DE102010060498B4

DE102010060498B4 - Isolierung und funktionale Identifizierung ganzer Zellen

Info

Publication number: DE102010060498B4
Application number: DE102010060498A
Authority: DE
Inventors: Dr. Lenz Thomas; Christian Dalhoff; Dr. Dreger Mathias
Original assignee: caprotec bioanalytics GmbH
Current assignee: KOESTER, HUBERT, PROF. DR., DE
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: EP2638391A1; WO2012062910A1; US9550978B2; US20130295636A1; DE102010060498A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer Zielzelle, in welchem die Zielzelle mit einer Fangverbindung in Kontakt gebracht wird, welche einen selektiv an die Zelloberfläche bindenden Kleinmolekülrest und eine Markierungsfunktion mit einer zur Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe oder eine gebundene zweite Oberfläche oder einen Farbstoffrest aufweist und in einem Isolierungsschritt durch Bindung an eine zweite Oberfläche und anschließende Separation der Oberfläche aus der Umgebung oder durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung der Zelle isoliert wird. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Fasermaterial zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Markierung und Isolation von Zellen, insbesondere zur Diagnostik und Therapie von Erkrankungen des menschlichen Körpers.
Die Identifizierung und Isolierung von funktional oder phänotypisch definierten Zellpopulationen ist eine wichtige Herausforderung in der Grundlagenforschung, aber auch im Hinblick auf Diagnose und Therapie von Erkrankungen, beispielsweise zur Erkennung und Isolierung zirkulierender metastasierender Tumorzellen. Bekannte Methoden dafür basieren auf Antikörpern gegen tumorspezifische Zelloberflächenproteine, die nicht-kovalent an die Tumorzellen binden. Sie sind durch die Verfügbarkeit, die Spezifität und die Bindungsaffinität der verwendeten Antikörper an ihre Zielstruktur limitiert.
In manchen Fällen werden tumorspezifische Zell-Oberflächenstrukturen erst durch die Interaktion mehrerer verschiedener Proteine gebildet. In solchen Fällen wäre eine Adressierung durch Antikörper, die für die einzelnen Proteinkomponenten der Zielstruktur spezifisch sind, wertlos, da diese eine viel weniger spezifische Verteilung auf verschiedenen Zellsorten aufweisen können.
Matrix-Metalloproteinasen (MMP) spielen eine wichtige Rolle bei Aufbau und Abbau von Geweben, Zellmigration und -adhäsion. Ihre Expression korreliert bei verschiedenen Tumorentitäten mit der Malignität des Tumors. Verschiedene Liganden für MMP sind bekannt. In der klinischen Entwicklung befand sich die Verbindung Marimastat, die zur Klasse der Succinylhydroxamate gehört. Als Wirkmechanismus dieser Klasse wird eine Komplexierung des Zink-Ions im aktiven Zentrum von MMP durch die in diesen Inhibitoren enthaltene Hydroxamatgruppe postuliert.
Trifunktionale Fangverbindungen, welche ein Arzneimittelderivat als Selektivitätsfunktion, eine photo-aktivierbare Gruppe als Reaktivitätsfunktion und eine Sortierfunktion aufweisen, sind aus der WO2004/064972A2 bekannt. Dort ist auch die Anwendung von trifunktionalen Fangverbindungen in der in-vitro-Untersuchung von Proteinhomogenaten im Rahmen der Proteomforschung gezeigt.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche es ermöglichen, Zellen, insbesondere Tumorzellen mit Potential zur Bildung von Metastasen, mit hoher Sensitivität und Selektivität zu erkennen und zu isolieren.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst.
Dabei werden die folgenden Begriffe in der nachstehend erläuterten Bedeutung verwendet:
Eine Zielzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine durch funktionale, phänotypische oder genotypische Merkmale charakterisierte (eukaryote oder prokaryote) Zelle, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren durch Wechselwirkung von Kleinmolekülen mit auf der Zielzelle vorhandenen Oberflächenstrukturen markiert, identifiziert oder isoliert werden soll. Eine Zielzelle hat eine weitgehend intakte Zellarchitektur und gegebenenfalls -soweit es sich nicht um eine Zielzelle innerhalb z. B. eines histologischen Präparats handelt- einen intakten Stoffwechsel und ist -soweit physiologisch für die betreffende Zellart typisch- teilungsfähig, mindestens vor der Markierung oder Isolierung.
Eine photoaktivierbare Funktion ist ein Molekülrest, welcher durch elektromagnetische Strahlung, z. B. sichtbares Licht oder UV-Licht, zur Bildung einer reaktiven Spezies, z. B. eines Nitrens, Carbens oder Radikals, angeregt wird, die schnell mit einem geeigneten Reaktionspartner eine Bindung eingehen kann, z. B. durch Addition an eine C=C-Doppelbindung oder durch Insertion in eine XH-Bindung (X = S, O, N, C).
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Zellen mit Partikeln markiert werden können, indem Partikel über die Wechselwirkung zwischen Proteinen auf Zelloberflächen und Liganden für diese Proteine, wie sie z. B. Arzneimittelmoleküle darstellen, an die Zellen gebunden werden. Diese Bindung der Partikel ist stark genug, um Waschschritte zur Entfernung ungebundener Partikel zu überdauern, und sogar stark genug, um die Zellen z. B. durch Rückhalt in einem Magnetfeld von ungebundenen Zellen zu trennen. Weiterhin wird durch die Kombination der Protein-Liganden-Bindung mit einer lichtinduzierten kovalenten Bindung einer zweiten Reaktivitätsfunktion an die Zelloberfläche die Bindung verstärkt und das Spektrum der anzuwendenden Methoden zu Markierung und Isolierung erweitert.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung einer Zielzelle aus einer Umgebung zur Verfügung gestellt. Vielfältige Umgebungen kommen dabei in Frage, z. B. eine Zellsuspension, Blut oder Biopsiematerial. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Zielzelle in einem Bindungsschritt mit einer Fangverbindung in Kontakt gebracht, welche die folgenden Komponenten aufweist:

– einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht, der selektiv an eine Zelloberfläche der Zielzelle binden kann, und
– eine Sortier- oder Markierungsfunktion umfassend bi) eine zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe oder bii) eine kovalent oder quasi-kovalent gebundene zweite Oberfläche oder biii) einen Farbstoffrest, vorzugsweise einen Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoff.

