTE ESPECTROMETRIA DE MASAS, RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR MASICA O ESPECTROMETRIA INFRARROJA MASICA PERMITE LA CODIFICACION FISICA, NO QUIMICA, DE UN GRAN NUMERO DE PRODUCTOS DE SINTESIS COMBINATORIA.

Description

Codificación y análisis cualitativo de bibliotecas combinatorias basadas en masa.

La presente invención se refiere en general al campo de la química combinatoria y se refiere en particular a codificar la biblioteca de productos de síntesis combinatoria.

Tendencias recientes en el área de investigación de sustancias químicas novedosas y especialmente agentes farmacológicos se han concentrado en la preparación de las así llamadas "bibliotecas químicas" como fuentes potenciales de nuevas guías para el descubrimiento de fármacos. Las bibliotecas químicas son colecciones creadas intencionalmente de diferentes moléculas las cuales se pueden preparar bien sintéticamente o bien biosintéticamente y rastreadas en busca de actividad biológica en una variedad de formatos diferentes. Alguien puede tener bibliotecas de moléculas solubles; bibliotecas de compuestos atados a perlas de resina, chips de sílice u otros soportes sólidos; o bibliotecas de péptidos recombinantes expuestos en bacteriófagos u otros vectores biológicos de exposición. Las bibliotecas químicas se elaboran ventajosamente usando técnicas del campo de la química combinatoria. El campo de la química combinatoria es una estrategia de síntesis que conduce a grandes bibliotecas químicas. La química combinatoria se puede definir como la conexión covalente sistemática y repetitiva de un grupo de diferentes bloques de construcción de estructuras variables entre sí para producir una gran serie de diversas entidades moleculares.

Tradicionalmente, las nuevas estructuras químicas medicinales guía se han originado del aislamiento de productos naturales a partir de fermentaciones microbiológicas, extractos vegetales, y fuentes animales; de rastrear bases de datos de compuestos de compañías farmacéuticas; y más recientemente a través de la aplicación de ambas aproximaciones basadas en mecanismo y basadas en estructura al diseño racional de drogas. Todos estos procedimientos son relativamente caros. Los estudios recientes de costo sugieren que el costo medio de crear una nueva entidad molecular en una compañía farmacéutica principal está alrededor de 7,500 \textdollar por compuesto, usando la tecnología química tradicional de síntesis que requiere transmisión de manipulación de reactivos y aparatos y la atención de un químico, más o menos constantes.

Además, el advenimiento de técnicas de producción altamente automatizadas ha hecho posible el rastreo robotizado de cientos de miles de compuestos individuales por año en exceso, por fármaco diana. La disponibilidad de esta capacidad, combinada con el coste relativamente alto de la química hecha a mano más tradicional ha causado un cambio global en el énfasis hacia el concepto de producción en masa, el cual es un concepto industrial que puede expresarse usándose la aproximación de la química combinatoria.

Las ineficiencias de la química hecha a mano son de este modo grandemente dirigidas mediante un cambio al concepto de usar tecnologías de química combinatoria para sintetizar rápidamente colecciones de compuestos. Así, empleando una aproximación de bloques de construcción y ensamblando sistemáticamente estos bloques en muchas combinaciones usando procedimientos químicos es posible crear bibliotecas químicas en forma de vastas poblaciones de moléculas. Un punto de partida esencial para la generación de la diversidad molecular es un surtido de pequeñas moléculas reactivas las cuales se pueden considerar bloques de construcción químicos. El universo de la diversidad estructural accesible a través del ensamblaje de incluso una pequeña serie de elementos que sirven como bloques de construcción es potencialmente muy grande, y desatar el poder inherente en la aproximación de los bloques de construcción es crucial para el éxito del procedimiento combinatorio. El argumento de los bloques de construcción se ilustra fácilmente como sigue. Teóricamente, el número de posibles combinaciones individuales diferentes, N, preparado mediante una síntesis combinatoria ideal se determina por dos factores; el número de bloques disponible para cada etapa "B" y el número de etapas sintéticas en el esquema de reacción, s. Si se usa un número equivalente de bloques de construcción en cada etapa de reacción, entonces N = B^{S}. Si el número de bloques que alguien desea para cada etapa varía (por ejemplo b, c, d en una síntesis de tres etapas), entonces N = bcd.

De los expuesto anteriormente en este documento, se puede ver que un procedimiento de síntesis combinatoria relativamente conservador que implica 20 bloques en un procedimiento de síntesis de tres pasos producirá 20^{3} = 8.000 compuestos. Este resultado de producción relativamente generoso plantea la siguiente pregunta, que es ¿cómo se identificarán los compuestos? Por ejemplo, una típica técnica combinatoria de síntesis es aquella de la síntesis dividida. Como un ejemplo de la síntesis dividida en la síntesis de péptidos en el estado sólido, un lote de soporte resina (típicamente pequeñas perlas de resina) se divide en n fracciones, acoplando un único monómero aminoácido para cada alícuota en una reacción separada, y después mezclar meticulosamente todas las partículas de resina juntas. Repitiendo este protocolo por un total de x ciclos podemos producir una colección aleatoria de hasta n^{x} moléculas diferentes, como se controló mediante una distribución hipergeométrica. Para asegurar la representación de la mayoría de los posibles ligandos, alguien necesita empezar con una multitud de perlas. Un valor típico sería tantas perlas como diez veces el número deseado de ligandos. Teóricamente existe un conjunto de cada posible combinación de bloques de construcción en las alícuotas. Con el fin de determinar la composición de un compuesto en particular el cual se encuentra que es de interés, alguien pudo proseguir con el análisis estructural directo de ligando, preferiblemente en un espectrómetro de masas, sobre una base especie por especie. Una típica síntesis combinatoria tiene lugar ahora en una placa de reacción que tiene de 960 a 2.304 pocillos de reacción. Alguien identifica los productos compuestos de verdadero interés mediante una respuesta positiva en un ensayo apropiado. Sin embargo, incluso después de que los ensayos estén en marcha eso reducirá grandemente el número de compuestos que no han sido activos en el ensayo, el problema con una aproximación analítica convencional de espectrómetro de masas es que se requieren muchos análisis de ensayos individuales, sólo puede haber muy pequeñas cantidades de material disponible tras poner en marcha una síntesis combinatoria, y el tiempo total de producción fue bastante largo. Existe una necesidad entonces, de algún modo, de compuestos marca, de forma que vayan a través de sus etapas combinatorias. Donde los compuestos están, por ejemplo, atados a perlas de resina, la solución de la técnica previa al problema ha incluido anclar chapas identificadoras a las perlas coincidentes con cada bloque acoplado a etapa en la síntesis. Las diferentes propiedades químicas de cada chapa comunican después que bloques de construcción se acoplaron en una etapa en la síntesis, y la estructura general de un ligando en cualquier perla puede deducirse "leyendo" la serie de chapas en la perla, teniendo de hecho codificada la perla.

Las chapas deberían tener idealmente un contenido en información altamente discreto, que sería flexible a muy alta sensibilidad de detección y decodificación, y debería ser estable a los reactivos usados en la síntesis de ligandos. Las chapas de la técnica previa ancladas sobre perlas han incluido nucleótidos, péptidos, o una serie combinada de hidrocarburos homólogos y aromáticos policlorados. El documento WO 97(14814 (SmithKline Beecham Corp.) describe un procedimiento de identificación con chapas en el que la chapa contiene ^{13}C y/o ^{15}N los cuales se detectan usando técnicas de nmr (abreviatura en inglés de resonancia magnética nuclear, la abreviatura en español es rmn). Los oligonucleótidos de cadena simple se construyen sobre perlas de resina después de que la síntesis peptídica esté llevándose a cabo y que se amplifique subsiguientemente a través de la reacción en cadena de la polimerasa y se secuencie. Otra técnica es una donde enlaces diamina ortogonalmente diferenciados se unen en la construcción de péptidos quiméricos solubles que comprenden una cadena de "unión" a una cadena "codificante". Como los monómeros aminoácidos bloques de construcción se acoplan a la cadena de unión, esto se registra construyendo un código de aminoácidos sobre la cadena "codificante". La secuencia de la cadena codificante se resuelve entonces mediante degradación de Edman. Un problema con esta aproximación es que requiere una etapa química extra por cada etapa tomada en la construcción de la biblioteca. Otro problema con esta aproximación que requiere procedimientos sintéticos ortogonales para levantar una marca en conjunción con síntesis de ligandos, es decir, requiere la adición de residuos similares, mientras hay un interés muy grande en descubrir procedimientos para producir compuestos los cuales no se limitan a la adición secuencial de residuos similares. Tales procedimientos encontrarían aplicación, por ejemplo en la modificación de esteroides, antibióticos, azúcares, coenzimas, inhibidores enzimáticos, ligandos, y similares, lo cual frecuentemente implica una síntesis multi-fase en la cual alguien desearía variar los reactivos y/o condiciones de las reacciones para proporcionar una variedad de compuestos. En tales procedimientos los reactivos pueden ser agentes orgánicos o inorgánicos, donde las funcionalidades pueden introducirse o modificarse, los grupos laterales anclarse o eliminarse, los anillos abrirse o cerrarse, la estereoquímica cambiar, y similares. Para que un procedimiento tal sea viable, sin embargo, necesita haber una forma conveniente de identificar las estructuras del gran número de compuestos los cuales resultan de una amplia variedad de modificaciones diferentes.

Una técnica que es útil para el rastreo de las moléculas orgánicas no secuenciables preparadas por síntesis combinatoria multietapa se describe en el documento WO 95/28640 (fideicomisos de la universidad de Columbia). Esto usa una serie de derivados halocarburos analizables por cromatografía de gases como marcas moleculares, los cuales, cuando se agregan a un grupo reactivo en la superficie de la perla, pueden constituir un código binario que refleja la historia química de cualquier miembro de una biblioteca. En lugar de las aproximaciones de codificar el oligonucleótido o péptido donde el orden de ensamblaje de los bloques químicos de construcción para cualquier miembro de la biblioteca se preserva en la secuencia de una única molécula relacionada que funcione como chapa identificadora, la estrategia binaria usa una mezcla de chapas definida de forma única para representar cada bloque de construcción a cada etapa particular de la síntesis. Por lo tanto, una serie de N chapas se puede usar para codificar la síntesis combinatoria de una biblioteca de 2^{N} miembros identificados diferentes. Después del emsamblaje, las chapas se fotolisan y analizan mediante captura de electrones por capilaridad en cromatografía de gases.

El documento WO 96/30392 (Ciba-Geigy AG) describe una técnica de marcaje binario con chapas identificadoras en donde la chapa es un elemento átomo o ión el cual puede unirse a la perla no covalentemente.

En todos los casos, el uso de marcas informadoras complica las estrategias sintéticas, incrementa el riesgo de reacciones laterales y sub-productos, y produce sólo evidencia indirecta de la estructura. Así, hay una necesidad de hallar una forma por la cual la historia de reacción de un compuesto se pueda registrar, e identificar la estructura del compuesto resultante.

El uso de marcas específicas de sitio de ^{13}C se ha usado también, en conexión con espectroscopía RMN de 13C como un procedimiento de control del progreso de la síntesis combinatoria en el estado sólido.