Durch das Inkontaktbringen bindet der Kleinmolekülrest an die Zelloberfläche der Zielzelle.
Weiterhin wird gemäß diesem Aspekt der Erfindung die Zielzelle in einem Isolierungsschritt

i) durch Bindung der zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe an eine (feste) zweite Oberfläche und anschließende Separation der zweiten Oberfläche aus der Umgebung (für Alternative bi),
ii) durch Separation der zweiten Oberfläche aus der Umgebung (für Alternative bii),
iii) durch Fluoreszenz-aktiverte Zellsortierung der Zelle (für Alternative biii)

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung weist die Fangverbindung eine photoaktivierbare Reaktivitätsfunktion auf. Die Fangverbindung wird dann durch Photoaktivierung der Reaktivitätsfunktion kovalent an die Zielzelle gebunden.
Die Fangverbindung werden entweder a) vor Durchführung des Verfahrens zur Markierung oder b) nach Durchführung des Verfahrens zur Markierung durch Bindung der Sortierfunktion an eine (feste) zweite Oberfläche gebunden. Alternative a) bedingt, dass zunächst die zweite Oberfläche mit der Fangverbindung reagiert und dann die Zielzelle über die Selektivitätsfunktion präferentiell mit der zweiten Oberfläche interagiert und durch Aktivierung der Reaktivitätsfunktion gebunden wird. Nach Alternative b) wird zunächst die Fangverbindung an die Zielzelle gebunden und dann die Zielzelle an die zweite Oberfläche sortiert.
Die zweite Oberfläche ist beispielsweise die Oberfläche eines Partikels, eines Chromatographiematerials, einer flachen Oberfläche (z. B. Chip, Microtiterplatte) oder einer Faser.
Das Partikel weist dabei in fest gebundener Form (kovalent oder quasi-kovalent gebunden) eine Fangverbindung auf, die einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht als Liganden trägt, der selektiv an die Zelloberfläche der Zielzelle binden kann (”Selektivitätsfunktion”). Die Bindung des Kleinmoleküls an die Zelloberfläche der Zielzelle erfolgt über nicht-kovalente Wechselwirkungen und hat eine Dissoziationskonstante von unter 100 μmol/l, vorzugsweise < 10 μmol/l, < 1 μmol/l, < 100 nmol/l, < 10 nmol/l oder < 1 nmol/l. Typische Beispiele für solche Bindungen des Kleinmoleküls an die Zelloberfläche der Zielzelle sind die Interaktionen von pharmazeutischen Wirkstoffen mit ihren Zielproteinen oder Zielproteinkomplexen auf der Zelloberfläche.
Die (zweite) Oberfläche, mit der die Zelloberfläche der Zielzelle in Kontakt gebracht wird, kann z. B. die Oberfläche eines Partikels sein, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren an die Zielzelle gebunden wird und sie so markiert. Die Zelle kann dann nach einem Waschschritt, in dem nicht gebundene Partikel entfernt werden, entweder im Lichtmikroskop oder durch andere optische Methoden (z. B. Streulichtbestimmung im FACS) erkannt werden.
Alternativ kann auch zunächst die Bindung der zweiten Oberfläche z. B. eines Partikels dadurch vorbereitet werden, dass in einem ersten Schritt die Fangverbindung an die Zelloberfläche der Zielzelle gebunden wird. Dazu wird die Zielzelle in einem ersten Schritt mit einer Fangverbindung in Kontakt gebracht. Diese weist einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht als Liganden, der selektiv an die Zelloberfläche der Zielzelle binden kann, und eine Sortierfunktion auf. Die Fangverbindung bindet selektiv an die Zelloberfläche der Zielzelle; überschüssige Fangverbindung wird ggf. durch einen Waschschritt entfernt. In einem zweiten Schritt wird ein selektiv an die Sortierfunktion bindungsfähiges Partikel mit der Zielzelle in Kontakt gebracht. Die Sortierfunktion kann beispielsweise Biotin sein, welches über auf der Oberfläche des Partikels vorhandene Streptavidinmoleküle gebunden wird.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Zielzelle mit einer Fangverbindung in Kontakt gebracht. Diese Fangverbindung umfasst

– einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht, der selektiv an eine Zelloberfläche der Zielzelle binden kann (”Selektivitätsfunktion”). Die Bindung des Kleinmolekülrests an die Zelloberfläche der Zielzelle erfolgt über nicht-kovalente Wechselwirkungen und hat eine Dissoziationskonstante von unter 100 μmol/l, vorzugsweise < 10 μmol/l, < 1 μmol/l, < 100 nmol/l, < 10 nmol/l oder < 1 nmol/l,
– eine aktivierbare (z. B. photoaktivierbare) Reaktivitätsfunktion zur irreversiblen Bindung der Fangverbindung an die Zielzelle und
– eine Sortier- oder Markierungsfunktion, umfassend ci) eine zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe als Sortierfunktion oder cii) einen Farbstoffrest, vorzugsweise einen Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoff und
– einen mindestens trifunktionalen zentralen Rest Z, an welchem der Kleinmolekülrest, die Reaktivitätsfunktion und die Sortier- oder Markierfunktion jeweils einzeln kovalent gebunden sind.