Otro procedimiento aún es usar un chip el cual permite el análisis por separado en sitios separados físicamente en la superficie del chip. Conociendo que reactivo se añade secuencialmente a cada sitio, alguien puede registrar la secuencia de eventos y así la serie de reacciones. Si alguien somete después al chip a un procedimiento de rastreo para una característica deseada en particular y detecta la característica, puede determinar fácilmente el compuesto sintetizado y el sitio en el cual se manifiesta esa característica.

El documento WO 97/08190 (SmithKine Beecham plc) describe un procedimiento para elaborar una estrategia de selección para reactivos químicos para usar en una biblioteca combinatoria para asegurar que las redundancias de masa están controladas, permitiendo así que el producto final escindido se identifique mediante espectroscopía de masas.

Un análisis discreto muestra-por-muestra producirá un gran acuerdo de información irrelevante, dado que se analizará todo en la muestra. Sin embargo, analizando los resultados de una síntesis combinatoria, es deseable ser capaz de seguir la pista en términos lineales, teniendo en cuenta que es mediante un procedimiento lineal que todo eso está añadiéndose a la construcción de interés en la síntesis, lo cual omitirá la presencia de disolventes, trozos de resina, reacciones laterales e impurezas.

En vista de las necesidades mencionadas anteriormente en este documento y defectos de la técnica previa, es un objetivo primario de la presente invención reducir la cantidad de tiempo necesario para leer y decodificar los productos de una síntesis combinatoria. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de codificar construcciones combinatorias que no requieren química ortogonal, es decir, química que ha sido cuidadosamente seleccionada de tal forma que no se interfiera con la química que es está ejecutando como parte de la síntesis combinatoria en sí misma. Otro objeto de la invención es minimizar la cantidad de inversión en capital necesaria para desarrollar una estrategia codificante que no requiere más que lo que se necesita para desarrollar inicialmente una serie de apropiados enlaces de soporte sólidos.

A diferencia de los procedimientos de la técnica previa, la presente invención realiza un procedimiento de codificar más isotópicamente que químicamente un monómero para leer una historia de síntesis. Las diferencias legibles en los residuos codificantes, por lo tanto, dependen de la diferenciación física, más que de la diferenciación química. El monómero codificado isotópicamente está, sin embargo, unido químicamente al ligando de interés durante la síntesis, en contraste con los procedimientos de identificación en los cuales los isótopos diferenciables físicamente se mezclan en y se entremezclan con grandes cantidades de productos químicos o materias primas para identificar su fuente de fabricación. La invención, asimismo, no depende del marcado mediante chapas de una molécula, como señaló otra técnica previa.

Descripción de las figuras

La figura 1 es una serie de picos de EM que representan las firmas de picos observadas para los bloques código de la glicina marcada descritos en la especificación de abajo.

La figura 2 es una gráfica que muestra la correlación observada entre el número de átomos de carbono presentes y la fracción de contenido en enlaces que tiene presente N^{15}. El gráfico se puede usar para calcular firmas de picos de igual intensidad.

La figura 3 representa una estrategia posicional codificante de dos picos, presentando la ruptura de los picos de EM en dobletes para mejorar el reconocimiento del código.

La figura 4 representa la correlación observada entre el área del pico de EM y la tasa de N^{15} presente en una muestra código para una serie de muestras código que difieren en el contenido de N^{15} mediante incrementos del 5%.

La figura 5 es un patrón de picos de RMN para el compuesto:

1

indicando que el 55% del carbono en la penúltima posición se marcó con C^{13}.

La figura 6 es un patrón de picos de RMN para el compuesto:

2

indicando que el 60% del carbono en la penúltima posición se adulteró con C^{13}.

La figura 7 es un patrón de picos de RMN para el compuesto:

3

indicando que el 75% del carbono en la penúltima posición se adulteró con C^{13}.

La figura 8 es un patrón de picos de RMN para el compuesto:

4

indicando que el 80% del carbono en la penúltima posición se adulteró con C^{13}.

La figura 9 es una chapa que correlaciona la razón observada de C^{13} a C^{12} en el espectro de RMN de las figuras 5 a 8 con el porcentaje de C^{13}presente en cada una.

Las figuras 10 a 12 muestran el espectro observado en conjunción con el procedimiento del ejemplo 23 en la realización de la invención Reacción de Rastreo.

Las figuras 13 a 17 muestran diagramas de flujo de síntesis usados en la discusión del ejemplo 23 en la realización de la invención Reacción de Selección.

Las figuras 18 a 51 muestran los espectros observados en conjunción con la discusión del ejemplo 24 de la realización de la invención Razón de Codificación.

Las figuras de la 52 a la 110 muestran los espectros observados en conjunción con la discusión del ejemplo 25 de estireno codificado y el ejemplo 26 discutiendo la copolimerización de estireno y F-estireno.

Las figuras 111 a 132 muestran espectros representando la decodificación de una síntesis paralela de una biblioteca en perlas de resina codificadas, usando una aproximación con engarce dual en la cual un primer ligando fue un engarce fotoescindible y un segundo engarce fue un engarce Knorr.

Las figuras 133 a 286 son espectros que se producen mediante un grupo de bloques código organizados en un tipo de razón codificante denominada como razón codificante de cuatro picos, usando versiones protegidas de alanina F-moc isotópicamente distintas.

La figura 287 es un diagrama de flujo para un programa de ordenador capaz de automatizar la descodificación de un conjunto de bloques codificantes y sus espectros asociados.

Sumario de la invención

En un breve sumario, la invención es la aplicación de codificación de masas o isotópica en la impronta de información codificada dentro de o en conjunción con materiales o procedimientos tales como los detalles de los componentes o etapas del proceso, puede ser fácilmente determinada mediante uno o más de los procedimientos de espectrometría de masas, espectroscopía de resonancia magnética nuclear, o espectroscopía infrarroja, incluyendo la técnica de espectroscopía de Ramen. En una realización preferida, la invención es un procedimiento de codificar los productos de síntesis combinatoria adulterando isotópicamente una parte de una construcción de química combinatoria y analizando los productos de reacción combinatoria mediante espectrometría de masas, espectroscopía de resonancia magnética nuclear o espectroscopía infrarroja.

En una visión de conjunto, la invención comprende varias realizaciones. Primeramente, la invención comprende un procedimiento no químico basado en masas para grabar la historia de reacción de una serie de reacciones en cada uno de una pluralidad de soportes sólidos únicos; dicho procedimiento comprende:

(a) reaccionando, a una fase de inserción de bloques de masa, una pluralidad de agentes de masa teniendo cada uno una masa definida única con cada uno de los grupos de dichos soportes sólidos únicos, tal que cada uno de los soportes sólidos únicos de dicho grupo ha estado reaccionando con un agente que tiene una masa definida que es diferente de cualquier otro agente que haya estado reaccionando con cualquier otro de dichos grupos de dichos soportes sólidos únicos;

(b) reaccionando cada uno de dichos grupos sólidos teniendo un agente de masa definido diferente con un primer reactivo químico diferente:

(c) mezclando dichos grupos conjuntamente y entonces dividiendo dicha pluralidad de soportes sólidos únicos en una pluralidad de grupos para una segunda fase intermedia o final;

(d) repitiendo dicha reacción con un agente químico al menos una vez para proporcionar una pluralidad de productos finales, teniendo diferentes productos sobre los diferentes soportes sólidos únicos individuales;

siendo dichos agentes de masa únicos definidos capaces de analizarse y en los que dichos análisis definen la elección de un primer agente químico. El procedimiento es particularmente preferido en llevar a cabo un ensayo o usar de técnicas de separación incluyendo cromatografía en columna o placa o escaneo celular auxiliar de fluorescencia para encontrar productos de reacción que tengan una característica de interés y entonces llevar a cabo el análisis de identificación de tales productos de reacción. Este procedimiento es particularmente preferido con respecto a la determinación del primer agente químico añadido a la secuencia de reacción. Los productos de reacción pueden incluir un no oligómero el cual es alifático, alicíclico, aromático, o heterocíclico o un oligómero el cual es un oligopéptido, oligonucleótido, oligosacárido, polilípido, poliéster, poliamida, poliuretano, poliurea, poliéter, derivado polifósforo donde el fósforo se toma del grupo consistente en fosfato, fosfonato, fosforamida, fosfonamida, fosfito, o fosfinamida, o derivado poliazufre donde el azufre es tomado del grupo consistente en sulfona, sulfonato, sulfito, sulfinamida, o sulfenamida.

Los medios de análisis preferidos son mediante espectrometría de masas (MS), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), e infrarrojo o espectroscopía de Raman. Estos medios de análisis producen distintos patrones usados en análisis, identificación, y estrategias de codificar y descodificar. El espectrómetro de masas en particular produce picos de masa simples únicos, picos de masa dobles únicos, pares únicos de picos simples de masa, pares únicos de picos de masa dobles y otros patrones únicos de picos múltiples, los cuales son capaces adicionalmente de traducirse en patrones legibles por máquina, incluyendo códigos de barras. Los procedimientos de RMN, IR y Raman también producen patrones únicos útiles de picos, que pueden transformarse en patrones legibles por máquina, incluyendo códigos de barras. Tales patrones, incluyendo patrones legibles por máquina, se pueden asignar en estrategias codificadoras a representar reactivos químicos discretos añadidos en una serie de reacciones químicas, o asignados a representar condiciones discretas de reacción química bajo las cuales se añadió un reactivo químico en una serie de reacciones, incluyendo, pero no limitadas a, concentraciones, temperaturas, presiones, catalizadores, enzimas, energía electromagnética impartida al sistema (condiciones de luz visible, irradiación, etc.), y así sucesivamente. Esto se hace generando inicialmente patrones de reconocimiento para agentes de masa definidos únicos los cuales son bien legibles a simple vista o bien legibles por máquina. Los patrones resultantes de las etapas de análisis se compararon entonces con los patrones de reconocimiento para identificación y decodificación, con o sin la asistencia de una máquina. Los patrones de reconocimiento y los patrones de análisis que son legibles por máquina son capaces de almacenarse electrónicamente en un almacén computacional adecuado y en dispositivos de memoria bien conocidos para aquellos de habilidad normal en la técnica y tales patrones almacenados forman una base de datos fácilmente recuperable que también forma una realización reivindicada de la invención.

Los agentes de masa usados en estos procedimientos son preferiblemente una entidad molecular tal como un engarce perla de resina de soporte químico en estado sólido el cual tiene uno o más de sus átomos reemplazados por un isótopo de ese átomo, alterando así la masa, pero no las propiedades químicas de esa entidad química. Otro agente alternativo de masa es simplemente repetir la aparición de una entidad molecular un número entero de veces en una construcción lineal química.

El procedimiento de la invención puede llevarse a cabo usando química del estado sólido o química de disoluciones. Los productos de reacción se pueden escindir de un soporte sólido para su análisis, o se puede analizar la construcción entera. Los reactivos químicos añadidos a una serie de reacciones pueden incluir uno o más que pueden actuar como un sustrato para la determinación de especificidad de unión a un compuesto químico de interés. Cualquiera de todas las etapas de codificación, síntesis, análisis y decodificación puede automatizarse con la ayuda de medios computerizados adecuados o medios robóticos adecuados, todo mediante metodologías bien conocidas para cualquiera de habilidad normal en las técnicas de la química combinatoria, la espectroscopía, la informática, la robótica y el escaneo óptico.

Los procedimientos de descodificación, mencionados anteriormente en este documento, de reactivos químicos y condiciones de reacción en reacciones químicas de interés en una síntesis combinatoria, donde los compuestos en el kit tienen masas distinguibles diferentes, pero las mismas propiedades químicas, tales kits pueden comprender soportes en estado sólido anclados a engarces isotópicamente marcados, series o combinaciones de mezclas de isótopos en razones fácilmente identificables, en una variedad de combinaciones de residuos isotópicamente marcados (también llamados bloques codificados en el presente documento) con enlaces covalentes u otros residuos orgánicos como enlaces o enlazadores.

La invención también comprende kits de soportes en estado sólido que se han preparado de tal forma que sólo se han definido agentes de masa en su superficie. Los soportes sólidos pueden ser perlas de resina en un amplio rango de tamaños desde 1 a 10.000 \mum en dimensión. El soporte por sí mismo puede estar marcado isotópicamente incorporando un isótopo dentro de la estructura química del soporte. Esto diferencia la masa del soporte a partir de soportes relacionados, pero no cambia sus propiedades químicas. Tales soportes sólidos se usarían después en los procedimientos de la invención. Grupos de tales soportes definidos exclusivamente por la masa pueden comprender bibliotecas, las cuales son también una realización de la invención como se reivindica en el presente documento.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas y mejor modalidad de la invención.

El término "marcaje isotópico" o "marcado isotópicamente" se usa aquí para significar la introducción dentro de una molécula de un isótopo de uno o más de los átomos que aparecen normalmente en esa molécula.

Una "unión" es un enlace covalente o un residuo molecular que es adecuado para unir juntas dos partes de una construcción.

Un "engarce" es un residuo que comprende un bloque codificado, una primera unión para enlazar el bloque codificado a un soporte sólido u otro residuo, y un segundo enlace para unir el bloque codificado a un ligando u otro residuo.

Una "mezcla de unión" es una mezcla de dos moléculas isotópicamente distintas pero químicamente idénticas, teniendo la mezcla una razón discreta entre el primer isótopo y el segundo isótopo.

Un "bloque codificado" es una molécula o una serie de moléculas que contienen uno o más átomos isotópicamente marcados o que tiene un número repetido de moléculas en series, tales que sus masas pueden ser definidas y diferenciadas discretamente de cualquier otro bloque codificado.

Un átomo "marcado", bloque de código o residuo se refiere a una entidad en la cual hay un átomo en una molécula el cual se ha reemplazado por uno de sus isótopos. Los átomos marcados como se plantea en esta invención incluyen todos los átomos encontrados en la química orgánica que tienen isótopos y en particular, hidrógeno, carbono, nitrógeno, flúor y oxígeno. Los isótopos no radiactivos se prefieren generalmente sobre los radiactivos.

El término "monómero" se usa en este documento no sólo para indicar subunidades que completan moléculas lineales tales como aminoácidos, sino también para indicar materiales químicos de partida y agentes químicos que reaccionan químicamente con otro en la síntesis química orgánica combinatoria para producir moléculas que no son lineales, tales productos incluyen las así llamadas "moléculas pequeñas" las cuales son moléculas orgánicas de 500 daltons o menos en peso molecular. Los términos "monómero" y "agente químico" son intercambiables tal como se usan en el presente documento.

Una "serie de reacción", como se usa aquí se refiere a una serie de etapas en una síntesis química en un formato de síntesis combinatoria.

Un "soporte sólido" es un soporte o los materiales con los cuales se puede elaborar uno con síntesis química combinatoria, incluyendo perlas, superficies sólidas, sustratos sólidos, partículas, gránulos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, fibras sólidas, perlas de celulosa, perlas de cristal poroso, geles de sílice, perlas de poliestireno opcionalmente entrecruzadas con N,N'-dis-acroliletilendiamina, las partículas de cristal recubiertas con un polímero hidrofóbico, fulerenos y soportes solubles tales como poliestirenos no entrecruzados de bajo peso molecular.

Una "construcción" es una entidad unida covalentemente que comprende, en cualquier combinación , algún tipo de soporte sólido, uno o más engarces, uno o más bloques codificantes, y uno o más ligandos.

Un "ligando" es un producto de reacción química de interés. Un ligando puede ser parte de una construcción mayor, donde la meta definitiva será identificar y/o escindir el ligando aparte del resto de la construcción.

En general, los procedimientos de la investigación hicieron uso de alguna variante e una construcción de la fórmula general no limitante:

5

Los isótopos se insertaron dentro de tales construcciones por medio de enlaces marcados. Es decir, después de la determinación se ha hecho de forma que constituya un enlace químicamente adecuado, el enlace se sintetizó usando uno o más átomos del enlace que se sustituyeron por una forma isotópica del átomo. La forma isotópica es, sin embargo, físicamente distinguible de otras formas isotópicas por análisis de EM o RMN. Esta diferencia física se manifiesta por la distinta apariencia de los patrones de picos de EM, IR o RMN. Una amplia variedad de inserciones isotópicas o estrategias de marcaje están disponibles, conduciendo a un gran número de residuos químicos físicamente distinguibles, cada uno teniendo su propio patrón de picos distintivo. La existencia de tales patrones de picos distintivos significa que las formas isotópicas se pueden usar para crear un código que se puede usar en varias estrategias codificantes para identificar fácilmente entidades químicas o condiciones que se pueden usar durante una síntesis combinatoria. Varias de tales estrategias codificantes se dan más adelante en este documento.

El chorro de electrones de la espectrometría de masas proporciona información de masa e intensidad de carga iónica para una entidad molecular dada. En general, las moléculas menores sólo aparecen en el espectro una vez como especies cargadas por separado, y el efecto de la variación de la composición isotópica resultó en un muy predecible cambio en la masa cuántica. Así, por ejemplo, una molécula que tiene un peso molecular de 304c producirá un pico a 305 (M + 1) en un espectro de un espectrómetro de masas (abreviadamente en inglés MS). Si un átomo de nitrógeno en tal molécula tiene un peso atómico de 14 (N^{14}) se reemplazó (mediante marcaje isotópico, tal como ese término se usa en el presente documento) mediante el isótopo N^{15}, después el pico SM cambiará a la derecha de forma precisa una unidad a 306. Además, tal marcaje isotópico no afectará la ionización o la reactividad química de la molécula. La habilidad para medir ambas propiedades de masa e intensidad iónica con seguridad razonable (es decir, masa hasta aproximadamente 0,1 unidades de masa atómica e intensidad relativa hasta aproximadamente un 3%) proporciona la base para una estrategia codificante novedosa que usa isótopos para codificar, más isotópicamente que químicamente, un monómero para leer una historia sintética, en lugar de marcando una molécula en sí misma. Usando el procedimiento de la invención, las estrategias de codificación se elaboran a partir del uso de la sola información de la masa, la información de la intensidad relativa en uno o más picos de masa solos o en combinación de los dos. La metodología básica de la invención, la cual es insertar diferentes isótopos dentro de construcciones combinatorias para identificar la adición de monómeros o las condiciones químicas, causa varias realizaciones alternativas para codificar y descodificar, las cuales son capaces de implementación individual o en combinaciones seleccionadas.

Se analizarán múltiples aproximaciones codificadoras preferidas que usan los agentes de masa definidos. Estos ejemplos son no limitantes y no significan que estén excluidas otras aproximaciones codificadoras.

Ejemplo 1 Aproximaciones codificadoras

Ejemplo codificante A

Aproximación de razón codificadora

En una realización más preferida de la invención, se prepara una serie de mezclas de engarces n marcados isotópicamente, con cada mezcla de engarces en la serie comprendiendo una razón discreta entre el primer isótopo y el segundo isótopo, y con cada mezcla en las series que difieren en la razón de la mezcla previa y la subsiguiente en las series mediante una cantidad igual. Así, por ejemplo, se puede preparar una serie de 21 grupos de monómeros marcados, con el primer grupo en la serie teniendo una razón del 100% del primer isótopo y el 0% del segundo isótopo, el segundo grupo teniendo una razón del 95% del primer isótopo y el 5% del segundo isótopo, y de esta forma hasta el grupo 21º, el cual tendrá 0% del primer isótopo y 100% del segundo isótopo. Cada engarce se caracteriza además por ser capaz de escindirse de tal forma que una parte escindida contendrá siempre el residuo molecular marcado isotópicamente. Cada engarce reacciona químicamente con un medio de soporte en una cara del engarce para producir n grupos de engarces al soporte, de nuevo teniendo cada uno una razón discreta entre el primero y el segundo isótopo. Después, se añade un agente de interés a cada lote para producir n grupos de moléculas engarces a los soportes, cada una de ellas teniendo asimismo las razones discretas entre dos isótopos. Si, por ejemplo ahora, se está persiguiendo un procedimiento de síntesis separada, después los n lotes se combinan dentro de un único recipiente de mezcla y la mezcla resultante se divide después en n alícuotas, y se añade a cada alícuota un segundo agente de interés, y se permitió desarrollarse a las reacciones resultantes. La etapa previa de combinar todas las alícuotas y después separarlas en n alícuotas se repitió, y se añadió un tercer reactivo de interés. Si todas las reacciones posibles se ha desarrollado por completo, después hay n^{3} productos conocidos. Los engarces se pueden escindir de forma que los fragmentos marcados isotópicamente permanecen con el producto químico, y la construcción producida marcada químicamente con isótopo resultante se analizó mediante un espectrómetro de masas. El espectrograma de masas resultante manifestará un patrón de picos que refleja la razón entre el primer isótopo y el segundo isótopo presentes en el fragmento de unión, identificando así que el primer agente químico que se añadió entonces al pocillo de reacción particular. Así, por ejemplo, si la razón isotópica es de 100% del primer isótopo y 0% del segundo isótopo, entonces aparecerá un pico relativamente alto en el espectrograma en la posición del espectro ocupada por la masa atómica discreta que tiene ese residuo (como se apreciará por aquellos con una habilidad normal en la técnica, otros picos relativamente pequeños, aparecerán, por supuesto, pero aparecerá justamente un pico prominente que es característico de la molécula como se usa en el procedimiento de identificación de la presente invención). Si la razón isotópica es de 95% del primer isótopo y 5% del segundo isótopo, después habrá un primer pico prominente y un segundo pico prominente, teniendo el primer pico prominente aproximadamente el 95% del área total bajo los dos picos prominentes, y teniendo el segundo pico prominente aproximadamente el restante 5%, formando así un distinto patrón de picos prominentes el cual sirve para identificar claramente la razón isotópica y, por lo tanto, el agente químico. Se entenderá que otros picos menores que no forman parte de los patrones que forman los códigos de la invención aparecerán, en virtud de la gran abundancia de C^{13}, y su tamaño relativo se predijo usando los siguientes análisis. Si un residuo dado contiene 24 carbonos y nitrógeno y se ha marcado a una razón 50/50 de N^{14}/N^{15}, entonces el pico 1 se calculará a partir de N^{14}/C^{12} presentes como (0,989)^{24} x 0,5 = 0,383; el pico 2 se calculará a partir de N^{14}/C^{12} y N^{14}/C^{13} presentes como (0,989)^{24} x 0,5 + (0,989)^{23} (0,011) x 24 x 0,5 = 0,485; y el tercer pico se calculará a partir del N^{15}/C^{13}(0,989)^{23} (0,011) x 24 x 0,5 = 0,102, resultando así en un patrón distintivo que tiene dos picos aproximadamente del mismo tamaño, y el pico lateral relativamente menor. Idealmente, las especies isotópicamente distintas usadas diferirían en dos o más UMA y esto produciría picos bien separados que no se afectarían por la presencia natural de ^{13}C. Para conseguir esto con los átomos que se usan más comúnmente en tal química (C, H, N, O) típicamente requiere que más de un átomo se sustituya isotópicamente, como los isótopos estables disponibles de C, H, y H difieren por sólo una única unidad de masa.