Durch das Inkontaktbringen bindet der Kleinmolekülrest an die Zelloberfläche der Zielzelle. In einem zweiten Schritt wird die Fangverbindung durch Aktivierung der Reaktivitätsfunktion kovalent an die Zielzelle gebunden.
Die kovalente Bindung von Kleinmolekülrest, Reaktivitätsfunktion und Sortier- oder Markierfunktion jeweils einzeln an einem mindestens trifunktionalen zentralen Rest Z bedeutet, dass diese individuell an (kurzen) Kohlenstoff- bzw. Kohlenstoff-Heteroatom-Ketten an ein zentrales Molekül, beispielsweise Lysin, gebunden und im Raum rotierbar sind. Dadurch werden die Bindungseigenschaften am Kleinmolekülrest, der mit der Oberfläche der Zelle z. B. durch ein auf der Zelloberfläche befindliches Membranprotein in Wechselwirkung tritt, nur minimal gestört im Vergleich zu der Alternative, in welcher Reaktivitätsfunktion und Kleinmolekülrest direkt aneinander gebunden sind. Weiterhin bedeutet dies, dass mit dem Verfahren gemäß dieses Aspekts der Erfindung Zellen aufgrund ihrer Wechselwirkung des Kleinmolekülrestes mit der Zelloberfläche der Zielzelle selektioniert werden können, die kovalente Bindung der Zelle an die Sortier- oder Markierfunktion aber über eine andere Zelloberflächenstruktur der Zielzelle als die vom Liganden erkannte erfolgen kann. Dies kann z. B. zu diagnostisch wertvollen Informationen führen, soweit die Zelle nach ihrer Markierung isoliert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist dabei dadurch charakterisiert, dass die Fangverbindung eine photoaktivierbare Reaktivitätsfunktion aufweist, und die Zielzelle in einem ersten Schritt mit dem Partikel in Kontakt gebracht wird, so dass der Kleinmolekülrest an die Oberfläche der Zielzelle binden kann, und in einem zweiten Schritt die Fangverbindung durch Photoaktivierung der Reaktivitätsfunktion kovalent an die Zielzelle gebunden wird. Die Reaktivitätsfunktion und der Kleinmolekülrest können dabei über einen zentralen Rest Z jeweils einzeln -damit mit allen Freiheitsgraden der Bewegung- an das Partikel gebunden sein. Alternativ kann die Reaktivitätsfunktion direkt am Kleinmolekülrest angebracht sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Oberfläche zur Markierung oder Isolierung von Zielzellen zur Verfügung gestellt.
Diese umfasst einen Kleinmolekülrest, der selektiv mit der Zelloberfläche der Zielzelle interagieren kann, und eine aktivierbare Reaktivitätsfunktion.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann die Oberfläche, welche einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht (Dalton), der selektiv mit der Zelloberfläche der Zielzelle interagieren kann, und eine photoaktivierbare Reaktivitätsfunktion aufweist, als Fasermaterial (z. B. als Hohlfaser zur Vergrößerung der Oberfläche) oder in grobporiger Körnung vorliegen. Diese Ausführungsform ermöglicht die Herstellung von Kartuschen oder anderen durchströmten Behältnissen, in welche eine Zielzellen enthaltene Suspension geleitet werden kann. Durch Bindung der in der Suspension enthaltenen Zielzellen an die Oberfläche werden diese in der Suspension abgereichert. Damit können z. B. Tumorzellen aus Blut entfernt werden.
Eine Fangverbindung zur Markierung von Zielzellen umfasst einen Kleinmolekülrest, der selektiv mit der Zelloberfläche der Zielzelle interagieren kann, eine (photo-)aktivierbare Reaktivitätsfunktion, ein Partikel und einen mindestens trifunktionalen zentralen Rest Z, an welchem der Kleinmolekülrest, die Reaktivitätsfunktion und das Partikel jeweils einzeln kovalent gebunden sind.
Dabei ist die Bindung an den Kleinmolekülrest, der selektiv mit der Zelloberfläche der Zielzelle interagieren kann, zunächst reversibel, so dass sich die Zelle durch das Vorbeiströmen der Suspension wieder von der Oberfläche lösen könnte. Durch (Photo-)aktivierung der Reaktivitätsfunktion wird eine irreversible, kovalente Bindung von der Oberfläche zur Zielzelle hergestellt. Die Zielzelle kann nun nicht mehr (oder erheblich schwerer durch Loslösen des kovalent gebundenen Proteins aus der Zellmembran) von der Oberfläche abgelöst werden. Die Aktivierung, vorzugsweise Photoaktivierung, kann sowohl kontinuierlich als auch gepulst erfolgen.
Es werden diejenigen Zellen irreversibel an die Oberfläche gebunden, die sich dort durch die Selektivitätsfunktion angereichert haben. Je nach Reaktionsbedingungen kann es dabei zur Bindung eines gewissen Teils an Nicht-Zielzellen kommen. Dies wird gegebenenfalls in Kauf genommen, da eine weniger als optimale Selektivität der Bindung insbesondere dem Ziel einer möglichst vollständigen Entfernung von Tumorzellen nicht entgegensteht. Um letzteres Ziel zu erreichen, kann eine mehrstufige, kreisförmige Prozessführung von Vorteil sein.
Bevorzugt sind Ausführungsformen, in welchen die zweite Oberfläche die Oberfläche eines Partikels, insbesondere eines Magnetpartikels oder eines Goldpartikels, ist. Goldpartikel haben den Vorzug der leichten Kopplung an organische Verbindungen durch Schwefelbrücken. Dies macht eine entsprechende Fangverbindung einfach und billig herstellbar und erleichtert den Einsatz einer solchen Verbindung z. B. in der Reihenuntersuchung von histologischen Präparaten.