Subsiguientemente, con el fin de identificar el tercer componente en la estructura combinatoria, el tercer componente se podrá identificar por su número de pocillo de reacción. Ahora, con la identidad del primer componente conocida en virtud del espectrógrafo de masas y la del tercer componente conocida en virtud del número de pocillo, sus pesos moleculares combinados se restan del peso molecular total de la construcción para llegar a una masa residual la cual identifica al segundo componente de la construcción.

Debería apreciarse que el uso de procedimientos y construcciones de la invención proporcionan una serie entera de engarces codificados que proporcionan grandes ahorros económicos, desde que sólo la síntesis adicional se requiere adicionalmente para marcar isotópicamente un engarce soporte sólido que tuvo que construirse en el primer lugar. No se necesitan otras modificaciones químicas para hacerse a los engarces que se eligieron inicialmente para la síntesis combinatoria del estado sólido.

Ejemplo codificante B

Aproximación razón dual codificadora

Para síntesis que tienen más de tres pasos, el procedimiento de la razón de codificación descrita anteriormente en este documento se continúa en que se prepara una serie de n mezclas de engarces isotópicamente marcados, con cada mezcla de engarces en las series que comprenden una razón discreta entre el primer y el segundo isótopo, y difiriendo cada mezcla en la serie de la mezcla previa o subsiguiente en la serie por una cantidad igual. Si embargo, un segundo tipo de átomos se estimula isotópicamente, de tal forma que hay dos tipos de isótopos atómicos presentes. Por ejemplo, una posición nitrógeno puede marcarse con una mezcla de N^{14} y N^{15}, mientras que una posición de carbono puede marcarse con una mezcla de C^{12} y C^{13}. De nuevo, este ejemplo seguirá la progresión de incrementos del 5%, de tal forma que hay 21 posibles combinaciones de combinaciones de razón de nitrógeno. Además, la posición carbono se protege con un grupo de protección adecuado, el cual puede desprotegerse para correlacionar a una etapa de reacción en la síntesis combinatoria. Así, el patrón de picos del espectrógrafo para el nitrógeno marcado identifica el primer componente de síntesis, el patrón de picos del espectrógrafo de masas para el carbono marcado identifica el segundo componente de síntesis, un ensayo identifica el cuarto componente, y el tercer componente se identifica mediante sustracción del primero, segundo y cuarto componentes del peso total del producto.

Ocasionalmente, el código de degeneración puede presentarse cuando se usa más de un tipo de isótopo, como en el caso donde un residuo llevó una combinación de N^{15}-C^{12} y otro llevó una combinación de N^{14}-C^{13}, teniendo ambas el mismo peso atómico y por lo tanto dando patrones de picos indistinguibles en un espectrógrafo de masas. Este problema se pudo evitar por uno o dos caminos generales. Primeramente, seleccionando C^{12} o C^{14} como el par de isótopos de carbono, se elude este tipo de degeneración del código. O, si se evita la radiactividad, se pueden usar C^{12} y C^{13}mediante la técnica de espectrografía de masas combinada con fragmentación. Por ejemplo, un motivo amida de la estructura

CH_{3}-NH-CO-CH_{2}-CH_{3}

puede marcarse de dos maneras que produjeron el mismo peso atómico como sigue:

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Sin embargo, cuando se fragmentan a lo largo de las líneas de escisión indicadas, el residuo I producirá un fragmento que tiene un N marcado y un C normal, mientras el residuo II producirá un fragmento que tiene un C marcado y un N normal, produciendo de este modo patrones de picos distintivos en el EM.

Los siguientes esquemas ilustran la aproximación al código posicional de un único pico.

Ejemplo codificante C

Código posicional de un pico aislado

Esquema 2

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Siguiendo el procedimiento en el esquema 2, otra realización alternativa de la invención de codificación de isótopos puede seguir a una aproximación posicional de un pico EM único. Esta aproximación genera un pico de EM. En este formato, la masa del bloque codificante se modifica de tal forma que parece en una parte conveniente del espectro, y se usa para representar el primer monómero del bloque de construcción usado en la síntesis de un compuesto particular. Después de que la síntesis combinatoria se completa, el enlace 2 se escindió con el fin de permitir la identificación del bloque de código, el cual determina la identificación de un primer monómero de reserva.

El primer y el segundo enlaces en un esquema de engarces pueden ser el mismo o diferentes. Los enlaces pueden ser el mismo cuando se usa un ensayo directo de unión, seguido por la eliminación de las perlas positivas. Cuando los enlaces son diferentes, esto permite al ensayo estar solo bien mediante unión directa o con el ligando escindido.

La descodificación de una biblioteca combinatoria de tres monómeros se logra por tres etapas. Se determina la masa del bloque de código, identificando así el código, el cual identifica el primer monómero de reserva. El número de reserva del monómero de adición final determinó el monómero final, del cual se conoce la masa del monómero final. Después, las masas del primer y tercer monómero de reserva se restan del peso total de la construcción entera, dejando así la masa del segundo monómero de reserva, de la cual se infiere la identidad del segundo monómero de reserva.

El segundo pico posicional que codificó la aproximación es especialmente útil cuando los ligandos activos se rastrearon mediante el uso de una cromatografía en columna, y las construcciones de enlace se eluyen entonces.

El siguiente esquema ilustró la aproximación codificadora posicional de doble pico.

Ejemplo codificante D

Codificación posicional de doble pico

Esquema 3

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Siguiendo el procedimiento en el esquema 3, otra realización alternativa de la invención de la codificación isotópica puede seguir una estrategia de doble pico EM Esta aproximación produce dos picos EM. Por ejemplo, se preparó un juego de perlas de resina en el que las perlas llevan dos sitios protegidos, tales como BOC y FMOC. Un primer sitio protegido está desprotegido. Se preparó un número de n bloques de código isotópicos y cada código se unió a un primer sitio desprotegido.

El segundo sitio protegido se desprotege. Un residuo de referencia estándar que tiene una masa diferente se unió al segundo sitio desprotegido. Tras la EM, esto produjo un pico para la referencia estándar y un segundo pico para el código, con la diferencia de masas entre los dos picos siendo la unidad codificante. La decodificación de una biblioteca combinatoria de tres monómeros se logró a partir de tres etapas. La masa del ligando más el bloque codificante se determinó, identificando así el código, el cual identificó el primer monómero de reserva. El número de reserva de la adición final de monómero determinó el monómero final, a partir de lo cual se conoce el monómero final. Entonces, las masas de las reservas primera y tercera se sustrajeron del peso molecular total de la construcción entera, dejando así la masa del segundo monómero de reserva, de la cual se puede inferir la identidad de l segundo monómero de reserva.

En una construcción alternativa, el código de bloques se preparó para contener dos especies similares, una de las cuales es constante y actúa como una masa de referencia, mientras que la otra tiene bloques de masa variable a aquellos descritos para el siguiente esquema codificador del pico posicional único. Después de la escisión del enlace a la resina, se generó un ligando con un código de incremento anclado variable. La información codificada se determina ahora de la diferencia en masa de la unidad codificadora y la unidad de referencia de masa. La ventaja de esto es que el código puede dejar de anclarse al ligando y leerse al mismo tiempo como la masa de la construcción que se determina por EM. Esta estrategia proporciona dos picos de masa que representan el ligando unido tanto al código de referencia como al código variable. La diferencia en masa se usó para determinar la identidad del monómero 1, mientras el monómero 3 se conoce de la reserva correspondiente y por lo tanto el monómero 2 se infiere como se describe anteriormente en este documento.

La invención también hizo posible una realización alternativa que en efecto creó un mecanismo de codificación de barras. Algunas versiones no ejemplares de construcciones en estado sólido son posibles como sigue.

Ejemplo codificante E

La aproximación por codificación de barras

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En esta aproximación y sus variaciones, el bloque de código más ventajoso consistió en un dímero, cada una de sus unidades tiene una, dos o tres masas discretas. Por ejemplo, una construcción de la estructura: contiene un bloque de código que tiene dos bloques de masa, M_{1} y M_{2}, lo cual en este ejemplo constará de uno, dos o tres aminoácidos. Los aminoácidos se marcaron a tres masas discretas, produciendo, por ejemplo, glicina (G^{0}), con una masa de 57, glicina llevando N^{15} (G^{1}) con una masa de 58 y glicina llevando dos átomos de deuterio (G^{2}) en el carbono 2 con una masa de 59. Ensamblando estos tres motivos en 7 posibles conjuntos de masas producen los siguientes códigos y sus fracciones del total:

Composición	Presencia relativa
G^{0}	100%
G^{1}	100%
G^{2}	100%
G^{0}G^{1}	50% y 50%
G^{0}G^{2}	50% y 50%
G^{1}G^{2}	50% y 50%
G^{0}G^{1}G^{2}	33,3%, 33,3% y 33,3%.

Ahora es posible ensamblar estos conjuntos de masas dentro de sus bloques M_{1} y M_{2} y predecir que su característico patrón de picos EM será para cada bloque de código. Para este grupo de conjuntos de masas en la versión 1 de la aproximación de la codificación de barras, se predice el siguiente patrón de EM:

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En esta tabla, se predice un único pico para la muestra de código 1 a 144, dado que las masas combinadas de cada G^{0} son 57 + 57 = 114. Para la muestra de código 2, se predijeron dos grupos iguales a 114 y 115, dado que G^{0} en M_{1} más G^{0} en M_{2} suman hasta 114, y G^{0} en M_{1} más G^{1} en M_{2} suman hasta 115. En la muestra de código 6, dos picos únicos se predijeron a 114 y 118 y se predijo una redundancia a 116 para producir un pico aproximadamente dos veces tan alto como los picos a 114 y 118.

En la siguiente tabla, os patrones de pico predichos se muestran para 25 muestras de código. Los actuales patrones de pico EM se muestran en este documento más adelante de la tabla del patrón de picos predichos, y puede verse que hay una excelente correlación entre los patrones de pico observados y los predichos. Las referencias a G^{0}, G^{1}, y G^{2} se omitieron aunque las tres mismas versiones estimuladas isotópicamente de glicina anteriormente descritas en este documento se usan aún en esta tabla. (Nótese que los valores numéricos para la EM en la figura 1 son para la masa total de la construcción completa, incluyendo un residuo de lisina y los engarces, los cuales caen dentro del intervalo de 300 a 309 unidades de masa).