Magnetpartikel haben den Vorteil, dass sie an die Fangverbindung gebundene Zellen einfach aus einer Umgebung entfernbar machen. Insbesondere bevorzugt sind dabei superparamagnetische Partikel, welche keine dauerhafte Magnetisierung erleiden und somit zur Herstellung von Suspensionen besonders geeignet sind.
Der Kleinmolekülrest kann gemäß allen Aspekten der Erfindung ein kurzes Peptid sein. Er kann ein Molekülgewicht von unter 3500 u bis ca 900 u aufweisen, wie er für Zelloberflächen-bindende Peptide wie CGRP (calcitonin gene related peptide), Bradykinin oder Substanz P typisch ist. Ebenso kann der Kleinmolekülrest ein kleines Molekül sein, beispielsweise ein Arzneimittelmolekül oder ein Arzneimittel-Entwicklungskandidat. Bevorzugt ist ein Kleinmolekülrest von unter 1000 u oder unter 700 u, noch bevorzugter von weniger als 500 u. Besonders bevorzugte Kleinmolekülreste sind zugelassene oder in Prüfung befindliche Arzneimittel bzw. Kandidatenmoleküle zur Zulassung als Arzneimittel. Insbesondere weisen diese vorteilhafterweise die als ”Lipinski-Regeln” bekannten Charakteristika auf, nämlich ein Molekulargewicht von über 160 u, aber bis zu 500 u, bis zu fünf Wasserstoff-Brücken-Donatoren (Sauerstoff- und Stickstoffatome mit gebundenem Wasserstoffatom), bis zu zehn Wasserstoff-Brücken-Akzeptoren (Sauerstoff- und Stickstoffatome) und ein Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient logP von unter 5,6 in Bezug auf den Kleinmolekülrest. Die restlichen an der Fangverbindung beteiligten Reste gehen also in die Zählung der Wasserstoffbrückenbildner sowie die Berechnung des logP-Wertes und des Molekülgewichtes nicht ein.
Besonders bevorzugt als Kleinmolekülrest sind Ligandenmoleküle für zell-spezifische Oberflächenproteine, z. B. Matrix-Metalloproteinasen (MMP), insbesondere solche, welche mit einer Dissoziationskonstante von < 1 μmol/1 für das isolierte, nicht an die Fangverbindung gebundene Kleinmolekül an das Protein, z. B. eine MMP, binden. Weiterhin besonders bevorzugt sind Hydroxamat-Gruppen enthaltende MMP-Inhibitoren.
Beispiele für bevorzugte Kleinmolekülreste sind Marimastat (Ia) und Batimastat (Ib). Ein Beispiel für einen bevorzugten Kleinmolekülrest, welcher nicht an eine MMP bindet, sondern einen Neurotransmitterrezeptor, ist Sertindol (Ic):
Die aktivierbare Reaktivitätsfunktion ist gemäß allen Aspekten der Erfindung eine Gruppe, die in Gegenwart der Zellen mit oder ohne weitere Reagenzien, z. B. durch elektromagnetische Strahlung (sichtbares Licht oder IR-, UV- oder höherenergetische elektromagnetische Strahlung) aktiviert wird. Beispiele sind die Erzeugung eines Carbens durch Photolyse einer Diazo-Verbindung, beispielsweise eines Diazirins, oder die Erzeugung eines Nitrens aus einem Azid oder die Erzeugung eines (Di-)Radikals aus einer Kohlenstoff-Heteroatom-Doppelbindung wie im Falle von Benzophenon, und die Weiterreaktion des gebildeten reaktiven Intermediats mit – beispielsweise – einer in räumlicher Nähe befindlichen aromatischen Seitenkette oder einer Alkohol, Thiol- oder Aminofunktion einer Aminosäure.
Beispiele für bevorzugte aktivierbare Reaktivitätsfunktionen sind beispielsweise Aryl-trifluoromethyldiazirine (II), Arylazide (III) oder Benzophenone (IV):
Die Sortier- oder Markierungsfunktion ist gemäß allen Aspekten der Erfindung eine Gruppe, welche entweder eine zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine (zweite) Oberfläche geeignete Gruppe als Sortierfunktion, oder einen Fluoreszenzfarbstoff oder einen Lumineszenzfarbstoff umfasst.
Besonders bevorzugt als Sortierfunktion ist Biotin, welches mit Streptavidin eine Bindung eingeht, welche eine so niedrige Dissoziationskonstante hat, dass sie eine der kovalenten Bindung vergleichbare Dissoziationsenergie besitzt, somit als vergleichbar stark bezeichnet werden kann. Die Biotin-Streptavidin-Bindung ist ein Beispiel einer quasi-kovalenten Bindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform aller Aspekte der Erfindung wird als Fangverbindung ein Molekül eingesetzt, welches die drei Funktionalitäten der Selektivitätsfunktion, Reaktivitätsfunktion und Sortier- oder Markierungsfunktion über einen zentralen Molekülrest Z verbindet, an welchem die drei genannten Funktionalitäten kovalent gebunden sind. Bevorzugt besteht Z aus über ein zentrales Element (1 Atom oder eine kurze Kette aus < 10 Atomen mit Molekulargewicht 12 oder größer) verbundenen Kohlenstoff-Ketten, welche durch Heteroatome (Sauerstoff, Stickstoff, ggf. Phosphor oder Schwefel) verbunden sein können.
Besonders bevorzugt für Z sind Aminosäuren mit OH-, SH-, NH₂-, COOH-, oder CONH₂-Gruppen in der Seitenkette (z. B. Serin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure oder Glutamin), da diese ohne weiteren synthetischen Aufwand an drei Positionen derivatisiert werden können. Ebenso kann Z ein tertiärer Aminstickstoff sein.