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Una vez la MS ha actuado en una muestra de síntesis combinatoria completa, el patrón se compara con un patrón predicho, el cual identifica sucesivamente el código, el cual identifica sucesivamente el primer monómero de reserva. Los patrones predichos pueden formar un tipo de código de barras legible por máquina, el cual, usando procedimientos bien conocidos para aquellos de habilidad normal en la técnica del escaneo óptico, permite la entrada, decodificación e interpretación rápidas de datos.

Otras estrategias codificadoras

Es posible combinar elementos de una o todas las razones, los procedimientos de pico único, pico doble o código de barras para dar construcciones de código. Los bloques de código no han de añadirse en el extremo delantero de una construcción - ellos pueden añadirse en cualquier punto, asumiendo que un reactivo adecuado esté disponible, por ejemplo:

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donde el marcaje con isótopos ocurre en la unión a la perla y se ancla al final de un ligando de tres monómeros, como se indica por el asterisco. El marcaje con isótopos puede también llevarse a cabo en el otro extremo del ligando igualmente.

En otra realización alternativa de la invención, dado que los isótopos se pueden leer por resonancia magnética nuclear (abreviadamente RMN), ésta puede usarse en vez de, o en conjunción con, espectroscopía EM. La RMN ofrece las ventajas de una gran seguridad (alguien puede correr las reservas de las razones en incrementos por debajo del 1%) la perla no ha de ser eliminada de la construcción antes del análisis, y la RMN, al diferencia de la EM, no es destructiva.

Otras construcciones pueden tomar la fórmula general ejemplar no limitante:

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Las figuras 133 a 286 muestran espectrogramas asociados con otra variación de la razón codificadora, la cual es un esquema de la razón codificadora de cuatro picos. En la siguiente tabla, la primera columna representa el bloque de código, la segunda columna es un número interno de referencia, y las columnas tercera, cuarta, quinta y sexta representan las fracciones molares de alaninas protegidas con FMOC, con diferentes masas integrantes usando marcaje por isótopos, es decir A^{0}, A^{3}, A^{2}, y A^{1} (A hace referencia a alanina, A^{3} es alanina más tres unidades de masa atómica, A^{2} es alanina más dos unidades de masa atómica, etc.).

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En la siguiente tabla, cada uno de los bloques de código enumerados listados inmediatamente anteriormente se correlaciona con un número de espectrograma identificado en la segunda columna y mostrado en la cara de cada respectivo espectro en las figuras.

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Mientras en principio se puede generar cualquier número de códigos, la mayor utilidad se logra minimizando el tamaño de la unidad codificante, la cual asimismo minimizará la inversión química en ella.

La muestra de las siguientes referencias se incorpora en su totalidad en el presente documento mediante referencia: Atherton, E. y Sheppard, R.C. (1989) Solid Phase Synthesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford. Bodanszky, A. y Bodanszky, M. (1984) The Practice of Peptide Synthesis. Springer-Verlag, Berlin.

Ejemplo 2

Tres ácidos bromoacéticos disponibles comercialmente (marcados isotópicamente) proporcionaron tres motivos codificantes.

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El siguiente esquema de síntesis ilustra una variante de la razón de aproximación. Se preparan 21 reservas de ácidos bromoacéticos, teniendo cada una razones entre C^{12} y C^{13} que progresan en incrementos del 5% desde el 0% al 10% de cada uno, en este caso con el isótopo marcado que se da sólo en el carbono número uno.

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El residuo R^{1} se codifica mediante la razón entre C^{12} y C^{13} de la muestra, el R^{3} se codifica por el número de reserva de donde se tomó R^{3}, y el residuo R^{2} se codifica por la resta de las masas conocidas R^{1} y R^{3} de la masa total de la construcción.

Ejemplo 3 Un ejemplo de isótopo codificador que usa la razón entre isótopos N^{14,15} en forma de un reactivo - N^{14,15}H_{4}Oac

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(a) Resina codificada, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, diisopropilcarbodiimida, DMF; (b) trans-(\pm)-3-fenil-2-(fenil-
sulfonil)-oxaziridina, CHCl_{3}; (c) aldehído, (X%, Y%) ^{14}NH_{4}OAc: ^{15}NH_{4}Ac, AcOH/CHCl_{3} (50:50); (d) (i) Pd(PPh_{3})_{4},
CHCl_{3}/4-metilmorfolina/AcOH (90:5:5), (ii) dieltiltiocarbamato de sodio/didisopropiletilamina/DMF (99:0,5:0,5); (e) amina, PyBOP, didisopropiletilamina, DMF; (f) TFA/H_{2}O (95:5).

Ejemplo 4 Un ejemplo de isótopo codificador que usa la razón entre isótopos ^{1,2}H en forma de un reactivo -NaCNBD_{4}

Este ejemplo incorpora mediante referencia la publicación de Lebl, M. et al., Drug Development and Research 1994, 33, 146-156).

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Ejemplo 5 Codificar usando cuatro diestereoisómeros posibles del enlace 1, código 2, y enlace 2

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Ejemplo 6 Un ejemplo de codificación isotópica usando la razón isotópica H^{1,2} en forma de un reactivo -NaCNBD_{4}

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Esquema para los ejemplos del 7 al 13

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Ejemplo 7

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1 - En un matraz de tres cuellos de fondo redondo de 500 ml, cargados con una barra agitadora, instalado con un condensador de reflujo, y un embudo de adición de 60 ml (bajo nitrógeno), se situaron 50,5 g de ácido 4-hidroxibenzoico, y 95 ml de 1,3-dimetoxibenceno. Se añadieron 123,33 de cloruro de cinc, y la mezcla se calentó a 60ºC con un baño de aceite. Se añadieron 126 ml de oxicloruro de fósforo gota a gota durante aproximadamente 30 minutos. Después de la adición, la reacción tuvo lugar durante 90 minutos a 60ºC. La mezcla color rojo oscuro se vertió sobre 1,5 l de hielo (en condiciones de mezclado intenso), y se añadieron a esto 2776 g de carbonato de sodio, en pequeñas partes (se observó una evolución de gas significativa). Se añadieron 400 ml de acetato de etilo y la fase acuosa se extrajo con otros 500 ml de acetato de etilo. Los compuestos orgánicos se combinaron y lavaron dos veces con salmuera y se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron, y se concentraron in vacuo a 40ºC, y además se secaron al vacío para dar 142,2 g de un sólido rosa-rojizo. El sólido se titró con 400 ml de hexano caliente, se filtró, y se secó para dar 63,3 de un sólido rosa. La recristalización a partir de 75 ml de metanol caliente proporcionó una producción de un montón de 2,4-dimetoxi-4-hidroxi-benzofenona pura (1) como un sólido rosa claro (21,9%).

Ejemplo 8

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2 - En un matraz de recuperación de 500 ml se añadieron 20,043 de 2,4-dimetoxi-4-hidroxi-benzofenona, 150 ml de agua, 0,75 g de yoduro de potasio, y 82,5 g de cloroacetato de sodio. La mezcla se calentó entonces a 85ºC en un baño de aceite. Se añadió a la mezcla un 50% de NaOH (p/v) en pequeñas cantidades, para mantener el pH a 11-14.
La reacción se siguió por TLC (2/5 metanol/cloruro de metileno) hasta que la reacción se completó (3 horas). La disolución de reacción se transfirió a un matraz erlenmeyer de 500 ml, mientras permaneció caliente, y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron 150 ml de acetato de etilo y la disolución se acidificó a pH 2 con HCl concentrado. La disolución se mezcló durante toda una noche. La gran cantidad de precipitado blanco se filtró y lavó en 3 x 50 ml de agua. El sólido no blanco se secó al vacío para dar una producción de un montón de 16,17 g de 2 (66%).

Ejemplo 9

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3 - En un matraz de recuperación se situaron 1,00 g de 2, 32 ml de metanol, y 3,2 ml de NaOH 1N. Esta disolución clara se calentó a 50ºC en un baño de aceite. Se añadieron 0,18 g de borohidruro de sodio en pequeñas cantidades. Se permitió a la reacción enfriarse a temperatura ambiente, y la disolución se concentró adicionalmente para eliminar el metanol. La disolución se extrajo con acetato de etilo. Los compuestos orgánicos se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron, concentraron y secaron al vacío para dar 0,98 g de una espuma rosa claro 3 (97,5%). El producto se usó inmediatamente para la fase siguiente.

Ejemplo 10

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En un matraz de recuperación de 200 ml se situaron 10,0 g de Fmoc-Cl, los cuales se disolvieron en 100 ml de dimetoxietano al 80%. A esta mezcla se añadieron aproximadamente 35 ml de ^{15}N-amoniaco al 10% en agua. Comenzó a formarse un precipitado blanco. El pH de la mezcla se llevó a 7-9- Se permitió desarrollarse a la reacción durante 30 minutos.

La reacción se acidificó con HCl 12 N y el sólido blanco se filtró y se secó al aire. El secado adicional al vacío dio un primer montón de producción de Fmoc-^{15}NH_{2} como un sólido cristalino blanco.

Ejemplo 11

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4 - En el matraz de recuperación de 100 ml usado para secar 3 se añadieron 20 ml de dioxano, 0,75 g de Fmoc-^{15}NH_{2} y 0,25 g de ácido bencensulfónico. La reacción se calentó a 40ºC durante 18 horas. Se notó una gran cantidad de precipitado gris claro. La mezcla se añadió al agua y en sólido marrón claro se filtró y purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna (100% de acetato de etilo, después 98% de acetato de etilo/ácido acético) para dar 0,37 g de 4 puro y un sólido marrón claro.

Ejemplo 12

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5 - En un tubo agitador de 10 ml se pusieron 0,50 g de poliestireno aminometilado (0,21 mmol/g). Se añadió a la resina una disolución de 0,1845 g del engarce 4 ^{15}N-Knorr en 5 ml de DMF, y 0,164 ml de diisopropilcarodiimida. El acoplamiento tuvo lugar en un agitador durante 5 horas. La disolución se filtró, y la resina se lavó con DMF y CH_{2}Cl_{2}, y se secó al vacío (ninhidrina negativa) para proporcionar 5.

Ejemplo 13

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6a y 6b - En dos tubos agitadores de 5 ml, cada uno aproximadamente con 10 mg de resina, se añadieron a ambos 5, 2, 4 ml de 20% de piperidina/DMF. Ambos se lavaron después con DMF (ninhidrina positivo). Al primer agitador se añadieron 0,0246 g de 4-bromometil ácido benzoico, 0,05 ml de DIC, en 1,0 ml de DMF. Cada reacción se desarrolló en un agitador durante toda una noche. Las resinas se lavaron con DMF, cloruro de metileno, y se secaron al vacío (ninhidrina negativo). Se añadió 1,0 ml de 95% TFA/agua a las resinas secas y la escisión se llevó a cabo durante 1 hora. Las disoluciones se filtraron y se concentraron para dar 6a y 6b. ESI-EM mostraron una razón de N^{15} aproximada del 46%.