Als Zielzellen aller Aspekte der Erfindung sind aus dem periphären Blut isolierbare Zellen bevorzugt, ganz besonders zirkulierende Tumorzellen. Insbesondere bevorzugt sind nicht rekombinant modifizierte Säugetierzellen, insbesondere menschliche Zellen. Hinsichtlich der Verfahrensaspekte der Erfindung sind solche Verfahren besonders bevorzugt, bei welchen einem menschlichen Körper entnommene Zellen ex-vivo markiert oder isoliert werden.
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sie die Identifizierung, Markierung und Isolierung von Zellen ermöglicht, die auf einen bestimmten pharmakologischen Wirkstoff ansprechen. Dies wird dadurch erreicht, dass eine Fangverbindung in einem ersten Schritt an eine für die zu identifizierende, zu markierende oder zu isolierende Zelle charakteristische Oberflächenstruktur reversibel bindet und in einem zweiten Schritt an der Zielzelle kovalent gebunden wird. In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei der für die Zelle charakteristischen Oberflächenstruktur um ein für die Zelle spezifisches Oberflächenprotein.
In vielen Fällen liegen funktionale Bindungsstellen für solche Wirkstoffe nicht auf einem isolierten Protein, sondern werden erst durch die strukturelle Interaktion von mehreren Proteinen geschaffen, die zusammen einen funktionalen Proteinkomplex bilden. Die Herstellung von Antikörpern, die selektiv Protein-Protein-Interaktionsflächen erkennen, ist mit vorhandenen Methoden sehr aufwendig und häufig unmöglich. Antikörper-basierte Verfahren, welche einzelne Proteinkomponenten eines Komplexes erkennen, liefern für die Diagnose keine aussagekräftigen Ergebnisse und sind zur Markierung und Isolierung von durch einen funktionellen Proteinkomplex charakterisierten Zellen ungeeignet. Die Erfindung stellt hier das erste Mal Mittel und Verfahren zur Verfügung, welche die funktionale Adressierung des Gesamtkomplexes ermöglichen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch solche Strukturen effektiv getroffen werden, die nicht durch eine einzelne isoliert betrachtete Proteinkomponente charakterisierbar sind.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren in Lösung eingesetzt werden können. Es können krankheitsrelevante Zelloberflächen-Proteinstrukturen durch Wechselwirkung mit einer an der erfindungsgemäßen Fangverbindung enthaltenen molekularen Struktur markiert werden. Dies kann zu diagnostischen (Detektion pathologisch veränderter Zellen) und therapeutischen (Entfernung von pathologisch veränderten Zellen) Zwecken genutzt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Funktionalitäts-gerichtete Zellmarkierungen und Isolierungen durchgeführt werden, die aufgrund der zuvor beschriebenen Charakteristik der Markierungsweise Antikörper-basierten Methoden überlegen sind, oder komplementär zu diesen eingesetzt werden können. Dabei sind besonders für die Aspekte der Erfindung, welche sich der Reaktion mit aktivierbaren, vorzugsweise photoaktivierbaren Gruppen bedienen, zwei Vorteile von Gewicht:
Erstens werden Kleinmolekül-Bindungsstellen funktional adressiert. Die Bindungsstelle kann auf einem einzelnen Zielprotein liegen. In vielen Fällen wird sie aber durch Multiproteinkomplexen aus mehreren bis vielen Komponenten gebildet, die so in dieser Assoziation nur auf Zielzellen vorkommen, während die Einzel-Proteinkomponenten eine völlig andere Zell- oder Gewebeverteilung haben können. Dies können Antikörper-basierte Verfahren prinzipiell nicht leisten.
Zweitens wird das Zielprotein kovalent gebunden. Das die Affinität zur Oberflächenstruktur auf der Zielzelle bestimmende Kleinmolekül ist Teil einer tri-funktionalen Fangverbindung. Nach initialer Gleichgewichtsbindung zur Zielstruktur durch die Selektivitätsfunktion wird eine kovalente Bindung zur Zielzelle hergestellt. Eventuell erforderliche Waschschritte können dann – anders als bei Antikörper-basierten Methoden – nicht mehr zum Verlust der funktional spezifisch gebundenen Proteine führen.
Die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren können zur Markierung und Detektion von Zielzellen eingesetzt werden. So ist beispielsweise der Einsatz in einem der Immunhistochemie analogen Verfahren möglich, in dem funktionelle Kleinmolekülbindungsstellen dargestellt werden, mit allen vorstehend angeführten Vorteilen gegenüber Antikörper-basierten Verfahren. Die Analyse kann über Biotin als Sortierfunktion der Fangverbindung erfolgen, wenn geeignete Streptavidin-Enzym-Konjugate für eine spätere Farb- oder Chemolumineszenzreaktion oder Streptavidin-Fluorophor-Konjugate für die Fluoreszenz verwendet werden. Die Fangverbindung kann auch selbst einen Fluorophor tragen. Auch der Einsatz von Massen-Tags als Detektionsfunktion ist für Methoden wie das MALDI-MS-basierte „Tissue Imaging” zur Analyse der Gewebeverteilung interessierender Kleinmolekülbindungsstellen möglich.
Die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren können zur Isolierung von Zielzellen eingesetzt werden. Aus Zellsuspensionen oder Körperflüssigkeiten gewonnene Zellen können mit den erfindungsgemäßen Verfahren markiert und dann mit bekannten Mitteln durch sog. Fluoreszenz-aktiviertes Zell-Sortierung (FACS) isoliert werden. Markierte Zellen können auch bei Verwendung von Fangverbindungen mit Biotin als Sortierfunktion über die Bindung von Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln oder flachen Trägern (z. B. Chips, Microtiterplaten) durch Fixierung in einem Magnetfeld isoliert werden. Die so erfolgte Isolierung kann dem Studium des adressierten Zelltyps dienen, aber auch der Diagnostik und Therapie.
Die in den nachfolgenden Beispielen illustrierte Erfindung zeigt die Machbarkeit der Strategie in ihren wesentlichen Kernpunkten auf: Ganze Zellen können mit Kleinmolekül-Fangverbindungen auf der Basis der spezifischen Interaktion eines Kleinmoleküls, das als Selektivitätsfunktion Bestandteil der tri-funktionalen Fangverbindung ist, aufgrund ihrer Zelloberflächen-Struktur selektiv markiert werden. Die markierten Zellen können isoliert werden.
Beschreibung der Abbildungen:
1 zeigt schematisch den Ablauf der Markierung von Zielzellen mit Fangverbindung-beschichteten Partikeln ohne Photoaktivierung;
2 zeigt schematisch den Ablauf der Markierung von Zielzellen mit der Fangverbindung und nachfolgender Beschichtung mit Partikeln ohne Photoaktivierung;
3 zeigt schematisch den Ablauf der Markierung von Zielzellen mit Fangverbindung-beschichteten Partikeln mit Photoaktivierung;
4 zeigt schematisch den Ablauf der Markierung von Zielzellen mit der Fangverbindung und nachfolgender Beschichtung mit Partikeln mit Photoaktivierung; Beispiele
Beispiel 1: Synthese der trifunktionalen Marimastat-Fangverbindung
Die in den nachfolgenden Beispielen verwendete Marimastat-Fangverbindung wurde wie folgt dargestellt:
Die Herstellung der als ”SC” bezeichneten Verbindung erfolgt analog der von Dalhoff et al., ChemBioChem 11, 256 ff. (2010) beschriebenen Methode.
Detaillierte experimentelle Durchführung:
Beispiel 2a: Methode 1 zur Marimastat-spezifischen Zellmarkierung mit Magnetpartikeln:
Der Zellkulturüberstand (10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (PAA Laboratories GmbH), 1× Penicillin/Streptomycin (PAA) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) High Glucose (4,5 g/l) mit stabilem Glutamin (PAA)) zweier Zellkulturen von adhärenten Fibrosarkomzellen der Zellinie HT-1080 (ACC 315 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ Braunschweig; dicht bewachsen; 3,5 cm Petrischale; Passage 9) wurde abpipettiert, mit weiterem Zellkulturüberstand einer größeren Kultur vereinigt und aufbewahrt. Das Zellkulturgefäß wurde verschlossen, um eine Austrocknung der Zellen zu vermeiden.
20 μl 10 mg/ml Dynabeads MyOne Steptavidin C1 (Dynal) mit 1 μm Durchmesser (Streptavidin-Magnetpartikel oder kurz Partikel) wurden mit 10 μl 100 μM Marimastat-Fangverbindung V (caprotec bioanalytics GmbH)
gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Partikel wurden mit einem starken Magneten (caproMag von caprotec bioanalytics GmbH, enthält einen 150 × 9 × 7 mm Neodymmagneten (NdFeB) der Güte N52 (Energieprodukt 1,43 Tesla)) an der inneren Gefäßwand gesammelt, der Überstand wurde verworfen. Die Partikel wurden in 500 μl HT-1080 Zellkulturüberstand resuspendiert, erneut magnetisch gesammelt und in 200 μl Wasser resuspendiert, so dass eine 1 mg/ml Marimastat-Fangverbindung-Partikel-Suspension vorlag.
Für die folgende Zugabe zu einer HT-1080-Kultur „Ver” wurden 1 μl dieser Suspension mit 1 μl Wasser und 8 μl HT-1080 Zellkulturüberstand gemischt. Für die folgende Zugabe zur Kontroll-HT-1080-Kultur „Con” wurden 1 μl dieser 1 mg/ml Marimastat-Fangverbindung-Partikel-Suspension mit 1 μl 10 mM freiem Marimastat (Kompetitor) und 8 μl HT-1080 Zellkulturüberstand gemischt. Die Konzentration der Marimastat-Fangverbindung-Partikel war somit 0,1 mg/ml.
Jeweils 0,5 μl dieser 0,1 mg/ml Marimastat-Fangverbindung-Partikel-Suspensionen wurde auf den Zellrasen zweier Kulturen von adhärenten HT-1080-Zellen gegeben (ohne freies Marimastat zu Kultur „Ver”, mit freiem Marimastat zu Kultur „Con”), wobei eine kleine mit applizierte Luftblase das Zerlaufen der Suspension einschränkte. Es wurden mit Filzschreiber Markierungen (so klein wie möglich) an den äußeren Gefäßwänden nahe bei den zugegebenen Marimastat-Fangverbindung-Partikel-Suspensionen platziert, um diese Zugabe-Orte bei der Lichtmikroskopie wiederzufinden. Es wurde 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation mit der Marimastat-Fangverbindung erfolgte in beiden Kulturen gleich lang. Während dieser Zeit konnte lichtmikroskopisch das Herabsinken der Partikel auf den Zellrasen beobachtet werden. Es wurde eine lichtmikroskopische Aufnahme gemacht. Die mit Marimastat-Fangverbindung beschichteten Partikeln sind im Phasenkontrastmikroskop als dunkle Kügelchen erkennbar.
Das jeweilige Zellkulturgefäß wurde schräg gehalten und der Applikationsbereich je 10 mal mit 0,5 ml Zellkulturüberstand gewaschen, indem pulsierend pipettiert wurde, um Druck und Schaum zu erzeugen. Der Wasch-Zellkulturüberstand wurde abpipettiert. Es wurde eine lichtmikroskopische Aufnahme gemacht. Das Experiment wurde weitere zweimal mit gleichem Ergebnis (Zellen in „Ver” durch Partikel markiert, in „Con” nicht oder nur äußerst gering) wiederholt.