Ejemplo 14 Preparación de engarces fotoescindibles marcados por radioisótopo

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Ejemplo 15 Códigos de razones

1 - Una disolución de 1,511 g de 2-nitrobenzaldehído (10,0 mmol), 1,563 g de ácido malónico (15,0 mmol), 2,00 g
15 N (98% )-acetato de amonio (25,6 mmol), en 5,0 ml de ácido acético (99,999%) se calentó a 100ºC con un baño de aceite. Como se consigna en el experimental Oelschläger, durante el calentamiento hubo un precipitado temporal casi incoloro (sal de amonio del compuesto bencilideno). Después de 5 horas de calentamiento, se añadieron 8,0 ml de HCl al 25% y el calentamiento continuó durante otras 5 horas. Se añadieron 12,0 ml de agua y la reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró un precipitado marrón claro, y el filtrado se evaporó hasta casi sequedad. Después, la disolución se hirvió brevemente con carbón activo y se filtró. El filtrado se hizo básicamente con la adición de hidróxido de amonio concentrado. 1 precipitó como un sólido amarillento. El sólido se lavó después dos veces con agua, una vez con metanol al 50% en agua, una vez con 1:1 metanol-éter, y tres veces con éter. El sólido se secó entonces al vacío para producir 0,8 g de producto 1 puro (38%).

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0,470 g (2,22 mmol) de 1 se suspendieron en 5,0 ml de agua, y subsiguientemente se disolvieron por la adición de 0,299 (2,13 mmol) ml de trietilamina. A esta disolución se añadieron 0,757 g de Fmoc-OSU (2,25 mmol) en50 ml de acetonitrilo. La reacción después se desarrollo durante 30 minutos (pH 10). La suspensión se evaporó y diluyó con 5,0 ml de agua y 10,0 ml de acetato de etilo. El pH se ajustó a 2 con HCl 12N. Un sólido blanco precipitó. Se filtró y se extrajo con acetato de etilo. Los compuestos orgánicos se lavaron con HCl 2N, H_{2}O, y salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó para dar un sólido blanco el cual bajo titración con acetato de etilo y hexano dio 0,36 g de 2 puro (0,37%).

Disposición de los pocillos

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

Porcentaje/razones de fotoengarce-N^{14}/N^{15} de las disoluciones se generaron de la siguiente manera (desde 10,5 ml de disoluciones madre DMF de cada fotoengarce).

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Empezando con 6,3 g de aminometil poliestireno (0,21 mmol/g), dividido en 21 lotes iguales de 0,300 gramos cada uno, se añadieron 1,0 ml de las disoluciones de razones variables de ^{15}N-2 y ^{14}N-2, en incrementos del 5% (0%, 5%, 10% hasta el 100% de fotoengarce ^{15}N-2) (véase CDW, figura 1). Estas disoluciones se generaron disolviendo 0,4988 g del fotoengarce ^{14}N-2 y 0,500 g del fotoengarce ^{15}N-2, y usando alícuotas de 0,050 ml de cada una (20:0, 19:1, 18:2, a 0:20). Se añadieron después a la mezcla 0,169 ml de diisopropilcarbodiimida. Las muestras se mezclaron después y el acoplamiento tuvo lugar durante toda una noche (aproximadamente 16 horas). Las resinas se lavaron 8 veces con 1,5 ml de DMF, y después con cantidades copiosas de metanol.

Aproximadamente 0,1 g de cada lote se combinaron en 7 lotes que constan de las siguientes razones por lote (véase CDW, figura 2). Estos 7 lotes de resina se usaron en el estudio de la biblioteca de las aminas terciarias.

Disposición de los pocillos

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Aproximadamente 0,1 g de cada lote de resina de una razón determinada se acopló con 0,50 ml de una disolución de 0,55 g de 15N-Fmoc-alanina-OH en 10,5 ml de DMF, seguida por la adición de 0,169 ml de DIC. El acoplamiento se desarrolló durante toda una noche. Las resinas se lavaron con cantidades copiosas de metanol y se secaron al vacío (ninhidrina negativa).

Una pequeña cantidad de cada lote de resina, aproximadamente 0,01 g, se fotoescindió durante 4 horas en 0,200 ml de 3:2 agua/THF. EM se llevó a cabo subsiguientemente.

Ejemplo 16 Preparación de códigos basados en masa distinguibles por RMN

La resina Novabiochem TGR acoplada con ^{13}C_{2}-Fmoc-gly-OH. Tanto el carbono del carbonilo como el carbono del metileno de la glicina fueron evidentes por el ^{13}C en la RMN de la resina en CDCl_{3}.

Adicionalmente, estos carbonos se pudieron integrar frente a la señal estándar PEG que pudo permanecer constante a través de las razones de engarce ^{13}C/ligando pudo variar y determinarse subsiguientemente (resolución de ligando) por este procedimiento no destructivo.

51

La resina Novabiochem TG acoplada con ^{13}C_{2}-Fmoc-gly-OH

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La resina Novabiochem TG se acopló con ^{13}C, fotoengarce-^{15}N. Este engarce pudo tener una razón irrefutable entre ^{13}C y chapa ^{13}C, igual que una chapa ^{15}N.

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Ejemplo 17 Aproximación de razones codificadoras

El estudio de cuantificación de ^{13}C RMN en una razón de ácido acético marcado con ^{13}C y ácido acético no marcado unido a resina Tenta-Gel-NH_{2}. El ácido acético carbonilo ^{13}C puede integrarse frente al ^{13}C que se da de forma natural en la parte PEG de la resina TG-NH_{2}. Se observó una diferenciación de incrementos del 5%.

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Ejemplo 18 Preparación de bloques de código marcados isotópicamente protegidos por FMOC

Glicina marcada isotópicamente de los Laboratorios de Isótopos de Cambridge.

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Alanina marcada isotópicamente de los Laboratorios de Isótopos de Cambridge.

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N-moc-L-glicina

Se disolvió un gramo de cada glicina marcada isotópicamente (13,3 mmol) en 15 ml de agua purificada y 1,4 g de carbonato de sodio (véase la figura GP1). Se añadieron lentamente 15 ml de 1,4 g de carbonato de sodio (véase la figura GP1). Se añadieron lentamente 15 ml de 1,4-dioxano a cada una y se agitaron. Durante el periodo de dos horas, se añadieron 4,5 g de Fmoc-OSu (abreviatura de 9-fluorenilmetil-N-hidrosuccinimida) a cada una (véase la figura GP3 para el esquema). El carbonato de sodio saturado adicional en agua se añadió para mantener el pH = 10. Las disoluciones se dejaron agitando durante toda una noche. Se añadió HCl 6M lentamente a la disolución hasta que el pH fue aproximadamente 2. La extracción del compuesto se completó usando 50 ml de acetato de etilo, lavando cuatro veces con 50 ml de agua acidificada/purificada. Las fracciones acuosas se lavaron con 50 ml de acetato de etilo. Se combinaron ambas fracciones de acetato de etilo. El sulfato de magnesio se añadió para eliminar cualquier exceso de agua. Las muestras se filtraron y concentraron usando un Roto Vap hasta que el volumen final fue aproximadamente un tercio del volumen original. La cristalización se completó usando hexano. El hexano se decantó y se permitió secarse al compuesto.

N-Fmoc-L-alanina

Se disolvió 1 g de cada alanina marcada por isótopo (11,2 mmol) en 15 ml de agua purificada y 1,2 g de carbonato de sodio (véase figura GP2). Se añadieron lentamente a cada una 15 ml de 1,4-dioxano, y se agitaron. Durante el periodo de dos horas y media, se añadieron 3,8 g de Fmoc-OSu (9-fluorenilmetil- N-hidrosuccinimida) a cada una (véase la figura GP3 para el esquema ). Se añadió carbonato de sodio saturado adicional en agua para mantener el pH = 10. Se dejó a las disoluciones agitándose durante toda una noche. Se añadieron 6M de HCl lentamente a la disolución hasta que el pH fue aproximadamente 2. La extracción del compuesto se completó usando dos veces 150 ml de acetato de etilo, lavando cuatro veces con 300 ml de agua acidificada/purificada. El sulfato de magnesio se añadió para eliminar cualquier exceso de agua. Las muestras se filtraron y concentraron usando un Roto Vap hasta que el volumen final fue aproximadamente un tercio del volumen original. La cristalización se completó usando hexano. El hexano se decantó y se permitió secarse al compuesto.

La discusión de las siguientes referencias se incorporó en su totalidad en el presente documento mediante referencia: Atherton, E. y Sheppard, R.C. (1989) Solid Phase Peptide Síntesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Bodanszky, A. y Bodanszky, M. (1984). The Practice of Peptide Synthesis. Springer-Verlag, Berlín.

Ejemplo 18 Síntesis de péptidos isotópicamente marcados para análisis espectral de masa. Mostrando su uso en cuatro aproximaciones codificadoras

La alanina, la serina y la lisina protegidas por Fmoc se obtuvieron a partir de Bachem Bioscience. La glicina-Fmoc se obtuvo de Novabiochem. Los aminoácidos isotópicamente marcados se obtuvieron a partir de los laboratorios isotópicos de Cambridge y se protegieron con Fmoc en nuestra empresa (GP). El engarce Fmoc Knorr se elaboró a partir de Novabiochem. El ácido Fmoc-3-(2-nitrofenil)-3-aminopropiónico (un agente de unión fotolábil) se obtuvo de Universal Organics. La resina aminometil poliestireno (0,81 mmol/gramo) se obtuvo a partir de Advanced ChemTech.

Los engarces se anclaron al soporte sólido manualmente en los agitadores de la reacción (CM). La resina se dividió en 85 recipientes de reacción en un Advanced ChemTech ACT496 MBS. La resina se desprotegió con un 25% de piperidina/dimetilformamida dos veces durante 10 minutos, lavándose después minuciosamente con dimetilformamida. Los primeros aminoácidos se acoplaron como disoluciones 0,142 M en N-metil-pirrolidona, con activación in situ de PyBOP/diisopropiletilamida durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La desprotección Boc se llevó a cabo con un 25% de ácido trifluoroacético en diclorometano durante 30 minutos. Las acetilaciones se llevaron a cabo con un 33% de anhídrido acético en dimetilformamida durante 30 minutos. Todos los acoplamientos se verificaron mediante pruebas de color de ninhidrina. La escisión del engarce knorr se logró en un 90% de ácido trifluoroacético, 3% de agua, 3% de fenol y 3% de tioanisol durante 1,5 horas. Las muestras se secaron bajo una corriente de nitrógeno, después se disolvieron en agua y se liofilizaron dos veces. La fotoescisión se llevó a cabo en 2:1 agua: tetrahidrofurano bajo una lámpara de luz ultravioleta durante 12 horas. Las muestras se liofilizaron una vez.

Código de pico posicional único

Esta disposición se diseñó para producir 20 muestras con singlete, pesos moleculares únicos para la identificación positiva por espectroscopía de masas. Las muestras se ensamblaron en duplicados, un juego de veinte en un soporte sólido químicamente escindible, y el segundo juego de veinte en un soporte fotoescindible. Usando una combinación de uno o dos aminoácidos, se generó una "región codificante" antes de la adición del ligando sintético (en este caso acetil-lisina). Los veinte códigos se construyeron a partir de los siguientes aminoácidos:

Glicina

Glicina (15 N)

Glicina (2,2-D2)

Alanina

Alanina (15 N)

Alanina (1-13C)

Serina

Después de que la región codificante se haya ensamblado, la lisina se acopló como un ligando de prueba igual que para generar una cadena lateral amino libre para facilitar la observación mediante espectroscopía de masas. El grupo a-amino de la lisina se acetilo después.

Los códigos y ligando se ensamblaron en resina de poliestireno funcionalizada tanto con Fmoc-Knorr o engarces ácido Fmoc-3-(2-nitrofenil)-3-aminopropiónico.

La disposición del código posicional del pico único se muestra a continuación:

Figura 1

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Código posicional de pico doble

Esta disposición se diseñó para producir 20 muestras con doblete de picos en espectroscopía de masas; un pico se presenta a partir del ligando unidos a un código único, con un segundo pico resultante de un pico de referencia ensamblado simultáneamente (ligando más un residuo fijo). Como se describe en el SPPC anteriormente en este documento, usando una combinación de uno y dos aminoácidos, una "región codificante" se generó antes de la adición del ligando sintético (en este caso acetil-lisina). Los veinte códigos se construyeron también a partir de los siguientes aminoácidos:

Glicina

Glicina (15 N)

Glicina (2,2-D2)

Alanina

Alanina (15 N)

Alanina (1-13C)

Serina

Los códigos y el ligando se ensamblaron sobre resina de poliestireno funcionalizada con Fmoc-Knorr de engarces de ácido Fmoc-3-(2-nitrofenil)-3-aminopropiónico.

Los códigos para el doble pico posicional se muestran a continuación:

Figua 2

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En cada una de las muestras producidas en este experimento, el peso molecular del péptido mostrado anteriormente en este documento apareció superpuesto con el pico de referencia generado por Ac-Lys-Gly-NH_{2}. Esto es para demostrar la capacidad para identificar tanto el primer lote de reserva y el ión molecular generado por el ligando desconocido.

Para producir muestras que presenten el doble pico codificado, se usó un esquema de protección individual. El primer aminoácido protegido de la región codificante se acopló simultáneamente con una cantidad equimolar de Boc-glicina. La región codificante se ensambló usando química de Fmoc, después el grupo protector Boc se eliminó con ácido trifluoroacético. Después de una eliminación final del grupo protector código Fmoc con piperidina (la cual neutralizó concomitántemente las sales de la amina de glicina expuesta), el ligando (acetil lisina) se acopló. Tras la fotoescisión; dos compuestos se liberaron en cantidades equimoleculares: el ligando unido a un aminoácido de referencia (glicina) y el ligando unido a un código único. La diferencia de masas entre los dos picos indicó la identidad del código, y de ahí la identidad del primer monómero del ligando acoplado.

Código de barras del espectro de masas

Esta disposición produce veinticinco muestras, desmintiendo cada una de ellas un único ión molecular o patrón de pico mediante espectroscopía de masas. Usando sólo combinaciones de glicina marcada isotópicamente en sólo dos posiciones, se producen veinticinco "códigos de barras" únicos. De esta manera, se pudo identificar fácilmente el primer lote almacenado de cualquier perla única derivado de una biblioteca de combinación de escisiones.

En este experimento los aminoácidos protegidos por Fmoc se acoplaron bien a mezclas discretas o bien a mezclas equimoleculares de dos o tres aminoácido.

La disposición del código de barras del espectro de masas se muestra a continuación:

Figura 3

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Ejemplo 19

Se pusieron 4 gramos de poliestireno aminometilado (0,81 mmol/g) dentro de cada uno de los agitadores de 2-250 ml. La resina se hinchó con dimetilformamida (abreviadamente DMF) y se desecó. La resina se lavó entonces con un 20% de piperidina/DMF durante \sim3 minutos y se secó. La resina se lavó tres veces con DMF, una vez con diclorometano (abreviadamente DCM): DMF 1:1, y dos veces más con DMF.

Se añadieron al primer agitador 3,5 equivalentes del ligando de Knorr (6,12 g, 11,34 mmol) y 3,5 equivalentes de PyBop (5,9 g, 11,34 mmol). Se añadió suficiente DMF para cubrir el lecho de resina. La disolución se activó después con 10,5 equivalentes de DIEA (5,93 ml, 34,02 mmol). La reacción se desarrolló durante 1 hora con agitación manual cada 5-10 minutos.

Se añadieron al segundo agitador 3,5 equivalentes de fotoengarce (4,89 g, 11,34 mmol) y 3,5 equivalentes de PyBop (5,9 g, 11,34 mmol). Se añadió suficiente DMF para cubrir el lecho de resina. La disolución se activó entonces con 10,5 equivalentes de DIEA (5,93 ml, 34,02 mmol). La reacción se desarrolló durante 1 hora con agitación manual cada 5-10 minutos.

Después de una hora ambos agitadores se secaron. Las pruebas de ninhidrina indicaron acoplamiento completo para ambos ligandos. La resina se lavó cuatro veces con DMF, una vez con diclorometano (DCM):DMF 1:1 y dos veces más con DMF.

La resina se escindió a un bloque de reacción de 96 pocillos ACT 496 de teflón.

Ejemplo 20 Código posicional de doble pico

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Ejemplo 21 Razón de código que usa amina terciaria

Los siete lotes de resina (CDW fig. 2) se transfirieron a agitadores de 10 ml usando dimetilformamida (DMF). Los agitadores se cubrieron después con papel de aluminio. El ligando fue Fmoc desprotegido dos veces durante 5 minutos usando cada vez 20% de piperidina/DMF. La resina se lavó cuatro veces con DMF, una vez con diclorometano (DCM):DMF 1:1, y dos veces con DMF.

Se pesaron en viales separados 0,315 mmol de cada uno de los siete haloácidos y se añadió una cantidad equimolecular de PyBop a cada uno. Los haloácidos se disolvieron después en 2 ml de DMF. Cada disolución se añadió entonces al lote respectivo de resina y se activó con 165 \mul de diisopropiletilamina (abreviadamente DIEA). El acoplamiento se desarrolló durante 1 hora. Después del acoplamiento las resinas se secaron y lavaron cuatro veces con DMF, una vez con DCM:DMF 1:1, y dos veces con DCM para secar la resina.

Se pesaron 0,315 mmol de cada uno de los siete aminoácidos en viales separados y se añadió una cantidad equimolecular de HBTU a cada uno. Los haloácidos se disolvieron después en 2 ml de DMF. Cada disolución se añadió entonces al lote respectivo de resina y se activaron con 165 \mul de DIEA. El acoplamiento se desarrolló durante 1 hora. Después del acoplamiento las resinas se desecaron y se lavaron cuatro veces con DMF, una vez con DCM:DMF 1:1 y dos veces con DMF. El acoplamiento se completó con ninhidrina.

Los lotes de resina se combinaron y dividieron en 24 pocillos de un bloque de reacción ACT 396 polipropileno de 96 pocillos. La reina se lavó dos veces con DCM y se secó.

La resina se hinchó con DMF y se secó. Se añadió a cada pocillo 1 ml de una disolución amina 1,0 M en dimetilsulfóxido (DMSO). La reacción se desarrolló durante toda una noche. La resina se secó y lavó dos veces con DMF, una vez con DMF:metanol:agua (1:1:1), y se lavó tres veces más con DMF. Los 24 lotes de resina se combinaron después y se dividieron en 24 pocillos.

Se añadieron 350 \mul de disolución de aldehído (3,0 M/DMF) a cada pocillo y se mezclaron durante dos minutos. Se añadieron 250 \mul adicionales de trimetilortoformato a cada pocillo y se mezclaron durante 1 minuto, seguidos por 100 \mul de ácido acético al 3% en DMF. La reacción se mezcló durante 15 minutos antes de una adición final de 1 ml de 1,5 M de Nabh_{3}cn. La aminación reductiva se desarrolló durante 3 horas. La resina se secó y se lavó dos veces con DMF.

Una segunda aminación reductiva se llevó a cabo usando triacetoxiborohidruro de sodio. Se añadieron 350 \mul de disolución de aldehído (3,0 M/DMF) a cada pocillo y se mezclaron durante dos minutos. Se añadieron 250 \mul adicionales de trimetilortoformato a cada pocillo y se mezclaron durante 1 minuto, seguidos por 100 \mul de ácido acético al 3% en DMF. La reacción se mezcló durante 15 minutos antes de una adición final de 1 ml de 1,5 M de NaBH_{3}CN (O_{2}CCH_{3}). La reacción se desarrolló durante toda una noche. La resina se secó y lavó dos veces con DMF, tres veces con DMF:metanol:agua, tres veces con DCM, y tres veces finales con metanol.

Ejemplo 22 Código posicional de pico único con escisión fotolábil

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Ejemplo 23 Reacción de selección

La síntesis de un juego de resinas codificadas en serie que contienen 192 combinaciones de aminoácidos marcados isotópicamente (glicina G^{0}, G^{0}, G^{0}, G^{0} y alanina: A^{0}, A^{1}, A^{2}, y A^{3}) y se separaron mediante engarces Knorr como se muestra a continuación:

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La reacción de selección se lleva a cabo en la parte ligando de la molécula donde 3 monómeros diferentes se usaron para el acoplamiento de aminas primarias a los bromuros alélicos igual que las cuatro condiciones de reacción diferentes para dar un total de 12 combinaciones. La acilación de aminas secundarias con ácidos carboxílicos implicaron 4 ácidos diferentes y cuatro condiciones de reacción diferentes para dar otras 16 combinaciones. La resina se almacenó y trató con 36 condiciones diferentes para la reacción intramolecular de Heck final para dar más de 6900 compuestos potenciales que contienen diferentes monómeros y condiciones de reacción. Tras la escisión de la perla única con TFA/MeCl_{2} y un 6% de trietileno se liberan tanto la parte codificada como el ligando, como se destaca más adelante en este documento. El ligando se codifica también mediante la incorporación de glicina (0) y glicina (2) para ayudar a identificar los picos de ligando en el espectro de masas.

El espectro de masas que se muestra en las figuras de la 10 a la 12 contiene tanto el código (544-562) como el ligando(462 y 464), (504 y 506), (478 y 480). Los monómeros y condiciones que se desarrollaron para este espectro de masas en particular se enumeran en el espectro.

A partir de estos resultados alguien puede usar la aproximación molecular para mirar a varias condiciones de reacción y monómeros sobre una perla única y leer tanto el código como el ligando cuando el material se escinde de la perla.

Ejemplo 24 Código de razón: IR, RMN y análisis de EM

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Se sintetizaron 16 muestras de resina, donde R se definió mediante un acoplamiento simultáneo de monómeros del 1 al 3 en diferentes patrones de razones (las razones se destacan más adelante en este documento). Estas resinas se pudieron analizar después mediante varias técnicas analíticas para dilucidar su identidad de razón. Las perlas se analizaron mediante IR, espectrometría de masas, RMN, y análisis de aminoácidos. Las razones generadas para el acoplamiento simultáneo se definen R1:R2:R2 y fueron como sigue para las 16 muestras: muestra #1-1:1:5; muestra #2-1:2:5; muestra #3-1:3:5; muestra #4-1:4:5; muestra #5-2:1:5; muestra #6-2:2:5; muestra 7 #8-2:4:5; muestra 9-3:1:5; muestra #10-3:2:5; muestra #11-3:3:5; muestra #12-3:4:5; muestra #13-4:1:5; muestra #14-4:2:5; muestra #15-4:3:5; muestra #16-4:4:5. Los espectros para estas razones se muestran en las figuras acompañantes de la 18 a la 51 como sigue:

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Ejemplo 25 Estireno codificado

Las perlas por sí mismas usadas generalmente como soportes sólidos en síntesis en el estado sólido pueden marcarse isotópicamente. Las perlas de estireno compuestas de estireno pueden marcarse fácilmente mediante C^{13}, F^{20} o H^{2}. Adicionalmente, es posible combinar las construcciones marcadas isotópicamente con perlas que han estado codificadas por sí mismas o marcadas con una o más de una serie de monómeros.