Nach dem Waschen sind die Zellen in der Kultur ”Ver” an ihrer Oberfläche mit Marimastat-Fangverbindung beschichteten Partikeln markiert erkennbar, aber nicht die Zellen in der Kultur ”Con”. Hier hat die Kompetition mit einem Überschuß freien Marimastats die spezifische Bindung der mit Marimastat-Fangverbindung beschichteten Partikeln verhindert. Dies zeigt die Selektivität der Markierung.
Beispiel 2b: Methode 2 zur Marimastat-spezifischen Zellmarkierung mit Magnetpartikeln:
Zellkulturüberstand zweier Zellkulturen von adhärenten Fibrosarkomzellen der Zellinie HT-1080 wurde wie vorstehend beschrieben (Beispiel 2a) vorbereitet.
Die beiden Kulturen wurden jeweils mit 400 μl Zellkulturüberstand versetzt. Zu Zellkultur „Ver” wurden 20 μl Wasser gegeben, Kontroll-Zellkultur „Con” wurde mit 20 μl 10 mM freiem Marimastat (Kompetitor) versetzt, beide Zellkulturen wurden zur Homogenisierung geschwenkt und 3 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei auf stete Benetzung des Zellrasens geachtet wurde. In diesem Schritt bindet das freie Marimastat in Kultur „Con” an Marimastat-bindende Proteine oder Proteinkomplexe auf der Zelloberfläche und blockiert diese Bindungsstellen, so dass die Marimastat-Fangverbindung im nächsten Schritt nicht mehr binden kann. Zu beiden Kulturen wurden jeweils 2 μl 100 μmol/l Marimastat-Fangverbindung gegeben, geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bindung der Marimastat-Fangverbindung erfolgt nur an die nicht blockierten Zelloberflächenproteine in Kultur „Ver”. Der Überstand wurde jeweils entfernt, die beiden Kulturen wurden jeweils zweimal mit 400 μl frischem Zellkulturüberstand gewaschen, um den Überschuss an Marimastat-Fangverbindung zu entfernen, und jeweils mit 400 μl frischem Zellkulturüberstand versetzt. Es wurden zu beiden Kulturen jeweils 1 μl 10 mg/ml Dynabeads MyOne Steptavidin C1 von Dynal gegeben (Streptavidin-beschichtete Magnetpartikel), durch Schwenken homogenisiert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Hier bindet das Streptavidin auf der Magnetpartikeloberfläche an den Biotinrest der Marimastat-Fangverbindung, die in der Kultur „Ver” bereits durch den Marimastatrest an die Zelloberflächenproteine gebunden ist. Somit werden vermittelt durch die Marimastat-Fangverbindung die Magnetpartikel auf der Zelloberfläche gebunden. Der Überstand wurde in eine Pipette aspiriert und mehrmals pulsierend über den Zellrasen pipettiert, um Druck und Schaum zu erzeugen. Der Überstand wurde entfernt und die Waschprozedur nochmals mit 400 μl frischem Zellkulturüberstand wiederholt. Magnetpartikel, die nicht auf die beschriebene Art an Zelloberfläche binden, werden weggewaschen. Erneut wurde der Überstand entfernt. Nach Zugabe von 200 μl frischem Zellkulturüberstand wurden die Zellen lichtmikroskopisch untersucht mit dem zur Methode 1 analogen Ergebnis, dass in Kultur „Ver” die Zellen mit Partikeln markiert waren. In Kultur „Con” waren kaum Partikel erkennbar. Die Ergebnisse sind visuell denjenigen des in Beispiel 2a beschriebenen Verfahrens gleich.
1 zeigt ein Beispiel eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Dabei wird Fangverbindung 10 verwendet, welche eine Sortierfunktion 11 (Biotin), eine Selektivitätsfunktion 13 (Marimastat) und einen zentralen Rest 12 aufweist. In einem ersten Bindungsschritt A wird die Fangverbindung 10 auf mit Streptavidin 21 beschichtete Magnetpartikel 20 immobilisiert. Dann werden in einem Schritt B die Magnetpartikel 20 zu Zellkulturzellen 51 in einer Zellkulturschale 50 zugegeben, was dazu führt, dass diese über auf der Zelloberfläche 53 der Zielzellen 51 vorhandene MMP-Komplexe 52 an der Zelloberfläche 53 bindet. Im anschließenden Waschschritt C werden überschüssige Magnetpartikel 20 entfernt.
2 zeigt ein weiteres Beispiel eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung. Dabei wird wieder die Fangverbindung 10 verwendet, welche eine Sortierfunktion 11 (Biotin), eine Selektivitätsfunktion 13 (Marimastat) und einen zentralen Rest 12 aufweist. In einem ersten Bindungsschritt D wird die Fangverbindung 10 zu Zellkulturzellen 51 in einer Zellkulturschale 50 zugegeben. Die Fangverbindung 10 bindet über auf der Zelloberfläche 53 der Zielzellen 51 vorhandene MMP-Komplexe 52 an der Zelloberfläche 53. Durch Entfernen des Überstands und einen Waschschritt (nicht gezeigt) wird überschüssige, nicht an Zellen gebundene Fangverbindung entfernt. In einem nächsten Schritt E werden mit Streptavidin 21 beschichtete Magnetpartikel 20 in die Zellkulturschale 50 gegeben, wobei die Magnetpartikel über MMP-Komplexe 52 an der Zelloberfläche 53 der Zielzellen 51 bindet. Der Waschschritt C entfernt ungebundene Partikel.
Die 3 und 4 zeigen analoge Beispiele für die Verfahren der 1 und 2 mit Photoaktivierung. Dabei weist die Fangverbindung 10 eine Reaktivitätsfunktion 14 auf, die am zentralen Rest 12 gebunden ist. Entweder werden wieder die Magnetpartikel 20 zunächst mit der Fangverbindung 10 beschichtet (A in 3) und dann mit elektromagnetischer Strahlung 60 an die Zelloberfläche 53 der Zielzellen 51 gebunden. Alternativ (4) wird erst die Fangverbindung 10 mit elektromagnetischer Strahlung 60 an die Zelloberfläche 53 der Zielzellen 51 gebunden, und dann mit Magnetpartikeln 20 in Kontakt gebracht.
Beispiel 3: Spezifische Isolierung der selektiv markierten Zellen.
Nach der Markierung und dem Waschen (nach Methode 2, siehe Beispiel 2b) wurde die Überstände der Kulturen ”Ver” und ”Con” abgenommen und die Kulturen jeweils mit 200 μl nicht-enzymatischer Zelldissoziationslösung (Cell Dissociation Solution, Sigma) versetzt, gefolgt von einer 10 min Inkubation bei Raumtemperatur. Durch mehrmaliges Pipettieren der 200 μl Lösung über die Zellen wurden diese vollständig vom Zellkulturgefäß entfernt und suspendiert und danach jeweils in zwei 200 μl PCR-Gefäße ”Ver” und ”Con” überführt. Die Zellen bleiben dabei intakt. Ein starker Magnet (caproMag, caprotec bioanalytics GmbH, siehe Beispiel 2a) wurde an die Außenwand der PCR-Gefäße gehalten. Während die Zellen der Kontrolle ”Con” größtenteils unbeeinflusst vom Magneten zu Boden sanken, blieben in Ansatz ”Ver” ein erheblicher Teil der Zellen an der inneren Gefäßwand nahe dem Magneten haften.
In den Beispielen 2 und 3 humane Fibrosarkom-Zellen der Linie HT-1080 adressiert. Diese Zellen tragen an ihrer Oberfläche Multiproteinkomplexe, an denen Matrix-Metalloproteinasen (MMP) beteiligt sind. Diese Oberflächenkomplexe sind charakteristisch für metastasierende Tumorzellen. Zirkulierende Tumorzellen (CTC; ”circulating tumor cells”) sind diagnostisch hoch relevant u. a. in der Beurteilung der Prognose von Tumorpatienten. Die Funktion der MMP-Komplexe ist dabei ursächlich dafür, dass sich diese Zellen aus ihrem originären Gewebeverbund herauslösen können, über das Blut in andere Körperregionen gelangen und dort in andere Gewebe einwandern können. Im gezeigten Beispiel werden die MMP-Komplexe auf der Zelloberfläche von HT-1080-Zellen durch eine Fangverbindung adressiert, die den MMP-Inhibitor Marimastat als Selektivitätsfunktion trägt.
Weiterhin bestätigt dieses Ergebnis auch die Hypothese, dass das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage ist, Zellen über die gezielte Adressierung von Bindungsstellen zu selektieren, welche nur durch Interaktion mehrerer Proteinkomponenten gebildet werden. Die sekretierte MMP-2 liegt in der pro-Form vor, die Marimastat nicht oder nur schwach bindet. Im Komplex mit TIMP-2 und MT1-MMP auf der Zelloberfläche wird MMP-2 aktiviert und ermöglicht erst so die Interaktion der Selektionsfunktion Marimastat der Fangverbindung, und die anschließende kovalente Fixierung der Zelle.
Bezugszeichenliste

10: Marimastat-Fangverbindung
11: Biotin
12: zentraler Rest Z
13: Kleinmolekülrest (Selektivitätsfunktion)
14: Reaktivitätsfunktion
20: Magnetpartikel
21: Streptavidin
50: Zellkulturschale
51: Zellkulturzellen
52: MMP
53: Zelloberfläche
60: Licht

Claims

Verfahren zur Isolierung einer Zielzelle aus einer Umgebung, umfassend – einen Bindungsschritt, in welchem die Zielzelle mit einer Fangverbindung in Kontakt gebracht wird, welche a) einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht, der selektiv an die Zelloberfläche der Zielzelle binden kann, und b) eine Sortier- oder Markierungsfunktion umfassend bi) eine zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe oder bii) eine kovalent oder quasi-kovalent gebundene zweite Oberfläche oder biii) einen Farbstoffrest, vorzugsweise einen Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoff aufweist und – einen Isolierungsschritt, in welchem die Zielzelle i) durch Bindung der zur kovalenten oder quasi-kovalenten Bindung der Fangverbindung an eine zweite Oberfläche geeignete Gruppe an eine zweite Oberfläche und anschließende Separation der Oberfläche aus der Umgebung (für Alternative bi), ii) durch Separation der zweiten Oberfläche aus der Umgebung (für Alternative bii), iii) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung der Zelle (für Alternative biii) isoliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Fangverbindung eine photoaktivierbare Reaktivitätsfunktion aufweist, und wobei die Fangverbindung durch Photoaktivierung der Reaktivitätsfunktion kovalent an die Zielzelle gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Fangverbindung einen mindestens trifunktionalen zentralen Rest Z aufweist, an welchem der Kleinmolekülrest, die Reaktivitätsfunktion und/oder die Sortier- oder Markierfunktion jeweils einzeln kovalent gebunden sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Kleinmolekülrest ein Ligand für Matrix-Metalloproteinasen ist.
Fasermaterial, gekennzeichnet durch eine Oberfläche zur Markierung oder Isolierung von Zielzellen, gekennzeichnet durch a) einen Kleinmolekülrest von unter 3500 u Molekülgewicht, der selektiv mit der Zelloberfläche der Zielzelle interagieren kann, b) eine aktivierbare Reaktivitätsfunktion, vorzugsweise eine photoaktivierbare Reaktivitätsfunktion.