Estireno (M_{s}), 2-fluoroestireno (M_{1}), 3-fluoroestireno (M_{2}) y 4-fluoroestirano (M_{3}) se desinhibieron previamente a la polimerización pasando a través de una columna de adsorción de aluminio.

El iniciador 2,2-azobisisobutironitrilo (abreviadamente AIBN) se purificó mediante cristalización a partir de metanol. El grado de tolueno del espectro se usó como disolvente en una polimerización de radical libre sin purificación adicional.

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Copolimerización de estireno y F-estireno

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Ejemplo 26 Codificación de una biblioteca peptídica

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Una librería de 1.000 componentes que consta de tres posiciones monoméricas se diseñó para demostrar la utilidad de la estrategia codificante. La biblioteca se sintetizó usando la metodología de mezcla de escisiones para crear una biblioteca de 10 x 10 x 10. A partir del procedimiento de mezcla de escisiones se produce un compuesto por perla y las perlas se mezclan dos veces durante la síntesis, la química de la adición monomérica en cada etapa puede registrarse en la perla con el fin de descodificar el compuesto.

La primera posición se codifica controlando la razón de ^{12}C:^{13}C_{2} incorporados con el ácido bromacético en la primera etapa de síntesis. Diez razones únicas se emplearon con incrementos del 9% que varían de 9:91 a 90:10. El uso de incrementos del 9 por ciento evitó los puntos finales, bien 0:100 o bien 100:0, mientras que permite un total de 10 códigos. El tercer monómero se conocía ya porque la biblioteca no se recombinó después de la adición del monómero final (sólo un monómero del juego de tres estuvo presente en cada reserva). Esta posición, por lo tanto, se almacenó o codificó especialmente.

La segunda posición se codificó mediante el peso molecular del compuesto. Dado que el monómero uno se conoce por la reacción isotópica y el monómero tres por la reserva final, el monómero dos se calculó usando el peso molecular determina do por el espectrómetro de masas. Esto impuso una restricción para cualquier librería: los monómeros en la segunda posición deben tener diferentes pesos moleculares. Los otros monómeros no tienen ninguna restricción. Para esta prueba, las reservas finales estaban compuestas de compuestos que tienen pesos moleculares únicos con el fin de facilitar descodificación.

Se escindieron individualmente veinte perlas únicas de cada una de las 10 reservas. Los compuestos se analizaron mediante espectrometría de masas y se identificaron mediante la razón isotópica y el peso molecular de los picos analizados. El pico resultante del ión protonado monoisotópico se designó como M_{0}H^{+}mientras que el resultante del ión diisotópico (M_{0}H+2)^{+} se designó M_{2}H^{+}. El marcaje deliberado con ^{13}C_{2} controló la intensidad del pico M_{2}H^{+} relativa al pico M_{0}H^{+}.

Los datos espectrales de masa de una perla única en la reserva 3 mostraron que M_{0}H^{+} y M_{2}H^{+} fueron 552 y 554, respectivamente. La razón M_{0}H^{+}:M_{2}H^{+} se calculó para ser 10:90, lo cual estuvo bastante cerca de la razón actual para el ión 552, el cual fue 9:91. Usando M_{0}H^{+} como 550 y M_{2}H^{+} como 552, la tasa calculada entre M_{0}H^{+} y M_{2}H^{+} fue de 56:44. El compuesto que tiene un ión M_{0}H^{+} en la reserva 2 tuvo una razón teórica de 54:46, de nuevo en muy estrecha concordancia con la razón calculada. En algunos casos, las reacciones laterales implicadas en la adición de monómeros pueden complicar los espectros. Los espectros 2C muestran más adelante el espectro de masas de una perla única de la reserva 1. El ión más intenso en el espectro está a m/z 586. Sin embargo, la razón M_{0}H^{+}:M_{2}H^{+} calculada (65:35) no se corresponde con la razón conocida para el compuesto en la reserva 1 con M_{0}H^{+} de 586. Esta aparente discrepancia se debe a la adición del tercer monómero para la reserva 1, un nitrilo. Se sabe que bajo condiciones ácidas (condiciones de escisión) los nitrilos pueden estar hidratando a una amida. Con la adición de agua, los picos del ión M_{0}H^{+} a 586 cambian a 586 (M_{0}H^{+} +18). Así, la razón M_{0}H^{+}:M_{2}H^{+} de los picos a 586 y 588 verificó la codificación por el ión a 568 (el cual tiene su propio, más débil, juego de picos que tiene la misma razón). La razón conocida para el compuesto en la reserva 1 con un ión de 568 es 63:37, lo cual corresponde al valor calculado. Esta particular reacción de hidratación se observó para todos los compuestos en la reserva 1. Este ejemplo demostró la capacidad para descodificar compuestos y determinadas reacciones laterales, un importante incremento sobre otras metodologías de codificación las cuales serían útiles durante el desarrollo de la química de fase sólida.

Ejemplo 27 Programa de pseudo-código listado para ordenador-detección asistida de compuestos codificados isotópicamente en un espectro de masas

1. Introducir la fórmula molecular y las razones isotópicas de un compuesto codificado.

2. Calcular el peso molecular monoisotópico a partir de la etapa 1.

3. Calcular la distribución teórica de isótopo de la etapa 1.

4. Abrir el archivo de salida del espectro de masas.

5. Localizar el peso molecular monoisotópico en el archivo de salida del espectro a entre +/- 0,3 amu y revisar los correspondientes picos isotópicos.

6. Si la etapa 5 fue exitosa, comparar la distribución teórica de la etapa 3 con los valores medidos en el espectro de masas usando una prueba Chi-Square. El resultado de la Chi-Square determina la presencia o ausencia del compuesto codificado.

Derechos de autor 1996, Glaxo Wellcome, Inc. Todos los derechos reservados.

Esta invención es ejecutable en un computador MacIntosh o un computador IBM-PC compatible, ejecutando el sistema operativo Windows 95, Windows NT o Macintosh OS, lo cual incluye una CPU (abreviatura en inglés de Unidad Central de Procesamiento), un dispositivo principal de almacenamiento, recursos I/O (abreviatura en inglés de entrada/salida), y un interfaz de usuario incluyendo un teclado operado manualmente y un ratón.

Claims (29)

1. Un procedimiento basado en la masa, no químico, para registrar la historia de reacción de una serie de reacciones en cada uno de una variedad de soportes sólidos únicos, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) hacer reaccionar, en una fase de inserción de bloque de masa, una variedad de agentes de masa que cada uno de ellos tiene una única masa definida con cada uno de un grupo de dichos soportes sólidos únicos, tal que cada uno de dichos grupos de soportes sólidos únicos ha reaccionado con un agente que tiene una masa definida que es diferente de cualquier otro agente que reaccione con cualquier otro de dichos grupos o dichos soportes sólidos únicos;

(b) hacer reaccionar cada uno de dichos grupos de soportes sólidos que tienen un diferente agente de masa definido con un primer reactivo químico diferente;

(c) mezclar dichos grupos conjuntamente y después dividir dicha variedad de soportes sólidos únicos en una variedad de grupos para una segunda fase intermedia o fase final;

(d) repetir dicha reacción con un reactivo químico al menos una vez para proporcionar una variedad de productos finales, habiendo diferentes productos en los diferentes soportes sólidos únicos individuales;

siendo dichos agentes únicos de masa definida aptos para ser analizados y en los que dichos análisis definen la elección de un primer agente químico.

2. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha variedad de agentes de masa definida y entidades moleculares que difieren una de otra por tener al menos uno de sus átomos sustituido por un isótopo diferente de ese átomo, proporcionó que la fórmula química estructural de dichos agentes de masa definida es la misma.

3. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicha variedad de agentes de masa definida y entidades moleculares que difieren una de otra por tener al menos una sustitución isotópica en diferentes posiciones atómicas en la molécula proporcionó que la fórmula química estructural de dichos agentes de masa definida es la misma.

4. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha variedad de agentes de masa definida son entidades moleculares regularmente repetidas que difieren una de otra por un integrante de dichas entidades moleculares repetidas.

5. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dichos agentes de masa definida se analizan por espectroscopía de masas.

6. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un único pico simple de masa cuando se analiza mediante espectroscopía de masas.

7. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un único pico doble de masa cuando se analiza mediante espectroscopía de masas.

8. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un único par de picos simples de masa cuando se analiza mediante espectroscopía de masas.

9. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un único par de picos dobles de masa cuando se analiza mediante espectroscopía de masas.

10. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un patrón único de uno o más picos de masa.

11. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 10, en el que dichos agentes de masa definida pueden expresarse como un patrón legible por una máquina.

12. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 11, en el que dichos patrones legibles por una máquina son códigos de barras.

13. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera independientemente un único patrón de picos de espectrometría de masas seleccionado del grupo que consta de picos de masa simples únicos, picos de masa dobles únicos, pares únicos de picos de masa simples, pares únicos de picos de masa dobles, y patrones de pico únicos que son capaces de expresarse como patrones legibles por máquina.

14. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dichos agentes de masa definida se analizaron mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear.

15. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 14, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un patrón único de uno o más picos de resonancia magnética nuclear.

16. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 15, en el que dichos patrones de pico únicos para cada uno de dichos agentes de masa definida pueden expresarse como un patrón legible por máquina.

17. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 16, en el que dichos patrones legibles por máquina son códigos de barras.

18. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho agente de masa definida se analiza mediante espectroscopía infrarroja o mediante espectroscopía de Raman.

19. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 18, en el que dichos agentes de masa definida se seleccionan de tal forma que cada uno de ellos genera un patrón único de uno o más picos de espectroscopía infrarroja o de espectroscopía de Raman.

20. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 19, en el que dichos patrones de pico únicos para cada uno de dichos agentes de masa definida pueden expresarse como un patrón legible por máquina.

21. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 20, en el que dichos patrones legibles por máquina son códigos de barra.

22. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho primer, segundo o subsiguiente agente es un sustrato para la determinación de especificidad de unión a un compuesto químico de interés.

23. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicho análisis de espectroscopía de masas proporciona picos de masas adecuados para que se reconozca que representan como reactivos codificados.

24. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que se generan picos de masa adicionales que sirven como firma para la identificación positiva de picos de masa relevantes.

25. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que al menos dos grupos de dichos soportes sólidos únicos se emplean en cada una de dichas reacciones.

26. El procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, comprendiendo la etapa adicional de seleccionar dichos productos finales en dichos soportes sólidos únicos para una característica de interés e identificar la historia de reacción de al menos un producto final que tiene dicha característica de interés.

27. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, comprendiendo la etapa adicional de escindir dichos productos finales a partir de dichos soportes sólidos y seleccionar dichos productos finales.

28. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho análisis está automatizado.

29. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dichas etapas de reacción están automatizadas.